ผลกระทบของ Nephrotoxin Ochratoxin A ต่อเซลล์ไตของมนุษย์ที่ศึกษาโดยแบบจำลองวัฒนธรรมร่วมที่แปลกใหม่ได้รับอิทธิพลจากการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์
Mar 01, 2022
เชิงนามธรรม:ดิไตถูกคุกคามจากสารพิษมากมาย เพื่อศึกษาอิทธิพลของ nephrotoxin ochratoxin A (OTA) เราได้สร้างแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ซึ่งประกอบด้วยมนุษย์ไต เซลล์ท่อใกล้เคียงและไฟโบรบลาสต์ เราศึกษาผลของ OTA ต่อการอยู่รอดของเซลล์ การแสดงออกของยีนและ/หรือโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ เมทริกซ์นอกเซลล์ และสภาวะสมดุลของพลังงาน เนื้อร้ายที่เหนี่ยวนำโดย OTA นั้นได้รับการปรับปรุงในเซลล์ทั้งสองประเภทต่อหน้าเซลล์ประเภทอื่นตามลำดับ ในขณะที่การตายของเซลล์ที่เกิดจาก OTA นั้นไม่ขึ้นกับเซลล์ดังกล่าว ในไฟโบรบลาสต์ แต่ไม่พบในเซลล์ทูบูล ผลการเพาะเลี้ยงร่วมสามารถมองเห็นได้ที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของโปรตีน p21 ที่เกี่ยวข้องกับวัฏจักรเซลล์ การแสดงออกของโปรตีน vimentin ที่บ่งชี้การเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิวถึงมีเซนไคม์เป็นอิสระจากสภาวะการเพาะเลี้ยง การแสดงออกของ lncRNA WISP1-AS1 ที่เหนี่ยวนำโดย OTA ได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นในการเพาะเลี้ยงร่วม การได้รับ OTA ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญพลังงานโดยมีผลในการระดมกลูโคสและการแสดงออกของโปรตีนไมโตคอนเดรียที่ลดลง เราร่วมกันแสดงให้เห็นว่าปฏิกิริยาของเซลล์สามารถแตกต่างกันได้เมื่อมีเซลล์ที่อยู่ใกล้เคียงตามธรรมชาติ ดังนั้นจึงทำให้เกิดการพูดคุยข้ามเซลล์ ดังนั้นในการประเมินความเป็นพิษของสาร ควรพิจารณาการใช้วัฒนธรรมร่วมแทนการเพาะเลี้ยงเดี่ยว
คำสำคัญ:ออคราทอกซินเอ; การเพาะเลี้ยงเซลล์ เมแทบอลิซึมของพลังงาน ความสมดุลของการตายของเซลล์ - เนื้อร้าย; ไมโตคอนเดรีย; ไต; ไต
CISTANCHE จะปรับปรุงไต/ความล้มเหลวของไต
บทนำ
เนื่องจากมีหน้าที่ในการขับถ่ายไตถูกคุกคามจากรูปแบบย่อยที่เป็นอันตรายต่างๆ เช่น ยาหรือสารปนเปื้อนในอาหาร เช่น สารพิษจากเชื้อราที่นำไปสู่ภาวะเฉียบพลันหรือเลวร้ายกว่านั้นเรื้อรังโรคไตมีความชุกประมาณ 10 เปอร์เซ็นต์ [1,2] เพื่อให้เข้าใจกลไกของการกระทำที่เป็นพิษต่อไต การค้นหากลยุทธ์ในการบรรเทาสถานการณ์ที่เป็นอันตรายเหล่านี้เป็นประโยชน์ และการศึกษาจำนวนมากได้ดำเนินการเพื่อแก้ปัญหาว่าทำไมและอย่างไรไตกำลังใกล้สูญพันธุ์ [3–5] ในการศึกษาอิทธิพลของสารที่มีต่อสิ่งมีชีวิต มักเป็นเรื่องยากที่จะใช้สัตว์ทั้งตัวเนื่องจากความกังวลด้านจริยธรรมและข้อกำหนดเบื้องต้นเกี่ยวกับองค์กร ค่าใช้จ่ายสูงและซับซ้อน นอกจากนี้ การถ่ายทอดความรู้สู่สถานการณ์ของมนุษย์ยังสัมพันธ์กับความไม่แน่นอน ดังนั้น แบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์จึงถูกสร้างขึ้นและใช้กันอย่างแพร่หลาย และมีข้อได้เปรียบที่สามารถศึกษาชนิดเซลล์เฉพาะและการตอบสนองต่อสารหรือการรักษาได้ภายใต้สภาวะควบคุม แม้ว่าจะมีการค้นพบที่สำคัญจำนวนมากโดยใช้วิธีการนี้ แต่ข้อเสียบางประการก็มีอยู่จริง: เซลล์ของสายเซลล์มักจะถูกทำให้เป็นอมตะโดยกระบวนการกลายพันธุ์หรือวิธีอื่นๆ—บางครั้งรุนแรง—วิธีการ [6] วิธีนี้ช่วยให้จัดการได้ง่ายและใช้งานได้นาน แต่ด้วยอันตรายที่พบในระบบแบบจำลองเฉพาะ อาจไม่สามารถถ่ายทอดไปยังสถานการณ์ในอวัยวะทั้งหมดหรือสิ่งมีชีวิตได้ เพื่อเอาชนะข้อเสียนี้ แทนที่จะใช้สายเซลล์อมตะ สามารถใช้เซลล์หลักได้ แต่การสร้างเซลล์ปฐมภูมิมักจะยากและต้องใช้ทักษะทางเทคนิคขั้นสูง นอกจากนี้ เซลล์ปฐมภูมิมักไม่สามารถอยู่รอดได้เป็นเวลานานและต้องการสภาวะการเพาะเลี้ยงพิเศษเฉพาะ แต่เซลล์ปฐมภูมิเป็นขั้นตอนที่ใกล้ชิดกับสภาวะธรรมชาติมากขึ้น และอย่างน้อยบางครั้งมันก็ปรากฏว่าพวกมันไวต่อสิ่งเร้ามากกว่า เช่น สารกระตุ้นที่เป็นพิษเนื่องจากสายเซลล์ [7] หมายความว่าสายเซลล์อาจแข็งแรงกว่า ข้อเสียอีกประการหนึ่งคือความจริงที่ว่าเซลล์มักถูกเลี้ยงแบบเชิงเดี่ยว กล่าวคือ โดยไม่มีอิทธิพลของเซลล์ประเภทอื่นๆ ซึ่งมักจะอยู่ในอวัยวะที่บ้านของพวกมัน ดังนั้นจึงอาจเป็นขั้นตอนสู่สถานการณ์ที่เป็นจริงมากขึ้นในการศึกษาการตอบสนองของเซลล์ประเภทหนึ่งต่อสารหรือการรักษาต่อหน้าเซลล์เหล่านั้นซึ่งอยู่ในอวัยวะดั้งเดิมในบริเวณใกล้เคียง
ในไตเซลล์ทูบูลที่อยู่ใกล้เคียงล้อมรอบด้วยไฟไฟโบรบลาสต์และอาจสันนิษฐานได้ว่ามีอิทธิพลต่อกันและกัน นี่ก็เป็นกรณีในไตเสียหายสถานการณ์ที่ในกรณีส่วนใหญ่นำไปสู่การอักเสบและการเกิดพังผืดของ tubulo-interstitial และการเกิดพังผืด [8,9] และมีผลต่อการลดลงของไตการทำงาน. เนื่องจากความสามารถในการขนส่งและเอนไซม์ไตเซลล์ทูบูลที่อยู่ใกล้เคียงใกล้สูญพันธุ์โดยสารพิษต่างๆ ที่อาจเกิดขึ้น เช่น ยาหรือเศษของพวกมันหรือสารพิษจากเชื้อรา บทบาทหนึ่งของไฟโบรบลาสต์ที่อยู่รายรอบคือการสร้างเมทริกซ์นอกเซลล์โดยการปล่อยคอลลาเจนและส่วนประกอบเมทริกซ์อื่นๆ ดังนั้นจึงมีส่วนร่วมในความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อ [10] แต่พวกมันก็—ร่วมกับเซลล์เยื่อบุผิว—เกี่ยวข้องกับกระบวนการอักเสบหรือในไฟโบรติกโรคไต[11] กับความเสี่ยงของการพัฒนาภาวะไตวาย
สารพิษจากเชื้อราที่ศึกษาอย่างเข้มข้นซึ่งเกี่ยวข้องกับสุขภาพของมนุษย์คือ ochratoxin A (OTA) [12,13] สามารถพบได้ในอาหารหลายชนิด [12,14] และแทบจะเป็นไปไม่ได้เลยที่จะหลีกเลี่ยงการสัมผัสและการดูดซึม [9,15] สิ่งนี้นำไปสู่การสังเกตว่า OTA ถูกตรวจพบบ่อยครั้งในเลือดมนุษย์ในระดับนาโนโมลาร์ต่ำ [16] ในสัตว์ที่สัมผัส OTA นำไปสู่ไตล้มเหลวและการเปลี่ยนแปลง fifibrotic [17,18] การเปิดรับ OTA นั้นถือว่าเกี่ยวข้องกับมนุษย์โรคไต[19]. ในเซลล์ทูบูลปฐมภูมิของมนุษย์ มีการแสดงผลกระทบที่เป็นพิษของ OTA ซึ่งสามารถสังเกตพบได้ในไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิของมนุษย์ แม้ว่าจะไม่เด่นชัดเท่าในเซลล์ทูบูลที่อยู่ใกล้เคียง [7] กลไกเบื้องหลังการกระทำที่เป็นพิษของ OTA นั้นยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ และอยู่ภายใต้การศึกษาต่อเนื่องจำนวนมาก ระยะที่เซลล์ข้างเคียงซึ่งมีหน้าที่ต่างกันไปรบกวนและด้วยเหตุนี้จึงปรับการทำงานของเซลล์แทบไม่เป็นที่ทราบ แต่คาดการณ์ได้ ในการศึกษาครั้งก่อนโดยใช้แบบจำลองวัฒนธรรมร่วมประกอบด้วยหนูไตproximal tubule และเซลล์ fifibroblast ปรากฏว่ามีการ crosstalk ระหว่างเซลล์ทั้งสองประเภท นำไปสู่การสังเกตว่าผลกระทบของ OTA เป็นการเปลี่ยนแปลงของ epithelial-to-mesenchymal (EMT) เกิดขึ้นภายใต้เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงร่วมเท่านั้น [20] ข้อสรุปอีกประการหนึ่งจากการศึกษานั้นและอื่น ๆ ก็คือเซลล์ของหนูมีความทนทานมากกว่าในเรื่องความทนทานต่อ OTA เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์หลอดอาหารของมนุษย์ [7,20] ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีระบบแบบจำลองตามเซลล์ของมนุษย์เพื่อประเมินสถานการณ์ของมนุษย์อย่างใกล้ชิดและ ความเสี่ยงจากการสัมผัส OTA
ดังนั้นในการศึกษานี้ เราจึงสร้างแบบจำลองการเพาะเลี้ยงร่วมกันของเซลล์ขั้นสูงซึ่งประกอบด้วยเซลล์หลอดอาหารของมนุษย์ (เซลล์ HK2) และเซลล์ไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ (เซลล์ CCD-1092SK) เพื่อศึกษาผลกระทบของ OTA ต่อการอยู่รอดของเซลล์ (อะพอพโทซิส) , เนื้อร้าย) และการแสดงออกของยีนที่เลือกอย่างเป็นตัวอย่างที่เกี่ยวข้องกับวัฏจักรของเซลล์, การตายของเซลล์, เมทริกซ์นอกเซลล์และเมแทบอลิซึม คล้ายกับการศึกษาก่อนหน้านี้โดยใช้เซลล์ของหนูแรท [20] เซลล์ทูบูลที่อยู่ใกล้เคียงของมนุษย์ถูกวางไว้บนอุปกรณ์กรอง และตัวกรองถูกวางเหนือชั้นของไฟโบรบลาสต์ที่เพาะไว้ที่ด้านล่างของจานเพาะเชื้อ เพื่อให้ด้านเบสโซไซด์ของเซลล์เยื่อบุผิวหันไปทางด้านหน้า ไฟโบรบลาสต์ทำให้สามารถสนทนาระหว่างเซลล์ทั้งสองประเภทได้
ผลลัพธ์
โปรตีน การปลดปล่อยแลคเตทดีไฮโดรจีเนสและแคสเปส-3 กิจกรรมเพื่อให้ได้ความประทับใจครั้งแรกเกี่ยวกับผลกระทบที่เป็นไปได้ของสภาวะการเพาะเลี้ยง เช่นเดียวกับผลกระทบต่อการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก OTA เราจึงเปรียบเทียบกิจกรรมของ caspase-3 เป็นการวัดการตายของเซลล์ที่ปลูกในวัฒนธรรมเชิงเดี่ยวกับกิจกรรมของเซลล์ที่เติบโตใน co - เพาะเลี้ยงโดยมีหรือไม่มี OTA 100 นาโนเมตร เป็นเวลาสองจุด 24 และ 48 ชั่วโมง นอกจากนี้ แลคเตทดีไฮโดรจีเนส (LDH) การปลดปล่อยในฐานะการวัดสำหรับเนื้อร้ายถูกกำหนดหาเช่นเดียวกับปริมาณโปรตีนเพื่อให้การแสดงผลโดยรวมเกี่ยวกับสถานะของเซลล์ ดังนั้น จำนวนเซลล์ที่เท่ากันจึงถูกวางไว้ที่ก้นหลุม (ไฟโบรบลาสต์) หรือบนฟิกรองเตอร์ (เซลล์ทูบูลที่อยู่ใกล้เคียง) หลังจากถึงจุดบรรจบกันแล้ว ตัวกรองไฟจะถูกวางลงในบ่อน้ำที่มีไฟโบรบลาสต์อยู่ (ดูนามธรรมแบบกราฟิก) ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 1A แทบไม่มีผลใดๆ ที่ขึ้นอยู่กับสภาวะการเพาะเลี้ยงต่อปริมาณโปรตีนที่สามารถสังเกตพบได้ในเซลล์ทั้งสองชนิดหลังผ่านไป 24 หรือ 48 ชั่วโมง (ดูไฟล์เสริม S1) ในไฟโบรบลาสต์ การได้รับ OTA ทำให้ปริมาณโปรตีนเพิ่มขึ้นเล็กน้อย ในขณะที่ OTA ในเซลล์ทูบูลทำให้ปริมาณโปรตีนลดลงเล็กน้อย ซึ่งแสดงให้เห็นว่า OTA อาจส่งผลเสียต่อเซลล์ทูบูล ผลกระทบเหล่านี้เกือบจะเป็นอิสระจากสภาวะการเพาะเลี้ยงในเซลล์ทั้งสองประเภท
รูปที่ 1. ผลของโอคราทอกซิน A (OTA) และ/หรือสภาวะการเพาะเลี้ยงต่อปริมาณโปรตีน (A), กิจกรรมของแคสเปส-3 (B) และการปลดปล่อยแลคเตท ดีไฮโดรจีเนส (LDH) (C) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในการเพาะเลี้ยงเดี่ยวหรือเลี้ยงร่วมกันและเปิดเผยต่อ OTA 100 นาโนโมลาร์ เป็นเวลา 24 หรือ 48 ชั่วโมง N=3–6, n=14–18 (โปรตีน, LDH) หรือ 8–9 (แคสเปส-3) * หมายถึง ap < 0.05="" ไปยังเซลล์ที่ไม่เปิดเผย="" ota="" (เปรียบเทียบเอฟเฟกต์="" ota,="" การตอบสนองด้านซ้าย)="" หรือเซลล์ในวัฒนธรรมเดี่ยว="" (การเปรียบเทียบเอฟเฟกต์วัฒนธรรม,="" การตอบสนองด้านขวา)="" เพื่ออธิบายเพิ่มเติมถึงผลกระทบต่อปริมาณโปรตีน="" เราได้ศึกษาการตายของเซลล์และเนื้อร้าย="" เมื่อเทียบกับไฟโบรบลาสต์="" ota="" มีผลอย่างชัดเจนต่อการตายของเซลล์ในเซลล์ทูบูลหลังจากการสัมผัสสาร="" 24="" ชั่วโมง="" โดยมีกิจกรรมเพิ่มขึ้นประมาณ="" 2.5-เท่า="" (รูปที่="" 1b)="" หลังจากผ่านไป="" 48="" ชั่วโมง="" การเพิ่มขึ้นยังคงสังเกตเห็นได้="" แต่ไม่เด่นชัดเท่าหลังจากผ่านไป="" 24="" ชั่วโมง="" อย่างไรก็ตาม="" การเพิ่มขึ้นเหล่านี้เกือบจะเป็นอิสระจากสภาวะการเพาะเลี้ยง="" ยกเว้นว่าหลังจาก="" 48="" ชั่วโมงในการปรากฏตัวของไฟโบรบลาสต์="" กิจกรรมของแคสเปสในเซลล์ทูบูลลดลงเล็กน้อย="" ซึ่งบ่งชี้ถึงผลในการป้องกันเพียงเล็กน้อยของการเพาะเลี้ยงร่วม="" อย่างไรก็ตาม="" การป้องกันผลกระทบจากการเพาะเลี้ยงร่วมกันนั้นสามารถสังเกตได้สำหรับไฟโบรบลาสต์="" โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมี="" ota="" ในการเพาะเลี้ยงร่วม="" การปลดปล่อย="" ldh="" ถูกทำให้ดีขึ้นอย่างชัดเจนในไฟไฟโบรบลาสต์และเซลล์ทูบูลเมื่อเปรียบเทียบกับสภาวะการเพาะเลี้ยงเดี่ยวที่ไม่ขึ้นกับการมีอยู่ของ="" ota="" (รูปที่="" 1c)="" ในเซลล์แบบทูบูล="" ota="" ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ="" ldh="" ที่ปล่อยออกมาในสื่อโดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากการสัมผัสเป็นเวลา="" 48="" ชั่วโมง="" ซึ่งไม่เด่นชัดในไฟโบรบลาสต์="" เมื่อนำมารวมกัน="" การมีอยู่ของเซลล์ชนิดอื่น="" ๆ="" ตามลำดับทำให้เกิดเนื้อร้ายที่เพิ่มขึ้นแต่มีการตายของเซลล์น้อยลงเพื่อให้ปริมาณโปรตีนโดยรวมไม่เปลี่ยนแปลงอย่างน่าทึ่ง="" ผลกระทบของ="" ota="">
Western Blot และ mRNA Expression
CDKN1A/p21วัฏจักรของเซลล์แสดงให้เห็นว่าได้รับอิทธิพลจาก OTA และอาจแสดงให้เห็นว่าโปรตีน p21 ที่เกี่ยวข้องกับวัฏจักรของเซลล์ถูกควบคุมโดย OTA ในเซลล์ทูบูล [21] เพื่อตรวจสอบว่าโปรตีน รวมถึงการแสดงออกของการเข้ารหัส mRNA สำหรับ p21 นั้นได้รับอิทธิพลจากการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์มากเพียงใด เราทำ Western blots และ RT-PCR ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2A, B และ 3 การสัมผัสกับ OTA 100 นาโนโมลาร์ 48 ชั่วโมงทำให้ปริมาณโปรตีน p21 เพิ่มขึ้นในรูปแบบโมโน แต่ยังอยู่ในเงื่อนไขการเพาะเลี้ยงร่วมในเซลล์ทูบูล ในไฟโบบลาสต์ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงร่วมกัน OTA ไม่มีผลต่อการแสดงออกของโปรตีน p21- ถึงแม้ว่าการแสดงออกของ mRNA จะเพิ่มขึ้นโดย OTA ที่ไม่ขึ้นกับการมีอยู่ของเซลล์ประเภทอื่น ที่น่าสนใจภายใต้เงื่อนไขการเพาะเลี้ยงร่วมกัน การได้รับ OTA ไม่ได้เพิ่มการแสดงออกของโปรตีน p21 อีกต่อไป ในเซลล์แบบทูบูล การแสดงออกของอาร์เอ็นเอของพวกมันไม่ได้เปลี่ยนแปลงโดยการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์แต่ในไฟโบรบลาสต์ในการเพาะเลี้ยงร่วม thepZlmRNAexpressionwasenhanced ไม่เพียงแต่ในการเปิดเผย OTA แต่ยังอยู่ในเซลล์ที่ไม่ได้สัมผัสกับ OTA แล้ว (ดูไฟล์เพิ่มเติม S1) นี่แสดงให้เห็นว่า p resenee ของเซลล์อีกประเภทหนึ่งมีอิทธิพลต่อการแสดงออกของโปรตีน p21 โดยเฉพาะอย่างยิ่งในไฟโบรบลาสต์
ไซโคลออกซีเจเนส 2 (COX2)มีการแสดงให้เห็นว่าโปรตีน cyclooxygenase 2 (COX2) และระดับ mRNA เพิ่มขึ้นในระหว่างไตล้มเหลว[22]. ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2C,D และ 3 เฉพาะในไฟโบรบลาสต์เท่านั้นที่การแสดงออกของโปรตีนเพิ่มขึ้นโดยการเผยสัมผัส OTA นอกจากนี้ ในการปรากฏตัวของเซลล์ทูบูล การแสดงออกของโปรตีน COX2 ได้รับการปรับปรุงในเซลล์ที่ไม่ผ่านการบำบัดและในเซลล์ที่เปิดรับ OTA ซึ่งแสดงให้เห็นถึงอิทธิพลที่ชัดเจนของเซลล์ทูบูล อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของ mRNA ไม่ได้รับอิทธิพลจาก OTA และผลกระทบเล็กน้อยของการเพาะเลี้ยงร่วมกันเกิดขึ้นจากการสัมผัส OTA ในทางตรงกันข้าม ในเซลล์แบบทูบูล mRNA และการแสดงออกของโปรตีนของ COX2 นั้นไม่ขึ้นกับ OTA หรือการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์โดยสิ้นเชิง นั่นแสดงให้เห็นว่าเกี่ยวกับเซลล์ทูบูล COX2 สามารถส่งผลต่อไฟโบรบลาสต์ได้ แต่ไฟโบรบลาสต์ไม่มีผลกระทบต่อเซลล์ทูบูล
ไฟโบรเนคตินไตล้มเหลวมักมาพร้อมกับการเกิดพังผืด ระหว่างการเกิดพังผืดจะเกิดการสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์และการสังเกตอีกอย่างหนึ่งนอกเหนือจากสิ่งอื่นคือการเพิ่มขึ้นของปริมาณโปรตีน fifibronectin [23] ดังนั้น การเปลี่ยนแปลงที่ขึ้นกับ OTA ของ mRNA การเข้ารหัสไฟโบรเนคตินและการแสดงออกของโปรตีนจึงถูกกำหนดในสภาวะการเพาะเลี้ยงแบบเดี่ยวหรือแบบร่วม ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3 และ 4A,B การเผยสัมผัส 48 ชั่วโมงของเซลล์ทูบูลถึง 100 นาโนโมลาร์ OTA นำไปสู่การลดไฟโบรเนกตินภายในเซลล์ทั้งในแบบเพาะเลี้ยงเดี่ยวและแบบร่วม ผล OTA ต่ำกว่าในวัฒนธรรมร่วม นอกจากนี้ ปริมาณของการเข้ารหัส mRNA สำหรับ fifibronectin ลดลงโดยการได้รับ OTA อย่างเป็นอิสระจากสภาวะการเพาะเลี้ยง และการมีอยู่ของ fifibroblasts ทำให้การแสดงออกของ mRNA ลดลงในเซลล์ควบคุมและเซลล์ที่สัมผัสกับ OTA ในทางตรงกันข้าม ในไฟโบรบลาสต์ การแสดงออกของไฟโบรเนกตินแทบไม่เปลี่ยนแปลงทั้งโดย OTA หรือเงื่อนไขทางวัฒนธรรม เนื่องจากมีความแปรปรวนอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกลุ่ม Western blots แนวโน้มต่อการแสดงออกที่เกิดจาก OTA อาจมองเห็นได้ในวัฒนธรรมเดี่ยว
วิเมนตินVimentin เป็นโปรตีนที่มีความอุดมสมบูรณ์เพิ่มขึ้นเมื่อเกิดการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิวเป็นมีเซนไคม์ (EMT) และการพัฒนา EMT สามารถนำไปสู่ไตล้มเหลว[23]. ดังนั้นการเปลี่ยนแปลงที่ขึ้นกับ OTA ของ vimentin mRNA และการแสดงออกของโปรตีนจึงถูกกำหนดในสภาวะแบบโมโนและแบบร่วม ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3 และ 4C,D การเผยสัมผัสของเซลล์ทูบูลเป็นเวลา 48 ชั่วโมงจนถึง 100 นาโนโมลาร์ OTA ทำให้เกิดความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนวิเมนตินที่ต่ำกว่าทั้งภายใต้สภาวะโมโนและการเพาะเลี้ยงร่วม อย่างไรก็ตาม ในการปรากฏตัวของไฟไฟโบรบลาสต์ การแสดงออกของโปรตีนวิเมนตินเป็นอิสระจากสภาวะการเพาะเลี้ยง การแสดงออกของการเข้ารหัส mRNA สำหรับ vimentin แทบไม่มีการเปลี่ยนแปลงทั้งโดย OTA หรือโดยเงื่อนไขทางวัฒนธรรม ยกเว้นว่าการได้รับ OTA ในวัฒนธรรมร่วมนั้นเพิ่มขึ้นเล็กน้อย ในไฟโบรบลาสต์ การแสดงออกของโปรตีนวิเมนตินเป็นอิสระอย่างสมบูรณ์จากการได้รับ OTA และจากการมีอยู่ของเซลล์ทูบูล นอกจากนี้นิพจน์ mRNA ที่เข้ารหัส vimentin แทบไม่เปลี่ยนแปลง
การแสดงออกของยีนบางตัวที่เลือกเพื่อทดสอบเพิ่มเติมในตัวอย่างว่าสภาวะการเพาะเลี้ยงอาจส่งผลต่อการแสดงออกของ RNA อื่นๆ ด้วย เราเลือกยีนบางตัว ซึ่งมีบทบาทในการตายของเซลล์-เนื้อร้าย การพัฒนาของมะเร็ง หรือการเผาผลาญพลังงาน (ดูไฟล์เสริม S1)
WISP1-AS1เป็น RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาว (lncRNA) ที่เกิดจาก OTA ที่ส่งผลต่อการควบคุมการถอดเสียงและมีบทบาทในความสมดุลของการตายของเซลล์-การตายของเซลล์ และอาจอยู่ในการพัฒนาของมะเร็ง [24] ดังที่เห็นในรูปที่ 5A การสัมผัสกับ OTA 100 นาโนโมลาร์ 48 ชั่วโมงทำให้เซลล์ทั้งสองประเภทมีการแสดงออกของ lncRNA นั้นเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด หากไม่มี OTA การมีอยู่ของเซลล์ประเภทอื่นๆ นั้นแทบไม่มีอิทธิพลต่อการแสดงออก อย่างไรก็ตาม ในการปรากฏตัวของ OTA การแสดงออกของวัฒนธรรมร่วมนั้นสูงกว่าเมื่อเทียบกับวัฒนธรรมเดี่ยว
GDF15ปัจจัยการเจริญเติบโตที่แตกต่างกัน 15 (GDF15) เป็นสมาชิกของ superfamily ปัจจัยการเจริญเติบโตที่เปลี่ยนแปลงซึ่งตอบสนองต่อความเครียด มันถูกกล่าวถึงในฐานะ biomarker สำหรับโรคไตหรือเป็นตัวทำนายเพื่อความอยู่รอดของไตผู้ป่วยปลูกถ่าย [25,26]. การแสดงออกของการเข้ารหัส mRNA สำหรับ GDF15 ถูกทำให้ดีขึ้นในเซลล์ทั้งสองประเภทหลังจากการเผยสัมผัส OTA ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5B เอฟเฟกต์ที่เกิดจาก OTA นี้ได้รับความนิยมในไฟโบรบลาสต์เมื่อเซลล์ทูบูลอยู่ในบริเวณใกล้เคียง อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ทูบูล การแสดงออกไม่ขึ้นกับการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์ (รูปที่ 5B)CDK2Cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) ถูกระบุโดยการวิเคราะห์เครือข่ายสหสัมพันธ์แบบถ่วงน้ำหนักซึ่งเป็นตัวควบคุมหลักของการควบคุมวงจรเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย OTA [21] ในไฟโบรบลาสต์ในวัฒนธรรมเชิงเดี่ยว การแสดงออกของการเข้ารหัส mRNA สำหรับ CDK2 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงโดย OTA นอกจากนี้ การปรากฏตัวของเซลล์ทูบูลไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของ mRNA อย่างไรก็ตาม ในเซลล์แบบทูบูล OTA ทำให้เกิดการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นเล็กน้อยเฉพาะเมื่อมีไฟโบรบลาสต์ (รูปที่ 5C)
โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไกลโคเจนและกลูโคส: PYGM, GYS1 และ GLUT1 (SLC2A1)ดิไตยังเกี่ยวข้องกับสภาวะสมดุลของกลูโคสและสามารถให้กลูโคสแก่ร่างกายไม่ว่าจะโดยการสร้างกลูโคเนซิสหรือโดยการระดมการจัดเก็บไกลโคเจน [27] Glycogen phosphorylase (PYGM) มีบทบาทในการสลายตัวของที่เก็บไกลโคเจน ดังนั้นจึงระดมกลูโคส [28] ดังที่เห็นในรูปที่ 6A การสัมผัสกับ OTA 100 นาโนโมลาร์ 48 ชั่วโมงทำให้การแสดงออกของ mRNA เข้ารหัสสำหรับไกลโคเจนฟอสโฟรีเลสเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเซลล์ทูบูล อย่างไรก็ตาม ในเซลล์แบบทูบูล การเพิ่มขึ้นนี้ไม่ได้ขึ้นอยู่กับสภาวะของการเพาะเลี้ยง ในขณะที่ไฟโบรบลาสต์ การแสดงออกที่เหนี่ยวนำโดย OTA นั้นสูงกว่าเมื่อมีเซลล์ทูบูลเมื่อเทียบกับสภาวะที่ไม่มีเซลล์ทูบูล Glycogen synthase 1 (G^YSl) จะเร่งปฏิกิริยาที่ตรงกันข้าม และในขณะที่การแสดงออกของฟอสโฟรีเลสถูกควบคุม การแสดงออกของซินเทสถูกควบคุมโดย OTA ในเซลล์ทูบูลและในไฟโบรบลาสต์ในข้อต่อร่วม (รูปที่ 6B) สิ่งนี้บ่งชี้ถึงผลกระทบของการกระตุ้นกลูโคสของ OTA ที่น่าสนใจคือ mRNAexpression ของตัวขนส่งกลูโคสGLUTl (SLC2A1) ก็ถูกควบคุมโดย OTA เช่นกัน (รูปที่ 6C) ซึ่งเน้นย้ำแนวคิดของความต้องการกลูโคสที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากการได้รับ OTA อาจเป็นเพราะ
โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไมโตคอนเดรีย: NDUFB10 และ MRPS16
มีข้อบ่งชี้ว่าการสัมผัส OTA อาจทำให้ศักยภาพของไมโตคอนเดรียลดลงได้ไตเซลล์ [24] แสดงให้เห็นว่าการทำงานของไมโตคอนเดรียอาจได้รับอิทธิพลจากการได้รับ OTA ซึ่งอาจได้รับอิทธิพลเพิ่มเติมจากการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์ ดังนั้น ตัวแทนของการเข้ารหัส RNA อื่นๆ สำหรับโปรตีนไมโตคอนเดรีย เราแสดงการแสดงออกของ mRNA ที่เข้ารหัสสำหรับ NDUFB10 และ MRPS16 ที่นี่ รหัส NDUFBt0 สำหรับไมโตคอนเดรีย NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B10 ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของระบบทางเดินหายใจไมโตคอนเดรีย 1 และแสดงออกอย่างมากในหัวใจและไต(ยีน NCBI พร้อมใช้งานออนไลน์: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (เข้าถึงเมื่อ 17 มีนาคม 2021)) รหัสยีน MRPS16 สำหรับโปรตีนไรโบโซมของไมโตคอนเดรีย S16 ซึ่งมีบทบาทในการสังเคราะห์โปรตีนไมโตคอนเดรีย ดังแสดงในรูปที่ 7 การได้รับ OTA 24 ชั่วโมงทำให้เซลล์ทั้งสองประเภทมีการแสดงออกที่ลดลงของ mRNA ทั้งสอง ในเซลล์แบบทูบูล การแสดงออกที่ลดลงของยีน NDUFB10 ไม่ได้รับอิทธิพลจากการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์ ในขณะที่ในไฟโบรบลาสต์ การลดการแสดงออกของ NDUFB10 ที่เกิดจาก OTA ได้รับการช่วยเหลือเล็กน้อยเมื่อมีเซลล์ทูบูล (รูปที่ 7A) ในเซลล์แบบทูบูล การแสดงออกของยีนที่เข้ารหัสสำหรับยูนิตย่อยไรโบโซมของไมโตคอนเดรียที่ลดลงแล้วโดย OTA นั้นลดลงเพิ่มเติมเมื่อมีไฟโบรบลาสต์ ในขณะที่ไฟโบรบลาสต์ การมีอยู่ของเซลล์ทูบูลทำให้เกิดการแสดงออกของ MRPS16 mRNA ที่สูงขึ้นเล็กน้อย (รูปที่ 7B) นี่แสดงให้เห็นว่าการทำงานของไมโตคอนเดรียสามารถได้รับผลกระทบจาก OTA แต่เอฟเฟกต์ OTA สามารถแก้ไขได้เพิ่มเติมเมื่อเซลล์ทั้งสองชนิดอยู่ใกล้กัน
การอภิปราย
ดิไตถูกคุกคามด้วยสารที่เป็นพิษต่อไตหลายชนิดที่มีความเสี่ยงที่จะเกิดเฉียบพลันหรือเรื้อรังไตล้มเหลว[1]. สำหรับการศึกษาผลกระทบของสารพิษต่อไตต่อเซลล์ประเภทต่างๆ และเพื่อลดการจัดการกับสัตว์ การเพาะเลี้ยงเซลล์ได้ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลาย การเพาะเลี้ยงเซลล์เหล่านี้มีข้อได้เปรียบเพิ่มเติมที่สามารถควบคุมเงื่อนไขการทดลองได้และผลกระทบเฉพาะของสารที่ตรวจสอบโดยใช้ประเภทเซลล์ที่กำหนดไว้ นอกจากข้อดีที่ไม่มีปัญหาเหล่านี้แล้ว ยังมีข้อพิจารณาบางประการอยู่: ตัวอย่างเช่น ใน "อวัยวะภายใน" ประเภทเซลล์หนึ่ง (เช่น เซลล์หลอดใกล้เคียงในไต) ถูกล้อมรอบด้วยเซลล์ประเภทอื่นๆ (เช่น ไฟโบรบลาสต์) ที่มีการพึ่งพาอาศัยกันของ manifolb ดังนั้นปฏิกิริยาต่อสารที่สังเกตได้เมื่อใช้เซลล์เพียงชนิดเดียวอาจไม่เหมือนกับเมื่ออยู่ใกล้ๆ เซลล์ในเนื้อเยื่อเดิม ในแบบจำลองที่ประกอบด้วยเซลล์ไตของหนูสองชนิดที่แตกต่างกัน แสดงให้เห็นว่ามีการพูดคุยข้ามระหว่างเซลล์ทูบูลและไฟโบรบลาสต์ ทำให้เกิดปฏิกิริยาขึ้นเมื่อเซลล์ทั้งสองชนิดอยู่ใกล้กันเท่านั้น [20] อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบผลลัพธ์ของ stitdy นั้นกับการค้นพบที่สังเกตได้โดยใช้เซลล์ท่อไตของมนุษย์ ปรากฏว่าเซลล์ของหนูเห็นได้ชัดว่าแข็งแกร่งกว่าที่มนุษย์บอก cortcering ปฏิกิริยาของพวกมันต่อการรักษาด้วยเนฟโรทอกซินที่แพร่หลาย ochrafoxin A (OTA) [7] ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีแบบจำลองการเพาะเลี้ยงร่วมกันซึ่งประกอบด้วยเซลล์ของมนุษย์ เราสร้างแบบจำลองดังกล่าวโดยใช้สายเซลล์ทูบุลใกล้เคียงของมนุษย์ HK2 และไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ เซลล์ HK2 ทำให้เปียกบนแผ่นกรองและนำมารวมกันกับไฟโบรบลาสต์ ซึ่งเติบโตที่ด้านล่างของจานหลุม 6-หลุม หลังจากบันทึกพารามิเตอร์พื้นฐานเป็นอะพอพโทซิสและเนื้อร้าย เราใช้แบบจำลองนี้เพื่อลบข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับผลกระทบของโอคราทอกซิน A ต่อการเอ็กซ์พีซริออนของโปรตีนและอาร์เอ็นเอบางชนิดที่เกี่ยวข้องกับวัฏจักรเซลล์ EMT และเมแทบอลิซึมของเซลล์
การอยู่รอดของเซลล์ จากปริมาณโปรตีน ดูเหมือนว่าทั้ง OTA และสภาวะของวัฒนธรรมจะไม่มีผลอย่างน่าทึ่ง อย่างไรก็ตาม ความสัมพันธ์ระหว่างการตายของเซลล์อะพอพโทซิสกับเนื้อร้ายได้เปลี่ยนไปเป็นเนื้อร้ายในเซลล์ทั้งสองประเภทเมื่อเซลล์ถูกเพาะเลี้ยงร่วมกัน เป็นที่ทราบกันดีว่า OTA สามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ทูบูล [29] และขยายน้อยลงในไฟโบรบลาสต์ด้วย [7] สิ่งนี้สะท้อนให้เห็นในผลลัพธ์ปัจจุบันเช่นกัน ที่น่าสนใจ การมีอยู่ของเซลล์ชนิดอื่นตามลำดับทำให้อัตราการตายของเซลล์ตายลดลงในเซลล์ทั้งสองประเภทแต่เพิ่มการปลดปล่อย LDH นี่เป็นข้อบ่งชี้ครั้งแรกว่าการมีเซลล์ประเภทอื่นสามารถส่งผลต่อการทำงานของเซลล์ได้ และปฏิกิริยาของเซลล์ต่อสารพิษอาจแตกต่างกันในการเพาะเลี้ยงร่วมเมื่อเทียบกับการเพาะเลี้ยงเดี่ยว
การแสดงออกของโปรตีนและอาร์เอ็นเอ เราขยายการศึกษาของเราโดยการกำหนดโปรตีนและการแสดงออกของอาร์เอ็นเอของโปรตีนที่เป็นตัวอย่างที่ดีบางตัวและการเข้ารหัสอาร์เอ็นเอสำหรับพวกมัน เนื่องจาก OTA แสดงให้เห็นว่ามีอิทธิพลต่อวัฏจักรเซลล์ [21,30] จึงมีการศึกษาการแสดงออกของ CDKN1A/p21 จากการค้นพบโดย Dubourg et.al [21] OTA นำไปสู่การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นไม่เพียง แต่ของ CDKN1A mRNA แต่ยังรวมถึงโปรตีน CDKN1A/p21 ในเซลล์หลอดด้วย ในเซลล์เหล่านี้ การมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์ไม่ส่งผลต่อการแสดงออกของ CDKN1A mRNA ในขณะที่ในไฟโบรบลาสต์ ผลการเพาะเลี้ยงร่วมที่ชัดเจนสามารถมองเห็นได้ด้วยความอุดมสมบูรณ์ของ mRNA ที่เพิ่มขึ้นซึ่งมองเห็นได้เฉพาะในการเพาะเลี้ยงร่วมเท่านั้น อย่างไรก็ตาม การเพิ่มขึ้นของความอุดมสมบูรณ์ของ mRNA นี้ไม่ได้สะท้อนออกมาอย่างสมบูรณ์โดยการแสดงออกของโปรตีน ซึ่งชี้ให้เห็นถึงกลไกการควบคุมเพิ่มเติม อาจมีการเพิ่มการศึกษาวัฏจักรของเซลล์เพื่อรับข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับผลกระทบต่อวัฏจักรของเซลล์ ไคเนสที่ขึ้นกับไซคลิน 2 (CDK2) พบว่ามีบทบาทในการควบคุมการผิดปกติของวัฏจักรเซลล์ที่เกิดจาก OTA [21] ในเซลล์แบบทูบูล การแสดงออกของ mRNA ของมันได้รับการปรับปรุงโดย OTA ในการเพาะเลี้ยงร่วม ในขณะที่ไฟโบรบลาสต์ไม่ได้รับอิทธิพลจากเซลล์ทูบูล ผลการวิจัยร่วมกันชี้ให้เห็นว่าวัฏจักรของเซลล์ในเซลล์ทูบูลได้รับอิทธิพลจากการมีอยู่ของไฟโบรบลาสต์
ผลการเพาะเลี้ยงร่วมอีกประการหนึ่งถูกสังเกตพบสำหรับการแสดงออกของ COX2 ในไฟโบรบลาสต์ สำหรับไฟโบรบลาสต์ การมีอยู่ของเซลล์ทูบูลทำให้เกิดการแสดงออกของโปรตีนที่เพิ่มขึ้นอย่างชัดเจน (คล้ายกับผลลัพธ์ที่สังเกตพบในเซลล์ของหนูแรท [20]) ซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้สำหรับเซลล์ทูบูลซึ่งไม่แสดงการพึ่งพาวัฒนธรรมใดๆ ซึ่งบ่งชี้ว่าบทบาทของไฟโบรบลาสต์ในการอักเสบโรคไตอาจถูกประเมินต่ำไปโดยการศึกษาโดยใช้ไฟโบรบลาสต์ในวัฒนธรรมเดี่ยว วิเมนตินโปรตีนฟิลาเมนต์ระดับกลางถูกแสดงออกอย่างเป็นส่วนประกอบในไฟโบรบลาสต์และแสดงออกมากขึ้นในระหว่างการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิวเป็นมีเซนไคม์ (EMT) ในเซลล์เยื่อบุผิว [10] แม้ว่าจะแสดงให้เห็นว่าการได้รับ OTA เป็นเวลานานสามารถนำไปสู่การแสดงออกของคอลลาเจน III หรือไฟโบรเนกตินที่เพิ่มขึ้นในเซลล์ทูบูล [7] ในการศึกษานี้ การแสดงออกของโปรตีน vimentin ที่บ่งชี้ EMT ในเซลล์ทูบูลนั้นลดลงอีกหลังจากได้รับ OTA โดยอิสระ ของสภาพวัฒนธรรม นอกจากนี้ การแสดงออกของ fibronectin mRNA และโปรตีนค่อนข้างต่ำและไม่ดีขึ้น นอกจากนี้ ในไฟโบรบลาสต์ ไม่มีการแสดงออกที่เปลี่ยนแปลงไป ดังนั้นการค้นพบนี้จึงไม่โต้แย้งในความโปรดปรานของ EMT ที่เหนี่ยวนำโดย OTA ดังที่แสดงโดยผู้อื่น [31]
CISTANCHE จะปรับปรุงการทำงานของไต/ไต
เพื่อทดสอบเพิ่มเติมว่าการเพาะเลี้ยงร่วมสามารถมีอิทธิพลต่อคำตอบของเซลล์ต่อความเครียดที่เกิดจาก OTA ได้หรือไม่ เราได้พิจารณาการแสดงออกของ RNA ที่ได้รับการคัดเลือกที่เป็นแบบอย่างที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์-เนื้อร้าย การพัฒนาของมะเร็ง และเมแทบอลิซึมของพลังงาน RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัสเป็นเวลานานมีบทบาทสำคัญในกระบวนการควบคุมเซลล์จำนวนมากและการตกรางของพวกมัน และในการเกิดพังผืดของไตหรือมะเร็งด้วย [32] WISP1-AS1 เป็น RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบยาวซึ่งเหนี่ยวนำโดย OTA และแสดงออกในเซลล์เนื้องอกในไต [24] เราพบว่าการปรับขึ้นโดย OTA ทั้งในประเภทเซลล์และการเพาะเลี้ยงร่วมได้ปรับปรุงการควบคุมให้ดีขึ้น วิธีนี้ทำให้ผลของ WISP1-AS1 รุนแรงขึ้นต่อความสมดุลของการตายของเซลล์ตายและการตายของเซลล์และอาจก่อตัวเป็นเนื้องอกได้ การปลดปล่อย LDH ที่ปรับปรุงแล้วที่สังเกตพบในวัฒนธรรมร่วมจึงสามารถอธิบายได้อย่างน้อยบางส่วนโดยเนื้อหาที่ปรับปรุงของ WISP1-AS1 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าจำเป็นสำหรับเนื้อร้ายที่เกิดจาก OTA [24]
WISP1-AS1ยังสงสัยว่ามีบทบาทในการเผาผลาญรวมทั้งไมโทคอนไดเรีย [24] ในเซลล์เยื่อบุผิวในกระเพาะอาหาร OTA แสดงให้เห็นว่าทำให้เกิดความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย [33] สำหรับไตเซลล์มีผลเป็นที่ถกเถียงกันว่าการได้รับ OTA มีอิทธิพลต่อศักยภาพของไมโตคอนเดรียหรือไม่ [21,24] ศักยภาพของไมโตคอนเดรียที่ลดลงอาจเป็นผลมาจากไมโตคอนเดรียที่บกพร่องหรืออาจสร้างความเสียหายต่อไมโตคอนเดรีย การแสดงออกที่ลดลงของโปรตีนไมโตคอนเดรียอาจนำไปสู่การทำงานบกพร่องที่สะท้อนหรือตามมาด้วยการเปลี่ยนแปลงศักยภาพของไมโตคอนเดรีย การทำงานของไมโตคอนเดรียที่บกพร่องทำให้เซลล์ต้องใช้ทางเลือกอื่นเพื่อรับประกันการจ่ายพลังงาน การจัดหาพลังงานภายใต้การมีส่วนร่วมของไมโตคอนเดรียที่ไม่เหมาะสมสามารถรักษาได้ด้วยการใช้ไกลโคไลซิสที่เพิ่มขึ้นซึ่งนำไปสู่การผลิตแลคเตทที่เพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม ในเซลล์ HEK293 ตัวอ่อนของมนุษย์ไตกลุ่มเซลล์ พบว่า OTA นำไปสู่การลดระดับไกลโคไลซิสและปริมาณแลคเตทที่เพิ่มขึ้นเนื่องจากการผลิตแลคเตทจากกลูตามีนขึ้นอยู่กับการแสดงออกของ lncRNA WISP1-AS1 [24] ในทางตรงกันข้าม ในเซลล์เยื่อบุผิวในกระเพาะอาหาร อาจแสดงให้เห็นว่าการได้รับ OTA นำไปสู่การตั้งโปรแกรมใหม่ของการเผาผลาญกลูโคสไปสู่ไกลโคไลซิสและการทำงานของวงจรกรดไตรคาร์บอกซิอิกน้อยลง [34] เราสามารถแสดงได้ที่นี่ว่า (1) OTA นำไปสู่การแสดงออกของ mRNA ที่ลดลงของโปรตีนไมโตคอนเดรียสองตัวที่ได้รับการคัดเลือกอย่างเป็นตัวแทน ซึ่งมีบทบาทในการสังเคราะห์โปรตีนไมโตคอนเดรีย (MRPS16) และการผลิตพลังงาน (NDUFB10) และ (2) ที่ควบคุมเอนไซม์จัดการไกลโคเจน ในลักษณะที่สามารถระดมกลูโคสที่เพิ่มขึ้น (GYS1 down และ PYGM up) นอกจากนี้ ดูเหมือนว่าจะมีการกระตุ้นความสามารถในการขนส่ง GLUT1 ที่สูงขึ้น อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงที่เกิดจาก OTA เหล่านี้เกือบจะเป็นอิสระจากสภาวะทางวัฒนธรรม
โดยสรุป เราได้แสดงให้เห็นว่าภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงร่วม ปฏิกิริยาของเซลล์สามารถแตกต่างไปจากปฏิกิริยาที่สังเกตได้ในวัฒนธรรมเดี่ยว แม้ว่าพารามิเตอร์ทั้งหมดที่ศึกษาในที่นี้ไม่ได้ขึ้นอยู่กับวัฒนธรรมก็ตาม อย่างไรก็ตาม ตามการค้นพบที่นำเสนอในที่นี้ การใช้วัฒนธรรมร่วมควรเป็นที่ต้องการหากเป็นไปได้ ดังนั้นจึงหลีกเลี่ยงความเป็นไปได้ที่จะดูแลผลกระทบที่ไม่ได้เกิดขึ้นเมื่อมีการศึกษาเซลล์เพียงประเภทเดียว คำถามยังคงอยู่ว่าเซลล์สื่อสารกันอย่างไร การศึกษาในรูปแบบการเพาะเลี้ยงร่วมกันของหนูเผยให้เห็นกลไกที่ขึ้นกับ COX2- [20] และในหนู ดูเหมือนว่ากรดเรติโนอิกจะมีส่วนร่วมในการพูดคุยข้ามเซลล์ของไตเซลล์ [35]. นอกจากนี้ คำถามยังคงอยู่ ว่าเหตุใด OTA จึงขัดขวางการเผาผลาญพลังงานของเซลล์และบทบาทของไมโตคอนเดรียในนั้นและอย่างไร
การกำหนดกิจกรรม LDH และ Caspase-3 และปริมาณโปรตีนสำหรับการสลาย เซลล์ถูกล้างสองครั้งในบัฟเฟอร์ PBS ที่เย็นจัด รวบรวมและสลายในบัฟเฟอร์ MOPSTriton (20 มิลลิโมลาร์ 3-(N-มอร์โฟลิโน)โพรเพนซัลโฟนิก แอซิด, pH 7.4, 0 ไทรทัน 1 เปอร์เซ็นต์ X100) ปริมาณโปรตีนในเซลล์ไลเสตถูกกำหนดโดยใช้กรดบิซินโชนินิก [36,37] กิจกรรมของ LDH ในตัวกลางหรือเซลล์ไลเสตเป็นการวัดสำหรับเนื้อร้ายถูกกำหนดตามเบิร์กเมเยอร์ [38] ตามที่อธิบายในรายละเอียดใน [20] กิจกรรมของแคสเปส-3 เป็นตัววัดสำหรับการตายของเซลล์ถูกกำหนดโดยใช้สารตั้งต้นของแคสเปส florigenic-3 (DEVD-AFC) ตามที่อธิบายไว้ใน [39] โดยย่อ เซลล์ไลเซต 60 ไมโครลิตรถูกบ่มด้วยบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 65 ไมโครลิตร (20 มิลลิโมล/ลิตร ปิเปอราซีน-1,4-บิส(2เอเทนซัลโฟนิกแอซิด (PIPES), 4 มิลลิโมล/ลิตร EDTA, 0.2 เปอร์เซ็นต์ {{26} }[(3-cholaminopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfate (CHAPS), 10 mmol/L dithiotreitol (DTT), pH 7.4) ที่มี DEVD-AFC ขนาด 42 µmol/L (Aspglu-val-asp{{ 36}}อะมิโน-4-ไตรฟลูออโรเมทิลคูมาริน ความเข้มข้นสุดท้าย) ที่ 37 ◦C การเรืองแสงของผลิตภัณฑ์แยก (AFC) ถูกวัดที่การกระตุ้น 400 นาโนเมตรและการปล่อย 505 นาโนเมตร AFC ที่แยกออกถูกหาปริมาณโดยกราฟการปรับเทียบโดยใช้ AFC ที่รู้จัก ความเข้มข้น
RT-PCR การแยกกรดไรโบนิวคลีอิกทั้งหมด (RNA) ดำเนินการโดยใช้รีเอเจนต์ Trizol (Life Technologies, Darmstadt, Germany) เซลล์ถูกล้างและหลังจากนั้นไลเซชันด้วยรีเอเจนต์ Trizol และถ่ายโอนไปยังหลอดปฏิกิริยา หลังจากการเติมคลอโรฟอร์มและการหมุนเหวี่ยง (12,000× ก.) เฟสบนถูกรวบรวมและผสมกับไอโซโพรพานอลที่เย็นจัด หลังจากการปั่นเหวี่ยง (12,000× ก.) ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกำจัดออก และเม็ดถูกล้างสองครั้งด้วยเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์ และสุดท้ายถูกละลายในน้ำ การถอดความแบบย้อนกลับดำเนินการโดยใช้ชุดเครื่องมือทางการค้าจาก Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ตามคำแนะนำ PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้รีเอเจนต์สีเขียว SYBR (Invitrogen) ไพรเมอร์ถูกสังเคราะห์โดย Microsynth AG, Balgach, Switzerland ลำดับไพรเมอร์แสดงในตารางที่ 1 การเปลี่ยนแปลงแบบพับของการแสดงออกของยีนคำนวณโดยวิธี2∆∆Ct โดยใช้การแสดงออกของ EEF2 และ RPS17 เป็นข้อมูลอ้างอิง การแสดงออกของยีนทั้งสองนี้กลายเป็นยีนที่มีการเปลี่ยนแปลงน้อยกว่า (ถ้าเลย) ในข้อมูลการจัดลำดับ RNA เมื่อเปรียบเทียบ OTA ที่รับการรักษาด้วยเซลล์ HK2 ที่ไม่ได้รับการรักษา (ผลที่ไม่ได้เผยแพร่)
Western Blots หลังจากแยกโปรตีนโดยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (SDS-PAGE) โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส หลังจากนั้น ตำแหน่งการจับอิสระของเมมเบรนถูกบล็อกโดยสารละลาย 5 เปอร์เซ็นต์ของนมแห้งไม่มีไขมันในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ TRIS (3 mM TRIS base, 140 mM NaCl, 0.17 mM Tris -HCl, pH 7.4) มี Tween20 0.1 เปอร์เซ็นต์ แอนติบอดีตัวแรกที่เจือจางในน้ำเกลือ TRIS บวกกับอัลบูมินในซีรัมของวัว 5 เปอร์เซ็นต์ (TRIS-BSA สำหรับการเจือจางดูตารางที่ 2) ถูกเติมและบ่มเยื่อหุ้มเซลล์ข้ามคืน หลังจากการล้าง แอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่เรืองแสงใน TRIS-BSA ถูกเติมเป็นเวลา 90 นาที การเรืองแสงของแอนติบอดีที่สองถูกบันทึกโดยใช้ระบบตรวจจับ LICOR
CISTANCHE จะช่วยเพิ่มอาการปวดไต/ไต
