Tuliposides H–J และส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากกระเปาะของ Amana Edulis
Mar 20, 2023
เชิงนามธรรม:
ดอกทิวลิปด้านใหม่สามด้าน H–J (1–3) และสารประกอบที่รู้จัก 11 ชนิดได้รับจากสารสกัดเมทานอลของหัวของ Amana edulis เป็นครั้งแรก โครงสร้างของพวกเขาได้รับการอธิบายโดยข้อมูล NMR, MS และ IR สเปกโทรสโกปี, การหมุนด้วยแสง และวิธีการของ Mosher คุณสมบัติการสร้างเมลาโนเจเนซิสของเชื้อที่แยกได้ทั้งหมดได้รับการประเมินในเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดบี 16 ดังนั้น ไตรบิวทิล ซิเตรต (9) จึงมีฤทธิ์ต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสแต่เป็นพิษต่อเซลล์ต่อ B16 (บวก )-กรดไพโรกลูตามิก (4), (บวก )-บิวทิล 5-ออกโซ ไพร์โรลิดีน-2-คาร์บอกซีเลต (6), (–)-3-ไฮดรอกซี-2-เมทิลบิวทิโรแลคโตน (10 ) และ 5- (ไฮดรอกซีเมทิล)เฟอร์ฟูรัล (12) เพิ่มการผลิตเมลานินและกิจกรรมของเอนไซม์ไทโรซิเนส ส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์เหล่านี้สามารถศึกษาเพิ่มเติมในฐานะผู้ต่อต้านมะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมาและโรคด่างขาวสำหรับโรคผิวหนัง หรือการทำให้ผิวขาว/รอยดำบนเส้นผม
ในการวิจัยเรื่องความขาว เราพบว่า Cistanche มีผลทำให้ผิวขาวด้วย
ประการแรก Cistanche อุดมไปด้วยโพลีแซคคาไรด์และฟลาโวนอยด์ สารประกอบเหล่านี้ทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระและสามารถช่วยให้ร่างกายกำจัดอนุมูลอิสระ ชะลอความชราของผิวหนังและทำให้ผิวพรรณดีขึ้น
ประการที่สอง Cistanche ยังมีกรดอะมิโน แร่ธาตุ และวิตามินหลากหลายชนิด ซึ่งมีประโยชน์อย่างมากต่อการซ่อมแซมและฟื้นฟูผิว Cistanche สามารถส่งเสริมการเผาผลาญของเซลล์ผิว เพิ่มความสามารถในการซ่อมแซมตัวเองของผิว และฟื้นฟูผิวให้มีสีผิวที่แข็งแรง
ในที่สุด Cistanche ยังมีกรดอินทรีย์และสารอัลคาไลน์ และส่วนผสมเหล่านี้ยังมีผลต่อการปรับสภาพและการเผาผลาญของผิวหนังชั้นนอก สารเหล่านี้สามารถปรับสมดุลค่า pH ของผิวได้อย่างมีประสิทธิภาพ ปรับปรุงความหนาของชั้น corneum และทำให้ผิวโปร่งแสงและบอบบางยิ่งขึ้น
1. บทนำ
อามานาเอดูลิส (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker อยู่ในวงศ์ Liliaceae และเป็นพืชสมุนไพรพื้นบ้านที่ใช้รักษาโรคมะเร็ง [1,2] อย่างไรก็ตาม มีรายงานการศึกษาทางพฤกษเคมีและชีววิทยาของสปีชีส์นี้น้อยมาก
ตัวอย่างเช่น สารสกัด EtOH ร้อยละ 95 และ 50 สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ในกระเพาะอาหารของมนุษย์ (SGC7901) [1] และเซลล์ตับ (BEL7404, HepG2 และ Huh7) [2] เซลล์มะเร็งตามลำดับ พอลิแซ็กคาไรด์ที่เตรียมจาก A. edulis มีคุณสมบัติต่อต้านอนุมูลอิสระ ได้แก่ DPPH, OH− และ ABTS รวมถึงกิจกรรมการขับของเสีย [3–5] ในการวิจัยสารใหม่จากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติสำหรับความผิดปกติของผิวหนัง เราพบว่าสารสกัด MeOH ของหัวของ A. edulis แสดงศักยภาพการควบคุมการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่ยังไม่ได้รับการวิจัย เมื่อสัมผัสกับรังสีอัลตราไวโอเลตของแสงจากดวงอาทิตย์หรือสารเคมีที่เป็นอันตรายและปัจจัยที่ทำให้เกิดโรค การสร้างเม็ดสีในระดับปานกลางสามารถปกป้องผิวของเราจากการสร้างสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาในเซลล์เคราติโนไซต์และเซลล์เมลาโนไซต์ [6] ไทโรซิเนสเป็นเอ็นไซม์ที่สำคัญในการสร้างเมลาโนเจเนซิสเพื่อผลิตเมลานินมากขึ้น เพื่อป้องกันสภาวะอันตรายดังกล่าว [7]
ดังนั้น ส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ของ A. edulis จึงสมควรที่จะถูกล้างสำหรับการใช้งานทางการแพทย์ต่อไป ในการตรวจสอบนี้ ทิวลิปใหม่สามด้าน H–J (1–3) และ 11 สารประกอบที่รู้จัก (4–14) (รูปที่ 1) ถูกแยกออกจาก A. edulis และระบุโครงสร้างโดย NMR, MS, และ IR สเปกโทรสโกปีข้อมูล, การหมุนด้วยแสง หรือปฏิกิริยาโมเชอร์เอสเทอร์ สารประกอบ 9 สามารถลดปริมาณเมลานินแต่เป็นพิษต่อเซลล์ต่อเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดบี 16 สารประกอบ 4, 6, 10 และ 12 เพิ่มการผลิตเมลานินและกิจกรรมของเอนไซม์ไทโรซิเนส โดยรวมแล้ว งานนี้พิสูจน์ให้เห็นว่า A. edulis และส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์อาจเป็นตัวการใหม่สำหรับโรคที่เกี่ยวข้องกับเมลานิน เช่น มะเร็งผิวหนังและภาวะเม็ดสีผิวต่ำ (โรคด่างขาวหรือผมขาว)
2. ผลลัพธ์และการอภิปราย
2.1. การอธิบายโครงสร้างของไอโซเลท 1–3
สารสกัด MeOH (TEM) ของกระเปาะของ A. edulis ถูกแบ่งออกเป็นเศษส่วน EtOAc ที่ละลายได้ (TEE), n-BuOH ที่ละลายได้ (TEB) และส่วนที่ละลายด้วย H O (TEW) แยกกัน เศษส่วน การกระทำของสารสกัด TEE และ TEB ทำให้เกิดไอโซพรีนอยด์ไกลโคไซด์ 1-3 ใหม่และสารประกอบที่รู้จัก 4-14 (รูปที่ 1) นอกจากนี้ ส่วนประกอบหลักของสารสกัด TEW คือคาร์โบไฮเดรต
HRESIMS (แมสสเปกโตรเมตรีไอออนไนซ์ด้วยไฟฟ้าความละเอียดสูง) ที่ 1 แสดง (M - H- ไอออนที่ m/z 351.1652 ซึ่งบ่งชี้สูตรโมเลกุลของ CsH2gOg (calcd forC;5HoOg; 351.1655) และความไม่อิ่มตัวสองระดับ สเปกตรัม IR แสดงการดูดซับสำหรับการทำงานของไฮดรอกซิล (3376 cm-l) และคาร์บอนิล (1725 cm-l) สัญญาณคาร์บอนสิบห้าตัวรวมถึงเมทิลสองตัว เมทิลีนห้าตัว เมทีนเจ็ดตัว และคาร์บอนควอเทอร์นารีหนึ่งตัวถูกสังเกตใน NMR หนึ่งมิติ (1D) สเปกตรัมของ 1 (ตารางที่ 1) คาร์บอนควอเทอร์นารีถูกระบุว่าเป็นคาร์บอนิลคาร์บอนตามการเปลี่ยนแปลงทางเคมี 6c 176.6 1D และ HSOC (การเชื่อมโยงกันของควอนตัมเฮเทอโรนิวเคลียร์เดี่ยว) NMR สเปกตรัมแสดงหนึ่ง anomeric (0/8c: 4.27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4.9), ออกซีเมโธโลนห้าตัว (0h/8c: 3.21(t, J { {34}}.0 Hz)/75.1, 3.28 (เหลื่อมกัน)/71.6, 3.28 (เหลื่อมกัน)/78.0, 3.35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77.9, และ3.89 (td, I=7.0, 2.5 Hz)/73.6) และ oxymethylene สามตัว (6,/6c: 3.57 (dd, J {{64} }.5, 7.0 Hz)4.01 (dd, I {{7{0}}.5, 2.5 Hz)/73.1, 3.66 (dd, I { สัญญาณ {78}}.0, 5.0 Hz), 3.85 (brd, I=12.0 Hz)/62.7 และ 4.10 (2H, t, J=7.5 Hz)/65.5) สหสัมพันธ์ HMBC (สหสัมพันธ์พันธะหลายพันธะเฮเทอโรนิวเคลียร์) (รูปที่ 2) ของสารประกอบ 1 ที่เมทีนโปรตอน H-2 (8 2.67, quint กับ C-1 (6 176 6)/C-3 (6 73.6)/C-4 (6 73.1)/C-5 (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) กับ C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4.27, d) กับ C-4 และเมทิลโปรตอน H-5 (8 1.14 , d) withC-1/C-2/C-3 เสนอแนะว่ามอยอิตีของเมทิลและไฮดรอกซิลอยู่ที่ C-2 และ C-3 ตามลำดับ นอกจากนี้ เมทิลีนโปรตอนที่ H,-1" (8 4.10, t) และ H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) แสดงอันตรกิริยา 3 อันกับ C{{ 142}} และ C-1' (8 104.9) ตามลำดับ ใน HMBCspectrum (รูปที่ 2) ที่สนับสนุนการกำหนดกลุ่ม n-butyl ที่ C-1 และหนึ่งเบต้า -กลูโคส (H-1', 8 4.27, d, J=8.0 Hz) ที่ C-4 8]
รูปที่ 2 แสดงความสัมพันธ์ที่สำคัญของ COZY และ HMBC ที่สังเกตได้สำหรับ 1 การกำหนดค่าสัมพัทธ์ที่ C-2 และ C-3 (3-ไฮดรอกซี-2-เมทิล มอยอิตี) ของ 1 สามารถหาค่าต้าน - รูปแบบโดย 3 JH2-ค่า H3 ของ 7.0 Hz (รูปแบบต่อต้าน: 7.0 Hz; รูปแบบซินธ์: 4.0 Hz) [ 9]. เพื่อกำหนดหาโครงแบบสัมบูรณ์ สารประกอบ 1 ถูกบำบัดแยกกันด้วย (R)- และ (S)- -เมทอกซี- -(ไตรฟลูออโรเมทิล)-ฟีนิล อะซีติล คลอไรด์ [(R)- และ (S)-MTPA- Cl] ต่อหน้า pyridine-d5 เพื่อให้ได้เอสเทอร์ (S)- และ (R)-MTPA (1a และ 1b) ตามลำดับ เอสเทอร์ MTPA ถูกสร้างขึ้นสำเร็จที่ C-3 และ C-20/C-30/C-40 ตามที่อธิบายจาก 1H NMR และ 1H-1H COZY สเปกตรัม (1a, H-3, δ 5.82, m; H-20 , δ 5.70, t, J=9.5 Hz; H-30 , δ 4.39, t, J=9.5 Hz; H-40 , δ 5.76, t, J=9.5 Hz; 1b, H-3, δ 5.81, m; H{{64 }} , δ 5.56, t, J=9.5 Hz; H-30 , δ 4.12, t, J=9.5 Hz; H-40 , δ 5.66, t, J=9.5 เฮิร์ตซ์) ความแตกต่างระหว่างการเปลี่ยนแปลงทางเคมี 1H NMR สำหรับ 1a และ 1b (ค่า ∆ แสดงในรูปที่ 3) นำไปสู่การกำหนดการกำหนดค่า S- และ R ที่ C-3 และ C-2 ตามลำดับ ดังนั้น สารประกอบ 1 ถูกอธิบายว่าเป็นบิวทิล 4- -D-กลูโคไพราโนส-(S)-3-ไฮดรอกซี-(R)-2-เมทิลบิวทาโนเอตและตั้งชื่อด้านทิวลิปว่า H
สารประกอบ 2, ด้านดอกทิวลิป I, ให้สูตรโมเลกุล, C15H28O8, สร้างขึ้นโดย HRESIMS (m/z 359.1686 [M บวก Na] บวก , calcd สำหรับ 359.1682) สเปกตรัม 1D NMR ของ 2 ก็คล้ายกับสเปกตรัม 1 ยกเว้นข้อเท็จจริงที่ว่าการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของสัญญาณเมทิลีน δH 1.65 (sext, J=7.0 Hz) และ 1.96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34.6 ถูกระบุแทนหนึ่งเมทีนที่ C-3 จาก 1 (ตารางที่ 1) จากข้อมูล COZY และ HMBC (รูปที่ 2) สารประกอบ 2 ถูกตั้งสมมุติฐานว่าประกอบด้วยไอโซพรีนอยด์ หนึ่งกลูโคส และหมู่ n-บิวทิลเช่นกัน ความสัมพันธ์ HMBC 3 J ของ H2-1" (δ 4.04, 2H, t, J=7.5 Hz/δC 65.4) กับ C-1 (δ 178.5) และ H-10 (δ 4.19, d, J=8.0 Hz/δC 104.4) กับ C-4 (δ 68.4) แนะนำว่าหมู่ n-บิวทิลและหนึ่ง-กลูโคส moiety [8] ถูกเชื่อมต่อที่ C-1 และ C-4 ตามลำดับ (รูปที่ 2) ความสัมพันธ์ของคีย์ HMBC และ COZY แสดงในรูปที่ 2 การกำหนดค่า R ของ H3-5 ที่ C-2 ของ 2 ถูกกำหนดโดยการไฮโดรไลซิสของกรด 2 เพื่อให้สารประกอบทิวลิปลินที่สอดคล้องกัน 3-เมทิลไดไฮโดรฟิวแรน-2(3H)-โอน (รูปที่ S28) [8] ด้วยการหมุนด้วยแสงที่เป็นบวก ค่า ([ ] 23 D บวก 18.7, CH2Cl2) (R: [ ] 25 D บวก 14.7, CHCl3) [10] โครงสร้างของสารประกอบ 2 ถูกระบุว่าเป็นบิวทิล 4- -D-glucopyranose-(R){{ 81}}เมทิลบิวทาโนเอต
สูตรโมเลกุลของ 3 อนุมานได้เป็น C11H20O8 เนื่องจากการปรากฏตัวของ [M บวก Na] บวกไอออนที่ m/z 303.1049 (calcd สำหรับ 303.1050) ใน HRESIMS สัญญาณคาร์บอนสิบเอ็ดตัว รวมถึงเมทิลหนึ่งตัว (δ 17.6), เมทิลีนสามตัว (δ 34.7, 62.8 และ 68.6), เมทีนหกตัว (δ 37.6, 71.6, 75.1, 77.9, 78.0 และ 104.4) และคาร์บอนควอเทอร์นารีหนึ่งตัว (δ 180.6) ถูกสังเกตในสเปกตรัม 1D NMR ของ 3 (ตารางที่ 1) คาร์บอนควอเทอร์นารีถูกระบุว่าเป็นคาร์บอนิลคาร์บอนตามการเปลี่ยนแปลงทางเคมีของคาร์บอนที่ δ 180.6 นอกจากนี้ สารประกอบ 3 แสดงข้อมูลสเปกโทรสโกปีที่คล้ายกันกับของ 2 ยกเว้นสำหรับสัญญาณ n-บิวทิล ในสเปกตรัม HMBC (รูปที่ S15) โปรตอนที่เป็น anomeric ที่ δ 4.23 (d, J=8.0 Hz) แสดงปฏิสัมพันธ์ 3 J กับ C-4 (δ 68.6) ที่นำไปสู่ -glucose ซึ่งอยู่ที่ ค-4. การเชื่อมต่อคีย์ HMBC และ COZY แสดงในรูปที่ 2 สารประกอบ 3 ไม่ได้ถูกแยกออกในปริมาณที่เพียงพอเพื่อกำหนดการกำหนดค่าสัมบูรณ์ที่ C-2 ในที่สุด ทิวลิปด้าน J (3), 4- -D-glucopyranose-(R)-2-เมทิลบิวทาโนอิกแอซิด ถูกระบุเนื่องจากการอธิบายเชิงโครงสร้างที่กล่าวถึงข้างต้นของ 1 และ 2 ในการศึกษานี้
สารประกอบ 1–3 คือด้านทิวลิป ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์พิเศษชนิดหนึ่งซึ่งประกอบด้วย 4-ไฮดรอกซี2-กรดเมทิลีนบิวทาโนอิก (HMBA) และ/หรือ (3S)-3,4-ไดไฮดรอกซี -2-กลุ่มกรดเมทิลีนบิวทาโนอิก (DHMBA) ที่ตำแหน่ง C-1 และ/หรือ C-6 ของ -D-กลูโคส (Glc) ส่วนใหญ่พบในสกุล Tulipa [8,11] . ถึงตอนนี้ แอนะล็อกด้านทิวลิป ได้แก่ 1-ทิวลิปด้าน A, 6-ทิวลิปด้าน A, 1-ทิวลิปด้าน B, 6-ทิวลิปด้าน B และทิวลิปด้าน D–G ถูกแยกออกจาก Tulipa [8,11] อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีรายงานโครงสร้างของดอกทิวลิปด้าน C และอาจหายไปในเอกสารฉบับก่อนๆ [11] Tulipalins เช่น tulipalin A และ (–)-tulipalin B เป็นส่วน aglycone ของฝั่งทิวลิป ซึ่งแลคโตนเกิดขึ้นเองหลังจากปล่อยกลุ่ม HMBA และ/หรือ DHMBA โดยเอนไซม์เปลี่ยนฝั่งทิวลิป [8,11] ในการศึกษานี้ สารประกอบ 1–3 ชื่อทิวลิปด้าน H–J เป็นของด้านทิวลิป แต่พันธะคู่ของพวกมันที่ C-2 ลดลง และกลุ่ม -D-กลูโคสติดอยู่กับ C-4 (ออกซีเมทิลีน ) แทน C-1 (การทำงานของ O-acyl) ใน HMBA หรือ DHMBA (รูปที่ 1) นอกจากนี้ สารประกอบ 10 (2S,3S) เป็นทิวลิปปาลินแต่ไม่สามารถถูกเมแทบอลิซึมจาก 1 (2R,3S) เนื่องจากโครงแบบที่แตกต่างกันที่ C-2 การสังเคราะห์ทางชีวภาพที่เป็นไปได้ของดอกทิวลิปด้าน 1–3 แสดงไว้ในรูปที่ S29 [8,11]
นอกจากนี้ สารประกอบที่รู้จัก 11 ชนิด ได้แก่ สารอะนาลอกของกรดไพโรกลูตามิกสามชนิด (4–6) อนุพันธ์ของกรดซิตริกสามชนิด (7–9) ฟูราโนนสองตัว (10–11) หนึ่งฟูแรน (12) และสเตอรอยด์สองตัว (13–14) ที่แยกได้จาก A. edulis เป็นครั้งแรก สารประกอบ 1–9 และ 10– 14 ได้มาจากเศษส่วนน้ำมันดิบ TEB และ TEE ตามลำดับ พวกมันถูกระบุว่าเป็น (บวก )-กรดไพโรกลูตามิก (4) [12], (บวก )-เมทิล 5-ออกโซไพร์โรลิดีน-2-คาร์บอกซีเลต (5) [12], (บวก )-บิวทิล {{23 }}ออกโซไพโรลิดีน-2-คาร์บอกซีเลต (6) [12], 1-บิวทิลซิเตรต (7) [13], 1,10 -ไดบิวทิล 5-เมทิลซิเตรต (8) [ 13], ไตรบิวทิลซิเตรต (9) [13], (–)-3-ไฮดรอกซี-2-เมทิลบิวทิโรแลคโตน (10) [14–16], (–)- เมทิล 3-ไฮดรอกซี{{ 44}}ออกโซเตตระไฮโดรฟิวแรน-3-คาร์บอกซีเลต (11) [17], 5-(ไฮดรอกซีเมทิล)เฟอร์ฟูรัล (12) [18], ซิโตสเตอรอล (13) [19] และซิโตสเตอรอล-3- -D -กลูโคส (14) [20] จากข้อมูลสเปกโทรสโกปีและเปรียบเทียบกับเอกสาร
2.2. การอธิบายส่วนประกอบทางเคมีของ TEW
สเปกตรัม NMR 1H และ 13C ของ TEW ซึ่งเป็นเศษส่วนหยาบที่ละลายน้ำได้จากสารสกัด TEM แสดงให้เห็นคล้ายกันมากกับของคาร์โบไฮเดรต (รูปที่ S16 และ S17) มีรายงานว่าโพลีแซคคาไรด์ที่เตรียมจากสปีชีส์นี้มีแรมโนส ไซโลส อะราบิโนส กาแลคโตส แมนโนส กลูโคส และฟรุกโตสหลังการวิเคราะห์โมโนแซ็กคาไรด์ [3,8] ข้อมูลทางสเปกโทรสโกปีของ NMR และปัจจัยการเก็บรักษา TLC (โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง) ของ TEW เมื่อเทียบกับมาตรฐานน้ำตาล (รูปที่ S18–S23) แนะนำว่า D-กลูโคสและ D-ฟรุกโตสเป็นองค์ประกอบหลักในสารสกัด TEW
2.3. ผลของสารสกัดและไอโซเลตต่อการสร้างเมลาโนเจเนซิส
สารสกัด MeOH (TEM) ของสปีชีส์นี้ถูกแยกออกเป็นเศษส่วนหยาบของ TEE, TEB และ TEW และสารสกัดสี่ชนิดดังกล่าวได้รับการประเมินสำหรับความเป็นพิษต่อเซลล์และผลกระทบของการสร้างเมลาโนเจเนซิสในเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16 ที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 12.5 ถึง 200 µg/mL (รูปที่ S24) . TEE แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์อย่างชัดเจนต่อ B16 ที่ 200 µg/mL และ TEB รวมทั้ง TEW มีกิจกรรมที่เป็นพิษต่อเซลล์ที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 12.5 ถึง 200 µg/mL (รูปที่ S24A-1, B-1, C{{13} }, ง-1) ในการวิเคราะห์ทางชีวภาพ มีการใช้ -melanocyte-stimulating hormone ( -MSH) เพื่อกระตุ้นให้เซลล์ B16 สังเคราะห์เมลานินมากขึ้น และ TEM สามารถกระตุ้นการสร้างเม็ดสีได้ในระดับปานกลาง (รูปที่ S24A-2)
ส่วนใหญ่ของไอโซเลตทั้งหมด (รูปที่ 1) ยกเว้น 13 และ 14 ได้รับการทดสอบเพิ่มเติมสำหรับการควบคุมผลกระทบของเมลาโนเจเนซิสที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 10 ถึง 40 ไมโครโมลาร์ โดยใช้อาร์บูตินเป็นตัวควบคุมเชิงบวก (รูปที่ 4) ดังที่แสดงในรูปที่ 4 สารประกอบ 9 ยับยั้งการผลิตเมลานินที่ขึ้นกับขนาดยาอย่างเห็นได้ชัดและเป็นผลมาจากความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อเซลล์ B16 โดยมีค่า IC50 (ความเข้มข้นในการยับยั้งสูงสุดครึ่งหนึ่ง) ที่ 81.9 µM (รูปที่ S25) แยก 4, 6, 10 และ 12 ปริมาณเมลานินที่เพิ่มขึ้นโดยขึ้นอยู่กับปริมาณสูงสุดที่ร้อยละ 11.9 , 29.8 เปอร์เซ็นต์ , 27.2 เปอร์เซ็นต์ และ 17.6 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ที่ 40 µM โดยไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ ไทโรซิเนสมีบทบาทสำคัญในสองขั้นตอนแรกของการสร้างเมลาโนเจเนซิส [6]; ดังนั้น ผลของสารประกอบ 4, 6, 10 และ 12 ต่อไทโรซิเนสในเซลล์จึงได้รับการประเมินเพิ่มเติม -MSH เพิ่มการทำงานของไทโรซิเนสสูงถึง 254.3–305.5 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (100 เปอร์เซ็นต์) (รูปที่ 5 และตาราง S1)
ดังนั้น 4 (ร้อยละ 14.1–21.9 ), 6 (ร้อยละ 15.8–21.9 ), 10 (ร้อยละ 8.5–13.1 ) และ 12 (ร้อยละ 7.5–11.8 ) เพิ่มกิจกรรมของเอนไซม์ไทโรซิเนสในระดับปานกลางในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ที่ความเข้มข้น 10 ถึง 40 µM เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม -MSH (รูปที่ 5 และตาราง S1) กราฟความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณเมลานินในเซลล์และผลกระทบต่อไทโรซิเนสของสารประกอบ 4, 6, 10 และ 12 แสดงไว้ในรูปที่ S26 นอกจากนี้ เพื่อยืนยันผลการกระตุ้นการสร้างเมลาโนเจเนซิสของ 4, 6, 10 และ 12 สารประกอบแต่ละชนิดถูกเพิ่มในเซลล์ B16 โดยไม่มี -MSH ที่บำบัดร่วมกันซึ่งใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกในการทดสอบนี้ (รูปที่ S27) ดังนั้น บุคคลที่ 4, 6, 10 และ 12 ไม่ได้เพิ่มการผลิตเมลานินเพียงอย่างเดียว (รูปที่ S27) คล้ายกับที่แสดงในรูปที่ 4 มีข้อเสนอแนะว่าสารประกอบสี่ชนิดที่กล่าวถึงข้างต้นสามารถเพิ่มผลกระทบของการสร้างเมลาโนเจเนซิสของ -MSH เท่านั้น ดังนั้น เส้นทางสัญญาณเพิ่มเติมในการสร้างเมลาโนเจเนซิส เช่น โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไทโรซิเนส-1 (TRP-1), TRP-2, ปัจจัยการถอดความที่เกี่ยวข้องกับไมโครพาธาลเมีย, ตัวรับเมลาโนคอร์ติน 1, ไซคลิกอะดีโนซีนโมโนฟอสเฟต, โปรตีน kinase A, โปรตีนที่จับกับองค์ประกอบ cAMPresponse, c-Jun N-terminal kinases, ไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์, p38 และ phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B [7,21] ควรได้รับการทดสอบและยืนยันเพิ่มเติมสำหรับ ส่วนประกอบที่ใช้งานอยู่
3. วัสดุและวิธีการ
3.1. ขั้นตอนการทดลองทั่วไป
NMR spectra วัดด้วยเครื่องมือ Bruker Avance Ill 500 MHz (BrukerBillerica อเมริกา) สำหรับ 1H และ 125 MHz สำหรับ 13C-NMR ค่าการเปลี่ยนแปลงทางเคมี (0) มีหน่วยเป็น ppm และค่าคงที่ของการควบรวม () อยู่ในหน่วย Hz ด้วย CD; OD, CDCl และ/หรือ D, O ถูกใช้เป็นตัวทำละลาย รับการหมุนด้วยแสงบนโพลามิเตอร์ JASCO-P-2000 (JASCO, TokyoJapan) (ความยาวเซลล์ 10 มม.) IR spectra ถูกบันทึกไว้ใน PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR spectrometer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) ESIMSelectrospray ionization mass spectrometry ความละเอียดต่ำและความละเอียดสูง) ถูกวัดบนเครื่องสเปกโตรมิเตอร์แบบดักจับความจุสูงพิเศษของ Bruker Daltonics EsquireHCT และเครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลสาร Orbitrap (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific) ตามลำดับ TLC ดำเนินการบน Kieselgel60 F254 (0.25 มม.; Merck) และ/หรือ RP-18 F254S (0.25 มม.; Merck), แผ่นเคลือบแล้วย้อมด้วยการฉีดพ่นด้วยกำมะถัน 5 เปอร์เซ็นต์ (o/u) กรดในสารละลาย MeOH และให้ความร้อนบนจานร้อน ซิลิกาเจล (ซิลิไซเคิล: 70 230 และตาข่าย 230 400), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE ตอนที่ 0 pe open w Bre ใช้กับ SupelcoTM, Bellefonte) และ MCI CHP20P (โครมาโตกราฟีคอลัมน์ SupelcoT. Shimadzu LC-20AT pump และ Shimadzu RID-10เครื่องตรวจจับดัชนีการหักเหของแสง (Shimadzu Inc, Kyoto, Japan) พร้อมกับ Cosmosil 5C18-MS-II ( คอลัมน์ 250 x10 มม. id, 5 um) ที่อัตราการไหล 2.0 มล./นาที ถูกใช้สำหรับ HPLC สารทำปฏิกิริยาน้ำตาลรวมถึง D-กลูโคส (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, ฝรั่งเศส) และ D-ฟรุกโตส (TCI, Tokyoapan) ถูก ใช้สำหรับการวิเคราะห์เศษส่วนน้ำมันดิบที่ละลายน้ำได้ (TEW)
3.2. วัสดุปลูก
หัวแห้งของ A. edulis (ชื่อเดิมคือ T. edulis) ซื้อมาจากร้านขายยาแผนจีนในเมืองไทจง ประเทศไต้หวัน ในเดือนกันยายน 2018 และระบุโดยผู้เขียน Prof. Chang ตัวอย่างใบสำคัญ (TE201809) ถูกฝากไว้ที่ศูนย์วิจัยและพัฒนาการแพทย์แผนจีน มช. ไต้หวัน
3.3. การสกัดและการแยก
หัวของ A. edulis (5.0 kg) ถูกสกัดแปดครั้งด้วย MeOH (8.0 L ต่อครั้ง) ที่อุณหภูมิห้องเพื่อให้ได้สารสกัดหยาบ สารสกัด MeOH (TEM, 525.0 g) ถูกแบ่งสามครั้งระหว่างเอทิลอะซีเตต (EtOAc) และ H2O (1500:1500, v/v) เพื่อให้ EtOAc - ส่วนที่ละลายได้ (TEE, 45.0 ก.) และเฟสที่เป็นน้ำ ซึ่งถูกแบ่งส่วนเพิ่มเติมด้วย n-BuOH/H2O (1500:1500, v/v × 3) แล้วแยกออกเป็น n-BuOH ที่ละลายได้ (TEB, 53.6 ก. ) และเศษส่วนที่ละลายด้วย H2O (TEW, 410.0 ก.)
TEE ได้รับโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์เปิดบนซิลิกาเจล ({{0}}.063–0.200 มม., คอลัมน์: 7 × 26 ซม. เส้นผ่านศูนย์กลาง × ยาว) โดยใช้การไล่ระดับสีของเฮกเซน–EtOAc–MeOH (3{{20}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) และให้ 14 การลบ (TEE1–TEE14) หยาดน้ำฟ้า 14 (249.0 มก.; ผลผลิตการแยก: 0.{{100}}0498 เปอร์เซ็นต์ ) ที่ได้รับจากการย่อย TEE12 (2.2 ก.) ถูกกรองและล้างด้วย MeOH TEE9 (3.6 กรัม) ถูกแยกออกเป็นเจ็ดส่วนย่อย (TEE9-1 ถึง 9-7) โดยซิลิกาเจล (คอลัมน์: 5 × 24 ซม.; CH2Cl2–MeOH, 7:1; 1:1; 0:1 , v/v) ด้วยการหักเศษ TEE9-4 (1.1 ก.) จากนั้นนำไปผ่าน Sephadex LH-20 คอลัมน์โครมาโตกราฟี (คอลัมน์: 5 × 54 ซม.; CH2Cl2–MeOH, 1:1 ถึง 0: 1, v/v) เพื่อให้การหักเจ็ดส่วน (TE9-4-1 เป็น 9-4-7) TEE9- 4-5 และ TEE9-4-6 รวมกัน (ทั้งหมด 551.7 มก.) และทำให้บริสุทธิ์ซ้ำๆ โดย RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55; 20:80, v/v) เพื่อให้ 12 (21.0 มก. ; tR=13 นาที; ผลผลิตการแยก: 0.00042 เปอร์เซ็นต์ ) และสุราแม่ (131.2 มก.) ซึ่งอยู่ภายใต้ RP-HPLC (MeOH–H2O; 10:90, v/v) เพิ่มเติมเพื่อให้สารประกอบ 10 ( 35.5 mg; tR=13 นาที; ผลผลิตการแยก: 0.00071 เปอร์เซ็นต์ ) และ 11 (1.2 mg; tR=15 นาที; ผลผลิตการแยก: 0.000024 เปอร์เซ็นต์ ) เศษส่วน TEE6 (2.7 ก.) แยกได้โดย Sephadex LH-20 (คอลัมน์: 2.5 × 45 ซม.; CH2Cl2–MeOH, 1:1; 0:1, v/v) เพื่อให้ได้ 13 (6.8 มก.; ผลผลิตการแยก: ร้อยละ 0.000136 ).
TEB ถูกโครมาโตกราฟบนคอลัมน์ Diaion HP{{0}} (6 × 60 ซม.; H2O–MeOH– อะซีโตน, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} }0}}:0:100, v/v/v) ให้เศษส่วนหกส่วน (TEB1–TEB6) การหักส่วน TEB5 (502.0 มก.) ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย RP-HPLC (MeOH–H2O, 85:15, v/v) เพื่อให้ได้สารประกอบ 8 (9.3 มก.; tR {{34} } นาที อัตราการแยกเชื้อ: 0.000186 เปอร์เซ็นต์ ) และ 9 (144.2 mg; tR {{4{{2{{2{{218} }9}}3}}}} นาที ผลผลิตการแยก: 0.002884 เปอร์เซ็นต์ ) เศษส่วน TEB3 (5.5 ก.) อยู่ภายใต้โครมาโตกราฟี RP-18 (คอลัมน์: 7 × 25 ซม.; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v) และการหักเศษ TEB3-6 ( 1.0 ก.) ถูกแยกเพิ่มเติมโดย Sephadex LH-20 (คอลัมน์: 5 × 54 cm; MeOH) เพื่อให้ได้การย่อยเจ็ดส่วน (TEB3-6-1 ถึง 3-6-7) TEB3-6-4 (377.1 มก.) ถูกแยกโดย MCI เจลโครมาโตกราฟี (คอลัมน์: 2.5 × 23 ซม.; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, v/v) เพื่อให้การหักเจ็ดส่วน (TEB3-6-4-1 ถึง 3-6-4-7) TEB3-6-4-4 (38.1 มก.) ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย RP-HPLC (MeOH–H2O, 45:55 ในกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์, v/v) เพื่อให้ได้สารบริสุทธิ์ 1 (12.2 มก.; tR=17 นาที; ผลผลิตการแยก: 0.000244 เปอร์เซ็นต์ ) นอกจากนี้ TEB3-6-4-6 (31.0 มก.) ถูกดำเนินการด้วย RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 ในกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์, v/v) เพื่อให้ได้ 6 (7.1 มก.; tR=28 นาที ; ผลผลิตการแยก: 0.000142 เปอร์เซ็นต์ ) TEB3-6-5 (410.7 มก.) แยกได้โดย MCI เจลโครมาโตกราฟี (คอลัมน์: 2.5 × 23 ซม.; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, v/v) เพื่อให้การหักแปดส่วน (TEB3-6-5-1 เป็น 3-6-5-8) TEB3-6-5-3 (75.1 มก.) ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย MCI เจลโครมาโตกราฟี (คอลัมน์: 1 × 20 ซม.; H2O–MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, v/v) เพื่อให้ได้สารประกอบ 4 (59.3 มก.; ผลผลิตการแยก: 0.001186 เปอร์เซ็นต์ ) และ 5 (10.2 มก.; ผลผลิตการแยก: 0.000204 เปอร์เซ็นต์) Subfraction TEB3-6-5-4 (97.0 มก.) ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย RP-HPLC (MeOH–H2O, 40:60 ในกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์, v/v) เพื่อให้ได้ 7 (46.4 มก.; tR=18 นาที; ผลผลิตการแยก: 0.000928 เปอร์เซ็นต์ ) TEB3-10 (925.4 มก.) ถูกโครมาโตกราฟีเหนือ MCI เจลโครมาโตกราฟี (คอลัมน์: 2.5 × 28 ซม.; H2O–MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30 :70; 10:90; 0:100, v/v) เพื่อให้การหักแปดส่วน (TEB3-10-1 ถึง 3-10-8) และบริสุทธิ์ 2 (393.4 มก.; ผลผลิตการแยก: 0.007868 เปอร์เซ็นต์ ) สารประกอบ 3 (6.3 มก.; tR=8 นาที; ผลผลิตการแยก: 0.000126 เปอร์เซ็นต์ ) ได้มาจาก TEB3-10-2 (20.9 มก.) โดยการทำให้บริสุทธิ์ RP-HPLC (MeOH–H2O, 30:70 ใน 0.1 เปอร์เซ็นต์ของฟอร์มิก กรด v/v).
3.3.1. ทิวลิโพไซด์ เอช (1)
[ ] 23 ง −23.1 (ค 0.12, MeOH); IR (เรียบร้อย) νสูงสุด 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C{10}}O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 1075, 1041 (C–O– C), 926, 900, 632, 521 cm−1; ข้อมูลสเปกโทรสโกปี 1H และ 13C NMR ดูตารางที่ 1; HRESIMS m/z 351.1652 [M − H]− (calcd สำหรับ C15H27O9, 351.1655)
3.3.2. ทิวลิโพไซด์ I (2)
[ ] 23 ง −25.8 (ค 0.2, MeOH); IR (เรียบร้อย) νสูงสุด 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C{10}}O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 1077, 1036 (C–O– C), 897, 736, 625, 517 cm−1; ข้อมูลสเปกโทรสโกปี 1H และ 13C NMR ดูตารางที่ 1; HRESIMS m/z 359.1686 [M บวก Na] บวก (calcd สำหรับ C15H28O8Na, 359.1682)
3.3.3. ทิวลิโพไซด์เจ (3)
[ ] 23 D บวก 9.0 (c 0.1, MeOH); IR (เรียบร้อย) νสูงสุด 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C{10}}O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1182, 1120 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm−1; ข้อมูลสเปกโทรสโกปี 1H และ 13C NMR ดูตารางที่ 1; HRESIMS m/z 303.1049 [M บวก Na] บวก (calcd สำหรับ C11H20O8Na, 303.1050)
3.4. (R)-และ (S)-อนุพันธ์ของ MTPA ของ 1
การเตรียมอนุพันธ์เอสเตอร์ (S)-MTPA ของ 1 ได้ดำเนินการโดยขั้นตอน Mosher ester ที่สะดวก [22,23] สารประกอบ 1 (3.4 มก., 0.01 มิลลิโมล) ถูกถ่ายโอนไปในท่อ NMR ที่สะอาดแล้วทำให้แห้งสนิทภายใต้สุญญากาศก่อนที่จะเต็มไปด้วยไนโตรเจน นอกจากนี้ C5D5N ({{20}}.5 มล.) และ (R)-(−)- -เมทอกซี- -(ไตรฟลูออโรเมทิล)-ฟีนิล-อะซีติล คลอไรด์ (MTPA คลอไรด์, 12.2 มก., 0.05 มิลลิโมล) ถูกเติมทันทีในหลอด NMR ที่ปิดสนิทซึ่งถูกเขย่าเพิ่มเติมอย่างระมัดระวังเพื่อผสมตัวอย่างและ MTPA คลอไรด์ บันทึกสเปกตรัม 1H NMR และ 1H-1H COZY ของสารผสมหลังจากทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เอสเทอร์ (R)-MTPA 1 ของ (R)-MTPA ถูกเตรียมเช่นเดียวกันโดยกระบวนการดังกล่าวข้างต้น สารประกอบ 1: 1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0.78 (H-400, t), 1.26 (H-300, sext), 1.28 (H3-5, d), 1.52 ( H-200, quint), 3.08 (H-2, quint), 3.95 (H-50, m), 4.03 (H-4a, dd), 4.05 (H -20, เหลื่อมกัน), 4.15 (H-100, t), 4.23 (H-30, เหลื่อมกัน), 4.23 (H-40, เหลื่อมกัน), 4.36 (H{{ 68}}a, dd), 4.39 (H-3, เหลื่อมกัน), 4.43 (H-4b, dd), 4.53 (H-60b, d) และ 4.95 (H -10, ง).
3.4.1. (S)-MTPA เอสเทอร์ของ 1 (1a)
1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0.77 (H-400, t), 1.17 (H-300, sext), 1.21 (H3-5, d) , 1.37 (H-200, quint), 3.18 (H-2, quint), 3.92 (H-100, t), 3.97 (H-4a, dd), 4.33 (H-50 , m), 4.39 (H-30 , t), 4.49 (H-4b, brd), 4.64 (H-60a, dd), 4.96 (H-10 , d), 5.05 (H-60b, d), 5.70 (H-20 , t), 5.76 (H-40 , t) และ 5.82 (สูง-3, ม.)
3.4.2. (R)-MTPA เอสเทอร์ของ 1 (1b)
1H NMR (C5D5N, 500 MHz) δ 0.79 (H-400, t), 1.26 (H-300, sext), 1.30 (H3-5, d) , 1.50 (H-200, quint), 3.33 (H-2, quint), 3.60 (H-50 , m), 3.94 (H-4a, dd), 4.11 (H-100, t), 4.12 (H-30 , t), 4.13 (H-60a, dd), 4.50 (H-4b, brd), 4.70 (H-10 , d), 4.85 (H-60b, d), 5.56 (H-20 , t), 5.66 (H-40 , t) และ 5.81 (สูง-3, ม.)
3.5. การย่อยสลายด้วยกรดของ Tuliposide I (2)
แยก 2 (78.6 มก.) ถูกไฮโดรไลซ์ใน 1 M HCl (1.5 มล.) ที่ 100 ◦C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง [8] หลังจากการทำให้เย็นลง ของผสมปฏิกิริยาถูกสกัดด้วย CH2Cl2 (2.0 มล. × 3) เพื่อให้ทิวลิปพาลินแอนะล็อก, 3-เมทิลไดไฮโดรฟิวแรน-2(3H)-โอน (11.1 มก.) [ ] 23 D บวก 18.7 (c 1.1, CH2Cl2); 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.30 (3H, d, J=7.0 Hz), 1.94 (ม.), 2.45 (ม.), 2.61 (ม.), 4.20 (ddd, J {{43} }.8, 6.8, 6.4 Hz), 4.33 (ddd, J=8.8, 8.8, 2.8 Hz) 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15.2, 30.7, 34.1, 66.2, 180.1 (รูปที่ S28); ESIMS m/z 101.06 [M บวก H] บวก
3.6. การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์มะเร็งเมลาโนมา B16 ของหนูถูกเพาะเลี้ยงใน Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO Invitrogen corporation, New York, NY, USA) ของ Dulbecco เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ fetal bovine serum, 100 U/mL ของ penicillin และ 100 µg/mL ของ streptomycin ที่อายุ 37 ปี ◦C ในตู้อบ CO2 5 เปอร์เซ็นต์
3.7. การวัดความมีชีวิตของเซลล์ B16
ความเป็นพิษต่อเซลล์ของเซลล์ B16 สำหรับสารประกอบทดสอบถูกวัดโดย MTT ด้วยโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้พร้อมการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [6] เซลล์ถูกเพาะใน 96-จานหลุม (1 × 103 เซลล์/หลุม) และเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่จะถูกบำบัดด้วยสารประกอบอีก 72 ชั่วโมง หลังจากนั้น สื่อถูกนำออก 100 µL ของ MTT reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 มก./มล.) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ผลึกฟอร์มาซานถูกละลายใน 100 µL DMSO และวัดความหนาแน่นของแสงโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Germany) ที่ 570 นาโนเมตร
3.8. การวัดปริมาณเมลานินในเซลล์ B16
ปริมาณเมลานินในเซลล์ B16 ถูกตรวจสอบตามวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย [6] เพาะเซลล์ที่ความหนาแน่น 5 × 103 เซลล์/หลุมใน 24-จานหลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง อาหารเลี้ยงเชื้อถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสด 500 µL ที่มี 0.5 µM -MSH โดยมีหรือไม่มีสารประกอบเป็นเวลา 72 ชั่วโมง ใช้อาร์บูติน (1 mM) เป็นตัวควบคุมเชิงบวก หลังจากนั้น นำสื่อออกและล้างด้วย PBS (pH 6.8) สองครั้ง เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดย NaOH (200 µL, 2 N) จากนั้นให้ความร้อนที่ 85 ◦C เป็นเวลา 30 นาที หลังจากทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิห้องและปั่นแยก วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท
3.9. กิจกรรมไทโรซิเนสภายในเซลล์
การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนสในเซลล์ดำเนินการโดยวิธีการดัดแปลงเล็กน้อยซึ่งมีรายงานก่อนหน้านี้ [6] เซลล์ถูกเพาะใน 24-จานหลุมที่ความหนาแน่น 5 × 103 เซลล์/หลุม เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดใน DMEM ที่มี 0.5 µM -MSH โดยมีหรือไม่มีสารประกอบเป็นเวลา 72 ชั่วโมง หลังจากนำสื่อออกแล้ว เซลล์จะถูกล้างด้วย PBS เย็น (pH 6.8) สองครั้ง เซลล์ถูกแยกด้วย 100 µL lysis buffer (1 เปอร์เซ็นต์ของไตรตัน X-100 ใน PBS) และแช่แข็งที่ −80 ◦C เป็นเวลา 15 นาที
จากนั้น เซลล์ไลเซทถูกหมุนเหวี่ยงที่ 13,200× g ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อให้ได้ส่วนเหนือตะกอน ปริมาณโปรตีนทั้งหมดของส่วนเหนือตะกอนถูกหาปริมาณโดยการทดสอบโปรตีน BCA ถัดไป แต่ละไลเซตเชิงปริมาณ (30 µg/90 µL) ผสมกับ L-DOPA 10 µL (15 มิลลิโมลาร์) ในจาน 96-หลุม จากนั้นบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และวัดค่าการดูดกลืนแสง ที่ 405 นาโนเมตร โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท
4. ข้อสรุป
โดยรวมแล้ว สารประกอบบริสุทธิ์ 14 ชนิด ซึ่งรวมถึงไอโซพรีนอยด์ไกลโคไซด์ใหม่สามชนิด และด้านทิวลิป H–J (1–3) ถูกแยกได้จาก A. edulis อนุพันธ์ของกรดซิตริก 9, ไตรบิวทิล ซิเตรต มีฤทธิ์ต้านการสร้างเมลาโนเจเนซิสอย่างมีนัยสำคัญ แต่แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์ต่อเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดบี 16 ซึ่งสามารถนำไปวิจัยเพิ่มเติมสำหรับยาต้านมะเร็งผิวหนังได้ ในขณะที่ pyroglutamic acid analogs 4 และ 6, furanone 10 และ furan 12 มีปริมาณเมลานินเพิ่มขึ้นขึ้นอยู่กับขนาดยาและกระตุ้นไทโรซิเนสซึ่งสามารถศึกษาเพิ่มเติมสำหรับโรคผิวหนัง vitiligo หรือสารต่อต้านการฟอกสีฟันและสารป้องกันการเกิดรอยดำสำหรับผม อย่างไรก็ตาม กลไกในหลอดทดลองและ/หรือการศึกษาในร่างกายจำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบโดยละเอียดเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์
วัสดุเสริม:
ข้อมูลต่อไปนี้พร้อมใช้งานทางออนไลน์ รูปที่ S1–S5: ข้อมูลสเปกตรัม NMR ของสารประกอบ 1 รูปที่ S6–S10: ข้อมูลสเปกตรัม NMR ของสารประกอบ 2 รูปที่ S11–S15: ข้อมูลสเปกตรัม NMR ของสารประกอบ 3 รูปที่ S16–S22: ข้อมูลสเปกตรัม NMR ของ TEW, รูปที่ S23: การวิเคราะห์ TLC ของ TEW, รูปที่ S24: ความเป็นพิษต่อเซลล์และการควบคุมผลกระทบของเมลาโนเจเนซิสของ TEM, TEE, TEB และ TEW, รูปที่ S25: ข้อมูลความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบ 1–12, รูปที่ S26: กราฟความสัมพันธ์ระหว่าง ปริมาณเมลานินของเซลล์และผลกระทบต่อไทโรซิเนสของสารประกอบ 4, 6, 10 และ 12, รูปที่ S27: ผลกระทบของเมลาโนเจเนซิสของสารประกอบ 4, 6, 10 และ 12 เพียงอย่างเดียวโดยไม่มี -MSH, รูปที่ S28: NMR สเปกตรัมและข้อมูลการหมุนด้วยแสงของ ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการไฮโดรไลซิสด้วยกรดของสารประกอบ 2, รูปที่ S29: การสังเคราะห์ทางชีวภาพที่เป็นไปได้ของสารประกอบ 1−3, ตาราง S1: ฤทธิ์ของเอนไซม์ไทโรซิเนสของสารประกอบ 4, 6, 10 และ 12
ผลงานของผู้เขียน:
การสร้างแนวคิด, C.-LL; การระบุวัสดุปลูก มย.-วท.; การดำเนินการแยกและการทำให้บริสุทธิ์, C.-LL และ Z.-AG; การดำเนินการของ bioassays, Y.-LJ; การวิเคราะห์สเปกตรัมและการกำหนดโครงสร้างทั้งหมด, C.-LL และ C.-JC; การเขียนการเตรียมร่างต้นฉบับ ค.-LL ผู้เขียนทุกคนได้อ่านและยอมรับต้นฉบับฉบับที่จัดพิมพ์แล้ว
เงินทุน:
งานวิจัยนี้ได้รับทุนจากกระทรวงวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (MOST 108-2320-B039-035-) และ China Medical University (CMU108-MF-84) ประเทศไต้หวัน APC ได้รับทุนสนับสนุนจาก "ศูนย์วิจัยการแพทย์แผนจีน มหาวิทยาลัยการแพทย์จีน" จากโครงการศูนย์วิจัยพื้นที่เด่นภายในกรอบของโครงการต้นกล้าการศึกษาระดับอุดมศึกษาโดยกระทรวงศึกษาธิการ (MOE) ในไต้หวัน (CMRC-CHM{{5} }).
คำชี้แจงของคณะกรรมการพิจารณาสถาบัน:
ไม่สามารถใช้ได้.
คำชี้แจงความยินยอมที่ได้รับการบอกกล่าว:
ไม่สามารถใช้ได้.
คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล:
ไม่สามารถใช้ได้.
กิตติกรรมประกาศ:
งานนี้ได้รับการสนับสนุนทางการเงินจากกระทรวงวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (MOST 108-2320-B-039-035-) และ China Medical University (CMU108-MF-84) ประเทศไต้หวัน รวมทั้ง รางวัล "Chinese Medicine Research Center, China Medical University" จาก The Featured Areas Research Center Program ภายใต้กรอบของ Higher Education Sprout Project โดยกระทรวงศึกษาธิการ (MOE) ในไต้หวัน (CMRC-CHM-1) มอบให้กับ C .-LL
ผลประโยชน์ทับซ้อน:
ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
ตัวอย่างห้องว่าง:
ตัวอย่างของสารประกอบ 1–14 มีให้จากผู้เขียน
อ้างอิง
1. หลิน อาร์; หลี่, ซี; หลิน เจ; เยเจ; ไค, Q.; เฉิน, ล.; Peng, J. สารสกัด Ethanolic ของ Tulipa edulis Bak กระตุ้นการตายของเซลล์ใน SGC-7901 เซลล์มะเร็งกระเพาะอาหารของมนุษย์ผ่านทางเส้นทางการส่งสัญญาณของไมโทคอนเดรีย ออนคอล. เล็ต 2558, 10, 2371–2377. [ครอสรีฟ] [PubMed]
2. แฟน ย.; ฮู, X.; กู, ป.; เลเวล, X.; Zhao, L.; วัง เอช; โจว แอล; Feng, Y. การสกัด Amana edulis ทำให้เกิด apoptosis ของมะเร็งตับ Evid.-Based Complement. ทางเลือก แพทย์ 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]
3. จี, YH; เหลียว น.; หวง, JH; ฐากูร, พ.; หลี่, เอ็กแอล; Wei, ZJ ศักยภาพทางเคมีกายภาพและสารต้านอนุมูลอิสระของโพลีแซคคาไรด์ที่สกัดตามลำดับจาก Amana edulis ภายใน เจ. ไบโอล. แมคโครมอล. 2019, 131, 453–460. [ครอสรีฟ]
4. จี, YH; เหลียว น.; หวง, JH; ฐากูร, พ.; หลี่, เอ็กแอล; Wei, ZJ คุณสมบัติการไหลและพฤติกรรมอิมัลชันของพอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดตามลำดับจาก Amana edulis ภายใน เจ. ไบโอล. แมคโครมอล. 2019, 137, 160–168. [ครอสรีฟ]
5. เฉา ปป; จี วายเอช; เหลียว น.; หวง, JH; ฐากูร, พ.; หลี่, เอ็กแอล; หู, ฉ.; จาง เจจี; Wei, ZJ ผลของการดัดแปลงซัลเฟต ฟอสโฟรีเลต และคาร์บอกซีเมทิลเลตต่อกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลองของโพลีแซคคาไรด์ที่สกัดตามลำดับจาก Amana edulis ภายใน เจ. ไบโอล. แมคโครมอล. 2020, 146, 887–896. [ครอสรีฟ]
6. ลาย KY; หู HC; เชียง หือ; หลิว, วายเจ; ยาง เจซี ; หลิน, ย่า; เฉิน ซีเจ ; ช้าง, ยส; Lee, CL ใหม่ diterpenes leojaponins G−L จาก Leonurus japonicus Fitoterapia 2018, 130, 125−133. [ครอสรีฟ]
7. อัลลาห์, เอส.; จุง, วายซี; ฮยอน CG การเหนี่ยวนำการสร้างเมลาโนเจเนซิสโดยฟอสโฟมัยซินในเซลล์ B16F10 ผ่านการควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ P-JNK และ P-p38 ยาปฏิชีวนะ 2020, 9, 172 [CrossRef] [PubMed]
8. คริสเตนเซ็น LP; Kristiansen, K. การแยกและการหาปริมาณด้านทิวลิปและทิวลิปปาลินในดอกทิวลิป (Tulipa) โดยโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง ติดต่อเดอร์แมท. 2542, 40, 300−309. [ครอสรีฟ]
9. อ.ตรีปทิ; พุดดิก เจ; ปริญเสป, ม.ร.ว. ; ลี พีพีเอฟ; Tan, LT Hantupeptins B และ C, ไซโคลเดปซิเปปไทด์ที่เป็นพิษต่อเซลล์จากไซยาโนแบคทีเรียในทะเล Lyngbya majuscula พฤกษเคมี 2010, 71, 307−311. [ครอสรีฟ]
10. Qabaja, G.; วิลเลนท์, JE; เบนาวิเดส เออาร์ ; บุลลาร์ด จีอี; Petersen, KS Facile การสังเคราะห์ของไฮดรอกซีเอสเทอร์ที่ถูกแทนที่ด้วยเอนทิโอที่เสริมคุณค่าได้หลากหลายผ่านกรดเบรินสเตดเร่งปฏิกิริยาจลนพลศาสตร์ที่เร่งปฏิกิริยา องค์กร เล็ต 2013, 15, 1266−1269. [ครอสรีฟ]
11. โนมูระ ที.; Kato, Y. การจำแนกทิวลิปโอไซด์ G ซึ่งเป็นทิวลิปโอไซด์ประเภทกลูโคไซด์เอสเตอร์ชนิดใหม่และการกระจายตัวในดอกทิวลิป ซี. เนเทอร์ฟอร์ช. ซีเจ ไบโอไซ 2020, 75, 75−86 [ครอสรีฟ]
12. แก๊ง ฟลอริดา; จู้, ฉ.; หลี่ เอ็กซ์ที; เหว่ย เจแอล; วู ดับบลิวเจ ; Zhang, JW การสังเคราะห์และการประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพของ L-pyroglutamic acid analogs จากสารตะกั่วในผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ ไบโอออร์ก. แพทย์ เคมี 2018, 26, 4644–4649. [ครอสรีฟ]
13. เวเรชชากิน แอละแบมา; อานิกินา อีวี; เซอร์ไชน่า เอไอ ; ลาแปง MF; อาซิน, แอลเอ; Semenov, AA การตรวจสอบทางเคมีของสารที่มีรสขมของผลไม้ Lonicera caerulea เคมี ณัฐ. คอมพ์ 2532, 25, 289−292. [ครอสรีฟ]
14. ไจ ซี; ออร์ตูโน, RM; Font, J. Di- และ trisubstituted -lactones การศึกษาโครงสร้างโดยการคำนวณทางกลศาสตร์โมเลกุลและการวิเคราะห์ค่าคงตัวคู่ควบ เจ. ออร์ก. เคมี 2529, 51, 3946−3951. [ครอสรีฟ]
15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Enantiomerically บริสุทธิ์ , -epoxyesters จาก -hydroxylactones: การสังเคราะห์ของ -hydroxyesters และ (-)-GABOB จัตุรมุข 1990, 46, 4277−4282. [ครอสรีฟ]
16. ไจ, ซี; เซกูรา, ซี; Dinarés, I.; Font, J. แทนที่ -lactones ด้วยอะตอมของไฮโดรเจน การศึกษาโครงสร้างโดยการคำนวณ MM2 และการวิเคราะห์ค่าคงที่ของคัปปลิ้ง เจ. ออร์ก. เคมี 2536, 58, 154−158. [ครอสรีฟ]
17. โมริ, เค; Fukamatsu, K. การสังเคราะห์ (1R,5S)-( บวก )-ฟรอนทาลินจาก (S)-(−)-2-กรดไฮดรอกซีพาราโคนิก ลีบิกส์ แอน เคมี 2535, 11, 1191−1193.
18. มิยาซาว่า ม.; อันไซ เจ; ฟุจิโอกะ เจ; Ishikawa, Y. สารกำจัดแมลงต่อแมลงหวี่ melanogaster จาก Cornus officinalis Sieb และ Zucc ณัฐ. แยง. ความละเอียด 2546, 17, 337−339. [ครอสรีฟ] [PubMed]
19. ลี ซีแอล; วัง ซม; หู HC; เยน, HR; ซ่ง, วายซี; ยู เอสเจ ; เฉิน ซีเจ ; หลี่ สุขา; Wu, YC Indole alkaloids indigo-doles A–C จากชิ้นส่วนทางอากาศของอาหาร Strobilanthes ในยาจีนโบราณ Qing Dai มีคุณสมบัติต่อต้าน IL-17 พฤกษเคมี 2019, 162, 39−46. [ครอสรีฟ] [PubMed]
20. Faizi, S.; อาลี ม.; ซาลีม อาร์; อิรฟานัลเลาะห์ ; Bibi, S. เสร็จสิ้นการมอบหมาย 1H- และ 13C-NMR ของมลทิน-5-en-3-O- -กลูโคไซด์และอนุพันธ์ของอะซิติล ขนาด เรซอน. เคมี 2544, 39, 399–405. [ครอสรีฟ]
21. กัว YH; เฉิน ซีซี; อู๋ พีวาย; วู ซีเอส ; ซุง, พีเจ; หลิน, ไซย่า; Chiang, HM N-(4-methoxyphenyl) กลไกการยับยั้งการสร้างเมลาโนเจเนซิสที่เกิดจากคาเฟอีน BMC เสริม ทางเลือก แพทย์ 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]
22. โอทานิ ฉัน.; คุซึมิ, ที.; Kashman, ย.; Kakisawa, H. การประยุกต์ใช้ FT NMR ฟิลด์สูงของวิธีการของ Mosher การกำหนดค่าสัมบูรณ์ของเทอร์พีนอยด์ในทะเล แยม. เคมี สังคม 2534, 113, 4092−4096. [ครอสรีฟ]
23. ลี ซีแอล; ช้าง, FR; เซีย, PW; เชียง, มาย; อู๋ ซีซี; หวาง ซีวาย ; ลาน, YH; เฉิน ม.; ลี เคเอช ; เยน HF; และอื่น ๆ Cytotoxic ent-abietane diterpenes จาก Gelonium aequoreum พฤกษเคมี 2551, 69, 276−287. [ครอสรีฟ] [PubMed]
1 Department of Cosmeceutics, China Medical University, Taichung 406040, Taiwan
2 ศูนย์วิจัยและพัฒนาการแพทย์แผนจีน China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan
3 Chinese Medicine Research Center, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan
4 Department of Chinese Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine Resources, China Medical University, Taichung 40402, Taiwan
5 Graduate Institute of Integrated Medicine, China Medical University, Taichung 40402, ไต้หวัน
6 Proteomics Core Laboratory, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan
For more information:1950477648nn@gmail.com
