ผลการรักษาของ Cistanoside A ต่อการเผาผลาญกระดูกของหนูที่ตัดรังไข่ออก

1. บทนำ

โรคกระดูกพรุน ซึ่งเป็น "นักฆ่าเงียบ" ของระบบโครงกระดูก ได้กลายเป็นอันตรายต่อสุขภาพที่สำคัญที่กระทบต่อผู้คนมากกว่า 2,000 ล้านคนทั่วโลกในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา โดยมีลักษณะเฉพาะคือความหนาแน่นของมวลกระดูกต่ำ (BMD) และการเสื่อมสภาพทางสถาปัตยกรรมระดับจุลภาค ซึ่งเกิดจากการสลายของกระดูกส่วนเกินเหนือการสร้างกระดูก และสุดท้ายส่งผลให้เกิดกระดูกพรุนหัก ในปัจจุบัน การระบุสารที่จะบล็อกความแตกต่างและการสลายของกระดูกเป็นกลยุทธ์ที่ใช้กันทั่วไปและประสบความสำเร็จในการพัฒนายารักษาโรคกระดูกพรุน และจริงๆ แล้วมีสารสังเคราะห์หลายชนิด รวมถึง estradiol valerate และ alendronate Sodium ที่สามารถทำได้ป้องกันและรักษาโรคกระดูกพรุน- อย่างไรก็ตามยารักษาโรคยังห่างไกลจากอุดมคติ ยาเหล่านี้บางชนิดอาจเพิ่มความเสี่ยงต่อมะเร็งเยื่อบุโพรงมดลูกและมะเร็งเต้านม และยังมีผลข้างเคียงในระดับหนึ่ง เช่น แคลเซียมในเลือดสูง แคลเซียมในเลือดสูง เป็นต้น ซึ่งจำกัดการใช้งานทางคลินิก ดังนั้น เป็นเวลากว่าสหัสวรรษที่ยาแผนจีน (TCM) โดยเฉพาะ TCM ที่รับประทานได้ซึ่งมีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพและเศษส่วนได้ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางอย่างปลอดภัยและมีประสิทธิภาพในประเทศแถบเอเชีย เพื่อป้องกันและรักษาโรคต่างๆ รวมถึงโรคกระดูกพรุน

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับการรักษาและป้องกันโรคกระดูกพรุน PHGS75% ECH 30% ACT 12%

โรคกระดูกพรุนมีลักษณะพิเศษคือการสลายกระดูกที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากการสร้างกระดูกเพิ่มขึ้น และกระบวนการนี้เกี่ยวข้องกับการมุ่งมั่นของโมโนไซต์เม็ดเลือดในสารตั้งต้นของกระดูกซึ่งหลอมรวมเพื่อสร้างเซลล์สร้างกระดูกหลายนิวเคลียสที่กำหนดเป้าหมายบริเวณกระดูกที่อยู่ระหว่างการเปลี่ยนแปลง [4] ตัวกระตุ้นตัวรับสำหรับปัจจัยนิวเคลียร์-κBลิแกนด์ (RANKL) ซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญที่หลั่งออกมาจากเซลล์สร้างกระดูก ช่วยกระตุ้นการสร้างความแตกต่างของโมโนไซต์ไปเป็นเซลล์สร้างกระดูก [8,9] ปฏิสัมพันธ์ของ RANKL กับตัวรับ RANK ส่งผลให้เกิดเหตุการณ์ภายในเซลล์จำนวนมาก รวมถึง NF-κB, PI3K/Akt และไคเนสที่ขึ้นกับแคลเซียม/คาลโมดูลินโดยการสรรหาปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับตัวรับโปรตีนสัญญาณ TNF (TRAF6) เป็นผลให้ยีนมาร์กเกอร์ที่เกี่ยวข้องกับโรคกระดูกพรุนหลายชนิด รวมถึง TRAP, cathepsin K และ DPD ได้รับการควบคุม และกระบวนการสลายกระดูกจะถูกเร่งให้เร็วขึ้น

ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์มีลักษณะพิเศษคือกรดซินนามิกและไฮดรอกซิลฟีนิลเอทิลมอยอิตีที่เกาะติดกับกลูโคปาราโนส (เอพิโอส กาแลคโตส แรมโนส ไซโลส ฯลฯ) ผ่านทางพันธะไกลโคซิดิก ซึ่งมีการกระจายอย่างกว้างขวางในพืชสมุนไพร [10] ซิสตาโนไซด์ เอ (Cis A) มีฤทธิ์ออกฤทธิ์ฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ใน Cistanche Deserticola YC Ma ตามบันทึกของเภสัชตำรับแผนจีน C. Deserticola มักใช้รักษาภาวะขาดหยินไต กล้ามเนื้ออ่อนแรง เอวอ่อนแรง ฯลฯ และฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์เป็นองค์ประกอบหลักที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพในสมุนไพรนี้ [11] ตามทฤษฎี 'ไต' ของ TCM ไตสามารถควบคุมระบบกระดูกได้ ซึ่งหมายความว่าการพัฒนาและการทำงานของกระดูกขึ้นอยู่กับแก่นของไต และแก่นของไตนี้สามารถเปลี่ยนเป็นไขกระดูกเพื่อหล่อเลี้ยงกระดูก ส่งเสริมการเจริญเติบโตและการซ่อมแซมโครงกระดูกและเสริมสร้างโครงกระดูก [12] เนื่องจาก C. Deserticola สามารถทำให้ไตแข็งแรงขึ้น เราจึงคิดว่า Cis A สามารถป้องกันและรักษาโรคกระดูกพรุนได้ การศึกษาครั้งนี้จึงได้รับการออกแบบเพื่อตรวจสอบศักยภาพของCis A ในการป้องกันโรคกระดูกพรุนโดยใช้แบบจำลองหนูที่ตัดรังไข่ออก และการสร้างกระดูกและเครื่องหมายการสลาย เช่นเดียวกับกลไกที่เป็นไปได้ที่เกี่ยวข้อง ถูกกำหนดเพื่อประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพในการต้านโรคกระดูกพรุนของสารนี้

2. ผลลัพธ์และการสนทนา

2.1. ผลลัพธ์

2.1.1. ผลของ Cis A ต่อการทดสอบการดัดงอแบบสามจุดของกระดูก

เพื่อวิเคราะห์ว่าการรักษาด้วย Cis A จะทำให้กระดูกแข็งแรงขึ้นหรือไม่ เราทำการทดสอบการดัดงอแบบสามจุดด้วยโคนขาโคนขา ดังที่แสดงในรูปที่ 1 น้ำหนักสูงสุดที่ใช้เมื่อกระดูกหักคือ 21.5% และ 22.0% สูงกว่าในสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย 20 มก./กก. และ 80 มก./ kg Cis A ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับสัตว์ในกลุ่มที่ตัดรังไข่ (OVX) (p < 0.05) ในขณะเดียวกัน การรักษาด้วย Cis A ยังช่วยเพิ่มความแข็งของกระดูกอีกด้วย หนูที่ได้รับการรักษาด้วย Cis A ทั้งหมดมีความแข็งเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญด้วยข้อมูล 121 0 ± 12.1 (p < 0.05), 124.1 ± 16.2 (p < 0.05) และ 127.7 ± 9.6 (p < 0.01) ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับ 102.2 ± 10.7 ของหนู OVX ผลการวิจัยระบุว่าความแข็งแรงของกระดูกที่เพิ่มขึ้นในหนู OVX ที่รักษาด้วย Cis A เนื่องมาจากปริมาณกระดูกที่เพิ่มขึ้นและการเพิ่มประสิทธิภาพของคุณภาพกระดูก

2.1.2. ผลของ Cis A ต่อสถาปัตยกรรมจุลภาคของกระดูก

สถาปัตยกรรมจุลภาคกระดูก trabecular สามมิติของหนูที่วัดโดย micro-CT (รูปที่ 2 และตารางที่ 1) แสดงให้เห็นโดยสัญชาตญาณว่าหนูในกลุ่ม OVX นำเสนอการลดลงอย่างเห็นได้ชัดในพื้นที่ trabecular และจำนวน trabecular เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มหลอกลวง ซึ่งบ่งชี้ว่าการผ่าตัดรังไข่ออก อาจทำให้ความหนาแน่นของมวลกระดูกลดลงอย่างเห็นได้ชัด (BMD, −46%), ปริมาณแร่ธาตุในกระดูก (BMC, −66%), ปริมาณแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMC, −85%), เศษส่วนปริมาตรกระดูก (BVF, −82%) จำนวน trabecular (Tb. N, −76%) และการเพิ่มขึ้นของการแยก trabecular (Tb. Sp, +80%) โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในความหนาแน่นของเนื้อเยื่อรวม (TMD) และความหนาของ trabecular (Tb. Th) หลังจาก การดำเนินการ 12 สัปดาห์ อย่างไรก็ตาม หนู OVX ที่รักษาด้วย Cis A ส่งผลให้ BMD เพิ่มขึ้นตามขนาดยา (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), ลด Tb ได้มากขึ้น Sp (−79%~88%) และ Tb ที่ปรับปรุงเพิ่มเติม N (+73%~82%) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม OVX TMD ดูเหมือนจะไม่ได้รับอิทธิพลจากการผ่าตัดรังไข่ แต่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อรักษาด้วย estradiol valerate (EV)

2.1.3. ผลของ Cis A ต่อการสร้างกระดูกและเครื่องหมายการสลาย

ผลกระทบของ Cis A ต่อเครื่องหมายการสลายของกระดูก รวมถึง TRAP, DPD, cathepsin K ดัชนีการสร้างกระดูก ALP และกระดูก Gla-protein (BGP) แสดงในรูปที่ 3 หลังจากการผ่าตัดรังไข่เป็นเวลา 12 สัปดาห์ กิจกรรมของ TRAP, DPD และ cathepsin K ในกลุ่ม OVX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โดยเฉพาะ DPD ซึ่งเพิ่มขึ้นเกือบ 55.6%; TRAP และ cathepsin K ได้รับการปรับปรุง 43.5% และ 38.1% ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มหลอกลวง Cis A ซึ่งรับประทานทางปากเป็นเวลา 12 สัปดาห์ แสดงให้เห็นถึงศักยภาพที่โดดเด่นในการป้องกันเครื่องหมายการสลายของกระดูกทั้งหมดที่กล่าวมาข้างต้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งขนาดยาที่สูง (80 มก./กก.) ซึ่งแสดงผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการระงับกิจกรรมของ DPD 45.0% TRAP 49.0% และ cathepsin K 44.0% ตามลำดับ (p < 0.01) เมื่อเปรียบเทียบกับ หมู่ OVX (รูปที่ 3) แม้ว่าแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นของกิจกรรม ALP และ BGP จะแสดงในกลุ่ม OVX แต่ก็ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติ อย่างไรก็ตาม การปรับปรุงที่สำคัญในกิจกรรม ALP ถูกพบในกลุ่มที่ได้รับ Cis A ต่ำและสูง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเสแสร้ง (p <0.01)

CISTANCHE TUBULOSA ธรรมชาติสำหรับการป้องกันโรคกระดูกพรุน75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. ผลของ Cis A ต่อระดับการแสดงออกของโปรตีนของ TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG และ RANKL

การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อตเปิดเผยว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มเสแสม ระดับโปรตีนของ TRAF6, NF-κB และ RANKL ในกลุ่ม OVX เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) ในขณะที่ OPG PI3K และ Akt ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4) Cis A (2 0 มก. / กก. หรือ 80 มก. / กก.) ลดการแสดงออกของ TRAF6 อย่างมีนัยสำคัญ (p <0.05) ตามด้วยการแสดงออกของ RANKL ที่ลดลงและ OPG เพิ่มขึ้น ซึ่งหมายความว่าอัตราส่วน OPG / RANKL ได้รับการควบคุม ดังนั้นการส่งสัญญาณลดหลั่นของ NF-κBจึงถูกลดระดับลงและ PI3K / Akt ได้รับการควบคุมโดยการรักษา Cis A (p <0.05)

2.2. การอภิปราย

เมื่อพิจารณาถึงข้อจำกัดของทางเลือกในการรักษาโรคกระดูกพรุนในปัจจุบัน จึงมีความจำเป็นที่ต้องใช้ทางเลือกอื่นแทนอาหารหรือพืชสมุนไพรที่รับประทานได้ตามธรรมชาติ ในฐานะที่เป็นส่วนหนึ่งของความพยายามอย่างต่อเนื่องของเราในการค้นหาสารต้านโรคกระดูกพรุนที่มีประสิทธิภาพจาก TCM เราพบชุดของสารสกัด เศษส่วน และสารประกอบที่มีฤทธิ์ของคุณสมบัติต้านโรคกระดูกพรุน [13,14] Cistanche Deserticola เป็นยา TCM แบบคลาสสิกที่สำคัญ ซึ่งพบว่ามีความปลอดภัยที่ดี [15] และมีประโยชน์ทางยาอย่างกว้างขวางสำหรับการรักษาภาวะไตบกพร่อง เป็นต้น [16] ตามทฤษฎีของ TCM พบว่า TCM ที่มีผลในการทำให้ไตแข็งแรงมักจะเป็นใช้ในการรักษาโรคกระดูกพรุน- ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์เป็นองค์ประกอบหลักที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพในสมุนไพรนี้ จึงหมายความว่าฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ที่มีอยู่ใน C. Deserticola อาจมีคุณสมบัติต้านโรคกระดูกพรุน ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสารสกัด C. Deserticola สามารถยับยั้งการลดลงของ BMD ได้อย่างมีนัยสำคัญ และป้องกันการเสื่อมสภาพของสถาปัตยกรรมไมโครเนื้อโปร่งที่เกิดจาก OVX [17] ในการทดลองในหลอดทดลอง ยังเพิ่ม ALP, โปรตีนทางสัณฐานวิทยาของกระดูก-2 และ mRNA ของกระดูกออปโปนตินอย่างมีนัยสำคัญ รวมถึงการเพิ่มแร่ของกระดูกของเซลล์สร้างกระดูกที่เพาะเลี้ยง [18] Echinacoside ซึ่งเป็นส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลักใน C. Deserticola ที่บันทึกไว้อย่างเป็นทางการในเภสัชตำรับจีน [11] มีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนในปริมาณสูงที่ 30~270 มก./กก. น้ำหนักตัว/วัน [19] และผลการทดลองในหลอดทดลองเพิ่มเติมแสดงให้เห็นว่า สามารถส่งเสริมการสร้างกระดูกใหม่โดยการเพิ่มอัตราส่วน OPG/RANKL ใน MC3T3-E1 Subclone 14 เซลล์ [20] Cis A เป็นหนึ่งในฟีนิลเอธานอลไกลโคไซด์ที่แยกได้จาก C. Deserticola และรายงานหลายฉบับเปิดเผยว่าสารประกอบนี้มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ [21] และคุณสมบัติต้านการอักเสบ [22,23] บทความที่ตีพิมพ์เมื่อเร็วๆ นี้พบว่า Cis A แสดงฤทธิ์ในการป้องกันทั้ง CCl4 และความเป็นพิษต่อตับที่เกิดจากแอลกอฮอล์ในหนู และยังแสดงให้เห็นคุณสมบัติในการป้องกันความเสียหายที่เกิดจากเอธานอลในเซลล์ตับของหนูที่เพาะเลี้ยงปฐมภูมิ ในหลอดทดลอง [24] ในการศึกษาปัจจุบันของเรา ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า Cis A มีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนในปริมาณที่ต่ำ (20~80 มก./กก. น้ำหนักตัว/วัน) โดยใช้แบบจำลองหนูที่ตัดรังไข่ออก และการออกฤทธิ์ทางชีวภาพนี้กระทำโดยการลดระดับของ TRAF6 ซึ่งยับยั้ง การแสดงออกของ RANKL และ NF-κB และการกระตุ้น OPG, PI3K และ Akt ซึ่งหมายความว่าผลการรักษาของ Cis A ในหนู OVX เกิดขึ้นผ่านกลไกของการปิดใช้งาน NF-kappaB ที่เป็นสื่อกลางของ TRAF6- และการเปิดใช้งาน PI3K/Akt

เป็นที่ทราบกันดีว่าการผ่าตัดรังไข่ออกอาจทำให้เกิดโรคกระดูกพรุนโดยมีค่า BMD ความแข็งแรงทางชีวกลศาสตร์ คุณภาพของกระดูก และโครงสร้างจุลภาคของกระดูก trabecular ลดลงอย่างเห็นได้ชัด และการเปลี่ยนแปลงข้างต้นส่วนหนึ่งเป็นผลมาจากการขาดฮอร์โมนเอสโตรเจน [25] ขณะนี้ในการทดลอง ในสัตว์ทดลอง ปัจจุบัน การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าโรคกระดูกพรุนที่เกิดจากการผ่าตัดรังไข่ส่งผลให้ความแข็งแรงทางชีวกลศาสตร์และพารามิเตอร์โครงสร้าง trabecular ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ รวมถึง BMD, BMC, TMC และ Tb N และ Tb เพิ่มขึ้น เอสพี; และการรักษา Cis A คุณสมบัติทางกลของกระดูกดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ รวมถึงน้ำหนักสูงสุดและความแข็ง เพิ่ม BMD และปรับปรุงพารามิเตอร์โครงสร้างไมโครสถาปัตยกรรมกระดูก trabecular ส่วนใหญ่เมื่อเปรียบเทียบกับหนูในกลุ่ม OVX ซึ่งบ่งชี้ว่า Cis A มีประสิทธิภาพในการปรับปรุงคุณภาพกระดูก และสถาปัตยกรรมไมโคร trabecular ในหนู OVX

นอกจากค่า BMD ทั้งหมดแล้ว การทดสอบการดัดงอแบบสามจุดและการวัดสถาปัตยกรรมจุลภาคของกระดูกเนื้อโปร่งสามารถวินิจฉัยโรคกระดูกพรุนได้โดยตรง เครื่องหมายการสร้างกระดูก ซึ่งรวมถึง ALP และ BGP และดัชนีการสลายของกระดูก ซึ่งรวมถึง TRAP, DPD และ cathepsin K ก็ถูกนำมาใช้เพื่อ อธิบายกลไกการต่อต้านกระดูกพรุนที่เกี่ยวข้องของ Cis A ในการศึกษาของเรา กิจกรรม ALP ในหนูกลุ่ม OVX แสดงให้เห็นถึงแนวโน้มที่เพิ่มขึ้นที่ไม่มีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ถึงอัตราการหมุนเวียนของกระดูกที่เพิ่มขึ้น [26,27] ในโรคกระดูกพรุนในวัยหมดประจำเดือน; ปริมาณการรักษา Cis A สูง (80 มก./กก./วัน) และต่ำ (20 มก./กก./วัน) แสดงให้เห็นการปรับปรุงกิจกรรม ALP อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มหลอกลวง ในขณะที่กิจกรรม BGP ดูเหมือนจะไม่ได้รับอิทธิพลจาก การผ่าตัดรังไข่ในทุกกลุ่มที่ได้รับการรักษา TRAP, DPD และ cathepsin K เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม OVX และการบริหาร Cis A ลดเครื่องหมายการสลายกระดูกทั้งสามลงอย่างเห็นได้ชัด ข้อมูลข้างต้นบอกเป็นนัยว่า Cis A มีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนได้ และผลกระทบนี้เกิดขึ้นจากการควบคุมการเผาผลาญของกระดูก รวมถึงการยับยั้งการสลายของกระดูกและเพิ่มการสร้างกระดูก

การประสานงานระหว่างเซลล์สร้างกระดูกและเซลล์สร้างกระดูกเป็นปัจจัยสำคัญในการรักษาความสมบูรณ์ของโครงกระดูก เซลล์สร้างกระดูกซึ่งแสดง TRAP จะเกาะติดกับพื้นผิวของกระดูกผ่านการก่อตัวของโซนการปิดผนึกที่จับกับแอกติน ซึ่งภายในเอนไซม์โปรตีโอไลติก เช่น cathepsin K จะถูกปล่อยออกมา ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของหลุมการสลาย การปรับการสร้างกระดูกโดยเซลล์ที่ยังไม่เจริญเต็มที่ของเชื้อสายสร้างกระดูกจะถูกสื่อกลางโดย RANKL และ OPG [28] OPG เป็นตัวรับตัวล่อที่ยับยั้งการกระตุ้น RANKL ของการสร้างกระดูก ซึ่งช่วยลดการสลายของกระดูก RANKL ซึ่งให้สัญญาณสำคัญแก่ต้นกำเนิดของเซลล์สร้างกระดูก คือโมเลกุลที่จับกับเยื่อหุ้มเซลล์ของตระกูลลิแกนด์แฟกเตอร์เนื้อร้ายของเนื้องอกที่ส่งเสริมการก่อตัวของเซลล์สร้างกระดูก เชื่อกันว่าอัตราส่วนของการแสดงออกของ OPG/RANKL เป็นตัวแปรสำคัญของกิจกรรมการสร้างกระดูก และการส่งสัญญาณลดหลั่นที่กระตุ้นโดย RANKL รวมถึงวิถีทาง NF-κB และ PI3K [29] ความสำคัญของวิถีทาง NF-κB ต่อการสร้างเซลล์สร้างกระดูกนั้นแสดงให้เห็นได้จากข้อเท็จจริงที่ว่าการลบ NF-κB ในหนูส่งผลให้ไม่มีเซลล์สร้างกระดูกที่เจริญเต็มที่ [30] TRAF6 ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นเป้าหมายที่น่าหวังสำหรับยาต้านโรคกระดูกพรุนชนิดใหม่ หนูที่บกพร่อง6-ของ TRAF ซึ่งแสดงการสร้างเซลล์สร้างกระดูกที่มีข้อบกพร่องและโรคกระดูกพรุนอย่างรุนแรง จึงแสดงให้เห็นความสำคัญของ TRAF6 ในการเผาผลาญของกระดูก หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่ชี้ไปที่หน้าที่ด้านกฎระเบียบที่สำคัญสำหรับ TRAF6 ในการส่งสัญญาณแบบสื่อกลาง RANKL / RANK [4,31] ข้อมูลของการศึกษาในปัจจุบันระบุว่าการรักษาด้วย Cis A ในหนู OVX ส่งผลให้ระดับการแสดงออกของโปรตีน TRAF6 ลดลง ลด RANKL และการแสดงออกของ OPG ที่เพิ่มขึ้น จึงป้องกันการเปิดใช้งาน RANKL ของ NF-κB ดาวน์สตรีม และเปิดใช้งานเส้นทางสัญญาณ PI3K/Akt เสนอว่า Cis A ยับยั้งการสร้างความแตกต่างของเซลล์สร้างกระดูกโดยการยับยั้งการทำงานของ NF-kappaB ที่ใช้สื่อกลาง TRAF6- และการกระตุ้น PI3K/Akt และเพิ่มอัตราส่วน OPG/RANKL ซึ่งต่อมายับยั้งการสร้างกระดูกและส่งเสริมการสร้างกระดูก

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับฤทธิ์ต้านมะเร็งPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. วัสดุและวิธีการ

3.1. วัสดุพืช การเตรียมและการกำหนด

ลำต้นของ Cistanche DeserticolaYC Ma ซึ่งระบุตัวตนโดยศาสตราจารย์ Xue-yan Fu จากภาควิชาเภสัชศาสตร์ มหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย ถูกเก็บรวบรวมเมื่อวันที่ 2015 กันยายนในเทศมณฑลหยงหนิง มณฑลหนิงเซี่ย ประเทศจีน ตัวอย่างบัตรกำนัล (#20150901) ได้รับการเก็บรักษาไว้ในหอพรรณไม้ของแผนกเภสัชกรรม ลำต้นแห้งด้วยอากาศของ C. Deserticola จำนวน 30.0 กิโลกรัมถูกสกัดด้วยกรดไหลย้อนด้วยเอธานอล 70% (180 ลิตร 3 × 2 ชั่วโมง) 3 ครั้ง สารกรองถูกนำมารวมกันและนำไปผ่านคอลัมน์เรซินที่มีรูพรุนขนาดใหญ่ (AB-8) พร้อมด้วยระบบตัวทำละลายเกรเดียนต์แบบขั้นตอนเพื่อเพิ่มเอทานอลในน้ำ (0%, 20% และ 60% แต่ละตัว 60 ลิตร) เพื่อให้เศษส่วนสามส่วน จากนั้น 60% ของเศษส่วนถูกทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมโดย Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, สวีเดน) และโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงแบบกึ่งเตรียมการ (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, เยอรมนี) เพื่อให้ได้สีเหลืองอ่อน ซิสตาโนไซด์ A 4.5 กรัม (Cis A; ผลผลิตเท่ากับ 0.015%) โครงสร้างส่วนใหญ่ได้รับการอธิบายโดยการวิเคราะห์ข้อมูล NMR (Bruker Avance, 400 MHz, เยอรมนี) และ MS spectra (Agilent 6540, Agilent Technologies) ซึ่งสอดคล้องกับข้อมูลที่รายงาน [19] ความบริสุทธิ์ถูกกำหนดโดยวิธีการทำให้เป็นมาตรฐานของพื้นที่ HPLC (รูปที่ 5) ในการทดลองในสัตว์ทดลอง ตามการทดลองเบื้องต้นของเรา ปริมาณของ Cis A คือ 20–80 มก./กก./วัน

3.2. เคมีภัณฑ์และตัวทำละลาย

มีการใช้สิ่งต่อไปนี้: ชุดสกัดโปรตีนทั้งหมดและชุดตรวจปริมาณโปรตีน BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, หนานจิง, จีน), แอนติบอดีปฐมภูมิของ TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -actin และ tubulin ( เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์, เบเวอร์ลี, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา), แอนติบอดีทุติยภูมิของแพะต่อต้านกระต่าย IgG จากฮอสราดิชเปอร์ออกซิเดส-คอนจูเกต (ZSGB-BIO, ปักกิ่ง, จีน), เอสตราไดออล วาเลเรต (1 มก., Delpharm Lille SAS, ปารีส, ฝรั่งเศส), กระดูก Gla -ชุดทดสอบ crosslinks โปรตีนและดีออกซีไพริดิโนลีน ELISA (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., เซี่ยงไฮ้, จีน) และชุด cathepsin K ELISA (Biovision, Mountain View, CA, USA) สารเคมีและสารชีวเคมีอื่นๆ ทั้งหมดที่ใช้คือรีเอเจนต์เกรดเชิงวิเคราะห์ AR

3.3. การทดลองกับสัตว์

หนูสายพันธุ์คุนหมิงเพศเมียจำนวน 60 ตัว อายุ 8 สัปดาห์ น้ำหนักตัว 26.0 ± 1.62 กรัม ซื้อจากมหาวิทยาลัยการแพทย์หนิงเซี่ย และหนู 10 ตัวถูกเลี้ยงไว้ในกรงเดียวโดยใช้อาหารในห้องปฏิบัติการมาตรฐาน และน้ำประปาภายใต้สภาวะที่ควบคุมด้วยอากาศ (24.0 ± 0.5 °C, ความชื้น 45%–50% และรอบการส่องสว่างในที่มืดและสว่าง 12 ชั่วโมง/12 ชั่วโมง) หลังจากเคยชินกับสภาพแวดล้อมเป็นเวลา 1 สัปดาห์ การผ่าตัดเสร็จสิ้นภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ และหนูทุกตัวได้รับการดมยาสลบด้วยคลอราลไฮเดรต (100 มก./กก., ip); หนูที่ได้รับการผ่าตัดโดยไม่ต้องถอดรังไข่ออกคือกลุ่มเสแสร้ง (n=10); ส่วนที่เหลือได้รับการผ่าตัดรังไข่ทวิภาคีในฐานะกลุ่ม OVX (n=50) การทดลองกับสัตว์ข้างต้นดำเนินการตามแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมทางชีวภาพของ Ningxia Medical University

หลังจากช่วงพักฟื้นอีก {{0}} สัปดาห์ หนู OVX 50 ตัวข้างต้นถูกสุ่มและแบ่งออกเป็น 5 กลุ่มเท่าๆ กัน: รักษาทางปากด้วยเอสตราไดออล วาเลเรต (1 มก./กก./วัน) ในฐานะกลุ่มควบคุมเชิงบวก (EV); โดยให้ Cis A 20, 40 และ 80 มก./กก./วัน เป็นกลุ่มขนาดยาต่ำ ปานกลาง และสูง ตามลำดับ โดยมียานพาหนะ (0.5% คาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส()-Na) เป็นกลุ่มแบบจำลอง (OVX) หนูทุกตัวถูกบริหารให้ทางปากด้วยปริมาตรที่เท่ากันของกระสายยาที่มีน้ำหนักตัว 1 มิลลิลิตร/100 กรัม, EV หรือ Cis A ซึ่งเริ่มในสัปดาห์ที่สองหลังการผ่าตัดและคงอยู่เป็นเวลา 12 สัปดาห์ วัดน้ำหนักตัวทุกสองสัปดาห์ โดยปรับขนาดยาตามนั้น หลังจากการให้ยาทางปากครั้งสุดท้าย ตัวอย่างเลือดจะถูกถอนออกจากหลอดเลือดแดงต้นขาของหนูที่ได้รับยาสลบ ปล่อยให้จับตัวเป็นก้อน และปั่นแยกที่ 3,000× กรัม เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อให้ได้ซีรั่ม กระดูกต้นขาและกระดูกหน้าแข้งด้านขวาถูกผ่าออก ตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ −80 ◦C เพื่อการประเมินเพิ่มเติมของสถาปัตยกรรมจุลภาคของกระดูกและพารามิเตอร์ทางชีวเคมีในซีรั่มที่เกี่ยวข้องกับโรคกระดูกพรุน

3.4. การทดสอบการดัดงอแบบสามจุด

คุณสมบัติทางชีวกลศาสตร์ของกระดูกโคนขาขวาของเมาส์ถูกกำหนดโดยการใช้การจัดเรียงแบบโค้งสามจุด จิ๊กดัดงอมีตัวรองรับรูปตัว V เพื่อยึดปลายส่วนปลายและปลายโคนขาใกล้เคียงระหว่างการทดสอบ กระดูกโคนขาอยู่ในตำแหน่งแนวนอนโดยให้ส่วนหน้าหงายขึ้น และรับภาระลงที่กึ่งกลางของกระดูกโคนขา ระยะห่างระหว่างส่วนรองรับคือ 8 มม. กระดูกถูกบรรทุกด้วยอัตราการกระจัดคงที่ที่ 0.02 มม./วินาที จนกระทั่งเกิดความล้มเหลวโดยใช้เครื่องทดสอบ BOSE (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, USA) ได้รับเส้นโค้งการกระจัด-โหลดและใช้สำหรับการคำนวณคุณสมบัติโครงสร้างและวัสดุ รวมถึงโหลดสูงสุด โหลดสูงสุด โมดูลัสยืดหยุ่น ความแข็งแรงดัดงอ ฯลฯ

3.5. การวิเคราะห์เอกซเรย์คอมพิวเตอร์แบบไมโคร

กระดูกโคนขาขวาของหนูทุกตัวได้รับการทำความสะอาดจากเนื้อเยื่ออ่อนที่เกาะติดกัน และสถาปัตยกรรมจุลภาคกระดูก trabecular ของอภิปรัชญากระดูกต้นขาส่วนปลายด้านขวาข้างต้นถูกกำหนดโดยเครื่องสแกน micro-CT (eXplore Locus SP, GE Healthcare, London, ON, แคนาดา) ด้วย ความละเอียดไอโซโทรปิกตั้งไว้ที่ 8 µm ในมิติเชิงพื้นที่ทั้งสาม ภูมิภาคที่สนใจ (ROI) ถูกเลือกโดยใช้พิกัดเดียวกันในแผ่นการเจริญเติบโตของกระดูกโคนขา พารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาของกระดูก รวมถึง BMD ปริมาณแร่ธาตุในกระดูก (BMC) ปริมาณแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMC) ความหนาแน่นของแร่ธาตุในเนื้อเยื่อ (TMD) เศษส่วนของปริมาตรกระดูก (BVF) การแยกเนื้อโปร่ง (Tb. Sp) จำนวนเนื้อโปร่ง (Tb. N ) และความหนาของกระดูกโปร่ง (Tb. Th) ได้รับการประเมินผ่านการวิเคราะห์ ROI โดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์กระดูก ABA

3.6. การวิเคราะห์พารามิเตอร์ทางชีวเคมี

กิจกรรมของเซรั่มอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) วัดบนเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)); ระดับของซีรั่ม DPD, BGP และ cathepsin K ถูกกำหนดโดยชุดรีเอเจนต์ที่เกี่ยวข้อง และวิเคราะห์กรดฟอสฟาเตสที่ทนต่อทาร์เทรต (TRAP) ตามวรรณกรรมที่เกี่ยวข้อง [32]

3.7. การวิเคราะห์แบบ Western Blot

ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG และ RANKL ในกลุ่มต่าง ๆ ถูกตรวจพบโดยการวิเคราะห์แบบ Western blot โดยสรุป โปรตีนถูกสกัดจากกระดูกหน้าแข้งด้านขวาของหนูโดยใช้บัฟเฟอร์สลายซึ่งมีสารยับยั้งฟีนิลเมทิลซัลโฟนิล ฟลูออไรด์, โปรตีเอส และฟอสฟาเตส 0.5 มิลลิโมลาร์ ไลเซตถูกปั่นแยกเป็นเวลา 10 นาทีที่ 12,000× กรัม เพื่อให้ได้ส่วนลอยเหนือตะกอนสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม ความเข้มข้นของโปรตีนของไลซีนถูกวัดโดยใช้การสอบวิเคราะห์ปริมาณกรดไบซินโคนิก แยกโปรตีน (50–100 ไมโครกรัม) โดยใช้ SDS-PAGE 10% ถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลดีนไดฟลูออไรด์และบ่มด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดีปฐมภูมิที่กำหนดเป้าหมาย TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG และ -actin (1:500) เมมเบรนเดียวกันนั้นถูกถอดและทดสอบใหม่ โดยมีสัญญาณเคมีเรืองแสงที่ตรวจพบโดยซอฟต์แวร์ Image Lab -actin หรือ tubulin ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมภายใน

3.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดที่ได้รับจากการทดลองในสัตว์ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ทางเดียวของความแปรปรวนกับการทดสอบของ Dennett โดย SPSS (เวอร์ชัน 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA ) ซอฟต์แวร์; ค่า p < 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ และผลลัพธ์ทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SD

4. ข้อสรุป

โดยสรุป Cis Aฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ใช้งานอยู่ที่แยกได้จาก C. Deserticola มีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนที่มีนัยสำคัญในหนู OVX และกลไกระดับโมเลกุลอาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้ง NF-kappaB ที่เป็นสื่อกลางของ TRAF6- และการกระตุ้น PI3K/Akt ดังนั้นจึงน่าจะเป็นสารที่มีแนวโน้มในการรักษาโรคกระดูกพรุน โรค.

ถังเก็บน้ำธรรมชาติ TUBULOSA สำหรับฤทธิ์ต้านมะเร็งPHGS75% ECH 30% ACT 12%