TUNEL Assay: เครื่องมืออันทรงพลังสำหรับการประเมินอาการบาดเจ็บที่ไต

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

เชิงนามธรรม:การทดสอบ Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) เป็นการทดสอบที่มีมายาวนานซึ่งใช้ในการตรวจหาการกระจายตัวของ DNA ที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ (3'-OH DNA termini) โดย endonucleases เนื่องจากเอนไซม์เหล่านี้ทำงานเฉพาะในไต TUNEL จึงถูกใช้อย่างกว้างขวางเพื่อระบุและหาปริมาณการกระจายตัวของ DNA และการตายของเซลล์ในการเพาะเลี้ยงไต เซลล์และสัตว์และไตของมนุษย์ที่เกิดจากการบาดเจ็บที่เป็นพิษหรือขาดออกซิเจน. การระบุลักษณะเฉพาะเบื้องต้นของ TUNEL ในฐานะการทดสอบอะพอพโทติกได้นำไปสู่การตีความผิดๆ มากมายเกี่ยวกับกลไกของเซลล์ไต บาดเจ็บ.อย่างไรก็ตาม TUNEL กำลังเป็นที่นิยมมากขึ้นสำหรับไตบาดเจ็บการประเมินเพราะสามารถใช้ได้อย่างทั่วถึงในเซลล์เพาะเลี้ยงและเนื้อเยื่อ และสำหรับกลไกการตายของเซลล์ทั้งหมด นอกจากนี้ มันมีความละเอียดอ่อน แม่นยำ เชิงปริมาณ เชื่อมโยงกับเซลล์หรือช่องเนื้อเยื่อเฉพาะอย่างง่ายดาย และสามารถรวมเข้ากับอิมมูโนฮิสโตเคมีเพื่อให้การระบุชนิดเซลล์ที่เชื่อถือได้หรือกลไกที่น่าจะเป็นของการตายของเซลล์ ตามเนื้อผ้า การวิเคราะห์ TUNEL ถูกจำกัดให้มีหรือไม่มีสัญญาณ TUNEL อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกการตายของเซลล์สามารถหาได้จากการวิเคราะห์รูปแบบ TUNEL

การรักษาโรคไตที่เร้าอารมณ์ทางเพศด้วยอาหารเสริม cistanche

บทนำ DNA เป็นโมเลกุลเดียวในเซลล์ที่สามารถซ่อมแซมได้ แต่จะไม่สามารถสังเคราะห์ใหม่ได้อย่างสมบูรณ์หลังจากความเสียหาย การทำลายดีเอ็นเอเป็นหนึ่งในขั้นตอนสุดท้ายของกระบวนการการตายของเซลล์แบบหลายขั้นตอน ซึ่งอาจย้อนกลับได้จนถึงจุดสิ้นสุดของการแยกตัวของดีเอ็นเอ ดังนั้น สิ่งหลังจึงเป็นคุณลักษณะทั่วไปและเครื่องหมายทางกลไกของการตายของเซลล์ที่ไม่สามารถย้อนกลับได้ [1,2] การกระจายตัวของ DNA ที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์มักจะ "มองเห็นได้" โดยการทดสอบการติดฉลาก dUTP nick-end labeling (TUNEL) ของเทอร์มินัล deoxynucleotidyl transferase dUTP, DNA Ladering หรือการทดสอบดาวหาง [3] อิเล็กโตรโฟรีซิสของสนามพัลส์ [4] และการทดสอบการสังเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์-ไพรเมอร์แบบสุ่ม (ROPS) แบบสุ่ม [5] เป็นการสอบวิเคราะห์รองอีกสองแบบที่ไม่ค่อยได้ใช้ การใช้การทดสอบดาวหางจำกัดเฉพาะในหลอดทดลอง (เซลล์เพาะเลี้ยง) เท่านั้น และการหาปริมาณนั้นใช้แรงงานมาก [6] การทดสอบดาวหางในนิวเคลียสของเซลล์ที่แยกได้นั้นเป็นไปได้ แต่สัมพันธ์กับปัจจัยรบกวนเพิ่มเติมในระหว่างการแยกนิวเคลียส วิธีที่สอง การทดสอบขั้นบันไดของ DNA ไม่ใช่วิธีการเชิงปริมาณ และความหวังเริ่มแรกว่ารูปแบบแลดเดอร์กับสเมียร์จะแยกแยะระหว่างอะพอพโทซิสและเนื้อร้ายตามลำดับ ถูกกำจัดออกไปเนื่องจากวิธีการนี้พิสูจน์แล้วว่าไม่น่าเชื่อถือ [7] จากสามวิธีหลัก TUNEL เป็นวิธีที่ละเอียดอ่อนที่สุด ใช้เวลาน้อยที่สุด และใช้ได้ในระดับสากลมากที่สุด สามารถใช้ในเซลล์และเนื้อเยื่อที่เพาะเลี้ยง และสำหรับกลไกการตายของเซลล์ทั้งหมด มีความแม่นยำ เชิงปริมาณ เชื่อมโยงกับเซลล์หรือช่องเนื้อเยื่อเฉพาะอย่างง่ายดาย และสามารถใช้ร่วมกับอิมมูโนฮิสโตเคมีเพื่อให้ระบุประเภทเซลล์หรือกลไกของการบาดเจ็บของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณบวกของ TUNEL ได้อย่างน่าเชื่อถือ [2]

การแบ่ง DNA ที่วัดได้โดย TUNEL นั้นส่วนใหญ่ผลิตโดยเอนโดนิวคลีเอส apoptotic เอ็นโดนิวคลีเอสที่ออกฤทธิ์มากที่สุดในไตคือดีออกซีไรโบนิวคลีเอส 1 (DNase I) และเอ็นโดนิวคลีเอส G (EndoG) [8–10] DNase I เป็นเอ็นโดนิวคลีเอส apoptotic ที่กระฉับกระเฉงและมีมากที่สุดในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [11] ไต ต่อมน้ำลาย ตับอ่อน และลำไส้เป็นอวัยวะที่ทราบว่าผลิต DNase I ในปริมาณสูง เซลล์เยื่อบุผิวในต่อมน้ำลาย ตับอ่อน และลำไส้หลั่ง DNase I เป็นเอนไซม์ย่อยอาหารในทางเดินอาหาร DNase เซลล์บางตัวต่อสู้กับ DNA "ต่างประเทศ" ที่บุกรุกเซลล์เจ้าบ้าน [12] DNase I ที่ไม่หลั่งออกมาทำให้เกิดอันตรายที่ซ่อนอยู่ต่อ DNA ของเซลล์เจ้าบ้าน แต่โดยปกติ DNase จะไม่ทำปฏิกิริยากับ DNA ของเซลล์เจ้าบ้านจนกว่าจะได้รับบาดเจ็บหรือการตายของเซลล์ ในไต DNase I ถูกหลั่งโดยเซลล์เยื่อบุผิวท่อ สันนิษฐานว่าจะทำลายไวรัสและแบคทีเรียในปัสสาวะ หน้าที่นี้น่าจะเกิดขึ้นร่วมกับโปรตีเอส โดยเฉพาะเมปริน ซึ่งเป็นโปรตีเอสหลักในปัสสาวะ [13] แม้ว่าจะสามารถป้องกันการติดเชื้อได้ แต่การมี DNase ที่มีฤทธิ์สูงในไตทำให้อวัยวะนี้เสี่ยงต่อการบาดเจ็บ ซึ่งทราบว่ากิจกรรมของ DNase เป็นพิษต่อเซลล์ของโฮสต์ DNases ส่งเสริมการตายของเซลล์ที่เกิดจากสิ่งเร้าที่เป็นพิษหรือขาดออกซิเจน และทำลายเซลล์ DNA ของไตโฮสต์ทั้งหมดที่ปล่อยออกมาอันเป็นผลมาจากการตายของเซลล์

ไตเป็นการกรองอวัยวะที่ขจัดสารพิษออกจากร่างกาย กิจกรรม DNase I สูงในไตทำให้เซลล์ไตไวต่อการบาดเจ็บจากสารพิษและผลิตภัณฑ์เมตาบอลิซึม ทำให้ TUNEL เป็นวิธีการที่เหมาะสมและเหมาะสมที่สุดในการวัดการบาดเจ็บที่ไต ในการทบทวนนี้ เราจะเน้นที่ TUNEL ว่าเป็นการทดสอบที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ให้ข้อมูล และแม่นยำสำหรับการวัดการตายของเซลล์และการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อในไต เราจะหารือเกี่ยวกับแง่มุมต่าง ๆ ของ TUNEL ตามที่ใช้กับโรคไตและการบาดเจ็บ และระบุคุณภาพ เทคนิค และคุณลักษณะที่ไม่ได้ใช้ของ TUNEL เพื่อส่งเสริมการใช้การทดสอบอันทรงพลังนี้ให้เกิดประสิทธิผลและเหมาะสมในการวิจัย การวินิจฉัย และการรักษาโรคไต นอกจากนี้เรายังจะหารือเกี่ยวกับรูปแบบภาพ TUNEL ต่างๆ ที่สามารถเชื่อมโยงกับกลไกการตายของเซลล์ ประเด็นที่ยกมาในการทบทวนนี้ใช้ได้กับการใช้ TUNEL ในอวัยวะอื่นที่ไม่ใช่ไตอย่างกว้างขวาง

คำสำคัญ:อุโมงค์; การตายของเซลล์ ไต; ดีเอ็นเอส; เอ็นโดนิวคลีเอส; การบาดเจ็บของเนื้อเยื่อ

หลักการของ TUNELการทดสอบ TUNEL ได้รับการพัฒนาในปี 1992 โดย Gorczyca et al [14] และ Gavreli et al. [15] โดยใช้การติดฉลาก fluorochrome และ avidin-peroxidase ตามลำดับ ในเวลานั้น มีความจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องใช้วิธีใหม่ในการประเมินการตายของเซลล์ และ TUNEL ก็เติมเต็มช่องว่างนี้ได้สำเร็จ เริ่มแรกวางตลาดเพื่อใช้เป็นชุดทดสอบสำหรับการแตกของสาย DNA ระหว่างหรือเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ [14,16] หากไม่มีการทดสอบที่ดีกว่า TUNEL ก็กลายเป็นชุดทดสอบมาตรฐานสำหรับการตายของเซลล์อย่างรวดเร็ว [17,18] อย่างไรก็ตาม นักวิจัยรับรู้เกือบจะในทันทีว่า TUNEL ตรวจวัดการกระจายตัวของ DNA อย่างไม่เจาะจง ไม่ใช่แค่สิ่งที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ [19–21] อย่างไรก็ตาม ความจำเป็นในการตรวจอะพอพโทซิสนั้นยิ่งใหญ่มากจนโดยทั่วไปแล้วมักละเลยรายงานที่หายากของ TUNEL ที่ไม่เฉพาะเจาะจงสำหรับการตายของเซลล์ สิ่งนี้นำไปสู่รายงานที่เป็นเท็จในเชิงบวกจำนวนมากเกี่ยวกับการตายของเซลล์ในไตและอวัยวะอื่น ๆ จนถึงระดับที่รายงานถึง 20 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ทั้งหมดเป็น apoptotic แม้จะไม่มีการบาดเจ็บ [22–25] เมื่อมีการเปลี่ยนแปลงตาม ขนาดเล็กเพียง 0.01 เปอร์เซ็นต์อาจเป็นหลักฐานที่มีนัยสำคัญทางสถิติของการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อ

การทดสอบ TUNEL ประสบกับการฟื้นฟูในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมานับตั้งแต่สิ้นสุดการศึกษาการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสเมื่อไม่กี่ปีที่ผ่านมา การค้นหาบทความในวารสาร PubMed ของเราที่เกี่ยวข้องกับคำศัพท์ "ไต" และ "TUNEL" ให้ผลลัพธ์มากกว่า 1,500 ผลลัพธ์ตั้งแต่ปี 1992 ถึง 2020 ในปี 2019 มีการเผยแพร่บทความ 170 บทความซึ่งเป็นจำนวนสูงสุดในหนึ่งปีในช่วง 28 ปีที่ผ่านมา (รูปที่ S1) และที่ เป็นบทความส่วนใหญ่ที่สำรวจสำหรับการทบทวนนี้ การศึกษาจำนวนมากใช้ TUNEL-positivity เป็นการวัดระดับสากลของการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการกระจายตัวของ DNA ในการตายของเซลล์ประเภทอื่นนอกเหนือจากการตายของเซลล์ ตัวอย่างเช่น เฟอร์รอปโตซิส ซึ่งเป็นรูปแบบใหม่ที่ค้นพบของการตายของเซลล์แบบตั้งโปรแกรมและไม่ใช่อะพอพโทซิสที่ถูกกระตุ้นโดยความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดขึ้นระหว่างภาวะไตขาดเลือด-การกลับเป็นซ้ำ (IR) ในหนูทดลอง สามารถตรวจพบได้โดย TUNEL [26] ไพรอพโทซิสซึ่งเป็นรูปแบบการอักเสบของการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ซึ่งแตกต่างจากการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซิสและเนื้อร้าย แสดงให้เห็นว่ามีความเกี่ยวข้องกับสัญญาณบวกของ TUNEL [27,28] TUNEL-positive ถูกสังเกตในระหว่าง necroptosis ซึ่งมีส่วนทำให้เซลล์ท่อไตเสื่อมลงอย่างก้าวหน้าในหนูที่ได้รับการผ่าตัดไตโดยรวม [29] ในไตและเนื้อเยื่ออื่น ๆ พบสัญญาณ TUNEL เชิงบวกในเนื้อร้าย [30,31] autophagy ผิดปกติ [32–35], anoikis [36,37], mitotic catastrophe [35,38], autolysis [39], Pautolysis [39], proptosis [40] และ aponeurosis [30] แสดงให้เห็นว่า TUNEL เป็นการทดสอบที่เป็นสากลอย่างแท้จริงสำหรับการตายของเซลล์ที่ไม่สามารถย้อนกลับได้

การทดสอบ TUNEL อิงจากการติดฉลากของ 3'OH ที่สิ้นสุดโดยเอ็นไซม์ DNA จำเพาะ 3'OH, เทอร์มินอลดีออกซีนิวคลีโอทิดิลทรานส์เฟอเรส (TdT) (รูปที่) การใช้ DNA polymerase หรือ Klenow fragment DNA polymerase แทน TdT อาจช่วยกำหนดประเภทของปลาย 3'OH (ชื่อเล่น ช่องว่าง หรือโอลิโกที่ยื่นออกมา) เนื่องจาก DNA polymerase จำเป็นต้องมีแม่แบบ (สาย DNA ตรงข้าม) จึงจะไม่ติดฉลาก ปลาย DNA ที่ห้อยหรือยื่นออกมา สิ่งสำคัญคือต้องจำไว้ว่าการผลิตปลาย DNA ของ 3ZOH นั้นไม่ได้เกิดขึ้นเฉพาะกับเอนโดนิวคลีเอส apoptotic (DNA-degrading) ปลาย DNA 3'OH เป็นสัญญาณ "ตัวสื่อสาร" ที่สำคัญ ซึ่งเป็นตัวหารร่วมของเอ็นไซม์ DNA ส่วนใหญ่ พวกมันถูกผลิตและใช้งานโดยเอ็นไซม์ DNA เกือบทั้งหมดในยูคาริโอต รวมถึงเอ็นโดนิวคลีเอสการซ่อมแซม (apurinic/apyrimidinic, AP) ของ DNA, exonucleases, DNA polymerase, DNA ligases, DNA transferases และ topoisomerases นอกจากนี้ 3'Id 3z-sugar หรือ 3z-protein conjugates สามารถแปลงเป็น 3'OH termini โดย phosphatases, glycosylases และ proteinases ตามลำดับ นี่คือเหตุผลที่ความเข้าใจอย่างแม่นยำถึงสิ่งที่กำลังวัดจึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการนำ TUNEL ไปใช้งานที่ประสบความสำเร็จและการตีความผลลัพธ์

เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการพื้นฐานอื่นๆ สองวิธีในการวัดการกระจายตัวของดีเอ็นเอ แลดเดอร์ดีเอ็นเอ และการวิเคราะห์ดาวหาง TUNEL มีข้อได้เปรียบตรงที่การจำแนกดีเอ็นเอเทอร์มินีมากกว่าการแยกส่วน (รูปที่ 2) ตามทฤษฎีแล้ว TUNEL shocld มีความไวและเป็นเส้นตรงมากกว่าสำหรับการระบุการกระจายตัวของ DNA เริ่มต้น (ต่ำ) มากกว่าบันไดหรือดาวหาง DNA ซึ่งทั้งสองอย่างนี้มีช่วงเวลาล่าช้าในการสะสมของชิ้นส่วนขนาดเล็กที่มีความคล่องตัวสูง ไม่ว่าในกรณีใด การศึกษาที่รวม TUNEL กับดาวหางอย่างใดอย่างหนึ่ง )41,42] หรือบันไดดีเอ็นเอ [43,44] มีข้อได้เปรียบบางประการในการจับการกระจายตัวของดีเอ็นเอในระยะเริ่มต้นด้วยความไวสูงสุด

แอปพลิเคชั่น TUNELTUNEL ใช้เพื่อระบุและวัดปริมาณการบาดเจ็บของไตในการศึกษาทางพิษวิทยาทางคลินิกและขั้นพื้นฐานในการใช้งานที่หลากหลาย รวมถึงการรักษาพยาบาล [45] สิ่งแวดล้อม [46] การเกษตร [41] และอุตสาหกรรม [47] ความเสี่ยง และสัตว์ [48 ] และวิทยาศาสตร์การอาหาร [49]. TUNEL ใช้ได้กับเซลล์ทุกประเภท อวัยวะ และสปีชีส์ที่มี DNA และ DNases ซึ่งรวมถึงแทบทุกสปีชีส์ TUNEL ถูกใช้เพื่อระบุและวัดปริมาณการบาดเจ็บของไตในสัตว์หลายชนิด เช่น ปลาม้าลาย [50] ปลาข้าวญี่ปุ่น [51] ไก่ [48] หนูเจอร์บิล [52] หนู [41] หนู [45], แรบบิทของมัน [53] หมูจิ๋ว [54] และมนุษย์ [55] ข้อได้เปรียบที่สำคัญของ TUNEL คือสามารถใช้ในเซลล์ที่เพาะเลี้ยงแบบตายตัวและเนื้อเยื่อตายตัว สิ่งนี้ให้ความสอดคล้องของระเบียบวิธีในการเปรียบเทียบระหว่าง ผล ในหลอดทดลอง และ ในร่างกาย ในการศึกษาที่กลไกสามารถตรวจสอบได้ในเซลล์ไตที่เพาะเลี้ยง ในขณะที่การประเมินผลกระทบจากร่างกายในไตของสัตว์ สิ่งใดก็ตามที่อยู่ในระหว่างเซลล์ทั้งหมดและเนื้อเยื่อก็สามารถใช้ได้เช่นกัน รวมถึงเซลล์ทรงกลมที่เพาะเลี้ยง [56] และชิ้นไตภายนอกร่างกาย [57,58]

ความเข้มของ TUNEL ในแง่ของความแรงของสัญญาณหรือจำนวนเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL อาจแตกต่างกันระหว่างสปีชีส์ขึ้นอยู่กับกิจกรรมของ DNases จากประสบการณ์ของเรา ไตของหนูมี DNase I ที่แอคทีฟมากกว่าไตของหนู และความแรงของสัญญาณที่เป็นบวกของ TUNEL มีความสัมพันธ์กับสิ่งนี้ เมื่อเปรียบเทียบไตกับอวัยวะอื่น สัญญาณ TUNEL-positive จะรุนแรงมากและคล้ายกับอวัยวะอื่นๆ ที่มีกิจกรรม DNase I สูง เช่น ลำไส้และต่อมน้ำลาย ในอีกด้านของสเปกตรัม ความแรงของสัญญาณที่เป็นบวก TUNEL ต่ำสุดจะสังเกตเห็นได้ในสมองและเซลล์เนื้องอก/มะเร็ง โดยที่การแสดงออกของ DNase I มักจะถูกปิดใช้งานโดยการประกบทางเลือกในบริเวณการเข้ารหัส [59] สัญญาณบวกของ TUNEL พบได้ในเซลล์ทุกประเภทในไต โดยเฉลี่ย เยื่อบุผิวท่อได้รับความเสียหายมากกว่าโกลเมอรูไล โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการบาดเจ็บเฉียบพลัน (รูปที่ 3A) สิ่งนี้สัมพันธ์กันดีกับกิจกรรม DNase I ที่มีอยู่ในเซลล์ประเภทนี้ เมื่อพิจารณาจากความแตกต่างทางเพศและอายุที่สังเกตได้ในการทดลองของเรา DNase I มีความอุดมสมบูรณ์และกระฉับกระเฉงในเพศชายมากกว่าเพศหญิงและสัตว์วัยกลางคนเมื่อเทียบกับสัตว์อายุมากหรือทารกแรกเกิด อย่างไรก็ตาม ไม่มีความแตกต่างที่ชัดเจนในความเป็นบวกของ TUNEL ที่สัมพันธ์กับเพศหรืออายุ อาจเป็นเพราะปัจจัยอื่นที่โดดเด่นหรือมีอิทธิพลเหนือกว่า ในบางแบบจำลองไต (เช่น ischemia-reperfusion) DNase I จะถูกเหนี่ยวนำ [9]; ในขณะที่ยาอื่นๆ ไม่ได้ผลและอาจถูกระงับได้ (เช่น ในความเป็นพิษของซิสพลาติน) [10] การกระตุ้นเอ็นโดนิวคลีเอส หากมี แสดงว่าเกิดขึ้นภายใน 24 ชั่วโมงแรกหลังจากได้รับบาดเจ็บที่ไต [9,60,61] ดังนั้นจึงไม่น่าแปลกใจที่การใช้ TUNEL อย่างน้อยครึ่งหนึ่งในการวิจัยเกี่ยวกับไตในการทบทวนนี้ถูกใช้สำหรับการบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน (AKI) เนื่องจากการประเมิน AKI มักจะเกิดขึ้นภายใน 24 ถึง 72 ชั่วโมงหลังจากได้รับบาดเจ็บเมื่อเอนโดนิวคลีเอสมีการเคลื่อนไหวมากที่สุด . รายการการศึกษา AKI มีความยาวและรวมถึงการบาดเจ็บที่เป็นพิษ บำบัดน้ำเสีย การปลูกถ่าย และการบาดเจ็บจากการขาดออกซิเจน ในงานนี้ เราสำรวจแบบจำลอง ประเภทการสัมผัส การรักษา ระยะเวลาการประเมิน และประเภทเซลล์ที่ได้รับผลกระทบในการศึกษาเหล่านี้ การศึกษาที่สำรวจครอบคลุมถึงการบาดเจ็บของไตและโรคไตเรื้อรังทั้งแบบเฉียบพลันและแบบผสม-เรื้อรัง

การบาดเจ็บที่ไตด้วยสัญญาณ TUNEL-positive จะสังเกตพบในท่อหรือโกลเมอรูลัสหรือไม่นั้นขึ้นอยู่กับชนิดของตัวทำลายหรือโรค ตัวอย่างเช่น โรคไตอักเสบลูปัสในมนุษย์และความเสียหายของอนุภาคนาโนนิกเกิลได้รับการอธิบายว่ามีสัญญาณ TUNEL-positive ที่ไตอย่างเคร่งครัด [62,63] ในทางกลับกัน ischemia-reperfusion และ streptozotocin-induced diabetic nephropathy ในหนูแรทผลิต TUNEL-positive cells เฉพาะใน tubules [64,65] ท่อใกล้เคียง, ห่วงของ Henle, ท่อส่วนปลาย และท่อร่วมมักจะให้ผลบวก TUNEL ในแบบจำลองการขาดเลือดกลับคืนมา เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ทั้งในโกลเมอรูไลและทูบูลถูกอธิบายไว้ในหนูที่สัมผัสกับยา เช่น ไซโคลสปอริน เอ [66] และโดโซรูบิซิน [67] หรือวัสดุของผลิตภัณฑ์อุปโภคบริโภค เช่น อนุภาคนาโนซิงค์ออกไซด์ [68] และในรูปแบบหนูของโรคเบาหวาน [ 69. AKI ที่เหนี่ยวนำให้เกิดภาวะช็อกจากการติดเชื้อในมนุษย์ยังสัมพันธ์กับทั้งเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ที่เป็นไตและท่อไต [70] การอุดตันของลำไส้เล็กแบบปิดที่รัดคอทำให้เกิด TUNEL-positive ในไตภายใน 3 ชั่วโมง [87]

AKI สามารถเกิดขึ้นได้หลังการปลูกถ่ายและการบาดเจ็บจากการขาดออกซิเจน การปฏิเสธ Allograft ในมนุษย์มักเกี่ยวข้องกับความสูงของเซลล์ที่เป็นบวก TUNEL [88,89] หลังจากขาดเลือดขาดเลือด เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL มักจะถูกตรวจพบภายใน 2-24 ชั่วโมงในระหว่างการเกิดซ้ำ [90] หรืออย่างหวุดหวิดระหว่าง 14 ถึง 17 ชั่วโมงหลังจากขาดเลือดขาดเลือด [91] และบางครั้งเรายังคงสังเกตเห็นได้จนถึง 7 วันใน การปฏิเสธการปลูกถ่าย [92]. ในทำนองเดียวกัน ในแบบจำลองการขาดเลือดกลับของเลือด เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL มักถูกสังเกตพบมากที่สุด 24 ชั่วโมงหลังจากการให้เลือดกลับคืน [44,93,94] หรือภายในช่วงระหว่าง 4 [95,96] ถึง 72 ชั่วโมง [97] ในการศึกษาทั้งการปลูกถ่ายและการศึกษา AKI ขาดเลือด เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังเซลล์เยื่อบุผิวท่อส่วนปลายและส่วนใกล้เคียง [44,93] ในเมาส์ไตหลังจากได้รับบาดเจ็บจากการขาดเลือดขาดเลือดกลับคืน เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ถูกอธิบายว่าเข้มข้นในรอยต่อของคอร์ติโคเมดูลารี ซึ่งเป็นเป้าหมายปกติของการบาดเจ็บจากการขาดเลือด [98]

การบาดเจ็บแบบเฉียบพลันและแบบเรื้อรังแบบผสม โดยที่การได้รับพิษ สถานะโรค และ/หรือการประเมินมีทั้งแบบเฉียบพลัน (เช่น ชั่วโมง วัน) และเรื้อรัง (เช่น สัปดาห์ เดือน ปี) ในการศึกษาเดียวกัน ถูกสังเกตพบในการปลูกถ่ายมนุษย์ การปฏิเสธ (การตัดชิ้นเนื้อ 1 สัปดาห์ถึง 3 ปีหลังการปลูกถ่าย) [88] การติดเชื้อไวรัสตับอักเสบอีในสุกร (7 และ 14 วันหลังการฉีดวัคซีน) [52], ความเครียดที่เกิดจากปอดบวม CO2 ในภาวะไตเสื่อมไต(2 สัปดาห์ hydronephrosis, 2 วันหลัง pneumoperitoneum) [53], mesangial proliferative glomerulonephritis ที่เกิดจากพิษงู (1 ถึง 14 วันหลังฉีด) [99], unilateral ureteral อุดกั้น (1 ถึง 14 วันของการอุดตัน) [100], การได้รับยูแรนิลอะซิเตต (การสัมผัส 1 ถึง 28 วัน) [101] โรคไตจากกรด aristochic (5 และ 30- วันต่อวัน) [12] และภาวะขาดออกซิเจนในทารกแรกเกิด (ทดสอบ 1 ถึง 60 วันหลังคลอด สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนในครั้งแรก 14 วัน) [103]. สิบสี่วันหลังจากผลกระทบเป็นเวลาการประเมินทั่วไปสำหรับประเภทนี้อาการบาดเจ็บที่ไต[52,53,99,101,103]. ในกรณีส่วนใหญ่ เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL จะถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในท่อและท่อร่วม ข้อยกเว้นเพียงอย่างเดียวคือพิษงู ซึ่งส่วนใหญ่สร้างความเสียหายให้กับโกลเมอรูลี [99]

เรื้อรังไตโรค (CKD) กำหนดเป็นการปรากฏตัวของไตความเสียหายหรืออัตราการกรองไตที่ลดลง (GFR) ในมนุษย์เป็นเวลานานกว่า 3 เดือน เป็นเรื่องทั่วไปสำหรับการประเมิน TUNEL ซึ่งสามารถระบุได้ว่า CKD เกี่ยวข้องกับความก้าวหน้าหรือไม่ความเสียหายของไตCKD ที่มีการศึกษามากที่สุดซึ่งใช้ TUNEL คือโรคไตจากเบาหวาน การบาดเจ็บที่ระบุโดย TUNEL-positive เกิดขึ้นใน tubules และ podocytes [69] ในผู้ป่วยเบาหวานที่เป็นโรคเบาหวานก่อนการทดสอบ TUNEL ตั้งแต่ 7 ถึง 30 ปี [104,105] และ 2 ถึง 16 สัปดาห์หลังการรักษาด้วยสเตรปโตโซโตซินในสัตว์ฟันแทะ [106,107] TUNEL-positive histopathology ที่คล้ายคลึงกันได้รับการรายงานใน immunoglobulin A nephropathy [22] ในโรคไตอักเสบลูปัสและโรคไตอักเสบจากเยื่อหุ้มปอด พบผลบวกของ TUNEL ในโกลเมอรูไลเป็นหลัก [62,108,109] ในทางกลับกัน การศึกษาความปลอดภัยของยาของซิสพลาติน [110], คลอโรควิน [45], doxorubicin [67], finasteride [23], tacrolimus [111] และ levetiracetam [24] พบว่าส่วนใหญ่เป็นความเสียหายของท่อ ในทำนองเดียวกัน การบาดเจ็บเฉียบพลันต่อเนื่องที่ระบุโดยเซลล์ที่เป็นบวก TUNEL แบบท่อได้อธิบายไว้ในการศึกษาเกี่ยวกับโรคไตจากกรดยูริก [112], การขาดเมไทโอนีน [48], การสัมผัสกับสารพิษในสิ่งแวดล้อม microcystin-LR [50] และแคดเมียม [113] และใน สัมพันธ์กับการกระตุ้นแคลเซียมออกซาเลตไตหิน [114] และอนุภาคนาโนที่กลายเป็นปูน [115] ในขณะที่การระบุความเสียหายของไตที่ลุกลามระหว่าง CKD โดยใช้การทดสอบ TUNEL เป็นเครื่องมือวินิจฉัยที่มีประโยชน์ การรวมการทดสอบ TUNEL กับอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) อาจให้ข้อมูลมากขึ้นในการพิจารณากลไกของการบาดเจ็บ

TUNEL เทคนิคการหาปริมาณและโคโลคัลไลเซชัน

วิธีการหาปริมาณ TUNEL แตกต่างกันไป ในรายงานส่วนใหญ่ เซลล์/นิวเคลียสที่เป็นบวกของ TUNEL จะถูกหาปริมาณเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์/นิวเคลียสทั้งหมด [83,116,117] ดูเหมือนว่าจะเป็นสิ่งที่ถูกต้อง แม้ว่าจำนวนเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL จะไม่ตรงกับจำนวนเซลล์ที่ตายแล้ว เซลล์บางเซลล์อาจไม่ถึงระดับที่สามารถระบุการกระจายตัวของ DNA ในขณะที่เซลล์อื่นๆ อาจถูกกำจัดโดยมาโครฟาจแล้ว การหาจำนวนเซลล์บวก TUNEL ต่อตารางหน่วย (mm2) ก็ใช้เช่นกัน [118] แต่วิธีนี้ดูแม่นยำน้อยกว่าเพราะขึ้นอยู่กับตำแหน่งและเนื้อหาประเภทเซลล์ของพื้นที่ เยื่อหุ้มสมองส่วนใหญ่ประกอบด้วยโกลเมอรูลี หลอด หลอดเลือด และรังสีเกี่ยวกับไขกระดูก ในขณะที่ส่วนที่เกี่ยวกับไขกระดูกส่วนใหญ่ประกอบด้วยลูปของเฮนเล ท่อรวบรวม และหลอดเลือด ปริมาณ "ต่อ Fifield" แน่นอนขึ้นอยู่กับว่าเขตข้อมูลคืออะไร [72,119] และปริมาณ "ต่อส่วน" นั้นไม่ได้กำหนดไว้ [61,120] การวัดที่ระบุได้ไม่ดี เช่น "คะแนนเนื้อเยื่อ" [121] "ดัชนี apoptotic" [113] "อัตราการตายของเซลล์" [92] "เปอร์เซ็นต์ของการตายของเซลล์" [122] หรือเปอร์เซ็นต์ของการควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา [123,124] ดูเหมือนจะ มีความเหมาะสมน้อยกว่า และทำให้การตีความยากขึ้น และเทียบไม่ได้กับการศึกษาส่วนใหญ่

การตายของเซลล์ในเซลล์ข้างเคียงเริ่มต้นอย่างไม่สม่ำเสมอเนื่องจากขึ้นอยู่กับการเกิดหลอดเลือด วัฏจักรของเซลล์ และตัวแปรอื่นๆ ซึ่งมักส่งผลให้เกิดการย้อมสี TUNEL ของเซลล์ในเนื้อเยื่อไม่สม่ำเสมอ [45,96,125] น่าแปลกที่ความเข้มทั่วไปของสัญญาณบวกของ TUNEL ไม่ได้ใช้สำหรับการวัด TUNEL แม้ว่าจะขึ้นอยู่กับระดับของการกระจายตัวของ DNA โดยตรงก็ตาม อาจเป็นเพราะเซลล์ถูกพิจารณาว่าตายโดยไม่ขึ้นกับความเข้มของสัญญาณ TUNEL เนื่องจากเซลล์ไม่สามารถ "ตายได้มากกว่านี้" หากการย้อมสี TUNEL นั้นรุนแรงกว่า แม้ว่าจะเป็นเรื่องยากที่จะเปรียบเทียบการศึกษาที่ใช้วิธีการที่หลากหลายในการหาจำนวนผลลัพธ์ของ TUNEL แต่ปริมาณของเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ในสัตว์ควบคุมมักจะต่ำกว่า 2 เปอร์เซ็นต์ [75,99,100,116,126] การบาดเจ็บเฉียบพลันเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของ TUNEL ประมาณ 5–40 เท่า [79,126,127] ในระหว่างการบาดเจ็บเรื้อรัง การเพิ่มขึ้นของเซลล์บวก TUNEL จะลดลงเล็กน้อย ~2–20-เท่า [29,43,65] เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา

การทดสอบ TUNEL เบื้องต้นตามการย้อมสีไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB) ได้รับการออกแบบสำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง [14,15] วิธีการแบบดั้งเดิมนี้ยังคงใช้อยู่ในสองในสามของการศึกษาที่สำรวจในการทบทวนนี้และในการศึกษาชิ้นเนื้อในมนุษย์ส่วนใหญ่อย่างท่วมท้น การหาปริมาณทำได้โดยการนับเซลล์ด้วยตนเอง และแม้จะแม่นยำ แต่ก็ใช้เวลานาน บ่อยครั้ง การหาปริมาณไม่ได้ใช้เลย และผลลัพธ์จะถูกนำเสนอโดยใช้ภาพของตัวอย่างที่ผ่านการบำบัดและย้อมสีเป็นหลักฐานง่ายๆ ที่แสดงว่าเซลล์ตาย ระบบอัตโนมัติอาจเร่งกระบวนการหาปริมาณ [128,129] อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถรวม DAB กับการย้อมสีอื่นๆ ในตัวอย่างเดียวกันได้ และด้วยเหตุนี้ TUNEL ที่ใช้ DAB สามารถให้จำนวนเซลล์ที่ตายแล้วเท่านั้น โดยไม่มีการระบุชนิดเซลล์ (ยกเว้นการจดจำด้วยภาพ) หรือกลไกการตายของเซลล์

ในขณะที่การศึกษาในมนุษย์อาศัย TUNEL แบบ DAB อย่างท่วมท้นโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง แต่การศึกษาในสัตว์ทดลองประมาณครึ่งหนึ่งใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ FL (รูปที่ 3) Fluorescent TUNEL นั้นดึงดูดสายตา ตีความได้ง่าย และมีข้อดีหลักๆ หลายประการ นอกเหนือจากการหาปริมาณที่แม่นยำโดยการระบุนิวเคลียสที่เป็นบวกของ TUNEL หรือความเข้มเฉลี่ยของสีแล้ว สัญญาณ FL Fluorescent TUNEL ยังสามารถรวมเข้ากับสีอื่นๆ สำหรับฮิสโตเคมี (เช่น DAPI) (รูปที่ 3A) หรือ IHC (รูปที่ 3B) ในระยะหลัง การใช้เครื่องหมายโปรตีนอาจช่วยในการระบุสัญญาณที่เป็นบวกของ TUNEL ที่เกี่ยวข้องกับความแตกต่างไตแบ่งส่วนหรือให้ข้อมูลเกี่ยวกับชนิดของการตายของเซลล์ เราไม่พบตัวอย่างใดๆ ของ TUNEL ที่รวมกับการย้อมสีแอนติบอดี IHC สองเท่า แม้ว่าการรวมกันดังกล่าวจะเป็นข้อมูลที่ดีมาก ตัวอย่างเช่น สำหรับการระบุกลไกการตายของเซลล์ในเซลล์บางชนิด ปัญหาทางเทคนิคที่เกี่ยวข้องกับการย้อมสีดังกล่าวอาจมีค่ามากกว่าประโยชน์

บัตรประจำตัวของไตชนิดเซลล์ไม่ใช่ปัญหาสำหรับผู้มีประสบการณ์อย่างแน่นอนไตนักพยาธิวิทยา [104]. ด้วยเหตุนี้ การใช้เครื่องหมายเพิ่มเติมสำหรับการระบุประเภทเซลล์ เช่น การใช้ CD31 เพื่อระบุเซลล์บุผนังหลอดเลือด [130] จึงเป็นเรื่องที่หาได้ยาก อย่างไรก็ตาม มักใช้เครื่องหมายโปรตีน IHC ในการจำแนกลักษณะการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อ การศึกษาส่วนใหญ่ใช้ผลบวกของ TUNEL เป็นหลักฐานเพียงอย่างเดียวของการตายของเซลล์ ในการศึกษาอื่นๆ การตระหนักว่า TUNEL-positive ไม่ได้จำเพาะสำหรับการตายของเซลล์ได้ทำให้เกิดลักษณะทางสัณฐานวิทยาหลายอย่าง (เช่น hematoxylin และ eosin หรือ periodic acid–Schiff) สารชีวเคมีและ IHC ที่จะนำมารวมกับการย้อมสี TUNEL เพื่อยืนยันการตายของเซลล์ เครื่องหมายที่ใช้บ่อยที่สุดสำหรับการตายแบบอะพอพโทซิสที่ขึ้นกับแคสเปสคือ แคสเปสแบบแยกส่วน-3โดยใช้แอนติบอดีที่ไม่รู้จักแคสเปสขนาดเต็ม-3 [131,132] การทดสอบทั้ง TUNEL และ caspase แบบแยกส่วน-3 แสดงให้เห็นเฉพาะท่อที่ไม่ใช่ไต มีการย้อมสีในหนูแรทขาดเลือด-กลับเป็นซ้ำ [64] การศึกษาแคสเปสอื่นๆ ใช้แคสเปส-1 [27], -9 [53], -11 [28] และ -12 [75] เครื่องหมายอะพอพโทติกอื่นๆ ได้แก่ B-cell lymphoma 2 (Bcl2) family of proteins Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] และ Bad [43]; ตัวรับ apoptotic Fas [52] และตัวรับ apoptotic - ลิแกนด์ FasL [66]; forkhead box (FOX) ปัจจัยการถอดรหัสโปรตีน Fox01 [133] และ Fox03 [27]; และไซโตโครมค [53] การอักเสบถูกระบุโดย IHC ของ tumor necrosis factor-alpha (TNF ) [134]; ปัจจัยการเจริญเติบโตของเนื้องอก TGF [66] และ TGF- 1 [135]; ซีรีน/ทรีโอนีนไคเนส 1 (SGK1) [135]; ฟลาโวโปรตีนถ่ายโอนอิเล็กตรอน, เบต้า - ยูนิตย่อย (ETF ) [136]; เจนัส ไคเนส-2 (JAK2) [137]; ตัวแปลงสัญญาณและตัวกระตุ้นของการถอดรหัส 3 (STAT3) [137]; ปัจจัยนิวเคลียร์ kappa-light-chain Enhancer ของเซลล์ B ที่ถูกกระตุ้น (NF-κB) [137] และโปรตีนยับยั้งIκB [137] สำหรับไตการประเมินการบาดเจ็บ, โมเลกุลการบาดเจ็บของไต-1 (KIM-1) [24], aquaporin-1 channel (AQP-1) [45], ปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน {{7} }ปัจจัยการถอดรหัสอัลฟา (HIF-1 ) [103] ตัวขนส่งกรดอะมิโนชนิด Asc-1 (Asc-1) [121] เป้าหมายของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมของราพามัยซิน (mTOR) [131] ไคเนส และทรานส์กลูตามิเนส II [89] ถูกใช้ การบาดเจ็บที่ไตที่เกิดจากออกซิเดชันได้รับการศึกษาโดยใช้เครื่องหมาย เช่น 8-hydroxyguanosine (8OHdG) (102], neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) (102], deacetylase sirtuin ที่ขึ้นกับ NAD-1 (SIRT1) [138] และ heme oxygenase 1 (H2O-1) [90] ไคเนสได้รับการศึกษาอย่างเข้มข้น รวมถึงวิถีไคเนสไคเนส (JNK) ของขั้ว c-Jun [11], ฟอสโฟอิโนซิไทด์ 3-ไคเนส/โปรตีนไคเนส B/ปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยการถอดรหัสปัจจัย 2 ที่เกี่ยวข้อง (PI3K/ วิถีทาง Akt/Nrf2) [46], pannexin-1 (PANX1) พลาสมาเมมเบรน gap junction protein [26] และไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน/ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ (MAPK/ERK) [26] การศึกษาเอนโดนิวคลีเอส apoptotic ที่เกี่ยวข้องกับ DNase ที่กระตุ้นด้วยแคสเปส (CAD) [139], DNase I [108] และ EndoG [139] และตัวบ่งชี้ความเสียหายของ DNA รวมถึงโปรตีนเนื้องอก p53 (p53) [99] และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไดนามิน 1 (PARP1 ) [66]. การศึกษาบางชิ้นยังพบว่าการประเมินอะพอพโทซิสที่อาศัยความเครียดจากเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัมและการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อมีประโยชน์ [75]

จากการศึกษาเชิงกลไกจำนวนมากที่สำรวจและข้อดีของการรวม TUNEL กับ IHC markers เพื่อระบุกลไกการตายของเซลล์ เราคาดว่าการศึกษาจำนวนมากจะใช้ colocalization ระหว่างทั้งสอง การวิเคราะห์อาจดำเนินการโดยการ colocalization แบบพิกเซลต่อพิกเซลระหว่างเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL และเครื่องหมาย IHC, ความเข้มเฉลี่ยของเครื่องหมาย IHC ในพื้นที่ที่เป็นบวกของ TUNEL หรือสัญญาณที่เป็นบวกของ TUNEL หมายถึงความเข้มในพื้นที่ที่มีเครื่องหมายบวกของ IHC น่าเสียดาย ข้อดีของ TUNEL นี้ถูกใช้ในการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นเท่านั้น เซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ถูก colocalized ด้วย caspase ที่แยกออก-3 ในไตท่อระหว่างความเป็นพิษของ acetaminophen ในหนู [74] การรวมกลุ่มของ IHC ด้วยสัญญาณบวกของ TUNEL ช่วยให้สามารถระบุการตายของเซลล์ของเซลล์ mesangial ระหว่างโรคไตอักเสบ Habu [99] ในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง การทำ colocalization ด้วยเครื่องหมายกลไกของความเป็นพิษได้ดำเนินการในส่วนต่อเนื่อง ตามที่รายงานโดย Ott et al [89].

ปัญหาและข้อจำกัดของ TUNEL

ปัญหาที่อาจเกิดขึ้นหลายประการอาจเกิดขึ้นและควรคาดหวังเมื่อทำงานกับ TUNEL หนึ่งคือปลายสาย DNA 30OH เกิดขึ้นไม่เฉพาะระหว่างการตายของเซลล์อันเป็นผลมาจากการกระทำของเอนโดนิวคลีเอส แต่ยังเป็นเมแทบอไลต์ระดับกลางตามปกติในปฏิกิริยาของเอนไซม์เกือบทั้งหมดกับดีเอ็นเอ หน้าที่หลักของเซลล์ที่สร้างปลายทาง 30OH คือการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ซึ่งชิ้นส่วนของ Okazaki จำนวนมากอาจสร้างสัญญาณ TUNEL ที่เป็นเท็จในทางทฤษฎี โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการดัดแปลงการทดสอบที่มีความไวสูง ในระหว่างอาการบาดเจ็บที่ไต,การซ่อมแซม DNA อาจมีส่วนทำให้เกิดสัญญาณบวกของ TUNEL ที่ผิดพลาดซึ่งเป็นผลมาจากการกระทำของ AP endonuclease การบาดเจ็บที่ไตที่เกิดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันจำนวนมากที่เกิดจากสารเคมี (ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์, บลีโอมัยซิน) หรือการบาดเจ็บทางกายภาพ (การฉายรังสีแกมมา) อาจเพิ่มเป็นจำนวน 30OH สิ้นสุด ซึ่งเพิ่มการอ่านค่า TUNEL ที่เป็นเท็จนอกเหนือจากการกระจายตัวของ DNA ที่อาศัยเอนโดนิวคลีเอส

บ่อยครั้งและมีแนวโน้มมากขึ้น การกำหนดเงื่อนไขการทดลองอย่างไม่เหมาะสมของปฏิกิริยา TdT (เวลา อุณหภูมิ กิจกรรมของเอนไซม์ หรือปัจจัยร่วม) อาจส่งผลให้พื้นหลังสัญญาณบวก TUNEL เพิ่มขึ้นเกินจริง แม้ว่าจะยังไม่ได้กำหนดว่าอะไรที่ถือเป็นพื้นฐานปกติสำหรับตัวอย่างเนื้อเยื่อไตที่ไม่ได้รับการรักษา แต่ดูเหมือนว่ามีความเป็นไปได้ที่ประมาณ 1 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ทั้งหมดจะเป็นจำนวนที่สมเหตุสมผล แน่นอนว่า ภูมิหลัง 10 เปอร์เซ็นต์หรือสูงกว่านั้นเป็นหลักฐานที่ชัดเจนของสภาวะการทดสอบที่ไม่เป็นไปตามข้อกำหนดและที่ไม่ได้รับการขัดเกลา หรือการเบี่ยงเบนจากสภาวะการเก็บตัวอย่างที่เหมาะสม

ปัญหาที่คาดหวังอีกประการหนึ่งคือกิจกรรม DNase I ต่ำในเซลล์บางประเภท (เช่น endothelium)ไตช่อง (เช่น glomeruli) หรือเนื้อเยื่อทางพยาธิวิทยา (เช่น เนื้องอก) เซลล์เหล่านี้ควรได้รับการคาดหวังให้แสดงผลบวกของ TUNEL ต่ำ ไม่ใช่เพราะเซลล์เหล่านี้ทนต่อการบาดเจ็บ แต่เนื่องจากไม่มีกิจกรรมเอนโดนิวคลีเอสเพียงพอที่จะสร้างสัญญาณที่วัดได้ใน TUNEL จากประสบการณ์ของเรา แม้แต่การเปลี่ยนแปลงระหว่าง {{0}}.01 เปอร์เซ็นต์ถึง 0.1 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่เป็นบวกของ TUNEL ก็อาจมีนัยสำคัญทางสถิติและใช้เป็นหลักฐานที่ชัดเจนว่าไต (ของเนื้อเยื่ออื่น) ได้รับบาดเจ็บ

สุดท้าย ปัญหาในการหาปริมาณของการย้อมสี TUNEL เกิดขึ้นเมื่อปริมาณการแตกตัวของ DNA สูงเกินไป เช่น ในระยะสุดท้ายของการตายของเซลล์หรือการบาดเจ็บที่มีความเข้มข้นสูง ซึ่ง DNA ที่เหลืออยู่ไม่สามารถต่อต้าน DAPI ได้อย่างถูกต้องเนื่องจากการถอดแยกชิ้นส่วน เกลียวคู่ (รูปที่ 3D) ในกรณีเหล่านี้ สัญญาณบวกของ TUNEL จะ "ลอยอยู่ในอากาศ" และดูเหมือนจะไม่เกี่ยวข้องกับนิวเคลียส หน้าที่ของนักพยาธิวิทยาในการตีความสิ่งเหล่านี้เป็นเซลล์บวก TUNEL แทนที่จะเป็นสิ่งประดิษฐ์ ด้วย TUNEL ที่ติดฉลาก fluorescein มีความเสี่ยงในการระบุพื้นหลัง autofluorescence ในเนื้อเยื่อว่าเป็น TUNEL-positivity [140] ในกรณีเหล่านี้ ขอแนะนำให้เปลี่ยนไปใช้ TUNEL สเปกตรัมสีแดง [51,54]

รูปแบบ TUNEL เป็นแหล่งที่มาของข้อมูลเพิ่มเติม

รูปแบบ TUNEL หลายแบบสามารถแยกแยะได้อย่างชัดเจนและใช้เพื่อกำหนดกลไกที่เป็นไปได้และระดับของการบาดเจ็บ (ตารางที่ 1 รูปที่ 3) โดยปกติ รูปแบบ TUNEL ประเภทนิวเคลียสเท่านั้นเกิดจากการบาดเจ็บเล็กน้อย ในขณะที่การบาดเจ็บที่รุนแรงกว่า (เช่น การสัมผัสที่สูง) ส่งผลให้เกิดการย้อมสีและการแตกตัวของนิวเคลียสหรือเซลล์ที่รุนแรงขึ้น รูปแบบ TUNEL แบบอะพอพโทติกอย่างเคร่งครัดคือการกระจายตัวของนิวเคลียร์อันเป็นผลมาจากการก่อตัวของอะพอพโทซิส (รูปที่ 3E) พบชิ้นส่วนเล็กๆ ของนิวเคลียสที่เป็นบวกของ TUNEL ซึ่งมีแนวโน้มว่าจะเกิดการตายแบบอะพอพโทซิสในหนูแรทที่ขาดเลือดกลับคืนสู่สภาพปกติที่ 24-72 ชั่วโมง [97] นอกจากนี้ยังพบร่าง Apoptotic ด้วยการติดฉลาก TUNEL ของนิวเคลียสในเยื่อบุผิวของท่อไตและคั่นระหว่าง 14 วันหลังจากการบาดเจ็บของการขาดเลือดกลับคืนในหนู [141] ปริมาณน้ำมันลาเวนเดอร์ที่เพิ่มขึ้นช่วยลดรูปแบบ TUNEL เฉพาะนิวเคลียสและแปลงเป็น TUNEL ที่มีลักษณะคล้ายเนื้อร้ายโดยมีการรั่วไหลของไซโตพลาสซึม [94] หลังเป็นผลมาจากการทำลายซองจดหมายนิวเคลียร์อันเนื่องมาจากการกระทำของโปรตีเอสและไลเปสในเนื้อร้าย Cytoplasmic TUNEL (รูปที่ 3F) ที่ถูกมองว่าเป็น TUNEL-positive cytoplasm ถูกสังเกตในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงในแบบจำลอง rhabdomyolysis ในท่อของหนู [142] และใน podocytes ที่เพาะเลี้ยงเมื่อมีน้ำตาลกลูโคสสูงและในโรคไตจากเบาหวานในหนู [135] Cytoplasmic TUNEL ยังได้อธิบายไว้ในไตขาดเลือดกลับ-reperfusion ในหนูทดลองที่ใช้ FL fluorescent TUNEL [98] และใน ischemia-reperfusion ในหนูโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง [143] ความเสียหายเชิงท่อที่เกิดจากเมอร์คิวริกอย่างลึกซึ้งและเฉพาะด้วยการย้อมสี TUNEL ของไซโตพลาสซึมที่รุนแรงซึ่งบ่งชี้ถึงความเสียหายของเยื่อหุ้มนิวเคลียส [60] หากอาการบาดเจ็บยังคงมีอยู่หรือปริมาณของสารที่สร้างความเสียหายเพิ่มขึ้น cytoplasmic TUNEL สามารถแปลงเป็นภาพที่ "ยุ่งเหยิง" ของ TUNEL ที่กระจัดกระจาย (รูปที่ 3G) อันเนื่องมาจากระยะสุดท้ายของการทำลายเซลล์อันเนื่องมาจากเนื้อร้ายและการรั่วไหลของไซโตพลาสซึมของเซลล์และเศษซาก ตัวอย่างเช่น พบทั้ง cytoplasmic และ dispersed TUNEL ในหนูที่ได้รับ cisplatin [71,72] และหนู [144] และในการบาดเจ็บของ podocyte ในหนูที่เป็นเบาหวานที่เกิดจาก streptozotocin [145] TUNEL ที่เน่าเปื่อยกระจายยังพบในระหว่างการเป็นพิษต่อไตที่เกิดจาก uranyl acetate ในหนูทดลอง [101] สุดท้าย ตัวแปรสัญญาณ TUNEL อีกตัวที่ต้องให้ความสนใจคือความเข้มของสัญญาณบวกของ TUNEL ซึ่งอาจเบี่ยงเบนจากเซลล์หนึ่งไปอีกเซลล์หนึ่งขึ้นอยู่กับจำนวนช่วงพัก (ระดับของการบาดเจ็บ) ที่แต่ละเซลล์ได้รับ ดังที่บันทึกโดยการศึกษาบางส่วน [45,96,125] ]. สำหรับรุ่นที่มีการสังเกตความเข้มของสัญญาณ TUNEL ที่แตกต่างกัน แนะนำให้หาปริมาณโดยทั้งจำนวนของวัตถุที่เป็นบวกของ TUNEL และความเข้มเฉลี่ยของการย้อมสี

บทสรุป

เนื่องจากกิจกรรมสูงของ apoptotic endonucleases ในไต โดยเฉพาะ DNase I และ EndoG การใช้ TUNEL สำหรับการวิจัยและวินิจฉัยโรคไตเป็นข้อมูลมาก อาจมีประโยชน์มากขึ้นหากใช้ TUNEL นอกเหนือจากการใช้ครั้งแรกเพื่อระบุการตายของเซลล์ การใช้ TUNEL สำหรับการศึกษาอะพอพโทซิสโดยเฉพาะเป็นตัวอย่างที่ดีของการที่วิทยาศาสตร์อาจถูกชี้ทางผิดโดยไม่ได้ตั้งใจด้วยวิธีการที่ใช้อย่างไม่เหมาะสม แม้จะใช้เป็นการทดสอบอาการบาดเจ็บเฉียบพลันเป็นส่วนใหญ่ แต่ TUNEL ก็สามารถนำไปใช้ในการประเมินทั้ง AKI และ CKD ได้สำเร็จ อย่างไรก็ตาม ใน CKD ระดับของ TUNEL-positive ควรต่ำกว่าการบาดเจ็บเฉียบพลัน เนื่องจากการทำงานของเอ็นโดนิวคลีเอส (โดยหลักคือ DNase I) ในเยื่อบุผิวท่อจะสูงกว่าในช่องไตอื่นๆ มาก การบาดเจ็บที่ท่อไตจึงมักจะเห็นได้ชัดเจนกว่า อย่างไรก็ตาม สามารถศึกษาการบาดเจ็บที่ไตหรือหลอดเลือดได้โดยใช้ TUNEL หากอาการบาดเจ็บเกิดขึ้นจริงในช่องเหล่านี้ การรวมกลุ่มของ FL fluorescent TUNEL กับเครื่องหมาย IHC ช่วยให้สามารถระบุและเชื่อมโยงประเภทเซลล์และกลไกการตายของเซลล์ด้วยสัญญาณ TUNEL การหาปริมาณของ TUNEL สามารถให้ข้อมูลที่มีค่าเกี่ยวกับระดับการตายของเซลล์ และการใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพอาจมีประโยชน์มากในเรื่องนี้ เมื่อพิจารณาจากรูปแบบ TUNEL ที่หลากหลาย เราขอแนะนำอย่างยิ่งให้สร้างและสาธิตรูปภาพที่เป็นตัวแทน

สัญญาณ TUNEL ที่ถือว่าเป็นบวก สุดท้ายนี้ ควรใช้รูปแบบ TUNEL เป็นแหล่งที่มาของข้อมูลเพิ่มเติม เช่น กลไกการตายของเซลล์และระดับความเป็นพิษ ตัวอย่างเช่น การแยกความแตกต่างระหว่างวัตถุ apoptotic ที่เป็นบวกของ TUNEL การมีอยู่ของสัญญาณ TUNEL ของไซโตพลาสซึม หรือรูปแบบ TUNEL ที่กระจัดกระจายอาจช่วยระบุเซลล์ที่เป็นบวก TUNEL ที่เป็น apoptotic กับ necrotic เพื่อการตีความผลการวิจัยและการวินิจฉัยที่แม่นยำยิ่งขึ้น

การรักษาโรคไตผิดปกติทางเพศ