เชิงนามธรรมแม้ว่าความชราจะเป็นปัจจัยเสี่ยงที่ใหญ่ที่สุดสำหรับโรคเรื้อรังของมนุษย์ (มะเร็ง เบาหวาน หลอดเลือดหัวใจ และโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท) แต่ก็มีการแทรกแซงเพียงไม่กี่อย่างที่ทราบกันดี นอกเหนือจากการจำกัดแคลอรี่และยาจำนวนเล็กน้อย (ที่มีผลข้างเคียงมาก) ที่จัดการกับความชราโดยตรง ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับทางเลือกใหม่ที่สามารถชะลอกระบวนการชราและป้องกันโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุได้ การเสื่อมสภาพของเซลล์เป็นพื้นฐานของกระบวนการชราภาพ อายุขัยตามลำดับเวลา (CLS) ของยีสต์ Saccharomyces cerevisiae เป็นระบบแบบจำลองที่ได้รับการยอมรับอย่างดีสำหรับการตรวจสอบการแทรกแซงของการแก่ของเซลล์หลังไมโทติคของมนุษย์ CLS ถูกกำหนดเป็นจำนวนวันที่เซลล์ยังคงทำงานได้ในระยะคงที่ เราได้พัฒนาวิธีการเชิงปริมาณแบบใหม่ ราคาถูก และรวดเร็วสำหรับการวัด CLS ในเซลล์เพาะเลี้ยงที่บ่มร่วมกับสารเคมีและการควบคุมต่างๆ บน 96-เพลตหลุม โปรโตคอล PICLS ของเราที่มี (1) การใช้โพรพิเดียมไอโอไดด์สำหรับการอ่านค่าการอยู่รอดของเซลล์ด้วยแสงเรืองแสงในเครื่องอ่านไมโครเพลท และ (2) การวัดจำนวนเซลล์ทั้งหมดผ่านการดูดซับ OD600nm จากเพลตเดียวกันทำให้มีความสามารถในการรับส่งข้อมูลสูงอย่างแท้จริง ขึ้นอยู่กับการขนส่ง เพลตจำนวนมากสามารถดำเนินการแบบขนานเพื่อให้การคัดกรองสารประกอบนับพันเป็นไปได้ในเวลาอันสั้น วิธีการนี้ได้รับการตรวจสอบโดยการวัดผลของราปามัยซินและการจำกัดแคลอรี่ต่อ CLS ของยีสต์ เราใช้วิธีนี้ในการคัดกรองสารเคมี เราค้นพบศักยภาพในการต่อต้านความชรา/การป้องกันระบบประสาทของ 25-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) และแนะนำการใช้ทีละรายการหรือใช้ร่วมกับวิธีการต่อต้านความชราอื่นๆ

Glycoside ของ cistanche ยังสามารถเพิ่มกิจกรรมของ SOD ในเนื้อเยื่อหัวใจและตับ และลดปริมาณของ lipofuscin และ MDA ในแต่ละเนื้อเยื่อได้อย่างมีประสิทธิภาพ กำจัดอนุมูลออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาต่างๆ (OH-, H₂O₂ ฯลฯ) ได้อย่างมีประสิทธิภาพ และป้องกันความเสียหายของ DNA ที่เกิดขึ้น โดย OH-อนุมูล Cistanche phenylethanoid glycosides มีความสามารถในการกำจัดอนุมูลอิสระที่แข็งแกร่ง ความสามารถในการลดที่สูงกว่าวิตามินซี ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในการระงับสเปิร์ม ลดปริมาณของ MDA และมีผลป้องกันบางอย่างต่อการทำงานของเยื่อหุ้มสเปิร์ม โพลีแซคคาไรด์ของ Cistanche สามารถเสริมการทำงานของ SOD และ GSH-Px ในเม็ดเลือดแดงและเนื้อเยื่อปอดของหนูทดลองที่ชราภาพซึ่งเกิดจาก D-galactose รวมทั้งลดปริมาณ MDA และคอลลาเจนในปอดและพลาสมา และเพิ่มเนื้อหาของอีลาสติน ส่งผลดีต่อ DPPH, ยืดเวลาการขาดออกซิเจนในหนูชรา, ปรับปรุงกิจกรรมของ SOD ในซีรั่ม, และชะลอการเสื่อมทางสรีรวิทยาของปอดในหนูชราทดลองที่มีความเสื่อมทางสัณฐานวิทยาของเซลล์, การทดลองแสดงให้เห็นว่า Cistanche มีความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ดี และมีศักยภาพในการเป็นยาป้องกันและรักษาโรคชราทางผิวหนัง ในขณะเดียวกัน echinacoside ใน Cistanche มีความสามารถที่สำคัญในการกำจัดอนุมูลอิสระ DPPH และมีความสามารถในการกำจัดชนิดของออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาและป้องกันการเสื่อมสลายของคอลลาเจนที่เกิดจากอนุมูลอิสระ และยังมีผลการซ่อมแซมที่ดีต่อความเสียหายของแอนไอออนจากอนุมูลอิสระของไทมีน

คลิกเพื่อดูผลิตภัณฑ์ต่อต้านริ้วรอย

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

คำหลักSaccharomyces cerevisiae · อายุการใช้งานตามลำดับ · การตรวจทางเคมี · สารต่อต้านริ้วรอย · 2,5-แอนไฮโดร-ดี-แมนนิทอล

การแนะนำ

The growing fraction of the elderly (>65 ปี) ในบรรดาประชากรทั้งหมด (จากประมาณร้อยละ 10 ทั่วโลก (มากกว่าร้อยละ 20 ในประเทศโลกที่หนึ่ง) ในปี 2020 เป็นประมาณร้อยละ 16 ในปี 2050) รวมถึงอายุขัยที่เพิ่มขึ้น (ประมาณ 10 ปีนับตั้งแต่ปี 1960 ในประเทศโลกที่หนึ่ง) ) เผชิญหน้ากับโลกด้วยปัญหาที่ยากขึ้นเรื่อยๆ [1, 2] นอกจากกิจกรรมในการดำรงชีวิตโดยทั่วไปจะลดน้อยลงแล้ว ความชรายังคงเป็นปัจจัยเสี่ยงที่ยิ่งใหญ่ที่สุดสำหรับการพัฒนาของโรคเรื้อรัง ซึ่งต่อมาจะบั่นทอนชีวิตอิสระของมนุษย์และนำไปสู่การเสียชีวิตในที่สุด [3–7] แนวทางทางการแพทย์ในปัจจุบันเพื่อป้องกันโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุเป็นคำแนะนำสำหรับการใช้ชีวิตที่มีสุขภาพดี ซึ่งรวมถึงการออกกำลังกายและการรับประทานอาหาร อย่างไรก็ตาม การแทรกแซงเหล่านี้เพียงอย่างเดียวไม่เพียงพอที่จะป้องกันการเกิดโรคที่เกี่ยวข้องกับอายุ

ความชรามีลักษณะเฉพาะคือการสูญเสียความสมบูรณ์ทางสรีรวิทยาที่ก้าวหน้า ประสิทธิภาพในการทำงานของเซลล์ และการส่งสัญญาณเมแทบอลิซึม [8] ความพยายามที่เพิ่มขึ้นจะนำไปสู่ความเข้าใจกระบวนการชราภาพของเซลล์ที่ส่งผลต่อเครือข่ายปฏิสัมพันธ์ของยีนและโปรตีนที่ซ้ำซ้อนและเชื่อมต่อกันสูง [8, 9] แม้จะมีความซับซ้อนของการแก่ตัวลง แต่การวิจัยล่าสุดในระบบแบบจำลองต่างๆ รวมถึงสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ได้แสดงให้เห็นว่าการแก่ตัวที่ล่าช้าและอายุที่มากขึ้นนั้นเป็นไปได้โดยการแทรกแซงการต่อต้านความชรา เช่น การใช้ยาราปาไมซินและการจำกัดแคลอรี่ (กลูโคส) [10–15] ดังนั้น การขยายขอบเขตของสารต่อต้านริ้วรอยที่สามารถใช้เป็นยารักษาโรคปกป้องผิวและลดผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์จึงเป็นหนึ่งในกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มว่าจะสามารถชะลอความชราและยืดอายุสุขภาพได้

การวิจัยเมื่อเร็วๆ นี้แสดงให้เห็นว่ากลไกระดับโมเลกุลที่สังเกตได้ในวัยชราของมนุษย์ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในสิ่งมีชีวิตต่างๆ รวมถึงยีสต์เซลล์เดียว [8, 10, 16, 17] ยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ที่กำลังเติบโตเป็นหนึ่งในตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่ได้รับการศึกษามากที่สุดสำหรับการเปิดเผยกระบวนการทางชีววิทยาที่เกี่ยวข้องกับการแก่ตัวของเซลล์ ประโยชน์ของการศึกษาการแก่ตัวของยีสต์ ได้แก่ เวลาในการสร้างที่สั้น อายุขัยที่ยืดได้ และความสามารถในการทดสอบปริมาณงานสูง ดังนั้น สิ่งมีชีวิตนี้จึงกลายเป็นเครื่องมืออันทรงพลังในการระบุวิธีการต่อต้านความชรา ยีสต์มักใช้เพื่อศึกษาการแก่ชราในสองวิธีที่แตกต่างกัน: อายุการจำลองแบบ (RLS) และอายุขัยตามลำดับเวลา (CLS) [18] RLS วัดจำนวนครั้งที่เซลล์แต่ละเซลล์แบ่งตัว ซึ่งเป็นแบบจำลองอายุของเซลล์ไมโทติค เช่น เซลล์ต้นกำเนิด CLS วัดระยะเวลาที่เซลล์ที่ไม่มีการแบ่งตัวยังคงมีชีวิตอยู่ได้ในระยะหยุดนิ่ง ซึ่งเป็นแบบจำลองอายุของเซลล์หลังไมโทติค เช่น เซลล์ประสาท ความมีชีวิตของเซลล์ยีสต์ที่แก่ชราภายใต้สภาวะระยะคงที่ที่ขาดสารอาหารจะลดลง และพวกมันจะตายในที่สุด

CLS ได้รับการวัดแบบดั้งเดิมโดยการประมาณจำนวนหน่วยที่ก่อตัวเป็นโคโลนี (CFUs) บนแผ่นวุ้น [18] เซลล์ยีสต์ในขวดที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อทั้งหมด (มากกว่าหรือเท่ากับ 20 มล.) สัมผัสกับสารเคมีชนิดเดียว ที่จุดเวลาที่ต่างกัน (เช่น หลังจาก 2, 5 และ 8 วัน) ส่วนเล็ก ๆ ของการเพาะเลี้ยงอายุตามลำดับเวลาจากแฟสก์จะถูกทำให้เจือจางตามลำดับ ชุบบนแผ่นวุ้นที่มีสารอาหาร และบ่มเป็นเวลา 2-3 วันสำหรับการก่อตัวของโคโลนีและการนับจำนวน เศษส่วนของการอยู่รอดกำหนดจาก CFU สำหรับแต่ละจุดอายุตามลำดับเวลาเทียบกับวันที่ 1 (ถือเป็นการอยู่รอดของเซลล์ 100 เปอร์เซ็นต์) วิธี CFU เป็นเชิงปริมาณ แต่เกี่ยวข้องกับข้อเสียหลายประการ มันต้องการการเจือจางแบบอนุกรมหลายขั้นตอน ขั้นตอนการชุบ และระยะฟักตัวเพื่อให้โคโลนีปรากฏ การนับจำนวนโคโลนีทำได้ทั้งแบบใช้คนหรือเครื่องมือราคาแพง ยิ่งไปกว่านั้น วิธีการนี้ไม่เหมาะสมและมีราคาแพงเกินไปสำหรับการคัดกรองปริมาณงานสูง (HTS) ของสารประกอบหลายพันชนิด เนื่องจากต้องใช้ยาจำนวนมากในการทดสอบ การเพาะเชื้อในขวดปริมาณมาก และจานวุ้นจำนวนมาก น่าเสียดายที่วิธี CFU และตัวแปรล่าสุดทั้งหมดสำหรับการวัด CLS นั้นขึ้นอยู่กับความสามารถของเซลล์หลังไมโทติคในการกลับเข้าสู่ระยะไมโทติคอีกครั้ง โดยหลักการแล้ว วิธีการนี้ไม่สามารถแยกความแตกต่างของยีสต์ในการจับแบบไมโทติสจากเซลล์ที่ตายแล้ว

ความก้าวหน้าทางเทคนิคในปัจจุบันในวิธีการที่ได้มาจาก CFU วัดการอยู่รอดและการเจริญเติบโตของเซลล์โดยพิจารณาจากผลที่ตามมาของยีสต์ในระยะคงที่ที่สัมผัสกับยาในวัฒนธรรมที่อุดมด้วยสารอาหารทั้งในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นของเหลวหรือโดยการตรวจหาจุดบนจานวุ้น [17, 19–21] . หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง ผลที่ตามมาของเซลล์ที่แก่แล้วในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เป็นของเหลวจะถูกวัดโดยค่าการดูดกลืนแสงที่ OD600nm ในขณะที่การทดสอบการจำแนกจุดนั้น ผลที่ตามมาของการเพาะเลี้ยงที่แก่ที่ด่างบนอาหารเลี้ยงเชื้อวุ้นจะถูกระบุด้วยสายตาหลังจากผ่านไป 48 ชั่วโมง การปรับปรุงด้านลอจิสติกส์รวมถึงการใช้ 96-แผ่นหลุมที่อนุญาตให้มีการกรองสารเคมีหรือการกำจัดสายพันธุ์ทั่วทั้งจีโนมอย่างจำกัด สำหรับสายพันธุ์การลบยีสต์ที่ติดแท็กแบบรวม โฟลไซโตเมทรีจำเป็นต้องหาปริมาณความมีชีวิตของสายพันธุ์แต่ละตัว [22]

Propidium iodide (PI) เป็นสีย้อมเรืองแสงที่เข้าสู่เซลล์ที่ตายแล้วเท่านั้น ดังนั้นจึงเป็นเครื่องหมายที่มีประสิทธิภาพสำหรับการวัดปริมาณความมีชีวิตของเซลล์โดยตรง [23–25] ก่อนหน้านี้ การศึกษาใช้วิธีการที่อิงตาม PI สำหรับการวัด CLS และการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์โดยการวิเคราะห์ภาพที่ได้มาจากตัวนับเซลล์เรืองแสง ทรานสลูมิเนเตอร์ UV หรือโฟลไซโตเมทรี [26, 27] อย่างไรก็ตาม ความต้องการการประมวลผลหลายตัวอย่าง การสร้างภาพ และซอฟต์แวร์สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลมีราคาแพงและใช้เวลานาน ซึ่งเป็นอุปสรรคต่อวิธีการเหล่านี้ในแอปพลิเคชันที่มีปริมาณงานสูงจริง การแนะนำสีย้อมทางเลือกเช่นสีเขียว SYTOX นั้นมีค่าจำกัดในการตั้งค่าปริมาณงานสูงเนื่องจากต้นทุนที่ห้ามปราม [26]

ดังนั้น จำเป็นต้องมีวิธีการใหม่ในการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์ที่มีอายุ เพื่อหลีกเลี่ยงข้อจำกัดที่เกี่ยวข้องกับวิธีการที่มีอยู่ ในงานนี้ เราจะอธิบาย PICLS ซึ่งเป็นวิธีการวัด CLS ที่ใช้ PI ซึ่งไม่ขึ้นกับผลพลอยได้ วิธีการใหม่ของเราอาศัยการบ่มเซลล์ยีสต์ด้วยสารประกอบทดสอบต่างๆ หรือสภาวะของสื่อทดสอบที่แตกต่างกันใน 96-แผ่นหลุม เราใช้ PI เพื่อวัดปริมาณการอยู่รอดของเซลล์ การอ่านค่าที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพ (ภายใน ~ 15 นาที) มีให้โดยเครื่องอ่านไมโครเพลท ซึ่งเป็นอุปกรณ์ราคาประหยัดที่พร้อมใช้งานในห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่ วิธีการที่มีราคาถูกนี้เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการคัดกรองสารเคมีในปริมาณมากเพื่อระบุสารประกอบต่อต้านริ้วรอย เนื่องจากสามารถวางสารประกอบ สารควบคุม หรือการเจือจางต่างๆ มากมายบนจานใบเดียวได้อย่างสะดวก และสามารถแปรรูปจานจำนวนมากพร้อมกันได้ นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการของเราโดยการพิจารณาการขยาย CLS ของยีสต์โดยใช้วิธีการต่อต้านความชราที่เป็นที่รู้จัก เช่น การให้ยาราปามัยซินและการจำกัดแคลอรี่ การคัดกรองสารเคมีที่มีในห้องปฏิบัติการของเราโดยไม่คาดคิดเผยให้เห็น 25-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) ซึ่งช่วยยืดอายุของยีสต์ นอกจากนี้ เรายังยืนยันกิจกรรมต่อต้านความชราของ 2,5-AM ด้วยวิธีการเติบโตแบบเดิมๆ อะนาล็อกน้ำตาลที่ทดสอบอื่น ๆ ไม่ได้ให้ผลที่คล้ายคลึงกัน

ผลลัพธ์

การพัฒนาวิธีการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้การวัดการเรืองแสงของโพรพิเดียมไอโอไดด์ในเครื่องอ่านไมโครเพลท

ระเบียบวิธีใหม่ของเราเริ่มต้นด้วยการเปิดเผยเซลล์ยีสต์ป่าหรือการกลายพันธุ์ของพวกมันที่วางลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่อุดมด้วยสารอาหารใน 96-เพลตหลุมพร้อมกับความเข้มข้นเฉพาะของสารประกอบทางเคมีที่น่าสนใจ เราใช้ PI เป็นตัวบ่งชี้การตายของเซลล์เนื่องจากสีย้อมเรืองแสงนี้จะเข้าสู่เซลล์ที่ไม่รอดเท่านั้น [23–25] ความมีชีวิตของเซลล์ในการเพาะเลี้ยงระยะอยู่กับที่จะถูกหาปริมาณหลังจากจำนวนวันที่ระบุโดยการอ่านค่าการเรืองแสง PI ในเครื่องอ่านไมโครเพลท ซึ่งจะจัดเตรียมสเปรดชีตที่อ่านได้ทางอิเล็กทรอนิกส์สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล

ในการตรวจสอบความถูกต้องครั้งแรก เราแสดงให้เห็นว่าการทำงานกับหลุมไมโครเพลทจำนวนเล็กน้อยให้ผลลัพธ์ที่คล้ายกับวิธีการที่ใช้คิวเวตต์ และเครื่องอ่านไมโครเพลทมีความไวเพียงพอที่จะเก็บข้อมูลการอยู่รอดของเซลล์ ดังนั้นเราจึงวิเคราะห์การย้อมสี PI ของเซลล์ยีสต์ เซลล์ยีสต์เติบโตในขวดแก้วและต้มเป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 100 องศา เซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้วถูกล้างและบ่มใน 1×PBS (น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต) โดยปราศจากและด้วย PI (5 ไมโครกรัม/มล.) เป็นเวลา 15 นาที หลังจากการบ่ม เซลล์ถูกล้างและแขวนลอยใหม่ใน PBS เซลล์ถูกมองเห็นด้วยกล้องจุลทรรศน์และวัดความเข้มของการเรืองแสงโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท (รูปที่ S1 เพิ่มเติม) หลังจากการยืนยันว่า PI เป็นตัวบ่งชี้ที่เหมาะสมสำหรับการตายของเซลล์ การวิเคราะห์ในภายหลังได้ดำเนินการเพื่อพัฒนาวิธีการ เซลล์ที่ตายแล้วที่ย้อมด้วย PI ถูกแขวนลอยใหม่ใน PBS จนถึง 48 OD600nm สุดท้ายที่วัดได้ในคิวเวตต์โดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ ถัดไป เซลล์ถูกเจือจางตามลำดับใน PBS (OD600nm 48 ถึง 0.05) และถ่ายโอนไปยังจานหลุม 96-สีดำ (costar 3603) โปรดทราบว่า ไมโครเพลทสีดำมีราคาแพงกว่าเพลตใสถึงสี่เท่าและหาได้ไม่ง่ายนัก แต่เราใช้มันเนื่องจากเหมาะสำหรับการอ่านค่าฟลูออเรสเซนซ์มากกว่าเนื่องจากการหน่วงการเรืองแสงอัตโนมัติที่มาจากตัวอย่างและพื้นผิวไมโครเพลท ด้วยระบบการสร้างภาพ GelDoc (รูปที่ 1A) เรามองเห็นระดับของการรวมตัวกันของการย้อมสี PI ในเซลล์ยีสต์ที่ตายแล้วในการเจือจางต่างๆ เราใช้เพลตเดียวกัน วัดความเข้มของการเรืองแสง PI ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทที่การกระตุ้น 535 นาโนเมตร และปล่อยความยาวคลื่น 617 นาโนเมตร เราพบความสัมพันธ์เชิงเส้นสูงระหว่างความเข้มของการเรืองแสง PI และการดูดกลืนแสงของเซลล์ที่ OD600nm (รูปที่ 1B) ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าตัวแปรของวิธีการที่ใช้ฟลูออเรสเซนซ์ PI ของเรานั้นมีประสิทธิภาพในการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 ของคิวเวตต์ (รูปที่ 1D) ต่อไป เราพิจารณาความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มของการเรืองแสงของ PI และเซลล์ OD600nm ของ 96-หลุมเจาะภายในช่วง OD600nm ที่เหมาะสมที่สุดที่ 0.05–12 เราสังเกตเห็นความสัมพันธ์เชิงเส้นที่เกือบจะสมบูรณ์แบบ (รูปที่ 1E) ดังนั้น โปรโตคอลของเราจึงเป็นวิธีการที่มีประสิทธิภาพในการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์

ผลของประเภทไมโครเพลทต่อการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้การวัดการเรืองแสงของโพรพิเดียมไอโอไดด์ในเครื่องอ่านไมโครเพลท

ผลของราปาไมซินต่ออายุขัยตามลำดับเวลาของยีสต์

ราปาไมซินเป็นหนึ่งในวิธีการต่อต้านความชราที่รู้จักกันดีซึ่งแสดงให้เห็นเพื่อยืดอายุของสิ่งมีชีวิตจำลองต่างๆ รวมถึงยีสต์ ไส้เดือนฝอย แมลงวันผลไม้ และหนู [10, 14, 15, 28–30] มันยับยั้ง TORC1 เชิงซ้อนที่รับสารอาหาร (เป้าหมายของราปามัยซินคอมเพล็กซ์ 1) TORC1 เป็นคอมเพล็กซ์โปรตีนหลายหน่วยย่อยที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในเซลล์ยูคาริโอต ซึ่งจับคู่สารอาหารในสิ่งแวดล้อมเข้ากับการเจริญเติบโตและการเพิ่มจำนวนเซลล์ [19, 29, 31–34]

เราได้ตรวจสอบผลกระทบของราปาไมซินต่ออายุขัยตามลำดับเวลา (CLS) ของยีสต์สายพันธุ์เพื่อตรวจสอบโปรโตคอลที่พัฒนาขึ้นใหม่ของเรา ที่นี่และด้านล่าง เราใช้ยีสต์สายพันธุ์โปรโตโทรฟิก (CEN.PK113- 7D) ในการทดลองของเราเพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบที่รุนแรงของกรดอะมิโนเสริมต่อการอยู่รอดของเซลล์ในการเพาะเลี้ยงระยะคงที่ [35, 36] เซลล์ถูกบ่มด้วยราปาไมซินที่มีความเข้มข้นต่างกันในตัวกลางที่กำหนดโดยสังเคราะห์ (SD) วัดการเจริญเติบโตของเซลล์ที่จุดเวลาต่างๆ (24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง และ 72 ชั่วโมง) เราพบว่าการเจริญเติบโตของเซลล์ถึงจุดอิ่มตัวประมาณ 24 ชั่วโมงหลังจากการบ่มด้วยราปาไมซิน 5 นาโนโมลาร์หรือน้อยกว่า (รูปที่ 4A) อย่างไรก็ตาม การให้ราปาไมซิน 10 นาโนโมลาร์ชะลอการเจริญเติบโตของเซลล์ และความอิ่มตัวจะเกิดขึ้นหลังจาก 48 ชั่วโมงเท่านั้น (รูปที่ 4A) ก่อนหน้านี้ มีการสังเกตแนวโน้มที่คล้ายคลึงกันสำหรับเซลล์ที่เติบโตด้วยราปามัยซินในการทดลอง CLS [37]

ในขั้นตอนต่อไป วัด CLS ของเซลล์ที่ปลูกในราปามัยซินที่มีความเข้มข้นต่างกัน เราพิจารณาการอยู่รอดของเซลล์โดยใช้การเรืองแสง PI ที่จุดอายุตามลำดับเวลาที่แตกต่างกัน จุดเวลาการเติบโต 72 ชั่วโมงถือเป็นวันที่ 1 เราสามารถอนุมานได้จากกราฟการอยู่รอดว่าการเติมราปามัยซินที่มีความเข้มข้นต่างกันจะขยาย CLS ของยีสต์ (รูปที่ 4B) การอยู่รอดของเซลล์แก่ที่เสริมด้วยราปามัยซิน (5 นาโนโมลาร์และ 10 นาโนโมลาร์) ในวันที่ 4 คือ~75 เปอร์เซ็นต์ ; อย่างไรก็ตาม ถ้าไม่มีราปาไมซินก็ประมาณร้อยละ 50 ในวันที่ 7 การรอดชีวิตของเซลล์แก่ที่เสริมด้วยราปาไมซินคือ 70 เปอร์เซ็นต์ ; อย่างไรก็ตาม หากไม่มีราปาไมซินก็ลดลงเหลือน้อยกว่า 20 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้ยังสามารถสังเกตการขยาย CLS ของเซลล์ที่มีอายุมากได้ที่ความเข้มข้นต่ำ (0.62–2.5 nM) ของราปาไมซิน (รูปที่ 4B)

เราได้ตรวจสอบโปรโตคอลของเราโดยเปรียบเทียบโดยตรงกับวิธีการเจริญเติบโตแบบดั้งเดิม 2 วิธีที่ใช้วัดค่า CLS ของยีสต์ ประการแรก เราทำการทดสอบผลพลอยได้ในตัวกลางที่เป็นของเหลวเพื่อวัดผลของราปามัยซินต่ออายุขัย การอยู่รอดของเซลล์แก่ตามลำดับเวลาได้รับการตรวจสอบที่จุดอายุต่างๆ โดยการถ่ายโอน 3-µl เพาะเลี้ยงลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ YPD 200μL ในจาน96-หลุมใหม่ ผลพลอยได้สอดคล้องกับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตในหัวเชื้อ (รูปที่ 4C) ผลพลอยได้ของเซลล์อายุที่ลงทะเบียนผ่านค่าการดูดกลืนแสง OD600nm ถูกกำหนดโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท เศษส่วนของการอยู่รอดคำนวณจากค่าการดูดกลืนแสง OD600nm ที่เจริญเกินสำหรับแต่ละจุดอายุที่สัมพันธ์กับวันที่ 1 (ถือเป็นการอยู่รอดของเซลล์ 100 เปอร์เซ็นต์) กราฟการอยู่รอดแสดงในรูปที่ 4D

ในทำนองเดียวกัน เราได้ดำเนินการผลพลอยได้โดยการตรวจจับการทดสอบบนอาหารเลี้ยงเชื้อ เราพบ 3-µl aging culture บนแผ่นวุ้น YPD และบ่มเพาะเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ผลพลอยได้ของเซลล์ที่มีอายุมากบนแผ่นวุ้น YPD ถูกมองเห็นโดยระบบสร้างภาพ GelDoc (รูปที่ 4E) ตามที่คาดไว้ เราสามารถสังเกตแนวโน้มของการยืดอายุขัยโดยราปาไมซินภายใต้ทั้งการตรวจ YPD แบบเหลวและแบบวุ้นซึ่งขนานกับที่กำหนดด้วยโปรโตคอลใหม่ของเรา

ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าโปรโตคอล HTS ของเราจำลองว่าราปาไมซินช่วยยืดอายุเซลล์ นอกจากนี้ เราประเมินปัจจัย Z เพื่อประเมินคุณภาพของวิธีนี้ [38] โดยทั่วไป ปัจจัย Z ในช่วง 0.5–1.0 บ่งชี้ถึงการทดสอบ HTS ที่ยอดเยี่ยม ปัจจัย Z ถูกกำหนดสำหรับความเข้มข้นต่าง ๆ ของราปามัยซินที่มีการเรืองแสง PI ของเซลล์ที่มีอายุมาก (รูปที่ S2 เพิ่มเติม) เงินทุนของเรา Z-factor {{10}}.70 สำหรับราปาไมซิน 5 นาโนโมลาร์ และ 0.74 สำหรับราปาไมซิน 10 นาโนโมลาร์ ทำให้วิธี HTS นี้อยู่ในหมวดหมู่คุณภาพสูง ดังนั้น โปรโตคอลของเราจึงแข็งแกร่งพอที่จะระบุสารประกอบต่อต้านริ้วรอยที่อาจเกิดขึ้นได้

สำหรับการสำรวจว่าวิธีการนี้มีประสิทธิภาพในภูมิหลังทางพันธุกรรมของยีสต์ที่แตกต่างกันหรือไม่ เราได้ทดสอบผลของราปาไมซินต่อ CLS ของสายพันธุ์ BY4743 สายพันธุ์ Saccharomyces cerevisiae BY4743 เป็นสารเสริมสำหรับฮิสทิดีน ลิวซีน และยูราซิล สายพันธุ์ BY4743 ถูกปลูกในราปาไมซินที่มีความเข้มข้นต่างกันในอาหารเลี้ยงเชื้อ SD ที่เสริมด้วยองค์ประกอบออโซโทรฟิค การอยู่รอดของเซลล์ที่มีอายุมากถูกหาปริมาณโดยใช้ PI fluorescence (รูปที่ S3 เพิ่มเติม) เราพบว่าราปามัยซินเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์ BY4743 ในเชิงปริมาณในลักษณะเดียวกันกับ CEN.PK113-7D ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าวิธีการของเรามีประสิทธิภาพในยีสต์หลายสายพันธุ์

ผลของกลูโคสต่ออายุขัยตามลำดับเวลาของยีสต์

เรายังตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการของเราด้วยการตรวจสอบผลของการจำกัดแคลอรี่ต่ออายุขัยตามลำดับเวลาของยีสต์ การจำกัดแคลอรี่เป็นหนึ่งในมาตรการที่กำหนดขึ้นเพื่อชะลอความชราและยืดอายุขัยของสิ่งมีชีวิตจำลอง รวมถึงเซลล์ของยีสต์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม [11, 13, 16] ในการตรวจสอบผลกระทบของการจำกัดแคลอรี่ต่อ CLS ของยีสต์ เราลดปริมาณกลูโคสในอาหารเลี้ยงเชื้อ เราขยายเซลล์ในสภาวะอาหารเลี้ยงเชื้อ SD ที่แตกต่างกันสามสภาวะที่มีกลูโคส 0.25 เปอร์เซ็นต์ 0.5 เปอร์เซ็นต์ และกลูโคส 2 เปอร์เซ็นต์ เราวัดการเติบโตของเซลล์ที่จุดเวลาต่างๆ (24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง และ 72 ชั่วโมง) วัฒนธรรมทั้งหมดถึงจุดอิ่มตัวในการเจริญเติบโตหลังจาก 24 ชั่วโมง (รูปที่ 5A) การเติบโตของเซลล์ลดลงที่ 0.25 เปอร์เซ็นต์และ 0.5 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเทียบกับกลูโคส 2 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 5A) เราวัดความอยู่รอดของการแก่ตามลำดับเวลาสำหรับเซลล์ที่เติบโตภายใต้ความเข้มข้นของกลูโคสที่แตกต่างกันโดยใช้วิธีเรืองแสง PI (รูปที่ 5B) เราอนุมานจากกราฟการอยู่รอดว่าการจำกัดกลูโคสจะขยาย CLS ของยีสต์ นอกจากนี้ เรายังยืนยันการขยาย CLS ไปพร้อมกันโดยการทดสอบแบบผลพลอยได้ (รูปที่ 5C, D และ E) เพื่อตรวจสอบวิธีการใหม่ของเราในการพิจารณา CLS ของยีสต์เพิ่มเติม ผลของการ จำกัด กลูโคสต่อการขยาย CLS ของสายพันธุ์ BY4743 ก็แสดงด้วยวิธี PICLS (รูปที่ S3 เพิ่มเติม) ดังนั้น วิธีการของเราในการวัดค่า CLS ของยีสต์จึงเป็นวิธีการที่แปลกใหม่ รวดเร็ว และต้นทุนต่ำในการคัดกรองสารเคมีและสภาวะการเพาะเลี้ยงเพื่อระบุวิธีการต่อต้านความชรา

การคัดกรองสารเคมีโดยใช้วิธีการที่พัฒนาขึ้นใหม่ระบุว่า 2,5-anhydrous-D-mannitol เป็นสารประกอบต่อต้านริ้วรอยชนิดใหม่

หลังจากพัฒนาและตรวจสอบโปรโตคอลใหม่แล้ว เราใช้วิธีนี้เพื่อคัดกรองสารเคมีหลายร้อยชนิดเพื่อระบุสารต่อต้านริ้วรอย (รูปที่ S4 เพิ่มเติมและตารางที่ 1 เพิ่มเติม) จากผลลัพธ์ที่น่าประหลาดใจอย่างหนึ่ง เราพบข้อบ่งใช้ของสารประกอบ 25-แอนไฮโดร-ดี-แมนนิทอล (25-AM) เพื่อขยาย CLS ของยีสต์ ในรูปที่ 6 เรานำเสนอผลลัพธ์ของการทดลองติดตามผลอย่างละเอียดสำหรับสารประกอบนี้ เราทดสอบฤทธิ์ต้านการเสื่อมสภาพของ 2,5-AM ที่ความเข้มข้นต่างกันบนจานหลุม 96- ประการแรก เราพิจารณาผลกระทบของ 2,5-AM ต่อการเติบโตของเซลล์ เซลล์ยีสต์ถูกบ่มด้วยความเข้มข้น 2,{17}}AM ที่แตกต่างกันในอาหารเลี้ยงเชื้อ SD วัดการเจริญเติบโตของเซลล์ที่จุดเวลาต่างๆ (24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง และ 72 ชั่วโมง) เราพบว่าการเจริญเติบโตของเซลล์ถึงระดับความอิ่มตัวเท่ากันหลังจาก 24 ชั่วโมงสำหรับความเข้มข้นที่ทดสอบทั้งหมด 2,5-AM (รูปที่ 6A) จากนั้น เราวัดความอยู่รอดของเซลล์ที่แก่ตามลำดับเวลาซึ่งเสริมด้วยความเข้มข้น 2,{26}}AM ที่ต่างกันโดยใช้วิธีเรืองแสง PI ก่อนหน้านี้ วัฒนธรรมการเติบโต 72 ชั่วโมงถือเป็นวันที่ 1 สำหรับการวิเคราะห์ CLS กราฟการอยู่รอดถูกพล็อตสำหรับจุดอายุตามลำดับเวลาที่แตกต่างกัน (รูปที่ 6B) เราพบว่า 25-AM ขยาย CLS ในลักษณะที่ขึ้นกับความเข้มข้น การอยู่รอดของเซลล์แก่ที่เสริมด้วย 2,{34}}AM (8 mM) ในวันที่ 4 คือ ~ 80 เปอร์เซ็นต์ ; อย่างไรก็ตาม หากไม่มี 25- AM ก็ ~ 50 เปอร์เซ็นต์ ในวันที่ 7 การอยู่รอดของ 25-AM เสริมเซลล์แก่คือ ~ 75 เปอร์เซ็นต์ ; อย่างไรก็ตาม หากไม่มี 25-AM ก็ลดลงเหลือน้อยกว่า 20 เปอร์เซ็นต์ กิจกรรมการต่อต้านการแก่ของ 2,5-AM ยังได้รับการยืนยันโดยการทดสอบผลพลอยได้ (รูปที่ 6C, D และ E)

2,5-AM คือโมเลกุลน้ำตาลที่สามารถเข้าสู่วิถีไกลโคไลซิส จะถูกไฮโดรไลซ์ที่ขั้นตอนไกลโคไลติกในต้นน้ำเท่านั้นที่ทำให้เกิดการสะสมของ 2,5-AM-1,6-บิสฟอสเฟต (2,5-AMBP) ที่ไม่ได้เผาผลาญในเซลล์ [39–41 ]. เพื่อทดสอบว่า 2,5-AM ที่ความเข้มข้นใกล้เคียงกับการทดลอง CLS ได้รับการประมวลผลโดยเอนไซม์ไกลโคไลซิสหรือไม่ เราตรวจสอบความไวที่เพิ่มขึ้นของสายพันธุ์การลบยีน SNF1 SNF1 เป็นเซ็นเซอร์พลังงานเซลลูล่าร์และโปรตีนไคเนสที่เปิดใช้งาน AMP (AMPK) ที่ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงในยูคาริโอต [42, 43] เซลล์ยีสต์ที่ไม่มีกิจกรรม AMPK นั้นสัมพันธ์กับฟีโนไทป์การเจริญเติบโตที่ไวเกินเมื่อมีตัวกลาง glycolytic ที่ไม่ได้เผาผลาญ [44] เราวัดการเติบโตของความเครียดการลบ snf1Δ ที่มีความเข้มข้นต่างกันที่ 2,5-AM เราพบว่า 2,5-AM ยับยั้งการเติบโตของสายพันธุ์การลบ snf1Δ เมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ไวด์ (รูปที่ S5 เพิ่มเติม) ฟีโนไทป์ของการเจริญเติบโตที่สังเกตได้นี้บ่งชี้ว่า 25-AM ผ่านกระบวนการไกลโคไลซิสและถูกไฮโดรไลซ์เป็นตัวกลางไกลโคไลติกที่ไม่ได้เผาผลาญ

2,5-AM เป็นสารอะนาล็อกของน้ำตาลฟรุกโตสมอยอิตี [39] เพื่อชี้แจงว่าน้ำตาลอื่นๆ มีอิทธิพลต่อ CLS หรือไม่ เราตรวจสอบผลของฟรุกโตส แมนนิทอล และมอลโตสต่อการแก่ของยีสต์ เรายังรวมซอร์บิทอลซึ่งเป็นน้ำตาลที่ไม่ผ่านการเมแทบอลิซึมที่รายงานว่าเพิ่ม CLS ของเซลล์ยีสต์โดยการเพิ่มออสโมลาริตีของอาหารเลี้ยงเชื้อ [20, 45] ประการแรก เราทดสอบผลของฟรักโทส แมนนิทอล มอลโทส และซอร์บิทอลต่อการเติบโตของเซลล์ เซลล์ยีสต์ถูกบ่มด้วยฟรุกโตส แมนนิทอล มอลโทส และซอร์บิทอลที่มีความเข้มข้นต่างๆ กันซึ่งคล้ายกับ 25-AM ในอาหารเลี้ยงเชื้อ SD เช่นเดียวกับ 2,5-AM, ฟรุกโตส, แมนนิทอล, มอลโทส และซอร์บิทอล เซลล์ที่ฟักตัวจะอิ่มตัวเต็มที่หลังจาก 24 ชั่วโมง (รูปที่ 7A) ต่อไป เราวัดการอยู่รอดของเซลล์ที่แก่ตามลำดับเวลาในวันที่ 1 วันที่ 7 วันที่ 14 และวันที่ 21 ซึ่งแตกต่างจากวันที่ 25-AM การเสริมฟรุกโตส แมนนิทอล มอลโทส และซอร์บิทอลไม่ได้ยืดอายุขัยของ ยีสต์ (รูปที่ 7B, C, D, E และรูปที่เสริม S6) 2,{21}}AM ช่วยยืดอายุการใช้งานได้อย่างน่าทึ่งแม้ในช่วงปลายของการเสื่อมสภาพตามลำดับเวลา เซลล์แก่ที่เสริมด้วย 2 5-AM (8 มิลลิโมลาร์) จะอยู่รอดได้ (ประมาณ 65 เปอร์เซ็นต์) ในวันที่ 21 อย่างไรก็ตาม การอยู่รอดของเซลล์แก่ที่ไม่มีการเสริม 2 5-AM น้อยกว่า 10 เปอร์เซ็นต์

ทำให้เราประหลาดใจมาก เราพบว่าซอร์บิทอลที่การทดสอบความเข้มข้นต่ำไม่สามารถเพิ่ม CLS ได้ (รูปที่ 7B, C, D, E และรูปที่ S6 เพิ่มเติม) เราตั้งสมมติฐานว่าอาจต้องใช้ความเข้มข้นของซอร์บิทอลที่สูงขึ้นเพื่อเพิ่ม CLS เราทดสอบช่วงของความเข้มข้นที่สูงขึ้น ซึ่งรวมถึงซอร์บิทอล 1 โมลาร์ ซึ่งเป็นความเข้มข้นที่รายงานก่อนหน้านี้ว่ามีผลต่อ CLS (18 เปอร์เซ็นต์เทียบเท่ากับ 1 โมลาร์) [20, 45] สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้ เรายังพบว่าความเข้มข้นของซอร์บิทอลที่สูงมาก (ระหว่าง 0.5 ถึง 1 M) จะเพิ่ม CLS ของยีสต์ (รูปที่ S7 เพิ่มเติม) ซึ่งเห็นได้ชัดจากการเพิ่มออสโมลาริตีของตัวกลาง ที่น่าสนใจคือ CLS เพิ่มขึ้น 2 5-AM ที่ความเข้มข้นต่ำมาก (2 มิลลิโมลาร์) บ่งชี้ว่ากลไกในการต้านความชรานั้นแตกต่างจากออสโมติก ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าฤทธิ์ต้านความชราของ 2,5-AM นั้นมีความเฉพาะเจาะจงสำหรับสารประกอบน้ำตาลนี้ และไม่พบในสารเคมีอื่นๆ ที่มีโครงสร้างคล้ายกันหลายตัว

【สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】