ผลการป้องกันของ Herba Cistanches ต่อความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตตินในหลอดทดลอง
Mar 24, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
an Institute of Chinese Medicine, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, ฮ่องกง
b State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, ฮ่องกง
c Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine and Therapeutics, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, ฮ่องกง
เชิงนามธรรม:
ความเกี่ยวข้องทางชาติพันธุ์วิทยา: เฮอร์บาCistanches(เอชซีCistancheทะเลทราย, หรือCistanchetubulosa) เป็นสมุนไพรจีนโบราณที่ใช้สำหรับปัญหากล้ามเนื้อ การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าสารสกัด HC สามารถลดความเสียหายของกล้ามเนื้อและปรับปรุงการจัดเก็บ ATP ในหนูหลังออกกำลังกาย อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการศึกษาผลกระทบต่อความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตติน
จุดมุ่งหมาย:วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือเพื่อตรวจสอบว่าสารสกัดที่เป็นน้ำของ HC (HCE) สามารถป้องกันความเป็นพิษที่เกิดจากซิมวาสแตตินในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่างของหนู L6 ได้หรือไม่ และ verbascoside เป็นองค์ประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลักที่ก่อให้เกิดผลกระทบหรือไม่
วัสดุและวิธีการ:MTT ถูกดำเนินการเพื่อกำหนดหาผลของ HCE ({{0}}–2000 มก./มล.) หรือเวอร์บาสโคไซด์ (0–160 มิลลิโมลาร์) ต่อเซลล์ L6 ที่บำบัดด้วยซิมวาสแตติน (10 มิลลิโมลาร์) Annexin V-FITC/PI apoptosis assay และ Caspase 3 assay ได้ดำเนินการเพื่อกำหนดบทบาทการป้องกันของ HCE ต่อการตายของเซลล์ที่เกิดจาก simvastatin และเพื่อประเมินว่า HCE มีผลในการป้องกันผ่านวิถีของ caspase หรือไม่ การผลิต ATP ถูกวัดเพื่อตรวจสอบว่า HCE สามารถป้องกันการลดลงที่เหนี่ยวนำโดย simvastatin ในการผลิต ATP ในหลอดทดลองได้หรือไม่
ผลลัพธ์:Simvastatin เพิ่มการตายของเซลล์ apoptotic ในเซลล์ L6 อย่างมีนัยสำคัญ HCE ใช้การลดขนาดที่ขึ้นกับขนาดยาอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ apoptotic ที่เหนี่ยวนำโดยซิมวาสแตติน ซึ่งอาจใช้วิถีทางแคสเปส-3 Simvastatin ลดการผลิต ATP ในเซลล์ L6 ซึ่ง HCE ป้องกันโดยขึ้นกับขนาดยา verbascoside มีแนวโน้ม แต่ไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญ (ยกเว้นในขนาดที่สูง) ต่อการป้องกันความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจากซิมวาสแตติน
สรุป:โดยสรุป เราแสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกว่า HCE สามารถให้ผลการป้องกันที่ขึ้นกับขนาดยาต่อความเป็นพิษที่เกิดจากซิมวาสแตตินในหลอดทดลอง ซึ่งไม่น่าจะเกิดขึ้นได้เนื่องจากการมีอยู่ของ verbascoside การศึกษาของเราชี้ให้เห็นถึงศักยภาพของการใช้ HC ภายใต้สถานการณ์ความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากซิมวาสแตติน
คำสำคัญ:เฮอร์บาCistanches, สแตตินโคเลสเตอรอล, ภาวะไขมันในเลือดสูง, ความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อ, เวอร์บาสโคไซด์, แคสเปส-3
1. บทนำ
สารยับยั้ง HMG-CoA reductase (สแตติน) ซึ่งเป็นกลุ่มยาที่ต้องสั่งโดยแพทย์ที่ขายดีที่สุดในโลกในประวัติศาสตร์ ได้รับการบันทึกไว้อย่างดีว่ามีประโยชน์ต่อผู้ป่วยทั้งสองเพศในวัยต่างๆ ที่มีความเสี่ยงต่อโรคหลอดเลือดหัวใจ (CVD) ปานกลางและสูง (Golomb และ อีแวนส์ 2008). สแตตินที่แตกต่างกันจึงได้รับการพัฒนาและรับรองทางคลินิกซึ่งรวมถึงปราวาสแตติน, อะทอร์วาสแตติน, ฟลูวาสแตติน, โลวาสแตติน, พิทาวาสแตติน, โรสุวาสแตติน และซิมวาสแตติน โดยทั่วไป สแตตินทั้งหมดทำหน้าที่ผ่านการยับยั้งการลดลงของ HMG-CoA เป็นกรดเมวาโลนิกในช่วงเริ่มต้นของวิถีทางเมวาโลเนตเพื่อลดการผลิตโคเลสเตอรอล (Kromer and Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003) แม้ว่ายากลุ่ม statin มักจะสามารถทนต่อยาได้ดี แต่ผลข้างเคียงทางคลินิกที่สำคัญและเป็นที่รู้จักมากที่สุดอย่างหนึ่งก็คือความเป็นพิษของกล้ามเนื้อโครงร่าง (rhabdomyolysis) (Kobayashi et al., 2008) ความผิดปกติของกล้ามเนื้อโครงร่างอาจมีตั้งแต่อาการปวดกล้ามเนื้อที่ไม่ร้ายแรงไปจนถึงโรคกล้ามเนื้อรุนแรง แม้ว่าจะมีการเสนอกลไกแบบผสมและอาจรับผิดชอบต่อผลข้างเคียงของกล้ามเนื้อของสแตติน แต่เชื่อว่ากลไกของยลมีบทบาทสำคัญ (Golomb and Evans, 2008) Mevalonate ไม่เพียงแต่เป็นสารตั้งต้นของคอเลสเตอรอลเท่านั้น แต่ยังรวมถึงสารประกอบอื่นๆ เช่น selenoproteins, dolicol และ ubiquinone (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009) ความสามารถของ statin ในการยับยั้ง mevalonate จึงยังยับยั้งการผลิต selenoproteins เช่น glutathione peroxidase (GPx) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่สำคัญในการคงไว้ซึ่งกลไกการต่อต้านออกซิเดชัน (Kromer and Moosmann, 2009) สแตตินยังสามารถนำไปสู่การพร่องของยูบิควิโนน ทำให้การใช้ออกซิเจนลดลงและการสังเคราะห์ ATP (Beltowski et al., 2009) นอกจากนี้ การเพิ่มขึ้นของการศึกษาในหลอดทดลอง และในร่างกาย แสดงให้เห็นว่าสแตตินยังสามารถทำหน้าที่โดยตรงกับไมโทคอนเดรียของเนื้อเยื่อเพื่อกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ที่ขึ้นกับCa2þ (MPT) ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006 ). นอกจากนี้ยังเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของไมโตคอนเดรีย ซึ่งนำไปสู่การตายของเซลล์ ดังนั้นจึงมีส่วนทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ตับและกล้ามเนื้อ (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006)
เฮอร์บาCistanchesพืชแห้งทั้งต้นของ Cistanche deserticola YC Ma หรือ Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (วงศ์ Orobanchaceae) เป็นพืชกาฝากที่เติบโตในพื้นที่ทะเลทรายทางตอนเหนือและตะวันออกเฉียงเหนือของจีน (Siu and Ko, 2010)เฮอร์บาCistanchesเป็นสมุนไพรยาชูกำลังแบบจีนที่ให้พลังหยางซึ่งส่วนใหญ่ใช้รักษาภาวะไตบกพร่องที่มีอาการต่างๆ เช่น ความอ่อนแอ ภาวะมีบุตรยาก การหลั่งเร็ว ธรรมชาติที่หนักและแน่นของสมุนไพรยังช่วยให้ลำไส้ชุ่มชื้นและช่วยบรรเทาอาการท้องผูก นอกจากนี้ยังเป็นสมุนไพรจีนที่มีการกำหนดตามประเพณีสำหรับผู้ป่วยที่มีอาการปวดบริเวณเอวและเข่า และเป็นสมุนไพรที่ใช้กันทั่วไปในสูตรจีนสำหรับการรักษาปัญหากล้ามเนื้อ (Siu and Ko, 2010; Xiong et al., 1998) สิ่งที่น่าสนใจก็คือ ยังสอดคล้องกับการศึกษาทางวิทยาศาสตร์สมัยใหม่ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงฤทธิ์ต้านความเหนื่อยล้าของสารสกัดที่อุดมด้วยพอลิแซ็กคาไรด์และฟีนิลเลทานอยด์ของเฮอร์บาCistanchesในหนูหลังออกกำลังกายโดยลดความเสียหายของกล้ามเนื้อและปรับปรุงการจัดเก็บ ATP (Cai et al., 2010) ผลงานล่าสุดแสดงให้เห็นว่าสารสกัดจากเมทานอลของ Herba Cistanches สามารถเพิ่มการสร้าง ATP ของไมโตคอนเดรีย (Leung and Ko, 2008) ซิ่วและโก้ (2010) แสดงให้เห็นว่าเฮอร์บาCistanchesยังสามารถปรับปรุงสถานะของกลูตาไธโอนในไมโตคอนเดรียโดยการไกล่เกลี่ยระดับการสังเคราะห์กลูตาไธโอนและ GPx ซึ่งช่วยปกป้องเนื้อเยื่อจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในหัวใจของหนู ซิ่วและโก (2010) ยังแสดงให้เห็นว่าเฮอร์บาCistanchesสามารถลดปริมาณ Ca2þ ของไมโตคอนเดรีย ซึ่งจะช่วยลด MPT ที่ขึ้นกับ Ca2þ นอกจากนี้,เฮอร์บาCistanchesยังได้รับการพิสูจน์ว่าเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่งและสารกำจัดอนุมูลอิสระในอวัยวะต่างๆ ช่วยลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและกิจกรรม ROS ในการศึกษาในร่างกาย (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011) ที่น่าสนใจกว่านั้นคือ ในความพยายามที่จะกำหนดเศษส่วนแอคทีฟซึ่งมีส่วนช่วยในการต้านอาการเมื่อยล้าของเฮอร์บาCistanchesพบว่า verbascoside เป็นองค์ประกอบหลักในเศษส่วนที่ใช้งานอยู่ (Cai et al., 2010) Verbascoside ยังได้รับการพิสูจน์เพื่อลดความเมื่อยล้าของกล้ามเนื้อในคางคก ซึ่งอาจเนื่องมาจากฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ (Liao et al., 1999) ซึ่งบ่งชี้ว่า verbascoside อาจเป็นส่วนประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่เอื้อต่อผลประโยชน์ของ Herba Cistanches
จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือเพื่อตรวจสอบว่าการใช้สารสกัดจากน้ำสมุนไพร Cistanches (HCE) สามารถลดความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจาก simvastatin ในหลอดทดลองได้หรือไม่ มีการตั้งสมมติฐานว่าการใช้ HCE สามารถแก้ไขผลข้างเคียงของความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจากยาซิมวาสแตติน นอกจากนี้ยังมีความพยายามในการพิจารณาว่าผลประโยชน์ของเฮอร์บาCistanchesเกิดจากการมีอยู่ของ verbascoside
สารสกัดจากสมุนไพรเฮอร์บา ซิสแทนเช
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. การตรวจสอบและการเตรียมวัตถุดิบสมุนไพร
วัตถุดิบสมุนไพรของเฮอร์บาCistanchesซื้อมาจากซัพพลายเออร์ที่มีชื่อเสียงในกวางโจว ประเทศจีนเฮอร์บาCistanchesได้รับการตรวจสอบทางเคมีโดยใช้โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (TLC) ตามตำรับยาจีน (CP), 2010 โดยมี verbascoside และ echinacoside เป็นตัวบ่งชี้ทางเคมี (ไม่แสดงข้อมูล) เมื่อตรวจสอบสารเคมี ตัวอย่างใบสำคัญสมุนไพรของเฮอร์บาCistanchesถูกฝากไว้ที่พิพิธภัณฑ์สถาบันการแพทย์แผนจีนแห่งมหาวิทยาลัยจีนแห่งฮ่องกง (CUHK) โดยมีตัวอย่างใบสำคัญแสดงหมายเลข 2014–3434
โดยสังเขป แช่สมุนไพรดิบ 1 กิโลกรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วยการสกัดสองครั้งโดยให้ความร้อนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงภายใต้กรดไหลย้อนที่ 100 องศาโดยใช้น้ำกลั่น 10 ครั้งต่อการสกัดแต่ละครั้ง สารสกัดที่เป็นน้ำ (HCE) ถูกรวมและกรอง สิ่งกรองถูกทำให้เข้มข้นภายใต้แรงดันที่ลดลงที่ 60 องศา สารสกัดเข้มข้นถูกไลโอฟิไลซ์จนแห้ง เปอร์เซ็นต์ของผลผลิตเท่ากับ 50.1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก ปริมาณเล็กน้อยถูกใช้เพื่อกำหนดปริมาณของ verbascoside และ echinacoside โดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (UPLC) ผงสกัดทั้งหมดถูกบรรจุในสุญญากาศและเก็บไว้จนกว่าจะใช้
2.2. การวิเคราะห์ UPLC ของสารสกัดที่เป็นน้ำ
การวิเคราะห์ UPLC ดำเนินการโดยใช้ระบบ Waters Acquity Ultra Performance LC (Waters, USA) ตัวทำละลายทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการวิเคราะห์ UPLC นั้นซื้อมาจากภาควิชาเคมีที่มหาวิทยาลัยจีนแห่งฮ่องกง Verbascoside และ echinacoside ถูกซื้อมาจาก National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products ประเทศจีน สารละลายตัวอย่างถูกฉีดเข้าไปในคอลัมน์ Waters Acquity UPLC BEH C18 (10{{20}} 2.1 mm2 id, ขนาดอนุภาค 1.7 mm) ด้วย Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column ( 5-2.1 mm2 id, ขนาดอนุภาค 1.7 mm.) ตัวทำละลายทั้งหมดถูกกรองล่วงหน้าด้วยจานกรองมิลลิพอร์ 0.45 มม. (มิลลิพอร์) และขจัดแก๊ส การชะแบบเกรเดียนต์ดำเนินการโดยใช้ระบบตัวทำละลายต่อไปนี้: เฟสเคลื่อนที่ A – อะซีโตไนไทรล์; เฟสเคลื่อนที่ B – น้ำกลั่นสองเท่า/กรดฟอร์มิก (99.9/ 0.1; v/v) การชะถูกดำเนินการด้วยขั้นตอนเกรเดียนต์ดังนี้: 0–5 นาที, 88 เปอร์เซ็นต์ B; 5-10 นาที จาก 88 เปอร์เซ็นต์ B ถึง 83 เปอร์เซ็นต์ B. อัตราการไหลที่ใช้คือ 0.4 มล./นาที และการตรวจจับได้ดำเนินการที่ 331 นาโนเมตรตาม CP (2010) แต่ละตัวอย่าง (5 ul) ถูกฉีดเข้าไปในคอลัมน์หลังจากการกรองผ่านแผ่นกรอง 0.2 มม. การระบุเครื่องหมายของสารเคมีดำเนินการโดยการเปรียบเทียบเวลาการกักเก็บและการดูดกลืนแสง UV ของจุดสูงสุดที่ไม่ทราบค่ากับค่ามาตรฐาน กราฟการปรับเทียบถูกกำหนดโดยชุดความเข้มข้นของ verbascoside และ echinacoside (40, 20, 10, 5, 2.5 และ 1.25 มก./มล.) สำหรับการหาปริมาณ การหาปริมาณของ verbascoside และ echinacoside ภายในสารสกัดจากสมุนไพรได้ดำเนินการเป็นสามเท่า ระบบได้รับการตรวจสอบโดยคอมพิวเตอร์ที่ติดตั้งซอฟต์แวร์ Waters MassLynx สำหรับการเก็บรวบรวม การรวม และการวิเคราะห์ข้อมูล
2.3. การเพาะเลี้ยงเซลล์
สายเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่างหนู L6 ถูกซื้อจาก American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA) เซลล์ถูกรักษาที่ความหนาแน่นของคอนเฟลกต์ย่อยในตัวกลาง Modifified Eagle ของ Dulbecco (DMEM, ATCC, Manassas, VA, USA) เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ v/v fetal bovine serum (FBS) และ 1 เปอร์เซ็นต์ penicillin-streptomycin (P/S) และ ฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์และอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์
เพื่อตรวจสอบผลของ HCE ต่อความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตติน เซลล์ L6 ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตตินที่ 10 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อทำให้เกิดความเป็นพิษ HCE (ที่ความเข้มข้น 0, 250, 500, 1000 และ 2000 ug/ml) หรือ verbascoside (ที่ความเข้มข้น 0, 20, 40, 80 และ 160 μM) ถูกเติมเป็นการบำบัดร่วมกับสแตตินเพื่อตรวจสอบว่า สารสกัดจากสมุนไพรสามารถป้องกันความเป็นพิษของสแตตินที่เกิดจากเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง และหาก verbascoside สามารถให้ผลในการป้องกันที่คล้ายคลึงกันกับสารสกัดจากสมุนไพร
สารสกัดจากสมุนไพร Herba Cistanche มีผลป้องกันต่อความเป็นพิษที่เกิดจาก simvastatin ในหลอดทดลอง
2.4. ความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลอง
เซลล์ L6 (1x105/หลุม) ถูกเพาะในจานเพาะเลี้ยงก้นแบน {{0}}หลุม (อิวากิ ประเทศญี่ปุ่น) ในชั่วข้ามคืน ตามด้วยการบำบัดด้วยซิมวาสแตติน 10 ไมโครโมลาร์ ร่วมกับหรือไม่มีขนาดยา HCE ( 0–2000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือเวอร์บาสโคไซด์ (0–160 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง สื่อธรรมดา (DMEM) ถูกเติมลงในหลุมควบคุม สารสกัดจากสมุนไพรและสารประกอบถูกละลายใน DMEM
หลังการบำบัด 48 ชั่วโมง ตัวกลางจากเซลล์ทั้งหมดถูกละทิ้งและ 30 ไมโครลิตรเป็น 5 มก./มล. 3-(4,5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล)-2,{{ 8}}diphenyl-tetrazolium bromide (MTT; Sigma, USA) ในน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและเพลตถูกบ่มเพิ่มเติมเป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37 องศา จากนั้นนำ supernatant ออกและเติม DMSO 100 ul ในแต่ละหลุมเพื่อละลายผลึกฟอร์มาซานสีม่วง (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA) อ่านค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละตัวอย่างที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Biotek μ-Quant, USA) ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการดูดกลืนแสง MTT เทียบกับเซลล์ควบคุม
2.5. การทดสอบการย้อมสี Annexin-V FITC/PI
เซลล์ L6 (3 x105/ ดี) ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตติน ร่วมกับหรือไม่มีขนาดยาต่างๆ ของ HCE หรือเวอร์บาสโคไซด์ จากนั้นเซลล์จะถูกรวบรวม ล้าง และย้อมด้วยชุดอุปกรณ์ FITC ของแอนเนกซิน-V ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Trevigen, MD, USA) โดยย่อ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์การจับ 1 x และในลูกบาศก์ในสารละลายการติดฉลาก 100 ul ที่มีคอนจูเกต FITC ของแอนเนกซิน-V 1 ul และ PI 10 ul ในความมืดเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ตรวจพบการเรืองแสงของตัวอย่างโดยโฟลว์ไซโตเมทรี (Becton Dickinson FACSCanto II, USA)
2.6. การทดสอบกิจกรรม Caspase 3
กิจกรรมของ Caspase 3 ถูกกำหนดโดยใช้ fluorometric, immunosorbent enzyme assay (Sigma) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสังเขป เซลล์ L6 (3 105/หลุม) ที่บำบัดด้วยซิมวาสแตติน ร่วมกับหรือไม่มีขนาดยาต่างๆ ของ HCE verbascoside ถูกสลายโดยใช้บัฟเฟอร์การสลาย ฟรี 7-อะมิโน-4-เมทิลคูมาริน (AMC) ที่สร้างขึ้นผ่านการแยกย่อยโปรตีนของซับสเตรตโดยแคสเปส 3 ถูกวัดและหาปริมาณฟลูออโรเมตริกด้วยความยาวคลื่นกระตุ้นที่ 360 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อยที่ 460 นาโนเมตรด้วย BMG FLUOstarOptimamicroplate ผู้อ่าน (BMG LABTECH GmbH ประเทศเยอรมนี)
2.7. การทดสอบ ATP ของเซลลูล่าร์
เซลล์ L6 (3x105/ ดี) ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตติน ร่วมกับหรือไม่มีขนาดยาต่างๆ ของ HCE หรือเวอร์บาสโคไซด์ หลังการรักษา เซลล์ถูกรวบรวมและวัดเนื้อหา ATP โดยใช้ชุดสีที่มีขายทั่วไป (Abcam, UK) โดยการวัดปริมาณกลีเซอรอลฟอสเฟตของเซลล์ lysed และอ่านที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (Biotek μ-Quant สหรัฐอเมริกา ). การวัดการผลิตเอทีพีแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ที่สัมพันธ์กับกลุ่มควบคุม
2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ
ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการ 7SD, Prism 5 สำหรับ Window (เวอร์ชัน 5.0c, GraphPad Software, Inc., USA) ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในทุกกลุ่มได้รับการประเมินโดย ANOVA แบบทางเดียว ตามด้วยการทดสอบหลายข้อเปรียบเทียบของ Bonferroni ความน่าจะเป็นของ po0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ
3. ผลลัพธ์
3.1. การวิเคราะห์ UPLC ของสารสกัดที่เป็นน้ำ Herba Cistanches
รูปที่ S1A แสดงโปรไฟล์ UPLC ของของผสมมาตรฐานที่มีเอไคนาโคไซด์และเวอร์บาสโคไซด์ จุดเวลาการคงอยู่ของตัวทำเครื่องหมายเหล่านี้แต่ละตัวถูกเปรียบเทียบกับโปรไฟล์ UPLC ของเฮอร์บาCistanchesสารสกัดที่เป็นน้ำ (รูปที่ S1B) ปริมาณของเอ็กไคนาโคไซด์และเวอร์บาสโคไซด์ภายในเฮอร์บาCistanchesสารสกัดที่เป็นน้ำพบว่าเป็น {{0}}.45 เปอร์เซ็นต์ w/w และ 0.085 เปอร์เซ็นต์ w/w ตามลำดับ
3.2. ผลของ HCE และ verbascoside ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ในหลอดทดลองของซิมวาสแตตินในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6
ดังแสดงในรูปที่ 1A ซิมวาสแตตินทำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์อย่างมีนัยสำคัญต่อเซลล์ L6 ซึ่งสะท้อนจากการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในความมีชีวิตของเซลล์ L6 ที่ 10 มิลลิโมลาร์ของซิมวาสแตติน การรักษาด้วย HCE ขึ้นอยู่กับขนาดยาและป้องกันความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากซิมวาสแตตินอย่างมีนัยสำคัญที่ 500, 1000 และ 2000 มก./มล. Verbascoside พยายามปรับปรุงความมีชีวิตของเซลล์ L6 ที่รักษาร่วมกับซิมวาสแตติน อย่างไรก็ตาม ไม่มีความเข้มข้นใดที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 1B)
รูปที่ 1. ผลการป้องกันของ (ก) HCE; และ (b) verbascoside ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากซิมวาสแตตินในเซลล์ L6 ค่าแสดงถึงหมายถึง7SD (n¼3) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างการรักษาด้วยซิมวาสแตตินเพียงอย่างเดียวกับกลุ่มควบคุมโดยใช้การทดสอบ t ของนักเรียน: ### po0.{{10}}}01 ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตตินทั้งหมดที่มีหรือไม่มีการรักษาร่วมด้วย HCE verbascoside โดยใช้ ANOVA ทางเดียว: ** po0.01,*** po0.001
3.3. ผลของ HCE และ verbascoside ต่อการตายของเซลล์ที่เกิดจาก simvastatin ในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6
เพื่อตรวจสอบรูปแบบการตายของเซลล์ที่เกิดจากซิมวาสแตตินและกำหนดบทบาทการป้องกันของ HCE หรือ verbascoside ต่อการตายของเซลล์ที่เกิดจากซิมวาสแตติน สัดส่วนของเซลล์ apoptotic ถูกตรวจพบโดยการย้อมสีโพรพิเดียมไอโอไดด์ (PI) ผลการศึกษาพบว่าซิมวาสแตตินกระตุ้นให้สัดส่วนของเซลล์ apoptotic ระยะแรกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (Annexin V-FITC positive และ PI negative, Q4–2) และ apoptotic/เซลล์ตายตอนปลาย (Annexin V-FITC positive และ PI-positive, Q2– 2) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การรักษาร่วมกับ HCE ช่วยลดสัดส่วนของอะพอพโทติกในระยะแรก และอะพอพโทติก/เซลล์ตายระยะสุดท้ายในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาได้ถึง 1,000 มก./มล. (รูปที่ 2A) ผลการป้องกันนี้ยังพบเห็นได้ในกลุ่มที่ให้การรักษาร่วมด้วย verbascoside อย่างไรก็ตาม ไม่มีความเข้มข้นใดที่ทดสอบถึงนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 2B)
รูปที่ 2 ผลของซิมวาสแตตินที่มีหรือไม่มี HCE หรือการรักษาร่วมด้วย verbascoside ต่อการสร้างภายนอกของฟอสฟาติดิลซีรีนในเซลล์ L6 เซลล์ถูกย้อมด้วย Annexin-V FITC และ I และตรวจพบโดยโฟลว์ไซโตเมทรี
3.4. ผลของ HCE และ verbascoside ต่อการทำงานของ caspase 3 ในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6 ที่รักษาด้วย simvastatin
ดังที่แสดงในรูปที่ 3A ซิมวาสแตติน 10 มิลลิโมลาร์กระตุ้นกิจกรรมของแคสเปส 3 ในเซลล์ L6 อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ว่าซิมวาสแตตินทำให้เกิดการตายของเซลล์ L6 ผ่านทางน้ำตกแคสเปส อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ L6 ที่รักษาร่วมกับซิมวาสแตตินและ HCE นั้น HCE ขึ้นอยู่กับขนาดยาและลดกิจกรรมของ caspase 3 อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ถึงความสามารถของ HCE ในการป้องกันการตายแบบอะพอพโทซิสที่เกิดจากซิมวาสแตตินผ่านทางแคสเปส แคสเคด ในทางกลับกัน แม้ว่า verbascoside ยังมีแนวโน้มที่จะลดการเพิ่มขึ้นของกิจกรรมเอนไซม์ caspase 3 ที่เกิดจากซิมวาสแตติน แต่ความเข้มข้นที่ 160 mM เท่านั้นที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 3B)
มะเดื่อ 3. ผลการป้องกันของ (ก) HCE; และ (b) verbascoside ต่อการทำงานของเอนไซม์ caspase 3 ที่เกิดจาก simvastatin ในเซลล์ L6 ค่าแสดงถึงวิธี7SD (n¼3–5) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างการรักษาด้วยซิมวาสแตตินเพียงอย่างเดียวกับกลุ่มควบคุมที่ใช้การทดสอบ t ของนักเรียน: ###po0.001. ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตตินทั้งหมดที่มีหรือไม่มี HCE หรือการรักษาร่วมด้วย verbascoside โดยใช้ ANOVA ทางเดียว: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001
3.5. ผลของ HCE ต่อการลดลงที่เกิดจากซิมวาสแตตินในการผลิต ATP ในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6
ซิมวาสแตติน (10 มิลลิโมลาร์) ลดการผลิต ATP ในเซลล์ L6 ลงได้ประมาณ 60 เปอร์เซ็นต์เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4A) การรักษาร่วมโดยขึ้นกับขนานยา HCE ลดทอนการผลิต ATP ที่ลดลงในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตติน โดยขึ้นกับปริมาณยา ซึ่งมีเพียงความเข้มข้น 500, 1000 และ 2000 มก./มล. เท่านั้นที่มีนัยสำคัญทางสถิติ ในทางกลับกัน แม้ว่า verbascoside จะพยายามฟื้นฟูการผลิต ATP ที่ 50 มก./มล. แต่ก็ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 4B)
รูปที่ 4. ผลการป้องกันของ (a) HCE และ (b) verbascoside ต่อการลดลงที่เกิดจากซิมวาสแตตินในการผลิต ATP ในเซลล์ L6 ค่าแสดงถึงวิธี7SD (n¼3–5) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างการรักษาด้วยซิมวาสแตตินเพียงอย่างเดียวและกลุ่มควบคุมที่ใช้การทดสอบ t ของนักเรียน: ###po0.001. ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วยซิมวาสแตตินทั้งหมดที่มีหรือไม่มี HCE หรือการรักษาร่วมด้วย verbascoside โดยใช้ ANOVA ทางเดียว: *po0.05, **po0.01
4. การอภิปราย
ด้วยความชุกของโรคหัวใจและหลอดเลือด (CVD) ที่เพิ่มขึ้นและผู้ป่วยที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคไขมันในเลือดสูงทั่วโลก การใช้สแตตินจึงกลายเป็นเรื่องธรรมดามากขึ้น แม้ว่ายากลุ่ม statin โดยทั่วไปสามารถทนต่อยาได้ดีมาก แต่อาการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อเป็นผลข้างเคียงที่รายงานบ่อยครั้งที่เกี่ยวข้องกับการใช้ statin ซึ่งสามารถเกิดขึ้นได้อย่างรุนแรงในสัปดาห์หรือหลายเดือนหลังจากที่เริ่มใช้ยา (Fine, 2003) อาการของกล้ามเนื้ออาจแตกต่างกันไปจากปัญหาเล็กน้อย เช่น ความเจ็บปวด ความอ่อนโยน หรือความอ่อนแอที่มีหรือไม่มีระดับครีเอทีนไคเนส (CK) จนถึงภาวะที่ร้ายแรงที่สุดของการสลาย rhabdomyolysis (Armitage, 2007; Hu et al., 2012) เนื่องจากการเกิดขึ้นของผลข้างเคียงเหล่านี้ และไม่มีการรักษาที่มีประสิทธิภาพสำหรับความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตติน ยาสแตตินจึงยังคงถูกใช้น้อยไป ในการสำรวจความคิดเห็นในอาสาสมัครชาวฝรั่งเศสจำนวน 10,409 คนผ่านการสัมภาษณ์ทางโทรศัพท์ 10 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยที่ได้รับการรักษาด้วยสแตตินรายงานว่ามีอาการของกล้ามเนื้อ โดยที่ 30 เปอร์เซ็นต์ของผู้ป่วยที่มีอาการเหล่านี้ส่งผลให้ต้องหยุดการรักษา (Rosenbaum et al., 2013)
ได้พิสูจน์ให้เห็นเป็นครั้งแรกว่าสารสกัดจากน้ำของเฮอร์บาCistanchesซึ่งเป็นสมุนไพรจีนโบราณที่ใช้กันทั่วไป สามารถป้องกันความเป็นพิษที่เกิดจากซิมวาสแตติน ในหลอดทดลอง ในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6 ซึ่งบ่งชี้ถึงศักยภาพของเฮอร์บาCistanchesสารสกัดที่เป็นน้ำ (HCE) สำหรับบทบาทการป้องกันความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตติน ซึ่งเป็นผลข้างเคียงที่พบได้บ่อยในผู้ป่วยที่รับประทานสแตติน ความสามารถที่มีศักยภาพของ HCE ในการป้องกันความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตตินจึงมีศักยภาพสูง
ตามทฤษฎีดั้งเดิมใน TCM หยางเกี่ยวข้องกับเมแทบอลิซึมของพลังงานไมโตคอนเดรียในร่างกาย และพบว่าการสั่งจ่ายสมุนไพรที่ทำให้สดชื่นของหยางช่วยเพิ่มการสร้าง ATP ของไมโตคอนเดรีย (Ko and Leung, 2007) ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการลดลงของการผลิตเอทีพีในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6 ที่บำบัดด้วยซิมวาสแตติน และการลดการผลิตเอทีพีนี้ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญด้วยการรักษาร่วมกับ HCE ในการศึกษาของเรา โดยใช้เซลล์กล้ามเนื้อโครงร่างหนู L6 เราแสดงให้เห็นการลดลงของความมีชีวิตของเซลล์ที่เกิดจากซิมวาสแตติน การลดลงในการมีชีวิตของเซลล์ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญด้วยการบำบัดร่วมของเฮอร์บาCistanchesในลักษณะที่ขึ้นกับปริมาณยา แม้ว่ากลไกที่แน่ชัดของความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตตินยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างสมบูรณ์ แต่การตายแบบอะพอพโทซิสที่เกิดจากสแตตินของไมโอไซต์โครงกระดูกที่มีสุขภาพดีนั้นได้รับการแนะนำว่าเป็นปัจจัยที่ก่อให้เกิดโรคกล้ามเนื้อเสื่อม ซึ่งเป็นผลข้างเคียงที่พบบ่อยที่สุดโดยผู้ใช้สแตติน (Dirks and Jones, 2006) . ในการศึกษาของเรา เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ apoptotic ที่เกิดจากซิมวาสแตติน ซึ่งสัมพันธ์กับกิจกรรมของแคสเปส 3 ที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ข้อมูลเหล่านี้ยังสอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้านี้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าสแตตินหลายชนิดสามารถทำให้เกิดการตายของเซลล์ใน myoblasts โครงร่าง myotubes และในเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่างหลักของมนุษย์ที่แตกต่างกันผ่านการกระตุ้นกิจกรรมของ caspase-9 และ caspase-3 (Dirks) และโจนส์ 2549) HCE ของเราสามารถป้องกันการเพิ่มขึ้นของแคสเพสที่กระตุ้นด้วยซิมวาสแตติน-3 ที่กระตุ้นการตายของเซลล์ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา
เฮอร์บาCistanches
นอกจากนี้ วรรณกรรมก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่า verbascoside เป็นหนึ่งในองค์ประกอบสำคัญภายในเฮอร์บาCistanches. Verbascoside หรือที่เรียกว่า acteoside เป็นของสมาชิกของ phenylethanoid glycosides ซึ่งเป็นกลุ่มของสารประกอบโพลีฟีนอลที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติซึ่งละลายได้ในน้ำ (Liao et al., 1999) ก่อนหน้านี้ ได้มีการแสดงให้เห็นว่า verbascoside เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพซึ่งสามารถแสดงกิจกรรมการขจัด ROS และสารต้านอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง (Liao et al., 1999) ในการศึกษาของเรา เพื่อตรวจสอบว่า verbascoside เป็นองค์ประกอบหลักใน HCE ของเราที่มีผลประโยชน์ที่สังเกตพบหรือไม่ เราได้ทดสอบผลของ verbascoside ที่ความเข้มข้น 0–160 mM เนื่องจากเราได้แสดงให้เห็นว่า HCE ของเราทำงานที่ช่วงความเข้มข้น 250–2000 มก./มล. โดยอิงจากผลลัพธ์ HPLC ของเราซึ่งแนะนำว่า HCE ของเรามี verbascoside ที่ความเข้มข้น 0.085 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนัก /wt ความเข้มข้นที่ออกฤทธิ์ของ verbascoside ควรอยู่ในช่วงระหว่าง 0.2125–1.7 มก./มล. (เช่น 0.34–2.72 mM) verbascoside ควรเป็นส่วนประกอบที่ใช้งานอยู่หรือไม่ อย่างไรก็ตาม เราล้มเหลวในการสังเกตผลประโยชน์ที่มีนัยสำคัญของ verbascoside ด้วยช่วงความเข้มข้นที่ทดสอบ แม้ว่าเราจะสังเกตแนวโน้มที่ขึ้นกับขนาดยาเพื่อผลประโยชน์ของ verbascoside ต่อเซลล์กล้ามเนื้อโครงร่าง L6 ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลประโยชน์ของ HCE ของเราที่สังเกตพบในเซลล์โครงกระดูก L6 ไม่น่าจะเกิดจากผลของ verbascoside เพียงอย่างเดียว โดยการแนะนำส่วนประกอบอื่นที่ไม่ใช่ verbascoside อาจต้องรับผิดชอบต่อผลประโยชน์ที่สังเกตพบ นอกจากนี้ยังเป็นไปได้ที่ verbascoside อาจโต้ตอบกับสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพอื่น ๆ ภายในสารสกัดเพื่อนำไปสู่ผลประโยชน์ การทดลองเพิ่มเติมโดยใช้การแยกส่วนด้วยการวิเคราะห์ทางชีวภาพจะมีประโยชน์ในการให้ข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับการค้นพบส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่รับผิดชอบต่อผลการป้องกันที่สังเกตได้ของ HCE ต่อความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกิดจากซิมวาสแตติน
โดยสรุป การศึกษานี้บ่งชี้ว่า HCE สามารถให้ผลในการป้องกันอย่างมีศักยภาพต่อการลดลงที่เกิดจากซิมวาสแตตินในความมีชีวิตของเซลล์กล้ามเนื้อในหลอดทดลอง ผลลัพธ์เหล่านี้ให้หลักฐานเบื้องต้นที่ชี้ให้เห็นว่าสารสกัด HC ในน้ำอาจมีคุณค่าทางการรักษาในฐานะอาหารที่มีประโยชน์หรืออาหารเสริมสำหรับผู้ป่วยภาวะไขมันในเลือดสูงที่ต้องถอนตัวจากการรักษาด้วยสแตตินเนื่องจากความเป็นพิษต่อกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตติน
รับทราบการศึกษานี้ได้รับการสนับสนุนทางการเงินจากสำนักงานอาหารและสุขภาพ HKSAR กองทุนวิจัยด้านสุขภาพและการแพทย์หมายเลข 11120831.
อ้างอิง
Armitage, J. , 2007. ความปลอดภัยของสแตตินในการปฏิบัติทางคลินิก. มีดหมอ 370, 1781–1790.
Beltowski, J. , Wojcicka, G. , Jamroz-Wisniewska, A. , 2009. ผลข้างเคียงของ statin – กลไกและผลที่ตามมา สกุลเงิน เซฟยา. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y. , Chen, J. , Li, YC, Qi, Y. , 2010. ฤทธิ์ต้านความล้าของสารสกัดที่อุดมด้วยฟีนิลทานอยด์จาก Cistanche deserticola ไฟโตเธอร์. ความละเอียด 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. การตายของเซลล์ที่เกิดจากสแตตินและโรคกล้ามเนื้อโครงร่าง เป็น. เจ. ฟิสิออล. เซลล์ฟิสิออล 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. ความเป็นพิษของกล้ามเนื้อที่เกี่ยวข้องกับสแตติน คลินิก ฟา. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. ผลข้างเคียงของ Statin: การทบทวนวรรณกรรมและหลักฐานเกี่ยวกับกลไกยล เป็น. เจ. หัวใจและหลอดเลือด. ยา 8, 373–418
Hu, M. , Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. ความปลอดภัยของสแตติน: การอัปเดต เธอ. โฆษณา เซฟยา. 3, 133–144.
Kaufmann, P. , Torok, M. , Zahno, A. , Waldhauser, KM, Brecht, K. , Krahenbuhl, S. , 2006 ความเป็นพิษของสแตตินต่อไมโตคอนเดรียของกล้ามเนื้อโครงร่างหนู เซลล์. มล. วิทย์ชีวิต. 63, 2415–2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. การเพิ่มขีดความสามารถของการสร้าง ATP, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และกิจกรรมภูมิคุ้มกันด้วยสมุนไพรจีนหยางและหยิน tonifying คาง. เมดิ. 2, 3
Kobayashi, M. , Kagawa, T. , Narumi, K. , Itagaki, S. , Hirano, T. , Iseki, K. , 2008 การเสริมไบคาร์บอเนตเป็นวิธีป้องกันความเสียหายของกล้ามเนื้อที่เกิดจากสแตติน เจ. ฟาร์ม. เภสัช. วิทย์. 11, -8.
Kromer, A. , Moosmann, B. , 2009. อาการบาดเจ็บที่ตับที่เกิดจากสแตตินนั้นเกี่ยวข้องกับการพูดคุยข้ามระหว่างโคเลสเตอรอลและเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพของซีลีโนโปรตีน มล. เภสัช. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. สารสกัด Herba Cistanche ช่วยเพิ่มการสร้าง ATP ของไมโตคอนเดรียในหัวใจของหนูและเซลล์ H9C2 เภสัช. ไบโอล. 46, 418.
Liao, F. , Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. การชะลอความอ่อนล้าของกล้ามเนื้อโครงร่างโดย phenylpropanoid glycosides สองตัว: verbascoside และ martensite จาก Pedicularis plicata Maxim ไฟโตเธอร์. ความละเอียด 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. ศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของ Cistanche deserticola Ma. และ Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck คาง. ตราด. สมุนไพร. ยาเสพติด 26, 143.
คณะกรรมการเภสัช พ.ศ. 2553 ตำรับยาแห่งสาธารณรัฐประชาชนจีน. สำนักพิมพ์อุตสาหกรรมเคมี ปักกิ่ง
Rosenbaum, D. , Dallongeville, J. , Sabouret, P. , Bruckert, E. , 2013. การยุติการรักษาด้วยสแตตินเนื่องจากผลข้างเคียงของกล้ามเนื้อ: การสำรวจในชีวิตจริง Nutr. เมตาบ หัวใจและหลอดเลือด อ. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. สารสกัด Herba Cistanche ช่วยเพิ่มสถานะและการหายใจของ mitochondrial glutathione ในหัวใจของหนูด้วยการกระตุ้นให้เกิดโปรตีนที่แยกออกได้ เภสัช. ไบโอล. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. สารประกอบคาร์โบไฮเดรตที่ละลายน้ำได้จากร่างกายของเฮอร์บาCistanches: การแยกตัวและผลการขับออกของอนุมูลอิสระในผิวหนัง คาร์โบไฮเดรต โพลีม. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P. , Karas, RH, 2003. โรคกล้ามเนื้อที่เกี่ยวข้องกับสแตติน จามา 289, 1681–1690.
Vaklavas, C. , Chatzizisis, YS, Ziakas, A. , Zamboulis, C. , Giannoglou, GD, 2009 พื้นฐานระดับโมเลกุลของผงาดที่เกี่ยวข้องกับสแตติน หลอดเลือด 202, 18–28.
Velho, JA, Okanobo, H. , Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006 สแตตินทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงการซึมผ่านของไมโตคอนเดรียที่ขึ้นกับแคลเซียม พิษวิทยา 219, 124–132.
Xiong, Q. , Hase, K. , Tezuka, Y. , Tani, T. , Namba, T. , Kadota, S. , 1998. กิจกรรมป้องกันตับของ phenylethanoids จาก Cistanche deserticola แพลนตา เมด. 64, 120–125.
