Lanostane Triterpenoids ใน Poria Cocos มีบทบาทสำคัญในกิจกรรมภูมิคุ้มกัน

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม:Poria cocos (Schwein) FA Wolf(syn. Wolfiporia cocos) sclerotium แห้งเรียกว่าการพับเป็นเชื้อรา saprophytic ที่กินได้ซึ่งมักใช้เป็นยาชูกำลังและยาจีนโบราณต่อต้านริ้วรอย มันถูกใช้ร่วมกับยาจีนโบราณอื่น ๆ เพื่อเพิ่มภูมิคุ้มกัน การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าสารสกัด P. cocos (Lipucan⑨) ที่มี lanostane triterpenoids ไม่มีพิษต่อภูมิคุ้มกันและเสริมสร้างภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง (โดยกำเนิด) ผ่านการกระตุ้นเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติและส่งเสริมการหลั่งอินเตอร์เฟอรอน (IFN-y) โดยเซลล์ T-helper (Th1) ชนิดที่ 1 การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน นอกจากนี้ สารสกัด P. cocos ช่วยลดการหลั่งอินเตอร์ลิวคิน (IL-4 และ IL-5) อย่างมีนัยสำคัญโดยเซลล์ T-helper (Th2) ชนิดที่ 2 ซึ่งสัมพันธ์กับการตอบสนองต่อการแพ้ ครั้งแรกที่ระบุว่า lanostane triterpenoids ที่บริสุทธิ์เป็นส่วนผสมของ P. cocos ที่มีภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจงที่ได้รับการปรับปรุงโดยการส่งเสริมการหลั่ง interferon (IFN-) ในการศึกษาเบื้องต้น ผลการวิจัยของเราสนับสนุนว่าสารสกัด P. cocos มีบทบาทที่เป็นประโยชน์ต่อการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน

คำสำคัญ:โคโค่ Poria; lanostane triterpenoids; ภูมิคุ้มกัน; Th1/Th2: การควบคุมภูมิคุ้มกัน

1. บทนำ

การติดเชื้อไวรัส เช่น ไวรัสทางเดินหายใจ (รวมถึงไวรัสไข้หวัดใหญ่ ไรโนไวรัส อะดีโนไวรัส และโคโรนาไวรัส) เริม และไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ (HIV) คุกคามสุขภาพของมนุษย์อย่างจริงจัง ไวรัสระบบทางเดินหายใจที่แพร่ระบาดได้สูงเหล่านี้แพร่ระบาดในประชากรโลก กลายเป็นโรคระบาดใหญ่และคร่าชีวิตผู้คนจำนวนมาก ภัยคุกคามนี้กลายเป็นปัญหาด้านสุขภาพส่วนบุคคลและเป็นปัญหาด้านเศรษฐกิจ ความปลอดภัย และสังคมระหว่างประเทศ [1] การฉีดวัคซีนเป็นวิธีการหลักในการควบคุมการแพร่กระจายของการติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความสามารถในการกลายพันธุ์ของไวรัสที่มีชื่อเสียง จึงต้องพัฒนาวัคซีนใหม่ทุกปี มีความจำเป็นเร่งด่วนในการพัฒนายาต้านไวรัสหรือวิธีการรักษาที่มีประสิทธิภาพ น่าเสียดายที่ต้องใช้เวลาหลายปีและหลายร้อยล้านดอลลาร์ในการพัฒนายาใหม่ ซึ่งมักจะสายเกินไปที่จะต่อสู้กับไวรัสระบาดอย่างกะทันหัน รายงานล่าสุดระบุว่าผู้ที่มีอายุมากกว่า 50 ปีส่วนใหญ่ติดเชื้อไวรัสระบบทางเดินหายใจ [2,3] การแก่ชราเป็นสาเหตุหนึ่งที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความบกพร่องในระบบภูมิคุ้มกัน รวมถึงการทำงานของเซลล์และจำนวน [4-6] การดูแลตนเองเป็นแนวทางสำคัญที่ใช้ในประเทศส่วนใหญ่ในการลดค่าใช้จ่ายทางการแพทย์ส่วนบุคคลและภาระการดูแลสุขภาพทางสังคม |7,8] การพัฒนาสารเสริมภูมิคุ้มกันเพื่อเพิ่มความต้านทานของโฮสต์ต่อการติดเชื้อไวรัสและปรับปรุงความสามารถในการปรับตัวของโฮสต์เป็นแนวทางสำคัญที่ได้รับความสนใจอย่างมากเมื่อเร็วๆ นี้ [9,10]

ด่านแรกของร่างกายมนุษย์ในการป้องกันเชื้อโรครวมถึงสิ่งกีดขวางทางสรีรวิทยา เช่น ผิวหนัง เนื้อเยื่อใต้ผิวหนัง และเยื่อเมือก แนวป้องกันที่สองคือระบบภูมิคุ้มกัน ซึ่งประกอบด้วยอวัยวะภูมิคุ้มกัน เซลล์ภูมิคุ้มกัน และโมเลกุลภูมิคุ้มกัน ระบบภูมิคุ้มกันแบ่งออกเป็นภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและภูมิคุ้มกันแบบปรับตัว [11] ระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดเป็นระบบภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง มันสามารถแยกแยะตัวเองระหว่างตัวเองกับไม่ใช่ตัวตนโดยไม่ต้องสัมผัสกับเชื้อโรคเช่นแบคทีเรียและไวรัสซ้ำ ๆ เนื่องจากมีลักษณะเฉพาะที่ไม่เฉพาะเจาะจง จึงมีความสามารถกว้างในการต่อสู้กับการติดเชื้อหลายชนิด [12] เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ (NK) และอินเตอร์เฟอรอน (IFN) เป็นส่วนประกอบสำคัญของระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดในการป้องกันโฮสต์จากการติดเชื้อไวรัสทางเดินหายใจ [13] เซลล์ NK มีความสามารถในการฆ่าเซลล์ที่ติดไวรัสอย่างรวดเร็ว นอกจากนี้ เซลล์ NK ยังกระตุ้น เซลล์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ Type 1 T-helper （Th1) เซลล์ โดยปล่อย IFN- 【14,15】 อินเตอร์เฟอรอนมีความสามารถในการแทรกแซงการจำลองของไวรัสและสามารถแบ่งออกเป็นสามประเภท ได้แก่ interferons I （IFN- , IFN- ） , II （IFN-y） และ ⅢI （IFN-λ）【16,17】 การจำลองแบบไวรัสเป็นขั้นตอนพื้นฐานที่สำคัญของไวรัส เซลล์มีบทบาทสำคัญในการป้องกันการติดเชื้อไวรัส [18] ในอีกทางหนึ่ง มือ เซลล์ T-helper (Th2) ชนิดที่ 2 ส่วนใหญ่หลั่ง interleukins (ILs) ซึ่งรวมถึง IL-4 และ IL-5 และส่งเสริมเซลล์ B เพื่อคัดหลั่งอิมมูโนโกลบูลิน E(IgE) แอนติบอดีเพื่อส่งเสริมภูมิคุ้มกันทางร่างกายและ กระตุ้นการแพ้ [19].

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

การยื่น (โรคหนังแข็งแห้งของ Poria cocos(Schwein.)FAWolf(syn. Wolfiporia cocos)) ยาจีนโบราณที่รู้จักกันดีและต่อต้านริ้วรอย มีการใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นยาระงับประสาทและขับปัสสาวะมานานกว่าสองพันปี [ 20]. P. cocos ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีคุณสมบัติต้านการอักเสบ ต่อต้านเนื้องอก ต่อต้านน้ำตาลในเลือดสูง ยากล่อมประสาท และต่อต้านวัยด้วยสารไตรเทอร์พีนอยด์ lanostane ที่ระบุว่าเป็นส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ [21-30] นอกจากนี้ พบว่าเศษส่วนของเอทิลอะซิเตตและโพลิแซ็กคาไรด์แบบหยาบของ P. cocos ช่วยเพิ่มภูมิคุ้มกันในแบบจำลองของสัตว์โดยพิจารณาจากการทดสอบปริมาณเม็ดเลือดแดงในซีรัม ผลของฟาโกไซติกของมาโครฟาจโมโนนิวเคลียร์ และระดับการเปลี่ยนแปลงของลิมโฟไซต์ ลาโนสเตนไตรเทอร์พีนอยด์ถือเป็นส่วนประกอบหลักในส่วนของเอทิลอะซิเตตตามการวิเคราะห์ HPLC [31] อย่างไรก็ตาม ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าภูมิคุ้มกันโดยกำเนิดและภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวมีผลต่อการทำงานของเซลล์ NK, IFN, เซลล์ภูมิคุ้มกันหรือไซโตไคน์ของ P.cocos หรือไม่ และการชี้แจงสารประกอบออกฤทธิ์ การศึกษานี้ตรวจสอบผลกระทบของระบบภูมิคุ้มกันของสารสกัด P. cocos ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์ที่มีความคงตัวของเนื้อหา lanostane triterpenoids ที่จดสิทธิบัตรแล้ว โดยใช้แบบจำลองจากสัตว์ ส่วนประกอบที่ใช้งานถูกระบุก่อน

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.วัสดุปลูก

ซีลีโรเทียมแห้งของ P. cocos(Schwein.)FAWolf สกัดโดยใช้เอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์เพื่อให้ได้สารสกัด P. cocos (ลิปูแคน) สารสกัดนี้ผลิตโดย Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou Sinphar Group, China และพัฒนาโดย Sinphar R&D Center ประเทศไต้หวัน สารสกัดประกอบด้วยลาโนสเตนไตรเทอร์พีนอยด์หลักสี่ชนิด (รูปที่ 1, สารประกอบ 1-4) วิเคราะห์โดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (UPLC) [32] เนื้อหาไตรเทอร์พีนอยด์หลักสี่ชนิดคือ 6.2 เปอร์เซ็นต์ แคปซูลเชิงพาณิชย์ (FL) ที่มีสารสกัด P. cocos 27.{9}} มก. ถูกใช้เพื่อตรวจสอบผลกระทบต่อกิจกรรมการควบคุมภูมิคุ้มกัน

2.2.การแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของ Lanostane Triterpenoids จาก P. cocos

P.cocos แห้ง (10 กก.) ถูกสกัดสามครั้งโดยรีฟลักซ์ด้วยเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 3 ชั่วโมง [24] สารสกัดเข้มข้นถูกโครมาโตกราฟีบนซิลิกาเจล (70-230 เมช) โดยใช้ของผสมที่มีขั้วมากขึ้นของ CH2Cl และ MeOH(CH2Cl:MeOH,97:3; CH2Cl2:MeOH, 96:4;CH2Cl:MeOH,90:10, และ 100 เปอร์เซ็นต์ MeOH) ตามโครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง (TLC) เศษส่วนสี่ส่วน(Fr.1-Fr.4) ถูกรวบรวมสำหรับการแยกเพิ่มเติม Fr.1-Fr.3 อยู่ภายใต้การเตรียมโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) (Waters Prep 150 LCsystem, Milford, MA, USA) บนคอลัมน์ Waters XBridge RP-18 (250 มม. × 19 มม., 5 um, Milford, MA, USA) โดยใช้เมทานอล 80 เปอร์เซ็นต์เป็นระบบเฟสเคลื่อนที่ อัตราการไหลคือ 18 มล./นาที รวบรวมจุดสนใจที่สำคัญสี่จุดหลัก เศษส่วนที่มีสารประกอบเป้าหมายถูกควบแน่นเพิ่มเติมจนแห้งและทำให้เกิดกรดทูมูโลซิก(1)(120.1 มก.), กรดโพลีโฟนิก C(2)(16.0 มก.),3-กรดเอพิ-ดีไฮโดรทูมูโลซิก (3)(12.1 มก.) และกรดดีไฮโดรทูมูโลซิก(4)(6.8 มก.) ตามลำดับ โครงสร้างของพวกเขาได้รับการอธิบายโดยการวิเคราะห์สเปกโตรสโกปี NMR (คลื่นแม่เหล็กไฟฟ้านิวเคลียร์) และสเปกโตรสโคปีด้วยไฟฟ้าสเปรย์ไอออนไนซ์ (ESI-MS) และโดยการเปรียบเทียบกับข้อมูลวรรณกรรม [32]

2.3.การศึกษาสัตว์เบื้องต้นโดย Lanostane Triterpenoid Compounds (1-3) สำหรับการศึกษาการวิเคราะห์ IFN-r

สำหรับการศึกษานี้ สารประกอบลาโนสเตนไตรเทอร์พีนอยด์ที่ทำให้บริสุทธิ์ ได้แก่ กรดทูมูโลซิก (1) กรดโพลีโฟนิก C(2) และ 3-กรดอีพิดไฮโดรทูมูโลซิก (3) ถูกเตรียมสำหรับการศึกษาเบื้องต้นโดยใช้ BALB/c(สายพันธุ์ของหนูเมาส์ ของหนูเผือก) หนูเพศผู้ หลังจาก 4 วันของการบริหารให้ทางปากของสารประกอบ 1-3 และน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อ (กลุ่มควบคุม)(1 มล./หนูเมาส์) หนูถูกสังเวยในวันที่ห้า และเซลล์ม้ามถูกรวบรวม ม้ามสดถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยงที่ประกอบด้วยอาหารเพาะเลี้ยง Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640 10 มล. จากนั้นม้ามจะถูกบดบนตาข่ายละเอียดเพื่อปลดปล่อยเซลล์ม้าม จากนั้นเซลล์ม้ามที่แขวนลอยในตัวกลางถูกถ่ายโอนไปยังหลอดสำหรับการปั่นแยกที่มีก้นรูปกรวยขนาด 50 มล. และหมุนเหวี่ยงที่ 1300 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกทิ้งและเม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การสลายเซลล์เม็ดเลือดแดงเย็น (RBC) 1 มิลลิลิตรที่มี EDTA-NH4Cl เซลล์ถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที และจากนั้นล้างสามครั้งด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อโดยการหมุนเหวี่ยง จากนั้น เซลล์แขวนลอยม้ามถูกเพาะเลี้ยงในจานหลุม 24-หลุมที่ความหนาแน่น 1 × 10 องศาเซลล์/มล. ในตัวกลางที่มี RPMl 1640 เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรัมวัวในครรภ์ (FBS), 2 มิลลิโมลาร์ L-กลูตามีน, ยาปฏิชีวนะ และคอนคานาวาลิน A (ConA) 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ที่ 37 องศาเป็นเวลา 3 วัน รวบรวมสิ่งเหนือตะกอนของเซลล์ม้ามจากการเพาะเลี้ยง วัดความเข้มข้นของ IFN โดยใช้ชุดทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) (ระบบ R&D, Minneapolis, MN, USA)

2.4.แบบจำลองสัตว์และกำหนดการการทดลอง

หนู BALB/c เพศเมียถูกซื้อมาจากศูนย์สัตว์มหาวิทยาลัยแห่งชาติไต้หวัน สัตว์ต่าง ๆ ถูกเลี้ยงในกรงที่มีการระบายอากาศเฉพาะตัวสำหรับปลอดโรคเฉพาะที่ 22±2 องศา โดยมีอุณหภูมิและความชื้นอยู่ที่ 40-60 เปอร์เซ็นต์ โดยมีรอบแสง/มืด 12 ชม./12 ชม. และเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรี หลังจากปรับตัวให้ชินกับสภาพอากาศได้หนึ่งสัปดาห์ หนูจะถูกสุ่มกลุ่มตามน้ำหนักตัวและใช้สำหรับการทดลอง ปริมาณที่แตกต่างกันสี่ขนาด 26 มก./กก. (FL200),52 มก./กก. (FL400),104 มก./กก. (FL800), 156 มก./กก. (FL1200) ถูกละลายตามลำดับในเครื่องกลั่นที่ปราศจากเชื้อ น้ำ (0.4 มล.) และรับประทานเป็นเวลาห้าวันติดต่อกันต่อสัปดาห์เป็นเวลา 9 สัปดาห์ กลุ่มควบคุมถูกป้อนด้วยน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อ (0.4 มล.) หนูถูกฉีดด้วยแอนติเจนที่จำเพาะต่อโอวัลบูมิน (OVA) ในช่องท้องในสัปดาห์ที่สาม ห้า และเจ็ด OVA เป็นสารก่อภูมิแพ้ไข่ขาวที่พบในไข่ขาวเป็นหลัก มักใช้เพื่อทำให้เกิดอาการแพ้ในสัตว์ทดลอง เซลล์ม้ามถูกรวบรวมเพื่อการศึกษาเพิ่มเติม หนูถูกสังเวยโดยใช้การุณยฆาตคาร์บอนไดออกไซด์หลังจากการทดลอง 9 สัปดาห์ หมายเลขอนุมัติสำหรับการศึกษานี้โดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ของสถาบัน (IACUC) คือ A9647

2.5. การเก็บตัวอย่างม้าม

เก็บม้ามซึ่งเป็นอวัยวะยาวสีแดงเข้มที่ด้านซ้ายบนของช่องท้องของหนู หลังจากที่เนื้อเยื่อเกี่ยวพันถูกเอาออกอย่างระมัดระวังโดยใช้กรรไกรและคีมขนาดเล็ก ม้ามถูกใส่ลงในอาหารเลี้ยงเซลล์ (อาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 ที่มีซีรัมวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (HyClone)) หลังจากการชั่งน้ำหนัก ตัวอย่างม้ามถูกบดโดยใช้ตัวดันเข็มฉีดยาขนาด 5 มล. ที่สะอาดและปลอดเชื้อ สารแขวนลอยของเซลล์ม้ามถูกดูดเข้าไปในหลอดสำหรับการปั่นแยกขนาด 15 มล. ใหม่ที่มีหยดพลาสติกบรรจุภัณฑ์เดียวที่ปลอดเชื้อ 3 มล. เซลล์ที่ถูกแขวนลอยถูกรวบรวมหลังจากการตกตะกอน 5 นาที เซลล์ที่ถูกแขวนลอยถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 7 นาที และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกละทิ้งเพื่อให้ได้พาเลทเซลล์ จากนั้น บัฟเฟอร์การสลาย RBC 1 มล. ถูกเติมเพื่อกำจัดเซลล์เม็ดเลือดแดงเป็นเวลา 1 นาที ซีรั่มโควีนของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ 9 มล. ถูกเติมอย่างรวดเร็วไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อ, ขั้นตอนการปั่นแยกที่ทำซ้ำ, และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกละทิ้ง เพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายของความสมบูรณ์ของเซลล์ม้ามเนื่องจากบัฟเฟอร์ RBClysis ตัวอย่างจะถูกล้างสามครั้งด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ Balanced Salt Solution (HBSS) ของ Hank จากนั้นเซลล์ม้ามจะถูกระงับด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อในซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์สำหรับการวิเคราะห์และการทดลอง

2.6. การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง

2.6.1.การวิเคราะห์เครื่องหมายเซลล์ม้าม

การวิเคราะห์เซลล์ภูมิคุ้มกันดำเนินการโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีเรืองแสงที่จับกับเซลล์ภูมิคุ้มกันชนิดต่างๆ อย่างจำเพาะโดยใช้โฟลว์ไซโตมิเตอร์ โฟลว์ไซโตเมทรี (Epics XL-MCL Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ใช้ในการคำนวณสัดส่วนของเซลล์ภูมิคุ้มกันจำเพาะ เช่น คอมเพล็กซ์ histocompatibility ที่สำคัญประเภท I (MHC I), CD4 บวก T เซลล์, CD8 บวก T เซลล์, เซลล์ NK และมาโครฟาจ

2.6.2. การวิเคราะห์กิจกรรมเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ

YAC-1 (สายเซลล์ที่ไวต่อการกระทำของการออกฤทธิ์ของเซลล์ NK) สายเซลล์มะเร็งต่อมน้ำเหลืองของหนูเมาส์ (ATCC) ถูกใช้เป็นเป้าหมายของเซลล์ NK ในการทดลองนี้ เมื่อเซลล์ม้ามของหนูเมาส์เพศเมีย BALB/c ได้รับการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ YAC-1 ในจานเดียวกัน เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติจะฆ่าเซลล์ YAC-1 หลังจาก 3 ชั่วโมงของปฏิกิริยาความเป็นพิษต่อเซลล์ เซลล์ YAC-1 ที่ถูกฆ่าถูกย้อมด้วยสีย้อม(LIVE/DEAD Cell-Mediated Cytotoxicity Kit, Molecular Probes, L-7010) ดังนั้นโฟลว์ไซโตเมทรีจึงถูกใช้เพื่อตรวจจับและวิเคราะห์ความเข้มของการเรืองแสงโดยใช้ซอฟต์แวร์ WinMDI 2.8 (Purdue University Cytometry Laboratories, West Lafayette, IN, USA) อัตราส่วนเซลล์เอฟเฟกต์ (E) ต่อเซลล์เป้าหมาย (T) คือ 100:1 และ 200:1 (เซลล์เอฟเฟกต์คือเซลล์ม้าม และเซลล์เป้าหมายคือ YAC-1 เซลล์)

2.6.3. การหลั่งไซโตไคน์โดยใช้การวิเคราะห์เซลล์ม้าม

หลังจากกระตุ้นเซลล์ม้ามด้วย ConA (ความเข้มข้น 2.5 ug/mL) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง สารลอยเหนือตะกอนจากการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกรวบรวมและเก็บไว้ที่ -20 องศาสำหรับการวิเคราะห์ไซโตไคน์โดยใช้ชุด IL IL ของหนูเมาส์ OptEIA-5 ELISA ( Pharmigen, 555236, Franklin Lake, NJ, USA)และเมาส์ DouSet IFN- ELISA kit (ระบบ R&D, DY485, Minneapolis, MN, USA) บัฟเฟอร์เคลือบ (pH:9.6) ถูกเตรียมเพื่อให้มีปริมาณที่เหมาะสมของแอนติบอดีต้านไซโตไคน์ของหนู (L-5 และ IFN-y) บนจานหลุม 96-หลุม (เพลต Nunc-Immuno, MaxiSorp, Thermo วิทยาศาสตร์, Roskilde, เดนมาร์ก). หลังจากยืนที่อุณหภูมิ 4C ข้ามคืน แอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกไว้ถูกล้างด้วยเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มีบัฟเฟอร์ Tween20 (PBST) และบัฟเฟอร์การขัดขวาง 200 ไมโครลิตร/หลุม (1 เปอร์เซ็นต์ BSA ใน PBS) ถูกเติม หลังจาก 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ PBST และ 100 ไมโครลิตร/หลุมของสารเหนือตะกอนการเพาะเลี้ยงเซลล์หรือสารมาตรฐานไซโตไคน์ลูกผสมที่เติมลงในตัวอย่างหลังจาก 4 องศาข้ามคืน ตัวอย่างถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ PBST จากนั้นจึงเติมความเข้มข้นที่เหมาะสมของไบโอติน (ไบโอติน) แอนติ-ไซโทไคน์ทุติยภูมิแอนติบอดีที่เชื่อมโยง (100 ไมโครลิตร/หลุม) หลังจาก 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ PBST จากนั้นเติม Avidin-peroxidase (100 ไมโครลิตร/หลุม) (Sigma, St. Louis, MO, USA) หลังจาก 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เททราเมทิลเบนซิดีน (TMB)(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ถูกเติมเป็นเวลา 5 นาทีของปฏิกิริยาสี และเพิ่ม 50 ไมโครลิตร 2.5 เปอร์เซ็นต์ H2SO4 จากนั้นจึงเติม H2SO4 เพื่อหยุดปฏิกิริยาสี วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร

2.7. การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันจำเพาะโดย Ovalbumin (OVA) - หนูที่ได้รับการเหนี่ยวนำ

หนูเพศเมีย BALB/c ถูกฉีดเข้าช่องท้องด้วย OVA เป็นแอนติเจนและ CFA (สารเสริมของ Freund ที่สมบูรณ์) เป็นสารเสริม เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงเซลล์ม้ามเหมือนกับข้างต้น ไซโตไคน์ (L-4)ถูกวิเคราะห์โดย ELISA

2.8.การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ย (SD) และวิเคราะห์โดยใช้ ANOVA ทางเดียว ค่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่ p<0.05. dunnett's="" test="" was="" used="" to="" identify="" the="" differences="" between="">

3. ผลลัพธ์

3.1. การแยกและการระบุสารประกอบไตรเทอร์พีนอยด์ลาโนสเตนสี่ชนิด 1-4 ของ P.cocos

พีแห้งต่อต้านริ้วรอย cistanchecocos(10 กก.)ถูกสกัดสามครั้งโดยรีฟลักซ์ด้วยเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 3 ชั่วโมง สารสกัดเข้มข้นถูกโครมาโตกราฟีบนซิลิกาเจลและคอลัมน์ C18 เพื่อสร้างสารประกอบแลนสเตนไตรเทอร์พีนอยด์หลักสี่ชนิด ได้แก่ กรดทูมูโลซิก (1) กรดโพลีโฟนิก C (2) 3-กรดเอพิ-ดีไฮโดรทูมูโลซิก(3) และกรดดีไฮโดรตูมูโลซิก(4 ) ตามลำดับ (รูปที่ 1) โครงสร้างของพวกเขาได้รับการอธิบายโดย NMR spectroscopy (Table S1) และการวิเคราะห์ ESI-MS (รูปที่ S2, S4, S6 และ S8) และเปรียบเทียบกับข้อมูลวรรณกรรม [32,33] โครมาโตแกรม UPLC ของ 1-4 ถูกแสดงไว้ในรูปที่ S1, S3, S5 และ S7

3.2. การศึกษาเบื้องต้นในหนูตัวผู้ BALB/c โดย Lanostane Triterpenoid Compounds 1-3

เซลล์ม้ามที่แยกได้จากหนูเมาส์ที่บำบัดด้วยสารประกอบลาโนสเตน ไตรเทอร์พีนอยด์ (1-3) ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลาห้าวันต่อหน้าเซลล์หนึ่ง ปริมาณของ IFN-y ที่คัดหลั่งโดยทีลิมโฟไซต์ของม้ามถูกวัด หลังจากที่หนูเมาส์ถูกเลี้ยงด้วยขนาดยา 2.5 มก./กก./วัน หรือขนาดยาที่สูงขึ้นของสารประกอบ 1,5 และ 10 มก./กก./วัน ของ 2 และ 20 มก./กก./วันที่ 3 ตามลำดับ, IFN-y ที่ถูกคัดหลั่งโดย ConA -ทีเซลล์ที่กระตุ้นม้ามถูกเติมอย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1 และ 2) การศึกษาเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่า lanostane 1-3 เพิ่มการหลั่ง IFN-y โดยเซลล์ม้ามที่กระตุ้นโดย ConA

3.3.การประเมินความปลอดภัยจากการศึกษาวิจัยสัตว์ของสารสกัดพี.โคโคส

ตารางที่ 3 และ 4 ระบุว่าสารสกัด P. cocos ไม่มีผลต่อน้ำหนักตัวและน้ำหนักของม้ามซิสทานเช เบเนฟิซิโอสตารางที่ 5 ยังแสดงให้เห็นว่าเซลล์ภูมิคุ้มกัน เช่น เซลล์ T ทั้งหมด, เซลล์ B ทั้งหมด, MHC II (ชนิดเชิงซ้อนของความเข้ากันได้ที่สำคัญ II, CD4 บวก T เซลล์, CD8 บวก T เซลล์, เซลล์ NK และมาโครฟาจในกลุ่มสารสกัดจาก P. cocos มี ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม จากผลลัพธ์ข้างต้น ควรประเมินว่าไม่ควรมีความเสี่ยงต่อภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องในระหว่างการทดลองให้อาหารสารสกัดจาก P. cocos

3.4. การประเมินการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง

Nature Killer Cells (เซลล์ NK) มีบทบาทสำคัญในการสร้างภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง ตารางที่ 6 แสดงว่ากลุ่ม FL400 เหนี่ยวนำการเพิ่มขึ้นในการทำงานของเซลล์ NK อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม FL200 เป็นแนวโน้มที่จะมีผลเพิ่มขึ้นจากการทำงานของเซลล์ NK ของสารสกัด P.cocos Cytokines เป็นสารเคมีรวมทั้ง interleukins (IL) และ interferon (IFN) ที่ควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกันหรือการเติบโตของเซลล์ 【34】 เราวิเคราะห์ความเข้มข้นของ IFN- (การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน Th1) ของเซลล์ม้ามที่เหนี่ยวนำโดย ConA และ LPS และความเข้มข้นของ IL-5 (การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน Th2) ของเซลล์ม้ามที่เหนี่ยวนำโดย ConA ที่แยกได้จากหนูที่ได้รับการรักษาด้วย FL200, FL400, FL800 และ FL1200 (ตารางที่ 7 และ 8) กลุ่ม FL800 และ FL1200 กระตุ้นการผลิต IFN-y อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ม้ามของหนูเมาส์ในการมีอยู่ของ ConA (ตารางที่ 7) ตารางที่ 7 ยังแสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของเซลล์ม้ามของ IL-5 ที่แยกได้จากหนูที่บำบัดด้วย FL200, FL400, FL800 และ FL1200 มีผลลดลงอย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา นอกจากนี้ กลุ่ม FL400, FL800 และ FL1200 ยังกระตุ้นการผลิต IFN อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ม้ามของหนูเมาส์ต่อหน้า LPS (ตารางที่ 8)

4. การอภิปราย

ระบบภูมิคุ้มกันของมนุษย์มีหน้าที่ต่อสู้กับเชื้อโรคต่างประเทศเพื่อปกป้องสุขภาพพิวริแทน วิตามินซีภูมิคุ้มกันที่ไม่เพียงพอมักจะทำให้ร่างกายอ่อนแอต่อการติดเชื้อ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีภูมิคุ้มกันที่เพียงพอ แต่ยังต้องการกลไกการกำกับดูแลที่เข้มงวดเพื่อหลีกเลี่ยงความเสียหายหลักประกันที่มากเกินไป การรักษาสมดุลของภูมิคุ้มกันเป็นภารกิจของระบบภูมิคุ้มกันที่สำคัญที่สุด[35] หลักฐานจำนวนมากบ่งชี้ว่าความสมดุลของภูมิคุ้มกันมีความสัมพันธ์อย่างมากกับการตอบสนองของเซลล์ Th1/Th236,37] ความเครียดและอายุมากขึ้นอาจทำให้ Th1/Th2 เสียสมดุลและเอียงเข้าหา Th2 ซึ่งอาจทำให้เกิดการติดเชื้อและโรคภูมิแพ้ [38-40] การค้นหาภูมิคุ้มกันสมดุลที่มีประสิทธิภาพนี้มีความจำเป็นเร่งด่วน นอกจากนี้ เป็นเรื่องน่ายินดีที่ความรู้ที่ได้รับจากการวิจัยทางวิทยาศาสตร์ที่สั่งสมมาหลายทศวรรษเกี่ยวกับระบบภูมิคุ้มกันของมนุษย์และการตอบสนองต่อโรคติดเชื้อช่วยให้ข้อมูลเกี่ยวกับการวิจัยและพัฒนาการรักษา และยังมีกลยุทธ์ในการป้องกันการแพร่กระจายของไวรัสอีกด้วย [41 , A42]. การศึกษาก่อนหน้านี้จำนวนมากเกี่ยวกับการศึกษาทางเภสัชวิทยาของ P. cocos มีอคติต่อโปรตีน P. cocos [43,44] หรือโพลีแซ็กคาไรด์ [45,46] มีการศึกษาหลายชิ้นเกี่ยวกับประสิทธิภาพของ lanostane triterpenoids จาก P. cocos เช่น hypoglycemia [25], anti-cancer [24] และ sedative function [28]cistanche คืออะไรการศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าเศษส่วนของเอทิลอะซิเตทของ P. cocos มีส่วนประกอบหลักไตรเทอร์พีนอยด์และมีฤทธิ์เสริมสร้างภูมิคุ้มกัน 31 อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการตีพิมพ์งานวิจัยเชิงลึกติดตามผลเพิ่มเติม การศึกษาของเราประเมินฟังก์ชันภูมิคุ้มกันของ P. cocos ในรูปแบบหนูที่ได้รับการยอมรับอย่างดี ซึ่งรวมถึงการศึกษาคัดกรองเบื้องต้นของสารประกอบ lanostane triterpenoid ที่บริสุทธิ์ เราแสดงให้เห็นในการศึกษานี้ว่าสารสกัด P.cocos (Lipucan) ที่มี lanostane triterpenoids 6.2 เปอร์เซ็นต์จาก 4 ตัว มีบทบาทหลายประการในการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน

การตรวจสอบก่อนหน้านี้รายงานว่า CD4 ของมนุษย์บวก T-helper (Th) รวมถึงชุดย่อย Th1 และ Th2 ถูกกำหนดโดยไซโตไคน์ที่พวกมันหลั่งออกมา [36] เซลล์ Th1 ส่วนใหญ่หลั่ง IFN- ; เซลล์ Th2 ผลิต IL-4, IL-5 กระตุ้นการผลิตแอนติบอดี และนำไปสู่การตอบสนองต่อการแพ้โดยการเพิ่มการผลิต IgE โดยเซลล์ B และส่งเสริมการเติบโตของแมสต์เซลล์ และการสร้างความแตกต่างของอีโอซิโนฟิล เป็นที่ทราบกันดีว่าเซลล์ NK และ IFN มีบทบาทสำคัญในการป้องกันภูมิคุ้มกันจากการติดเชื้อไวรัส ระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติมีความสำคัญมากในการป้องกันไวรัสที่บุกรุกร่างกายในขั้นต้นและกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ปรับเปลี่ยนได้ในภายหลัง เซลล์ NK จัดเป็นภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง (โดยกำเนิด) ที่รับผิดชอบในการฆ่าเซลล์ที่ติดไวรัส【14】 IFN- ยับยั้งวงจรชีวิตของไวรัสและป้องกันการทำซ้ำของไวรัส IFN- ยังควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกันด้วยการกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจงของเซลล์และกระตุ้นภูมิคุ้มกันเฉพาะ [17] จากการศึกษาในสัตว์ทดลองเบื้องต้น สารประกอบลาโนสเตนไตรเทอร์พีนอยด์หลักของสารสกัด P. cocos, กรดทูมูโลซิก (1), กรดโพลีโฟนิก C (2) และ 3-กรดเอพิ-ดีไฮโดรทูมูโลซิก (3) กระตุ้นการหลั่ง IFN อย่างมีนัยสำคัญ โดยเซลล์ม้าม การยืนยันส่วนประกอบสารสกัด Poria cocos ที่ใช้งานอยู่ในการศึกษาเบื้องต้นนี้จะมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการควบคุมคุณภาพของผลิตภัณฑ์และการศึกษาความสามารถในการใช้ประโยชน์ทางชีวภาพและกลไกเพิ่มเติม นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นในการศึกษานี้ว่าสารสกัด P. cocos ช่วยกระตุ้นการทำงานของเซลล์ NK และการหลั่ง IFN อย่างมีนัยสำคัญโดยไม่มีคุณสมบัติทางภูมิคุ้มกัน ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงผลกระตุ้นที่สำคัญของสารสกัด P. cocos และ lanostane triterpenoids หลัก 1-3 ต่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน

นอกจากนี้ การค้นพบของเราระบุว่าสารสกัดจาก P. cocos ยับยั้งการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน Th2 โดยการยับยั้ง IL-5 ที่มีนัยสำคัญ (ตารางที่ 7) ในรูปแบบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ไม่เฉพาะเจาะจง และการยับยั้ง IL-4(ตารางที่ 9) อย่างมีนัยสำคัญ ในรูปแบบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันจำเพาะที่เกิดจาก OVA IL-4 และ IL-5 จะทำให้เกิดอาการแพ้sistancheโรคภูมิแพ้ หรือที่เรียกว่าโรคภูมิแพ้ เกิดจากระบบภูมิคุ้มกันที่ไวต่อสารในสิ่งแวดล้อม เช่น โรคหอบหืดจากภูมิแพ้ การตอบสนองของภูมิคุ้มกันของผู้ป่วยมีแนวโน้มที่จะเป็น Th2 ถ้า Th1/Th2 ในร่างกายสมดุลได้ ก็ควรปรับปรุงอาการภูมิแพ้ การศึกษานี้พิสูจน์ว่าสารสกัด P. cocos สามารถควบคุมการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน Th1/Th2 อาจลดการเกิดโรคภูมิแพ้ และสามารถพัฒนาให้เป็นตัวเลือกที่มีศักยภาพสำหรับโรคต่อต้านการแพ้

5. สรุปผลการวิจัย

การศึกษานี้เป็นครั้งแรกที่แสดงให้เห็นถึงการควบคุมภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะและจำเพาะของการทำงานของสารสกัด P. cocos ที่มีลาโนสเตนไตรเทอร์พีนอยด์ในหนูทดลอง การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันเหล่านี้รวมถึงการกระตุ้นเซลล์ NK การหลั่ง IFN ที่เพิ่มขึ้น และ IL-4 และ IL-5 ที่ลดลง ผลการวิจัยของเราสนับสนุนว่าสารสกัด P. cocos ที่ไม่มีความเป็นพิษต่อภูมิคุ้มกันในอาหารหรือใช้เพียงอย่างเดียวจะมีบทบาทในการควบคุมภูมิคุ้มกันที่เป็นประโยชน์ในการปรับปรุงภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องและปรับปรุงความสามารถในการป้องกันการติดเชื้อและการตอบสนองต่อภูมิแพ้ นี่เป็นการยืนยันครั้งแรกว่า lanostane triterpenoids เป็นส่วนผสมที่มีประสิทธิภาพ และสามารถใช้เป็นส่วนผสมในการควบคุมคุณภาพเพื่อรักษาความสม่ำเสมอของประสิทธิภาพของสารสกัด P. cocos

บทความนี้คัดลอกมาจาก Life 2021, 11, 111 https://doi.org/10.3390/life11020111 https://www.mdpi.com/journal/life