กลไกของ Cistanche Deserticola ส่งเสริมการทำงานของลำไส้

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, หยุนฉี

เชิงนามธรรม

ฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์(PhGs) ซึ่งเป็นกลุ่มของสารประกอบโพลีฟีนอล ถือเป็นหนึ่งในองค์ประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญของCistancheทะเลทรายYC Ma (CD) ซึ่งเป็นสารสกัดที่ใช้รับประทานในการแพทย์แผนจีน แม้ว่าการศึกษาทางเภสัชวิทยาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่า PhGs ดำเนินกิจกรรมหลายอย่าง แต่รูปแบบการขนส่งในลำไส้ยังไม่ได้รับการชี้แจง ในการศึกษานี้ เราตรวจสอบการซึมผ่านของลำไส้ของสารสกัดที่อุดมด้วย PhG (PRE) จากCistancheDeserticolaเป็นระบบบูรณาการในแบบจำลองเซลล์โมโนเลเยอร์ของ Caco-2 โดยใช้ระบบวิเคราะห์ทางชีวภาพ ผลการวิจัยพบว่า PRE ถูกขนส่งโดยหลักผ่านการแพร่แบบพาสซีฟที่ดูดซึมได้ไม่ดีลงด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นโดยไม่มีการไหลออก ซึ่งเป็นพื้นฐานทางเภสัชจลนศาสตร์สำหรับการประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ PhGs ในCistanche Deserticola. นอกจากนี้เรายังกำหนดความสามารถในการซึมผ่านของลำไส้สามหลักปริญญาเอก[acteoside (AC), isoacteoside (IS) และ echinacoside (EC)]โดย เอชแอลพีซี นอกจากนี้ เราได้พัฒนาวิธีการตรวจหา HPLC-fluorescence แบบใหม่เพื่อกำหนดปริมาณฟลักซ์ของ AC และ IS ได้อย่างแม่นยำ ตามที่คาดไว้ ลักษณะการขนส่งของสามปริญญาเอกสอดคล้องกับระบบ PRE ซึ่งบ่งชี้ว่าระบบการวิเคราะห์ทางชีวภาพในปัจจุบันมีความเหมาะสมและเชื่อถือได้สำหรับการประเมินลักษณะการขนส่งของกลุ่มสารออกฤทธิ์ (AIG) ใน PRE นอกจากนี้ ระบบนี้ยังอาจเหมาะสำหรับสารสกัดจากพืชชนิดอื่นๆ ที่มีการออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่เหมาะสม

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

สายเซลล์ Caco-2 ซึ่งได้มาจากมะเร็งลำไส้ของมนุษย์ มีลักษณะเฉพาะที่คล้าย enterocyte ภายใต้สภาวะปกติ เซลล์ Caco-2 จะแยกความแตกต่างจากเซลล์ที่เจริญเต็มที่ตามธรรมชาติและก่อตัวเป็นชั้นเดียวที่ไม่บุบสลาย [1] เซลล์ที่อยู่ติดกันจะเกาะติดกันผ่านทางรอยต่อที่แน่นซึ่งก่อตัวขึ้นที่ด้านปลายของโมโนเลเยอร์ ซึ่งสามารถแยกแยะยาที่ส่งผ่านอย่างอดทนและอย่างแข็งขันผ่านชั้นเยื่อบุผิว [2] เนื่องจากลักษณะทางสัณฐานวิทยาและชีวเคมีที่คล้ายคลึงกันกับ enterocytes ปกติ Caco-2 เซลล์ monolayers ทำหน้าที่เป็นแบบจำลองในหลอดทดลองที่ได้รับการยอมรับอย่างดีสำหรับการศึกษาศักยภาพการดูดซึมในลำไส้และลักษณะการขนส่งของยา [3, 4]

ตรงกันข้ามกับสารเคมี สารสกัดจากพืช (PE) คือสารผสมที่ฤทธิ์ทางชีวภาพและองค์ประกอบออกฤทธิ์มักไม่ได้รับการระบุอย่างดี [5] นอกจากนี้ คุณสมบัติการขนส่งในลำไส้ของ PE เมื่อเทียบกับคุณสมบัติขององค์ประกอบ มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการใช้ทางคลินิก การวัดค่าฟลักซ์สำหรับตัวอย่างทดสอบในเซลล์โมโนเลเยอร์ของ Caco-2 มักเกี่ยวข้องกับวิธีการทางเคมี เช่น HPLC, LC/MS เป็นต้น แม้ว่าวิธีการเหล่านี้จะเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพ แต่ก็ซับซ้อน ใช้เวลานาน มีราคาแพง และในบางครั้ง ต้องการอุปกรณ์ที่ทันสมัย ที่สำคัญกว่านั้น ทั้งองค์ประกอบเดียวหรือส่วนน้อยไม่สามารถสะท้อน PE โดยรวมได้ ดังนั้นจึงต้องมีการกำหนดแนวทางใหม่ที่ไม่ขึ้นอยู่กับการกำหนดองค์ประกอบเพื่อระบุและประเมินลักษณะการขนส่งของ PE

CistancheทะเลทรายYC Ma (CD) ซึ่งเป็นพืชโฮโลปาราซิติก เป็นยาจีนโบราณที่ใช้กันทั่วไปในการรักษาภาวะไตบกพร่อง ร่างกายอ่อนแอ และท้องผูก และการใช้งานเหล่านี้ได้รับการบันทึกไว้อย่างเป็นทางการในตำรับยาจีน [6] Phenylethanoid glycosides (PhGs) รวมทั้ง echinacoside (EC), acteoside (AC), isoacteoside (IS) ฯลฯ เป็นสารประกอบโพลีฟีนอล [7] พวกมันถือเป็นหนึ่งในองค์ประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญของCistancheสายพันธุ์ [8]. การศึกษาทางเภสัชวิทยาได้แสดงให้เห็นว่าฤทธิ์ทางชีวภาพของปริญญาเอกมีความหลากหลายและรวมถึงสารต้านออกซิเดชัน [9], ป้องกันความเมื่อยล้า [10], ปกป้องตับ [11], ภูมิคุ้มกัน [12], ต้านการอักเสบ [7, 13] และผลต่อระบบประสาท [14] อย่างไรก็ตาม ลักษณะการขนส่งในลำไส้ของปริญญาเอกยังไม่ได้รับการตรวจสอบ ในการศึกษานี้ เราสำรวจการซึมผ่านของลำไส้ของสารสกัดที่อุดมด้วย PhG (PRE) จากซีดีเป็นระบบบูรณาการและการซึมผ่านของ PhGs หลักสามชนิด (AC, IS และ EC) ในเซลล์ Caco-2 ที่แตกต่างกัน ผลลัพธ์ของเราระบุว่า PRE ถูกขนส่งโดยหลักผ่านการแพร่แบบพาสซีฟที่ดูดซึมได้ไม่ดีลงด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นโดยไม่มีการไหลออก ซึ่งเป็นพื้นฐานทางเภสัชจลนศาสตร์สำหรับการประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ PhGs ในซีดี

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

The human intestinal Caco-2 cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS and EC (>ร้อยละ 98 ถูกซื้อจาก Must Biotechnology Co. (เฉิงตู ประเทศจีน) Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) ผลิตโดย Gibco BRL (Grand Island, NY, USA) 6-หลุม TranswellTM เพลต (แทรกพื้นที่การเจริญเติบโตของเมมเบรน 4.67 cm2 ) ได้มาจาก Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA) คอลลาเจนหางหนูได้มาจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) รีเอเจนต์และสารเคมีทั้งหมดสำหรับการวิเคราะห์ HPLC มีระดับการวิเคราะห์

การเตรียม PRE จาก Cistanche deserticola

วัสดุซีดีที่แห้งด้วยอากาศถูกทำให้เป็นผงและสกัดโดยการซึมผ่านด้วยเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์ เศษส่วนที่อุดมด้วย PhG ถูกเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [10] และสกัดด้วย n-บิวทิลแอลกอฮอล์ที่อิ่มตัวด้วยน้ำ สุราสกัดถูกทำให้เข้มข้นและทำให้แห้งภายใต้แรงดันที่ลดลง Macroporous resin-UV spectrophotometry [15] วัดค่า pH ที่ 78.4 เปอร์เซ็นต์ ตัวอย่างสุดท้ายแสดงผลผลิต 1.75 เปอร์เซ็นต์ของวัตถุดิบโดยน้ำหนักแห้ง ตัวอย่างที่ได้รับถูกเก็บไว้ที่ -20 องศาจนกว่าจะใช้งานต่อไป

การกำหนด AC, IS และ EC โดย HPLC

ระบบ Shimadzu HPLC ที่ติดตั้งซอฟต์แวร์โซลูชัน LC ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์เนื้อหาของ AC, IS และ EC ใน PRE คอลัมน์ Intersil C18 แบบย้อนกลับ (4.6 มม. × 250 มม., 5 ไมโครเมตร) ถูกใช้และคงสภาพไว้ที่อุณหภูมิห้อง เฟสเคลื่อนที่คืออะซีโตไนไทรล์และน้ำที่มีกรดฟอสฟอริก 0.1 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) ที่มีการชะเกรเดียนท์ (ตารางที่ 1) ที่อัตราการไหล 1.0 มล./นาที เครื่องตรวจจับสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV ถูกตั้งค่าไว้ที่ 334 นาโนเมตร เพื่อกำหนดฟลักซ์ของ AC และ IS ได้อย่างแม่นยำ เราได้พัฒนาวิธีการตรวจจับเรืองแสง HPLC (HPLC-FLD) แบบใหม่ หลังจากการวิเคราะห์โครงสร้างและการสแกนความยาวคลื่นเรืองแสง (ไม่แสดงข้อมูล) เราได้รับเงื่อนไขการตรวจจับการเรืองแสงที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ AC (เช่น 338 นาโนเมตร Em: 448 นาโนเมตร) และ IS (เช่น 320 นาโนเมตร Em: 434 นาโนเมตร)

วิธีการวิเคราะห์ HPLC ได้รับการตรวจสอบโดยใช้คุณลักษณะด้านประสิทธิภาพต่อไปนี้: ความคงตัว, ความเป็นเส้นตรง, ความไว, ความแม่นยำ (ความแปรปรวนภายในและระหว่างวัน) และความแม่นยำ สารวิเคราะห์ในบัฟเฟอร์การขนส่งถูกเก็บไว้ที่ 25 องศาในที่มืดเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และวัดความเสถียรของพวกมัน สารที่วิเคราะห์มีความคงตัวสูงเมื่อมีวิตามินซี (0.4 เปอร์เซ็นต์) เนื่องจากค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (RSD) ในพื้นที่จุดสูงสุดคือ < 3.5="" เปอร์เซ็นต์="" สมการถดถอยเชิงเส้น="" สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์="" ช่วงของลิเนียริตี้="" lod="" และ="" loq="" สำหรับ="" ac,="" is="" และ="" ec="" แสดงในตารางที่="" 2="" lod="" (18–30="" nm)="" และ="" loq="" (60–100="" nm)="" ค่าแสดงให้เห็นว่าวิธี="" hplc-fld="" และ="" hplc-uv="" มีความไวสูง="" ค่า="" rsd="" ที่แสดงความแม่นยำของวิธีการทั้งหมด="">< 2="" เปอร์เซ็นต์สำหรับความแปรปรวนภายในและระหว่างวัน="" ซึ่งบ่งชี้ถึงความแม่นยำที่ดี="" สำหรับการประเมินการกู้คืน="" ac,="" is="" และ="" ec="" ถูกเพิ่มไปยังบัฟเฟอร์การขนส่งเพื่อให้ได้ระดับความเข้มข้นสามระดับ="" (สูง="" ปานกลาง="" และต่ำ)="" ค่าการกู้คืนของวิธีการวิเคราะห์สรุปไว้ในตารางที่="" 3="" ค่าการกู้คืนเฉลี่ยอยู่ระหว่าง="" 90.0="" เปอร์เซ็นต์="" ถึง="" 96.4="" เปอร์เซ็นต์="" ซึ่งบ่งชี้ถึงความแม่นยำที่ดี="" โดยสรุป="" วิธี="" hplc="" ที่จัดตั้งขึ้นเป็นที่พอใจในแง่ของความเป็นเส้นตรง="" ความไว="" ความแม่นยำ="" และความแม่นยำสำหรับการหาปริมาณของ="" ac,="" is="" และ="" ec="">

การหาค่า PRE โดยระบบวิเคราะห์ทางชีวภาพ

การทดสอบทางชีวภาพ (ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด) ขึ้นอยู่กับการทดสอบ FRAP (กำลังรีดิวซ์แบบเฟอริก/กำลังสารต้านอนุมูลอิสระ) ที่เราได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [16] และตรวจสอบความถูกต้องในแง่ของความเป็นเส้นตรงและความแม่นยำ (ความแปรปรวนภายในและระหว่างวัน) ความเป็นเส้นตรงของวิธีการวิเคราะห์ทางชีวภาพถูกกำหนดโดยอาศัยกราฟการปรับเทียบ ช่วงความเข้มข้นของความเป็นเชิงเส้นคือ 0.0625 − 40 ug/ml (y=0.0258x บวก 0.0968, R2=0.996) ความแม่นยำของวิธีการทดสอบทางชีวภาพที่กำหนดถูกกำหนดในแง่ของความแปรปรวนภายในและระหว่างวันสำหรับการวิเคราะห์ PRE (10.0 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ความสามารถในการทำซ้ำระหว่างวันของวิธีการถูกกำหนดหาบนพื้นฐานของการกำหนดหาที่ต่อเนื่องกันห้าครั้งในวันเดียวกัน ความสามารถในการทำซ้ำระหว่างวันถูกวัดตามการกำหนดหาที่ต่อเนื่องกันห้าครั้งในสามวันที่ต่างกัน ค่า RSD สำหรับความแม่นยำของวิธีการคือ 1.014 เปอร์เซ็นต์ และ 4.72 เปอร์เซ็นต์ สำหรับความแปรปรวนภายในและระหว่างวัน ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ถึงความแม่นยำที่ดี ดังนั้น วิธีการทดสอบทางชีวภาพที่จัดตั้งขึ้นจึงเป็นที่น่าพอใจในแง่ของความเป็นเส้นตรง ความแม่นยำ และความแม่นยำสำหรับการหาปริมาณของ PRE ในบัฟเฟอร์การขนส่ง

การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ Caco{0}} เพาะเลี้ยงที่ 37 องศาและความชื้นสัมพัทธ์ 95 เปอร์เซ็นต์ในบรรยากาศที่มี CO2 5 เปอร์เซ็นต์และสื่อที่ประกอบด้วย DMEM, 10 เปอร์เซ็นต์ FBS, 1 เปอร์เซ็นต์ NEAA, 1 เปอร์เซ็นต์ L-glutamine, penicillin ( 100 U/มล.) และสเตรปโตมัยซิน (100 ไมโครกรัม/มล.) สื่อถูกเปลี่ยนวันเว้นวันระหว่างการเจริญเติบโตของเซลล์และการสร้างความแตกต่าง เซลล์ถูกปลูกในขวดพลาสติกขนาด 75-cm2 และเก็บเกี่ยวทุก 3-5 วันด้วย EDTA-trypsin 0.05 เปอร์เซ็นต์ สำหรับการทดลองการขนส่ง เซลล์ถูกเพาะที่ความหนาแน่น 1×105 เซลล์/ซม2 บนเม็ดมีด Transwell ที่เคลือบด้วยคอลลาเจน ประมาณ 21 วันหลังจากการเพาะเมล็ด โมโนเลเยอร์ถูกใช้สำหรับการทดลองการขนส่ง ความสมบูรณ์ของพวกมันถูกกำหนดโดยการวัดความต้านทานไฟฟ้าทรานส์-เยื่อบุผิว (TEER) ทั่วทั้งโมโนเลเยอร์ด้วย EVOM ที่ติดตั้ง ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA) ค่า TEER ของโมโนเลเยอร์เซลล์ Caco-2 จำเป็นต้องเกิน 500 O∙cm2

การทดลองการขนส่ง

ชั้นเดียวถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์การขนส่ง (P-บัฟเฟอร์ที่มี 10 mM HEPES, โซเดียม ไพรูเวต 1 มิลลิโมลาร์, กลูโคส 10 มิลลิโมลาร์, 3 มิลลิโมลาร์ CaCl2 และ 145 มิลลิโมลาร์ NaCl, pH 7.4) แล้วจึงทำการบ่มล่วงหน้าเป็นเวลา 20 นาทีที่ 37 องศา . หลังจากนำบัฟเฟอร์การขนส่งออก บัฟเฟอร์การขนส่งใหม่ที่มีตัวอย่างทดสอบถูกเติมไปยังห้องปลาย (AP) (1.5 มล.) ใน AP ไปยังการศึกษาทิศทางเบส (BL) หรือห้อง BL (2.5 มล.) ในการศึกษาทิศทาง BL ถึง AP สำหรับการสอบวิเคราะห์ AC, IS และ EC โดยใช้ HPLC, ส่วนแบ่งหาร (300 ul) ถูกกำจัดออกจากแต่ละห้องตัวรับที่ช่วงเวลาที่ต่างกัน (30, 60, 90 และ 120 นาที) ห้องรับสัญญาณถูกเติมเต็มด้วยปริมาตรเดียวกันของบัฟเฟอร์การขนส่งที่อุ่นไว้ล่วงหน้า (37 องศา ) หลังการสุ่มตัวอย่างแต่ละครั้ง ตัวอย่างที่เก็บรวบรวมถูกเก็บไว้ที่ -20 องศาเพื่อใช้ต่อไป สำหรับการกำหนด PRE โดยใช้วิธีวิเคราะห์ทางชีวภาพ ให้เก็บตัวอย่างที่ 120 นาทีเท่านั้น เนื่องจากความไม่เสถียรของ PRE, AC, IS และ EC วิตามินซี 0.4 เปอร์เซ็นต์ (w/v) จึงถูกเติมเพื่อทำให้ตัวอย่างมีเสถียรภาพเพื่อกำหนดปริมาณ AC, IS และ EC โดย HPLC และตัวอย่างสำหรับ PRE การทดสอบทางชีวภาพถูกวิเคราะห์ทันทีหลังจากถูกสุ่มตัวอย่าง คำนวณค่าสัมประสิทธิ์การซึมผ่านที่ชัดเจน (Papp หรือ 'Papp) ของแต่ละตัวอย่าง

การวิเคราะห์ข้อมูล

ค่า Papp ในทิศทาง AP BL หรือ BLAP ของ AC, IS และ EC คำนวณจากสมการต่อไปนี้: Papp {{0}} (4Q/4t)/(AC0) โดยที่ Papp คือสัมประสิทธิ์การซึมผ่านที่ชัดเจน (ซม./วินาที) ที่กำหนดโดย HPLC (4Q/4t) คืออัตราการปรากฏของสารประกอบทดสอบ (AC, IS หรือ EC) ที่ด้านตัวรับ (μmol/s) A คือพื้นที่ผิวของเม็ดมีด (cm2 ); C0 คือความเข้มข้นของสารประกอบทดสอบเริ่มต้นที่ด้านผู้ให้ (ไมโครโมล/มล.) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ใช้หน่วยมวล "ug" แทน "μmol" เมื่อคำนวณค่า 'Papp' ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD

ผลลัพธ์

องค์ประกอบของ Acteoside, Isoacteoside และ Echinacoside ใน PRE จาก Cistanche Deserticola

เนื่องจาก AC, IS และ EC ถือเป็น PhGs ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่สำคัญของสายพันธุ์ Cistanche [8] เราจึงวิเคราะห์เนื้อหาใน PRE ผ่าน HPLC-UV โครมาโตแกรมที่เป็นตัวแทนแสดงในรูปที่ 1 การระบุองค์ประกอบเหล่านี้ขึ้นอยู่กับการเปรียบเทียบเวลาการคงอยู่และสเปกตรัม UV กับมาตรฐานของแท้ที่ความยาวคลื่น 334 นาโนเมตร เนื้อหาของ AC, IS และ EC ใน PRE เท่ากับ 26.60 เปอร์เซ็นต์ , 1.84 เปอร์เซ็นต์ และ 32.83 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ดังนั้นสารประกอบทั้งสามนี้จึงคิดเป็น 61.27 เปอร์เซ็นต์ของ PRE; นอกจากนี้ ผลลัพธ์ข้างต้นบ่งชี้ว่าเนื้อหา PhG ใน PRE เท่ากับ 78.4 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้น AC, IS และ EC จึงคิดเป็นประมาณ 80 เปอร์เซ็นต์ของ PhGs ใน PRE

ความสามารถในการต่อต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดของ PRE, AC, IS และ EC

มีรายงานการศึกษาฤทธิ์ต้านออกซิเดชันของ PhG จากซีดี [9] และ AC, IS และ EC คิดเป็นประมาณ 80 เปอร์เซ็นต์ของ PhGs ใน PRE ดังนั้น ความสามารถในการต้านออกซิเดชันทั้งหมดของ PRE, AC, IS และ EC จึงถูกวิเคราะห์และแสดงโดยใช้ค่า FRAP (× 10–6 mmol) ดังแสดงในรูปที่ 2 เมื่อค่า FRAP เท่ากับ 8 × 10–6 มิลลิโมล ความเข้มข้นสุดท้ายของ PRE, AC, IS และ EC เท่ากับ 6.20 ug/ml, 3.14 ug/ml, 22.92 ug/ml และ 4.89 ug/ ml ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระโดยรวมของตัวอย่างทั้งสี่นี้จัดลำดับดังนี้: AC > EC > PRE > IS ฤทธิ์ทางชีวภาพของ PRE มาจากกลุ่มสารออกฤทธิ์ (AIG) สำหรับประมาณ 60 เปอร์เซ็นต์ของ PRE, AC และ EC แสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระโดยรวมที่แรงกว่า PRE และ IS เนื่องจาก IS (1.84 เปอร์เซ็นต์ ) ประกอบขึ้นเป็นส่วนย่อยของ PRE เพียงเล็กน้อย ส่วนประกอบอื่นๆ เช่น IS ที่ต้านออกซิเดชันอย่างอ่อน ก็ยังทำงานอย่างชัดเจนใน PRE น่าแปลกที่ฤทธิ์ต้านออกซิเดชันทั้งหมดแตกต่างกันเกือบ 7-เท่าระหว่าง AC และไอโซเมอร์ IS ของมัน ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่เพียงแต่จำนวนหมู่ฟีนอลิกไฮดรอกซิล [9] แต่ตำแหน่งของหมู่ฟีนอลิกไฮดรอกซิลในโมเลกุลยังส่งผลต่อการต้านด้วย - ผลออกซิเดชัน

การตรวจสอบความถูกต้องของ Caco-2 monolayers

ในการตรวจสอบระบบโมโนเลเยอร์ของเซลล์ Caco-2 ค่า Papp ของโพรพราโนลอล (เครื่องหมายที่มีการถ่ายโอนอย่างดี) และสีเหลืองลูซิเฟอร์ (เครื่องหมายที่ขนส่งได้ไม่ดี) จาก AP ไปยัง BL ตลอดโมโนเลเยอร์ของ Caco-2 ถูกกำหนดเป็น 1.51 × 10–5 ซม./วินาที และ 2.8 × 10–7 ซม./วินาที ตามลำดับ และค่าเหล่านี้ตกลงกับค่าที่ตีพิมพ์ในรายงานก่อนหน้า [17, 18] การทดสอบฤทธิ์ของอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสยังยืนยันว่าโมโนเลเยอร์ของเซลล์ Caco-2 มีคุณภาพเทียบเท่ากับเยื่อบุผิวในลำไส้เล็ก [19]

การซึมผ่านของ Acteoside, Isoacteoside และ Echinacoside

In general, the Papp values of well-absorbed drugs were high (>1.0 × 10–5 ซม./วินาที) ในขณะที่ยาที่ดูดซึมได้ไม่ดีมีค่าต่ำ (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

การซึมผ่านของ PRE

ผลลัพธ์ข้างต้นบ่งชี้ว่าความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดของ PRE อย่างน้อยก็เนื่องมาจาก 61.27 เปอร์เซ็นต์ของ AIG จาก PRE ดังนั้นเราจึงประเมิน TR ของ PRE โดยพิจารณาจากเส้นกราฟความเข้มข้น-ผลกระทบของความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด และคำนวณ 'ค่า Papp เพื่อสะท้อนลักษณะการขนส่งของ PRE 'ค่า Papp ของ PRE สำหรับ AP!BL และ BL!AP คือ (2.16 ± 0.26) × 10–7 ซม./วินาที และ (3.13 ± 0.29) × 10–7 ซม./ ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบนี้ดูดซึมได้ไม่ดี นอกจากนี้ การไหลออกหรือการขนส่งที่เคลื่อนไหวไม่ชัดเจนเนื่องจากอัตราส่วนของ 'Papp BL ต่อ AP / 'Papp AP ต่อ BL สำหรับ PRE คือ 1.45 [20] นอกจากนี้ TR แบบสองทิศทางของ PRE เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงระหว่างประมาณ 300 ถึง 900 ug/ml (รูปที่ 5) การขาดการกำหนดทิศทางของผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการแพร่กระจายแบบพาสซีฟเป็นกลไกการขนส่งหลักของ PRE

การอภิปราย

เมื่อเทียบกับผลิตภัณฑ์ยาที่มีความบริสุทธิ์สูง โดยทั่วไปแล้ว PE จะเป็นส่วนผสมที่ประกอบด้วยองค์ประกอบหลายร้อยชนิดที่มีคุณสมบัติทางเคมีกายภาพที่แตกต่างกันอย่างมาก ดังนั้น PE จึงใช้การดำเนินการร่วมกันอย่างเป็นระบบ หลายเป้าหมาย และหลายช่องสัญญาณ เนื่องจาก AIG ที่ซับซ้อน [21] ซึ่งเป็นอุปสรรคต่อการวิเคราะห์ลักษณะการขนส่งของ PE เพื่อประเมินคุณสมบัติการขนส่งของ PE ในเชิงวิทยาศาสตร์มากขึ้น นักวิจัยบางคนได้ระบุส่วนประกอบหลายอย่าง แทนที่จะเป็นส่วนประกอบเดียว ใน PE [22–24] อย่างไรก็ตาม องค์ประกอบจำนวนจำกัดไม่สามารถสะท้อนถึง PE โดยรวมได้ อย่างไรก็ตาม การพิจารณาส่วนประกอบทั้งหมดใน PE นั้นเป็นไปไม่ได้ นอกจากนี้ หากส่วนประกอบที่หลากหลายใน PE แสดงลักษณะการขนส่งที่แตกต่างกันโดยสิ้นเชิง ลักษณะการขนส่งแบบองค์รวมของ PE จะระบุได้ยาก

ในปี 1990 ระบบวิเคราะห์ทางชีวภาพถูกนำมาใช้เพื่อประเมิน TR ของสารต้านจุลชีพ [25] ภายในปี 2548 Eguchi และเพื่อนร่วมงาน [26] ได้ประเมินฤทธิ์ต้านออกซิเดชันของสารสกัดจากแครอทโดยใช้สื่อ BL จากเซลล์ Caco-2 ที่แตกต่างกัน วิธีการนี้เหมาะสมกว่าในการสะท้อนสถานการณ์ในร่างกาย

จากรายงานก่อนหน้าของกิจกรรมของ PhGs [9] และผลลัพธ์ของเรา (รูปที่ 2) TR ของ AIG ใน PRE สามารถประเมินได้โดยการกำหนดความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระทั้งหมดของตัวกลางในห้องรับ หลังจากการทดลองการขนส่ง เราพบว่าค่า TR ของ PRE มีความคล้ายคลึงกันในทั้งสองทิศทาง และการขนส่งนี้ไม่อิ่มตัวและดูดซึมได้ไม่ดี ('Papp < ​​1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3]="" และ="" มันไม่ได้บ่งชี้ถึงการไหลออก="" ซึ่งบ่งชี้ว่าการแพร่กระจายแบบพาสซีฟลงจากการไล่ระดับความเข้มข้นเป็นกลไกการขนส่งหลักของ="" pre="" (รูปที่="" 5)="" นอกจากนี้="" ลักษณะการขนส่งของ="" pre="" ยังสอดคล้องกับคุณสมบัติต่างๆ="" ของ="" ac,="" is="" และ="" ec="" ซึ่งเป็นส่วนประกอบที่มีประสิทธิภาพซึ่งแสดงฤทธิ์ต้านออกซิเดชันใน="" pre="" (รูปที่="" 4="" และตารางที่="" 4)="" ผลลัพธ์นี้เป็นที่คาดหมายและระบุว่าระบบวิเคราะห์ทางชีวภาพในปัจจุบันมีความเหมาะสมและเชื่อถือได้สำหรับการประเมินลักษณะการขนส่งของ="" aig="" ใน="" pre="" ในเซลล์="" caco-2="">

ในทางตรงกันข้ามกับค่า Papp แบบบัญญัติซึ่งมักใช้เพื่อสะท้อนการขนส่งของสารประกอบเดี่ยว 'ค่า Papp ที่ได้รับจาก TR ตามเส้นกราฟความเข้มข้น-ผลกระทบอาจไม่เพียงแต่สะท้อนถึงส่วนประกอบที่เจาะชั้นโมโนเลเยอร์ที่มีโครงสร้างที่ไม่เสียหายแต่ ยังเกี่ยวข้องกับปัจจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมเป้าหมาย เช่น สารเมตาโบไลต์ของส่วนประกอบ ผลิตภัณฑ์ที่เสื่อมสภาพทางเคมี และแม้แต่ไซโตไคน์บางชนิดที่หลั่งจากเซลล์ Caco-2 เพื่อตอบสนองต่อการกระตุ้นที่อาจส่งผลต่อการออกฤทธิ์ทางชีวภาพของเป้าหมาย ดังนั้น มัลติแฟคเตอร์ที่กล่าวถึงข้างต้น จะเป็นตัวกำหนด 'ค่า Papp' แทนที่จะเป็นส่วนประกอบที่ไม่เสียหายที่ขนส่งเท่านั้น ดังนั้น 'Papp อาจสัมพันธ์กันอย่างมากในสถานการณ์ของ Vivo มากกว่าค่า Papp ที่เป็นที่ยอมรับ [26] ในการศึกษานี้ เราได้ชี้แจงลักษณะการแพร่กระจายแบบพาสซีฟและดูดซึมได้ไม่ดีของ PRE โดยพิจารณาจาก 'ค่า Papp ของมัน และลักษณะนี้อาจเกี่ยวข้องกับปริมาณที่สูงและระยะเวลาการรักษาทางคลินิกที่ยาวนานของ CD [27] อย่างไรก็ตาม การค้นพบนี้จะให้แนวทางที่เป็นระบบมากขึ้นสำหรับแพทย์ในการประยุกต์ใช้ซีดีเมื่อมีการระบุเฉพาะลักษณะการขนส่งของ AIG ส่วนใหญ่ในซีดี ไม่เพียงแต่ PhGs เท่านั้นที่ได้รับการระบุ

อย่างไรก็ตาม รายการฤทธิ์ทางชีวภาพที่เลือกต้องมีความไวเพียงพอที่จะตรวจพบในตัวกลางของห้องรับ ซึ่งเป็นความท้าทายในการจัดตั้งระบบการวิเคราะห์ทางชีวภาพเพื่อประเมินลักษณะการขนส่งของ PE นอกจากนี้ ฤทธิ์ทางชีวภาพควรขึ้นอยู่กับส่วนประกอบให้ได้มากที่สุด ในการศึกษาของเรา การทดสอบความสามารถในการต้านออกซิเดชันโดยรวมมีความเหมาะสมมากกว่าวิธีการอื่นๆ (รูปที่ S1) แต่ถึงกระนั้น การทดสอบของเราสามารถตรวจจับ TR ของ PRE ที่ 120 นาทีเท่านั้น

โดยรวมแล้ว การศึกษานี้ได้สร้างระบบการทดสอบทางชีวภาพแบบใหม่เพื่อประเมินการซึมผ่านของลำไส้ของ PRE ในเซลล์ Caco-2 ที่มีความแตกต่าง ผลลัพธ์ที่ได้แสดงให้เห็นว่าการแพร่แบบพาสซีฟที่ดูดซึมได้ไม่ดีตามระดับความเข้มข้นโดยไม่มีการไหลออกเป็นกลไกการขนส่งหลักของ PRE (รูปที่ 5) ซึ่งเป็นพื้นฐานทางเภสัชจลนศาสตร์สำหรับการประยุกต์ใช้ทางคลินิกของ PhGs ในซีดี การใช้ระบบวิเคราะห์ทางชีวภาพแบบใหม่เพื่อประเมิน TR และด้วยเหตุนี้จึงคำนวณ 'ค่า Papp เพื่อประเมินคุณสมบัติการขนส่งลำไส้ของ AIG ใน PEs ได้อย่างชัดเจน แนวทางนี้อาจเหมาะสมกับ PE อื่นที่ได้รับฤทธิ์ทางชีวภาพที่เหมาะสม

ข้อมูลสนับสนุน

S1 รูปที่ ผลกระทบของ PRE ต่อ (A) ซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน, (B) อนุมูลไฮดรอกซิล (C) ผลิตภัณฑ์ลิพิดเปอร์ออกซิเดชัน และ (D) DPPH เรดิคัล ขั้นตอนการทดสอบได้ดำเนินการตามรายงานก่อนหน้า [1, 2] โดยไม่ต้องใช้บัฟเฟอร์การขนส่ง ค่า IC50 (ความเข้มข้นในการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์) และ SC50 (ความเข้มข้นของการกำจัด 50 เปอร์เซ็นต์) ถูกคำนวณตามกราฟการตอบสนองความเข้มข้นมาตรฐาน (DOCX)

ผลงานของผู้เขียน

คิดและออกแบบการทดลอง: YG XC YQ ทำการทดลอง: YG CZ FL LF RC YS วิเคราะห์ข้อมูล: CZ YG YQ รีเอเจนต์/วัสดุ/เครื่องมือวิเคราะห์ที่สนับสนุน: RC. เขียนบทความ: YG YQ

Department of Research Center for Pharmacology and Toxicology, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, ปักกิ่ง, PR China,

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin, Heilongjiang, PR China