สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

การระบุและการตรวจสอบโปรตีนยึดเกาะของหลอดเลือด 1 ว่าเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บที่ท่อระหว่างเนื้อเยื่อในโรคไตจากเบาหวาน

หยาน เจีย และคณะ

บทคัดย่อ

โรคไตจากเบาหวาน(DKD) เป็นสาเหตุหลักของโรคไตเรื้อรัง(CKD) และโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้าย (ESRD) แต่การก่อโรคยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ การบาดเจ็บที่ท่อคั่นระหว่างหน้ามีบทบาทสำคัญในการพัฒนาและความก้าวหน้าของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน). การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบรายละเอียดของการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันของ tubulointerstitial และเปิดเผยกลไกพื้นฐานระหว่างการบาดเจ็บของเซลล์ในท่อและการอักเสบของคั่นระหว่างหน้าใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน)โดยใช้กลยุทธ์ทางชีวสารสนเทศ ประการแรก การวิเคราะห์ xCell ระบุเซลล์ภูมิคุ้มกันที่แสดงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน)ทูบูโลอินเทอร์สตีเทียม ซึ่งรวมถึง CD4 บวกทีเซลล์ที่ถูกควบคุม, เซลล์ Th2, CD8 บวกทีเซลล์, มาโครฟาจ M1, เซลล์เดนไดรต์ที่ถูกกระตุ้น (DC) และ DC แบบธรรมดา รวมทั้ง Tregs ที่ถูกปรับลดระดับ ประการที่สอง pyroptosis ถูกระบุว่าเป็นรูปแบบหลักของการตายของเซลล์เมื่อเปรียบเทียบกับรูปแบบอื่นของการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ โปรตีนยึดเกาะของเซลล์หลอดเลือด 1 (VCAM1) ถูกระบุว่าเป็นยีนฮับที่ติดอันดับบนสุด การวิเคราะห์สหสัมพันธ์แสดงให้เห็นว่า VCAM1 มีความสัมพันธ์เชิงบวกอย่างมีนัยสำคัญกับไพรอพโทซิสและเซลล์ภูมิคุ้มกันที่แทรกซึมในทูบูโลอินเทอร์สติเทียม การเพิ่มการควบคุมของ VCAM1 ใน DKD tubulointerstitium ถูกตรวจสอบเพิ่มเติมในกลุ่ม European Renal cDNA Bank และพบว่ามีความสัมพันธ์เชิงลบกับอัตราการกรองไต (GFR) การศึกษาในหลอดทดลองของเราตรวจสอบการแสดงออกของ VCAM1 ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ HK-2 ภายใต้สภาวะที่เป็นเบาหวาน และการยับยั้ง pyroptosis โดย disulfiram ลดการแสดงออกของ VCAM1 การอักเสบของไซโตไคน์ที่ปล่อยออกมา และการเกิดพังผืด โดยสรุป การศึกษาของเราระบุการแสดงออกของ VCAM1 ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ท่อไต ซึ่งอาจโต้ตอบกับเซลล์ภูมิคุ้มกันที่แทรกซึม ดังนั้นจึงส่งเสริมการเกิดพังผืด ยา disulfiram ที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA อาจช่วยปรับปรุงการเกิดพังผืดใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน)โดยกำหนดเป้าหมายไปที่ tubular pyroptosis และการแสดงออกของ VCAM1

คีย์เวิร์ด:ดีเคดี; tubulointerstitium; เซลล์ภูมิคุ้มกัน pyroptosis; VCAM1; disulfiram

Cistanche รักษาได้โรคไตจากเบาหวาน

Click to Cistanche สำหรับโรคไต

บทนำ

โรคไตจากเบาหวาน(DKD) หนึ่งในภาวะแทรกซ้อนที่พบบ่อยของโรคเบาหวาน เป็นสาเหตุหลักของโรคไตเรื้อรัง (CKD) และโรคไตวายเรื้อรังระยะสุดท้าย (ESRD) ในประเทศที่พัฒนาแล้วและกำลังพัฒนาจำนวนมาก [1,2] ตามรายงานจากเครือข่ายโรคไตของจีน (CK NET) DKD(โรคไตจากเบาหวาน)คิดเป็นร้อยละ 26.70 ของทุกกรณีของ CKD และกำหนดภาระทางการแพทย์และเศรษฐกิจจำนวนมาก [2] การเกิดโรคของ DKD นั้นซับซ้อนและเกี่ยวข้องกับเส้นทางที่แตกต่างกันมากมาย การชี้แจงลักษณะทางพยาธิวิทยาและการเกิดโรคของ DKD จะช่วยปรับปรุงการจัดการทางคลินิกและระบุเป้าหมายการรักษาใหม่

แม้ว่าความเสียหายของไตจะเป็นลักษณะทางพยาธิวิทยาหลักของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน)จากหลักฐานที่เพิ่มขึ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้เผยให้เห็นว่าพยาธิสภาพของเนื้อเยื่อตับ [3,4] เช่น การฝ่อของท่อ พังผืดคั่นระหว่างหน้า และเซลล์ภูมิคุ้มกันแทรกซึมที่แทรกซึมเข้ามา มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาและการลุกลามของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน)[5–7]. การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพในการประมวลผลข้อมูลจำนวนมากภายในระยะเวลาอันสั้น และให้ข้อมูลที่มีค่าเกี่ยวกับโรค อย่างไรก็ตาม การศึกษาชีวสารสนเทศเพื่อตรวจสอบการแสดงออกของยีน tubulointerstitial และการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันใน DKD นั้นค่อนข้างหายาก

วัตถุประสงค์ของการศึกษาคือเพื่ออธิบายลักษณะของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน)การแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันของ tubulointerstitial และเพื่อระบุยีนภูมิคุ้มกันและการอักเสบที่สำคัญบางอย่างเพื่อให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการเกิดโรคและการรักษา DKD อย่างแรก ชุดข้อมูล microarray tubulointerstitial ของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน)ถูกดาวน์โหลดจากฐานข้อมูล Gene Expression Omnibus (GEO) การใช้ xCell [8] ซึ่งเป็นเครื่องมือบนเว็บที่ทำการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะประเภทเซลล์ของข้อมูลการแสดงออกของยีนสำหรับเซลล์ภูมิคุ้มกันและสโตรมอล 64 ชนิด อันดับแรก เราได้ตรวจสอบความแตกต่างของการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันระหว่างเนื้อเยื่อไตจากบุคคลที่เป็นโรค DKD(โรคไตจากเบาหวาน)และการควบคุมตามปกติ ประการที่สอง รายการของยีนที่แสดงออกถึงความแตกต่างที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน (DEGs) ได้รับการคัดเลือก โดยในจำนวนนี้ ยีนอันดับสูงสุด โปรตีนยึดเกาะของเซลล์หลอดเลือด 1 (VCAM1) ถูกระบุว่าเป็นยีนฮับภูมิคุ้มกันใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน). จากนั้น ได้ชุดยีนที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์รูปแบบต่างๆ จาก GeneCards และ pyroptosis ได้รับการประเมินว่าเป็นรูปแบบหลักของการตายของเซลล์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรผันของชุดยีน (GSVA) ​​และการวิเคราะห์การเสริมชุดยีน (GSEA) นอกจากนี้ การวิเคราะห์สหสัมพันธ์พบว่า VCAM1 มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันในหลอดอาหาร และการเกิดไพรอปโทซิส การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ VCAM1 ใน DKD tubulointerstitium ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมในกลุ่ม European Renal cDNA Bank (ERCB) และพบว่ามีความสัมพันธ์เชิงลบกับการทำงานของไตในผู้ป่วยที่มี DKD การศึกษาในหลอดทดลองได้ตรวจสอบการแสดงออกของ VCAM1 ที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ HK-2 ที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะที่เป็นเบาหวาน และการยับยั้ง pyroptosis โดยยา disulfiram ที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA ลดการแสดงออกของ VCAM1 การปลดปล่อยไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ และการเกิดพังผืด ดังนั้น pyroptosis แบบท่อและการแสดงออกของ VCAM1 ที่เพิ่มขึ้นอาจเป็นเป้าหมายสำหรับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันของ DKD

วิธีการ

ข้อมูลไมโครเรย์

ดาวน์โหลดชุดข้อมูลการแสดงออกของยีนมนุษย์ GSE30529 จาก National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO ฐานข้อมูล GSE30529 (GPL571 [HG U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array ) ประกอบด้วย 10 DKD(โรคไตจากเบาหวาน)ตัวอย่างหลอดและตัวอย่างควบคุม 12 ตัวอย่าง

การประมวลผลข้อมูล

ข้อมูลดิบในชุดข้อมูล GSE30529 ถูกดาวน์โหลดและประมวลผลโดยใช้แพ็คเกจ Limma และแพ็คเกจ Oligo ตามลำดับ [9,10] การประมวลผลข้อมูลรวมถึงการแก้ไขพื้นหลัง การทำให้เป็นมาตรฐาน และการคำนวณนิพจน์ เมื่อโพรบหลายตัวถูกแมปกับสัญลักษณ์ยีนหนึ่งตัว ระดับการแสดงออกโดยเฉลี่ยของโพรบจะถูกคำนวณและถือเป็นระดับการแสดงออกของยีนของยีนนั้น โพรบที่ไม่ได้แมปกับยีนถูกลบออก

Cistanche รักษาได้โรคไตจากเบาหวาน

การวิเคราะห์เซลล์ภูมิคุ้มกันและสโตรมอล

เราใช้วิธีการใหม่ที่ใช้ลายเซ็นของยีน xCell [8] เพื่อประเมินคะแนนการเพิ่มประสิทธิภาพของประเภทเซลล์และกำหนดโปรไฟล์ของการแทรกซึมเซลล์ภูมิคุ้มกันใน tubulointerstitium ของผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน). xCell เป็นวิธีการสำหรับการวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะประเภทเซลล์โดยใช้การวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะชุดยีนตัวอย่างเดียว (ssGSEA) ที่คำนวณคะแนนการเสริมสมรรถนะสำหรับเซลล์ 64 ชนิด รวมถึงเซลล์ภูมิคุ้มกัน 34 ชนิด เซลล์สตรอม 30 ชนิด และเซลล์อื่นๆ มีประสิทธิภาพเหนือกว่าอื่นๆ อย่างกว้างขวางในการวิเคราะห์ซิลิโก (รวมถึง CIBERSORT) โดยการครอบคลุมเซลล์ภูมิคุ้มกันประเภทต่างๆ มากขึ้น และใช้เทคนิคการชดเชยการล้นเกินเพื่อลดการพึ่งพากันระหว่างประเภทเซลล์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด เซลล์ภูมิคุ้มกัน 34 ชนิดถูกจัดประเภทเป็นเก้ากลุ่ม ซึ่งรวมถึง CD4 บวกประชากรย่อยของทีเซลล์, CD8 บวกประชากรย่อยของทีเซลล์, แกมมาเดลต้าทีเซลล์ (เซลล์ T δ), เซลล์ NK, เซลล์ NKT, ประชากรย่อยบีเซลล์, ประชากรย่อยโมโนไซต์/มาโครฟาจ ประชากรย่อยของเซลล์เดนไดรต์ (DC) และประชากรย่อยของแกรนูโลไซต์

การวิเคราะห์ชุดยีน (GSEA) และการวิเคราะห์ความแปรผันของชุดยีน (GSVA)

เราใช้ชุดยีนเครื่องหมายรับรองคุณภาพเป็นชุดยีนอ้างอิง เราทำการวิเคราะห์ความแปรผันของชุดยีน (GSVA) ​​ระหว่าง DKD(โรคไตจากเบาหวาน) and control tissues using the GSVA Bioconductor package [11]. The thresholds were set to enrichment score change > 1.0, p-value < 0.05 and t value >2. มีการระบุเส้นทางที่ถูกควบคุมและควบคุมลง GSEA ดำเนินการด้วยแอปพลิเคชันเดสก์ท็อป GSEA [12] และอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR)<0.25 and="" p-value=""><0.05 were="" set="" as="" the="">

การสร้างชุดยีนที่แสดงถึงรูปแบบต่างๆ ของการตายของเซลล์และการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะ

ชุดยีนที่แสดงถึงการตายของเซลล์รูปแบบต่างๆ ถูกสร้างขึ้นโดยการค้นหาคำหลัก 'pyroptosis', 'necrosis', 'necroptosis', 'apoptosis', 'ferroptosis' และ 'autophagy' ในฐานข้อมูล GeneCards (https://www.genecards) .org/) ยีนที่ไม่มีรหัสโปรตีนถูกกำจัดออก ชุดยีนแสดงอยู่ในตาราง S2 จากนั้น ทำชุดยีน GSEA โดยใช้แอปพลิเคชันเดสก์ท็อป GSEA เพื่อประเมินรูปแบบการตายของเซลล์ใน tubulointerstitium เราทำการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของ Pearson เพื่อสำรวจความสัมพันธ์ระหว่างเส้นทางการตายของเซลล์สำคัญกับการแทรกซึมเซลล์ภูมิคุ้มกันใน tubulointerstitium

การวิเคราะห์ DEG และการตรวจคัดกรองยีนฮับภูมิคุ้มกัน

DEG ระหว่างผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)และการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพถูกระบุโดยใช้แพ็คเกจ 'Limma' [13] ในซอฟต์แวร์ R ค่า P ที่ปรับแล้ว<0.05 and="" log="" fold="" change="" (fc)="" ≥="" 1="" were="" set="" as="" the="" thresholds.="" a="" list="" of="" 1793="" immune-related="" genes="" was="" down-loaded="" from="" immport="" shared="" data="" (https://www.="" immport.org/shared/genelists),="" and="" shared="" genes="" from="" the="" two="" datasets="" (degs="" and="" immunerelevant="" gene="" list)="" were="" determined="" by="" constructing="" a="" venn="" diagram="" to="" identify="" immune-related="" hub="" genes.="" an="" analysis="" of="" the="" functional="" interactions="" between="" proteins="" might="" provide="" insights="" into="" the="" mechanisms="" of="" dkd="">(โรคไตจากเบาหวาน). ในการศึกษานี้ เครือข่ายระหว่างโปรตีนกับโปรตีน (PPI) ของยีนที่ใช้ร่วมกันเก้าสิบสี่ตัวถูกสร้างขึ้นโดยใช้ฐานข้อมูล STRING (https://string-db.org/) และแสดงภาพด้วยซอฟต์แวร์ Cytoscape (เวอร์ชัน 3.7.1, http ://www.cytoscape.org/) คะแนนการโต้ตอบที่มากกว่า 0.4 (ความเชื่อมั่นปานกลาง) ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ CytoHubba ซึ่งเป็นปลั๊กอิน Cytoscape ถูกใช้เพื่อสำรวจยีนฮับเครือข่าย PPI [14] ในหมู่พวกเขา VCAM1 เป็นยีนอันดับต้น ๆ การวิเคราะห์การเพิ่มคุณค่าของยีนฮับภูมิคุ้มกันสามสิบยีนที่ระบุข้างต้นได้ดำเนินการโดยใช้เครื่องมือออนไลน์ Metascape [15] นอกจากนี้ โมดูลที่โดดเด่นในเครือข่าย PPI ยังถูกระบุโดยใช้ปลั๊กอิน MCODE (เวอร์ชัน 1.4.2, http://apps.cytoscape.org/apps/ MCODE) ในซอฟต์แวร์ Cytoscape

การตรวจสอบ VCAM1 และการวิเคราะห์สหสัมพันธ์กับการทำงานของไต

การแสดงออกที่แตกต่างกันของ VCAM1 ใน tubulointerstitium ของผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)ได้รับการตรวจสอบในกลุ่ม ERCB (กลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี 31 กลุ่มและผู้ป่วยโรค DKD 17 ราย) จากนั้น เราใช้ฐานข้อมูลออนไลน์ Nephroseq v5 (http://v5.nephroseq.org) ซึ่งเป็นแพลตฟอร์มการทำเหมืองข้อมูลแบบบูรณาการสำหรับชุดข้อมูลการแสดงออกของยีนของโรคไต เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ VCAM1 กับลักษณะทางคลินิกของผู้ป่วยที่มี DKD การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเพียร์สันใน ERCB ค่า p ของ<0.05 was="" considered="" statistically="">

การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์สำหรับ VCAM1

ส่วนของไตพาราฟินจากผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยทางพยาธิวิทยาด้วย DKD(โรคไตจากเบาหวาน)ถูกย้อมด้วย VCAM1 สิ่งนี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยของโรงพยาบาลแห่งแรกของมหาวิทยาลัยปักกิ่ง (NO. 20171280) การจับที่ไม่จำเพาะเจาะจงถูกขัดขวางด้วย BSA 3 เปอร์เซ็นต์หลังจากการตรึงและการให้ความร้อนสำหรับการดึงแอนติเจน จากนั้น ส่วนของไตถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต้าน VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:200) ค้างคืนที่ 4 องศา แอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก Cy3- ได้มาจาก Jackson ImmunoResearch เนื้อเยื่อไตที่อยู่ติดกันของเนื้องอกจากตัวอย่างการตัดไตถูกใช้เป็นตัวควบคุมปกติ ภาพตัวอย่างถ่ายโดยใช้กล้อง Leica DFC 7000 T ผ่านซอฟต์แวร์ Leica Application Suite V4.7.1

การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ไต 2 ของมนุษย์ (HK-2) ซึ่งเป็นเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของไตของมนุษย์ ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM (11885084, Gibco, USA) เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (10099141 C, Gibco, USA) และ penicillin/streptomycin 1 เปอร์เซ็นต์ (10378016, Gibco, USA) ที่ 37 องศาโดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ กลูโคสสูง (30 mM D-glucose, G8644, Sigma) [16] และ TNF (40 ng/ml, 300–01A, PeproTech) [17] ถูกใช้เพื่อทำให้เซลล์ HK-2 บาดเจ็บ ในหลอดทดลอง ไดซัลฟิรัม (DSL, 0.3 ไมโครโมลาร์ [18,19], NSC190940, Selleck), ตัวยับยั้งการสร้างรูพรุน, ถูกเติม 3 ชั่วโมงก่อนการเหนี่ยวนำของ HK-2 การบาดเจ็บของเซลล์

หยดตะวันตก

โปรตีนทั้งหมดถูกสกัดจากเซลล์ HK{0}} โดยใช้บัฟเฟอร์ RIPA (Sigma, R0278) และความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดหาโดยใช้ชุดทดสอบ Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, 23227) ต่อมา โปรตีนที่แปลงสภาพถูกแยกโดยโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ เจล อิเล็กโทรโฟรีซิส (SDS– PAGE) จากนั้นจึงถ่ายโอนทางไฟฟ้าไปยังเยื่อโพลีไวนิลลิดีน ไดฟลูออไรด์ (Millipore, IPVH00010) เยื่อเมมเบรนถูกปิดกั้นเป็นเวลา 60 นาทีโดยมีนมปราศจากไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ละลายในน้ำเกลือ Tris-buffered มี Tween 20 (TBST) 0.1 เปอร์เซ็นต์ บลต์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่เกี่ยวข้องต่อไปนี้ในชั่วข้ามคืนที่ 4 องศา : GSDMD (Abcam, ab209845, 1:1000), VCAM1 (Abcam, ab134047, 1:2000) และทูบูลิน (ZSBio, TA-10, 1 :5000). การฟักไข่ด้วยการเจือจาง 1:1000 ของแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบกับ HRP ถูกดำเนินการเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างห้าครั้งด้วย TBST เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยสารตั้งต้นเคมีลูมิเนสเซนซ์ (Millipore, WBKLS0100) เป็นเวลา 5 นาที และจับภาพโดยใช้ระบบ Image Quant LAS 4000 Mini (GE Healthcare) การวิเคราะห์เชิงกึ่งปริมาณดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)

การแยก RNA และการวิเคราะห์ RT–PCR

RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากเซลล์ HK-2 โดยใช้ RNAsimple Total RNA Kit (Tiangen, DP419) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตและแปลงกลับเป็น cDNA โดยใช้ FastKing RT Kit (Tiangen, KR116) PCR เชิงปริมาณดำเนินการโดยใช้ StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) ด้วยวิธีการสองขั้นตอน ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้แสดงไว้ในตาราง S4 การแสดงออกของยีนเปรียบเทียบคำนวณโดยใช้วิธี2−ΔΔCtตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 60 ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ และข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM มีการใช้ t-test ที่ไม่มีการจับคู่แบบสองด้านเพื่อเปรียบเทียบระหว่างสองกลุ่ม ความแตกต่างที่ระดับ P < 0.05="">

Cistanche รักษาได้โรคไตจากเบาหวาน

ผลลัพธ์

การสะสมหลักฐานได้เปิดเผยเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่าพยาธิวิทยาของ tubulointerstitial มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาและความก้าวหน้าของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน). วัตถุประสงค์ของการศึกษาคือเพื่ออธิบายลักษณะของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน)การแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันของ tubulointerstitial และเพื่อระบุยีนภูมิคุ้มกันและการอักเสบที่สำคัญบางอย่างเพื่อให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการเกิดโรคและการรักษา DKD ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบโปรไฟล์ของการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันของ tubulointerstitial และระบุ pyroptosis เป็นรูปแบบหลักของการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน)โดยใช้การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ VCAM1 ถูกระบุว่าเป็นยีนฮับที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่มีอันดับสูงสุดและมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับไพรอพโทซิสและเซลล์ภูมิคุ้มกันที่แทรกซึม นอกจากนี้ การแสดงออกของ VCAM1 ถูกตรวจสอบความถูกต้องเพื่อยกระดับในเซลล์ท่อไตที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะที่เป็นเบาหวาน ยา disulfiram ที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA ยับยั้ง pyroptosis ของเซลล์ท่อไตและลดการแสดงออกของ VCAM1 ระดับไซโตไคน์อักเสบและการเกิดพังผืดในหลอดทดลอง

1. เวิร์กโฟลว์การวิเคราะห์ชีวสารสนเทศ

ขั้นตอนหลักของเวิร์กโฟลว์แสดงไว้ในรูปที่ 1 ก่อนอื่นเราประเมินการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันในเนื้อเยื่อระหว่างเนื้อเยื่อท่อจากผู้ป่วย DKD(โรคไตจากเบาหวาน). จากนั้น pyroptosis ซึ่งเป็นรูปแบบหลักของการตายของเซลล์ใน tubulointerstitium ถูกค้นพบโดยใช้ GSEA และ GSVA ต่อไป เราคัดกรองรายการยีนที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันและระบุยีนฮับ การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ถูกดำเนินการระหว่างเซลล์ภูมิคุ้มกันที่ถูกแทรกซึม ไพรอพโทซิส และยีนฮับบนสุด VCAM1 นอกจากนี้ ได้ทำการตรวจสอบทางคลินิกและการตรวจสอบยืนยันภูมิคุ้มกันของ VCAM1 สุดท้าย เราได้ทำการศึกษาในหลอดทดลองเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบผลการวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศ

2. การวิเคราะห์การสลายตัวของเซลล์ภูมิคุ้มกันและสโตรมอล

เราใช้ xCell ซึ่งสร้างคะแนนการเพิ่มประสิทธิภาพของประเภทเซลล์โดยใช้ข้อมูลการแสดงออกของยีนจำนวนมาก เพื่อกำหนดประเภทเซลล์ที่อาจเกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อท่อนำไข่ในโรคไตจากเบาหวาน. คะแนนการเสริมสมรรถนะของเซลล์ 64 ชนิด ซึ่งรวมถึงเซลล์ภูมิคุ้มกัน 34 ชนิดและสโตรมอล 30 ชนิดและเซลล์อื่นๆ ได้รับมาสำหรับแต่ละตัวอย่าง (รูปที่ 2(a)) แผนที่ความร้อนของคะแนนการเสริมสร้างเซลล์ภูมิคุ้มกัน 34 คะแนนถูกแสดงให้เห็นเพื่อระบุภูมิทัศน์ภูมิคุ้มกันของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน)tubulointerstitium (รูปที่ 2(b)) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมปกติ คะแนนการเสริมสมรรถนะของทีเซลล์ส่วนใหญ่ค่อนข้างสูงในผู้ป่วยที่เป็นโรค DKD(โรคไตจากเบาหวาน)ยกเว้น CD4 บวก Tcm, Tregs, เซลล์ Th1, CD8 บวกกับ T ที่ไร้เดียงสา และเซลล์ NKT คะแนนการเสริมสมรรถนะของ aDC และ cDC สูงขึ้นในผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)มากกว่าในกลุ่มควบคุม ในขณะที่คะแนนการเพิ่มประสิทธิภาพของเซลล์ Pro-B ต่ำกว่าในผู้ป่วยที่มี DKD คะแนนการเสริมสมรรถนะของชุดย่อยมอนอไซต์/มาโครฟาจและแกรนูโลไซต์ส่วนใหญ่ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง DKD(โรคไตจากเบาหวาน)และเนื้อเยื่อปกติ ยกเว้นมาโครฟาจและนิวโทรฟิล M1 และอีโอซิโนฟิล (ตารางที่ 1)

รูปที่ 2 การวิเคราะห์การแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันโดย xCell ใน tubulointerstitium ของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน). (a) การเปรียบเทียบคะแนนเซลล์ 64 ชนิดของเซลล์ใน tubulointerstitium ระหว่าง DKD และเนื้อเยื่อไตควบคุมในชุดข้อมูล GSE30529 (b) ภูมิทัศน์ระดับเซลล์ของสภาพแวดล้อมจุลภาคภูมิคุ้มกันใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน). แผนที่ความร้อนแสดงคะแนนการเพิ่มประสิทธิภาพของประเภทเซลล์ของเซลล์ภูมิคุ้มกันแต่ละประเภทสำหรับตัวอย่างทั้งหมด DC, เซลล์เดนไดรต์; Tcm, เซลล์ T หน่วยความจำกลาง; Tem หน่วยความจำที่มีประสิทธิภาพ T เซลล์; ที δ เซลล์ แกมมา เดลต้า ที เซลล์

3. GSVA และ GSEA ของชุดยีนที่โดดเด่น

นำ GSVA และ GSEA ของยีนที่โดดเด่นในชุดข้อมูล GSE30529 เพื่อสำรวจกระบวนการทางชีววิทยาใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน)tubulointerstitium. 'การตอบสนองของ interferon-alpha', 'การตอบสนอง interferon-gamma' และ 'complement' การส่งสัญญาณได้รับการกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญในการเกิดโรคของการบาดเจ็บที่ท่อนำไข่ในผู้ป่วยที่มี DKD (รูปที่ 3 (a)) และสรุปผล GSVA ในตาราง S1 จากนั้น เราดำเนินการ GSEA ของชุดยีนสามชุด และพบว่าชุดข้อมูลเหล่านี้ได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นในทางบวก คะแนนการเสริมสมรรถนะที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (NESs) คือ 1.89, 1.89 และ 1.7{{10}} โดยมีค่า p ที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (ค่า NOM p) ของ 0.000, 0.002 และ 0.019, ตามลำดับ (รูปที่ 3(bd)) วิถีทางที่สมบูรณ์ที่มีนัยสำคัญทั้งหมดที่ระบุโดยใช้ GSEA แสดงไว้ในตารางที่ 2 ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ tubulointerstitial มีบทบาทสำคัญในการก่อโรคของ DKD(โรคไตจากเบาหวาน).

4. GSEA และ GSVA ของชุดยีนที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ในรูปแบบต่างๆ

การตายของเซลล์รวมถึง pyroptosis, necrosis, necroptosis, apoptosis, ferroptosis และ autophagy ซึ่งมีกลไกทางพยาธิสรีรวิทยาและเส้นทางการส่งสัญญาณที่แตกต่างกัน มีรายงานว่าการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้หลายรูปแบบเกี่ยวข้องกับการตอบสนองการอักเสบและภูมิคุ้มกัน เราสร้างชุดยีนของการตายของเซลล์หลายประเภทจาก GeneCards (ตารางที่ S2) จากนั้นจึงทำทั้ง GSEA และ GSVA เพื่อสำรวจการมีส่วนร่วมของการตายของเซลล์ในการอักเสบของ tubulointerstitial ในผู้ป่วย DKD(โรคไตจากเบาหวาน). GSEA แสดงให้เห็นว่ามีเพียงชุดยีน pyroptosis เท่านั้นที่ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)เปรียบเทียบกับการควบคุมปกติ (NES=1.65, ค่า FDR q=0.023, FWER=0.013) (รูปที่ 3(e)) ในขณะเดียวกัน คะแนน GSVA สำหรับ pyroptosis นั้นสูงที่สุดในบรรดาประเภทต่าง ๆ ของการตายของเซลล์ที่วิเคราะห์ (ตารางที่ S3) จากผลลัพธ์นี้ pyroptosis อาจมีบทบาทในการเกิดโรคของการบาดเจ็บที่ท่อนำไข่ในผู้ป่วยที่เป็นโรค DKD(โรคไตจากเบาหวาน).

รูปที่ 3 การวิเคราะห์ชุดยีน (GSEA) และการวิเคราะห์รูปแบบชุดยีน (GSVA) (a) Barplot ของผลลัพธ์ GSVA ของชุดยีนที่โดดเด่น 50 ชุด (b)-(d) ผลลัพธ์ GSEA ของ 'Hallmark_ การตอบสนอง interferon-alpha', 'Hallmark_ การตอบสนองของ interferon-gamma' และ 'Hallmark complement' (จ) ผลลัพธ์ GSEA ของไพรอปโทซิส

5. ความสัมพันธ์ระหว่างคะแนนการเสริมสร้างไพรอพโทซิสกับการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกัน

คะแนนการเสริมสมรรถนะ GSVA สำหรับ pyroptosis มีความสัมพันธ์กับสัดส่วนของการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันโดยทำการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของ Pearson เพื่อประเมินความสัมพันธ์ระหว่าง pyroptosis และการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกัน เราสังเกตความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างเซลล์ภูมิคุ้มกัน 15 ชนิดกับไพรอปโทซิส (รูปที่ 4) ซึ่งบ่งชี้ถึงปฏิสัมพันธ์ที่ใกล้ชิดระหว่างเซลล์ภูมิคุ้มกันกับไพรอปโทซิส

6. การค้นพบยีนหลัก

วิเคราะห์การแสดงออกเชิงอนุพันธ์เพื่อสำรวจความสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ท่อไตและเซลล์ภูมิคุ้มกันคั่นระหว่างหน้าเพิ่มเติม สี่ร้อยแปด DEG ถูกระบุระหว่าง DKD(โรคไตจากเบาหวาน)กลุ่มและกลุ่มควบคุม ซึ่ง 65 ถูกปรับลดลงและ 343 ควบคุมเพิ่มขึ้น (รูปที่ 5) ดาวน์โหลดรายการยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันเพื่อระบุ DEG ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน และยีนภูมิคุ้มกันของฮับเก้าสิบสี่ตัวได้มาจากชุดข้อมูลสองชุด (DEG และรายการยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน) ผ่านแผนภาพเวนน์ (รูปที่ 6 (a)) การวิเคราะห์ PPI ของยีนภูมิคุ้มกันของฮับเก้าสิบสี่เหล่านี้เปิดเผย 97 โหนดและ 694 อันตรกิริยา (รูปที่ S1) โหนด 30 อันดับแรกที่คำนวณโดยอัลกอริทึม MCC ถูกระบุว่าเป็นยีนของฮับ (รูปที่ 6 (b) และตารางที่ 3) จากนั้นทำการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะของยีนฮับ 'การปฏิเสธ Allograft', 'การตอบสนองระหว่าง interferon-gamma', 'การตอบสนองต่อการอักเสบ', 'การตอบสนองต่อ interferon-alpha', 'การเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว - mesenchymal' และ 'ส่วนประกอบ' เป็นรายการที่มีคุณค่ามากที่สุดในการวิเคราะห์ลักษณะเด่น 'โรคข้ออักเสบรูมาตอยด์', 'ปฏิสัมพันธ์ของตัวรับไซโตไคน์', 'เส้นทางการส่งสัญญาณเหมือนตัวรับค่าผ่านทาง', 'ไอกรน' และ 'เส้นทางการส่งสัญญาณ NF-kappa B' เป็นคำศัพท์ KEGG ที่สมบูรณ์ที่สุด 'การตอบสนองของเซลล์อินเตอร์เฟอรอนแกมมา', 'กิจกรรมของคีโมไคน์', 'การยึดเกาะของเซลล์เม็ดเลือดขาว' และ 'การควบคุมการผลิตไซโตไคน์' เป็นเงื่อนไข GO ที่สมบูรณ์ที่สุด (รูปที่ 6 (c)) นอกจากนี้ ระบบการให้คะแนน MCODE ยังระบุกลุ่มสองกลุ่มที่มีคะแนนมากกว่าหรือเท่ากับ 5 PTRPC, TRIM22, PSMB8, KNG1 และ CXCL6 เป็นโหนดฮับที่มีระดับโหนดสูงกว่าในโมดูล 1 (รูปที่ 6 (d)) และ CD1C EGF, FCER1G, CD3D และ CD48 เป็นโหนดฮับในโมดูล 2 (รูปที่ 6(e))

7. ความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ VCAM1 กับการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกัน

ในบรรดายีนฮับที่ระบุ ยีนอันดับต้น ๆ คือ VCAM1 ถูกระบุว่าเป็นยีนฮับภูมิคุ้มกันใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน). การแสดงออกของ VCAM1 เพิ่มขึ้นอย่างมากในผู้ป่วย DKD(โรคไตจากเบาหวาน)(รูปที่ 7 (ก)). การวิเคราะห์สหสัมพันธ์เปิดเผยว่าการแสดงออกของ VCAM1 มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับ CD4 บวก T เซลล์ (r=0.6877, P=00{004), CD4 บวกเซลล์หน่วยความจำ T (r=0.7102, P=0.0002), เซลล์ Th2 (r=0.7358, P <0.0001), cd8="" บวก="" tcm="" (r="" {{18="" }}.6026,="" p="0.0030)," เซลล์="" t="" δ="" (r="0.5864," p="0.0041)," เซลล์="" nk="" (r="0.5692," p="0.0057)," มาโครฟาจ="" (r="0.5068," p="0.0161)," m1="" มาโครฟาจ="" (r="0.4441," p="0" .0384),="" adcs="" (r="0.4814," p="0.0233)" และ="" cdcs="" (r="0.6562," p="0.0009)" แต่มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความไร้เดียงสา="" cd8="" บวก="" t="" เซลล์="" (r="−0.4909," p="0.0204)" และเซลล์="" nkt="" (r="−0.5548," p="0.0074)" (รูปที่="" 7(b="">

8. ความสัมพันธ์ระหว่างการแสดงออกของ VCAM1 และ pyroptosis

การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเพียร์สันได้ดำเนินการเพื่อสำรวจว่าการแสดงออกของ VCAM1 ที่เพิ่มขึ้นใน tubulointerstitium ของผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)เกี่ยวข้องกับไพรอปโทซิส การแสดงออกของ VCAM1 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับไพรอพโทซิส (r=0.6118, P=0.0025) (รูปที่ 7(c)) ซึ่งบ่งชี้ว่าไพรอพโทซิสอาจกระตุ้นการแสดงออกของ VCAM1

9. การตรวจสอบ ความเกี่ยวข้องทางคลินิก และการตรวจสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ของการแสดงออกของ VCAM1

เราทำการวิเคราะห์ที่เกี่ยวข้องของผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)จาก ERCB เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในนิพจน์ VCAM1 ใน DKD(โรคไตจากเบาหวาน)tubulointerstitium. อย่างต่อเนื่อง ระดับ VCAM1 mRNA สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน)(รูปที่ 8(ก)). การแสดงออกของ VCAM1 มีความสัมพันธ์เชิงลบกับอัตราการกรองไต (GFR) (r=−0.5920, P=0.0123) (รูปที่ 8(b)) และมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับซีรัม ระดับครีเอตินีน (r=0.5189, P=0.0328) (รูปที่ 8(c)) นอกจากนี้ เรายังทำการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์สำหรับ VCAM1 ในเนื้อเยื่อไตของผู้ป่วยโรค DKD(โรคไตจากเบาหวาน)และพบว่าการแสดงออกของ VCAM1 ของท่อไตถูกควบคุมอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับในไตปกติ (รูปที่ 8(d))

10. DSL ยับยั้งการไพรอปโทซิสของเซลล์ HK-2 ที่เกิดจาก HG การแสดงออกของ VCAM1 และการอักเสบ

เราเปิดโปงเซลล์ HK-2 ที่เพาะเลี้ยงให้มีระดับกลูโคสสูง (HG) และ TNF- เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่างไพรอปโทซิสของเซลล์ในท่อ การแสดงออกของ VCAM1 และการตอบสนองภูมิคุ้มกันของ tubulointerstitial ในบุคคลที่มี DKD(โรคไตจากเบาหวาน). เนื่องจากแกนกลางของไพรอปโทซิสในเซลล์คือการสร้างรูพรุนของเมมเบรนที่เกิดจาก GSDMD แบบแยก เราจึงตรวจพบระดับของโดเมนปลายทาง N GSDMD (GSDMD-NT) และ VCAM1 โดยใช้ western blotting ทั้ง HG และ TNF กระตุ้นให้ระดับ GSDMD-NT เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ถึงการเกิดไพรอพโทซิสที่อาศัย GSDMD (รูปที่ 9(a)) การแสดงออกของ VCAM1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในกลุ่ม HG และ TNF (รูปที่ 9(b)) Disulfiram (DSL) เป็นตัวยับยั้งการก่อตัวของรูขุมขน GSDMD [18] การปรับสภาพด้วย DSL ช่วยลดระดับ GSDMD-NT ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ pyroptosis ถูกระงับ ในขณะเดียวกัน การแสดงออกของ VCAM1 ลดลงในกลุ่ม HG และ TNF ที่ปรับสภาพด้วย DSL (รูปที่ 9(ab)) ต่อมา โพรไฟล์ของไซโทไคน์ที่มีการอักเสบถูกกำหนดหาโดยใช้ qPCR ผลการศึกษาพบว่าระดับที่เพิ่มขึ้นของ MCP-1, IL-1 และ IL-18 mRNAs ที่เหนี่ยวนำโดย HG ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการปรับสภาพด้วย DSL ในกลุ่ม TNF- ระดับของ IL-1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มที่เตรียมด้วย DSL และระดับของ MCP-1 และ IL-18 ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญในระดับของ IL-6 และ IL-8 mRNAs ในกลุ่มใดๆ อย่างสำคัญ ระดับ mRNA ของ TGF- 1 ยังลดลงในกลุ่มที่บำบัดด้วย DSL ดังนั้น เซลล์ท่อไพโรโทติกเพิ่มการแสดงออกของ VCAM1 ภายใต้สภาวะที่เป็นเบาหวาน และการรักษาที่ยกเลิกไพรอปโทซิสยับยั้งการแสดงออก การอักเสบ และการเกิดพังผืดของ VCAM1 ในเซลล์ HK-2

Cistanche รักษาได้โรคไตจากเบาหวาน

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่II

จาก: 'การระบุและการตรวจสอบโปรตีนยึดเกาะของเซลล์หลอดเลือด 1 เป็นยีนศูนย์กลางที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับการบาดเจ็บที่เนื้อเยื่อท่อไตในโรคไตจากเบาหวาน' โดย Yan Jia, et al

---วิศวกรรมชีวภาพ 2021 ฉบับที่ 12 เลขที่ 1, 6655–6673