สถานะปัจจุบันของการป้องกันระบบประสาทในโรคหัวใจพิการแต่กำเนิด ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม:

การปรากฏตัวของ DNA นอกมดลูกในไซโตพลาสซึมทำให้เกิดการอักเสบและการตายของเซลล์ มีรายงานอย่างกว้างขวางว่าการรั่วไหลของ DNA นิวเคลียร์เข้าสู่ไซโตพลาสซึมส่วนใหญ่สามารถรับรู้ได้โดย cyclicGMP-AMP synthase (cGAS)

ดีเอ็นเอเป็นโมเลกุลที่ระบุข้อมูลทางพันธุกรรมของแต่ละคน และพบได้ในทุกเซลล์ของเรา การวิจัยล่าสุดแสดงให้เห็นว่า DNA สามารถรั่วไหลเข้าสู่ไซโตพลาสซึมผ่านวิถีทางบางอย่างและส่งผลต่อความจำของเรา

ปรากฏการณ์นี้พบได้ทั่วไปในผู้สูงอายุและผู้ที่มีความบกพร่องทางสติปัญญา เมื่อ DNA รั่วไหลเข้าสู่ไซโตพลาสซึม มันจะรบกวนการทำงานปกติภายในเซลล์ และเพิ่มความเสี่ยงต่อการสูญเสียความทรงจำและความบกพร่องทางสติปัญญา

อย่างไรก็ตาม เราไม่จำเป็นต้องรู้สึกหดหู่และสิ้นหวังกับเรื่องนี้ มีหลายวิธีในการปรับปรุงความจำและความสามารถทางปัญญาเพื่อช่วยรักษาสุขภาพสมองให้แข็งแรง

ขั้นแรก คุณต้องรักษาวิถีชีวิตที่มีสุขภาพดี ซึ่งรวมถึงการรับประทานอาหารที่สมดุล การนอนหลับให้เพียงพอ การออกกำลังกายในระดับปานกลาง และลดความเครียด การปฏิบัติเหล่านี้ส่งเสริมสุขภาพสมอง จึงหลีกเลี่ยงการรั่วไหลของ DNA และเพิ่มความจำ

ประการที่สอง จำเป็นต้องมีการฝึกอบรมด้านความรู้ความเข้าใจ ซึ่งอาจรวมถึงการเล่นเกมคณิตศาสตร์ การอ่าน การเรียนรู้ทักษะใหม่ๆ ฯลฯ กิจกรรมเหล่านี้สามารถช่วยกระตุ้นสมองและส่งเสริมการสร้างระบบประสาทเพื่อหลีกเลี่ยงการรั่วไหลของ DNA

สุดท้ายนี้ รักษาทัศนคติเชิงบวกไว้ ความไม่มั่นคงทางอารมณ์และความเครียดที่มากเกินไปอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางเคมีในสมองซึ่งส่งเสริมการรั่วไหลของ DNA ดังนั้นเราจึงต้องเรียนรู้ที่จะเผชิญกับความท้าทายในชีวิตในเชิงบวกและรักษาทัศนคติในแง่ดี

โดยสรุป แม้ว่าการรั่วไหลของ DNA เข้าสู่ไซโตพลาสซึมอาจส่งผลต่อความจำ แต่เราก็สามารถปรับปรุงสุขภาพสมอง หลีกเลี่ยงการรั่วไหลของ DNA และท้ายที่สุดก็ปรับปรุงความจำของเราด้วยการใช้ชีวิตที่เหมาะสม มีส่วนร่วมในการฝึกความรู้ความเข้าใจ และรักษาทัศนคติเชิงบวก ความจำและความสามารถทางปัญญา จะเห็นได้ว่าเราต้องปรับปรุงความจำ และ Cistanche Deserticola สามารถปรับปรุงความจำได้อย่างมาก เนื่องจาก Cistanche Deserticola เป็นยาจีนโบราณที่มีลักษณะพิเศษมากมาย หนึ่งในนั้นคือการปรับปรุงความจำ ประสิทธิภาพของ Cistanche Deserticola มาจากส่วนผสมออกฤทธิ์หลายชนิดใน Cistanche Deserticola รวมถึงกรดแทนนิก โพลีแซ็กคาไรด์ ฟลาโวนอยด์ไกลโคไซด์ ฯลฯ ส่วนผสมเหล่านี้สามารถส่งเสริมสุขภาพสมองผ่านวิถีทางที่หลากหลาย

คลิกรู้ 10 วิธีปรับปรุงความจำ

เรารายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่า DNA (dsDNA) แบบเกลียวคู่ที่ได้มาจากไมโตคอนเดรียซึ่งรอดพ้นจากการย่อยสลายของไลโซโซมทำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีนัยสำคัญที่เพาะเลี้ยงและในร่างกาย สันนิษฐานว่า DNA ไมโตคอนเดรียของไซโตพลาสซึมเกี่ยวข้องกับโรคและความผิดปกติต่างๆ และมีการตีพิมพ์เอกสารยืนยันเรื่องนี้มากขึ้นเรื่อยๆ ในทางกลับกัน วิธีปัจจุบันในการประเมินไมโตคอนเดรีย DNA ในไซโตพลาสซึมอาจไม่เชิงปริมาณ

ที่นี่เราแนะนำรายละเอียดวิธีการประเมินเซลล์ไมโตคอนเดรียนอกมดลูก วิธีการนี้มีประโยชน์ในการวิจัยขั้นพื้นฐานตลอดจนในการศึกษาความชรา โรคพาร์กินสัน โรคอัลไซเมอร์ ภาวะหัวใจล้มเหลว โรคแพ้ภูมิตัวเอง มะเร็ง และภาวะอื่นๆ

คำสำคัญ: DNA นอกมดลูก; DNA ของไมโตคอนเดรีย ปัจจัยการถอดรหัสไมโตคอนเดรีย A (TFAM) โรคพาร์กินสัน

1. บทนำ

DNA มีข้อมูลที่สำคัญเพื่อความอยู่รอดและการสืบทอด และจำเป็นต้องได้รับการปกป้องจากปัจจัยกดดันต่างๆ รวมถึงสารออกซิแดนท์และสารก่อกลายพันธุ์ เซลล์ยูคาริโอตประกอบด้วยไมโตคอนเดรียซึ่งผลิตพลังงานร่วมกับออกซิเจนหลายชนิดผ่านการหายใจแบบใช้ออกซิเจน

ดังนั้นในเซลล์ยูคาริโอต DNA จึงมีอยู่ในนิวเคลียสหรือไมโตคอนเดรียซึ่งบรรจุอยู่ภายในเยื่อหุ้มนิวเคลียสหรือเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียตามลำดับ อย่างไรก็ตาม DNA สามารถอยู่ในไซโตพลาสซึมได้ภายใต้เงื่อนไขบางประการ เช่น ในระหว่างการติดเชื้อไวรัสหรือไม่ใช่ไวรัส [1– 4].

แม้ในสภาวะที่ไม่ติดเชื้อ (เช่น อายุมากขึ้น หรือความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับอายุ หรือมะเร็ง) DNA ก็อาจถูกรั่วไหลเข้าสู่ไซโตพลาสซึมจากนิวเคลียสหรือไมโตคอนเดรีย [5–7]

DNA ในไซโตพลาสซึมสามารถทำให้เกิดการอักเสบและเป็นพิษต่อเซลล์ มีรายงานอย่างกว้างขวางว่าการรั่วไหลของ DNA นิวเคลียร์เข้าไปในไซโตพลาสซึมทำให้เกิดการอักเสบ ความเป็นพิษต่อเซลล์ และฟีโนไทป์ของการหลั่งที่เกี่ยวข้องกับการชราภาพ (SASP) โดยส่วนใหญ่ผ่านทางไซคลิก GMP-AMP synthase (cGAS) ซึ่งเป็นตัวกระตุ้นของทางเดินของยีนอินเตอร์เฟอรอน (STING) 5,6].

เรารายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้ว่า DNA แบบเกลียวคู่ของไซโตซิลิก (dsDNA) ของต้นกำเนิดไมโตคอนเดรียที่หลบหนีจากการย่อยสลายไลโซโซมนั้นแสดงให้เห็นว่ากระตุ้นให้เกิดพิษต่อเซลล์และการเสื่อมของระบบประสาทในแบบจำลองเซลล์ของโรคพาร์กินสัน [8] การเพิ่มขึ้นของการมีอยู่ของ DNA นอกมดลูกมักถูกระบุโดยภาพถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่เป็นตัวแทนและหลักฐานตามสถานการณ์ ไม่ใช่โดยการเพิ่มขึ้นของการรั่วไหลของ DNA เอง

เป็นที่คาดว่าการประเมิน DNA นอกมดลูกนี้จะมีความสำคัญมากขึ้นเรื่อยๆ ไม่เพียงแต่การวิจัยเชิงพื้นฐานเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการวิจัยเกี่ยวกับความชราและโรคอื่นๆ ด้วย เช่น โรคพาร์กินสัน, โรคอัลไซเมอร์, เส้นโลหิตตีบด้านข้างของอะไมโอโทรฟิค, ภาวะหัวใจล้มเหลว, โรคแพ้ภูมิตัวเอง, โรคเบาหวาน, ภาวะไขมันพอกตับอักเสบที่ไม่มีแอลกอฮอล์ (NASH) และมะเร็ง มีรายงานว่าเส้นทางของ cGAS-STING มีความสำคัญไม่เพียงแต่ในความชราเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการเกิดโรคของโรคเหล่านี้ด้วย [8-17]

อาจเนื่องมาจากสภาวะออกซิเดชั่นรอบๆ ไมโตคอนเดรียและการขาดระบบซ่อมแซม DNA ที่มีประสิทธิภาพสำหรับ DNA ของไมโตคอนเดรีย DNA ของไมโตคอนเดรียจึงไวต่อการกลายพันธุ์หรือความเสียหายมากกว่า DNA นิวเคลียร์ [18,19]

DNA ของไมโตคอนเดรียแตกต่างจาก DNA นิวเคลียร์ตรงที่ DNA ของไมโตคอนเดรียมีอยู่หลายสำเนาในเซลล์เดียวและถูกสังเคราะห์ตามความจำเป็น ดังนั้น DNA ของไมโตคอนเดรียอาจมีโอกาสรั่วไหลเข้าสู่ไซโตพลาสซึมได้มากกว่ามากในช่วงอายุหรือในสภาวะที่เป็นมะเร็ง เช่น ความผิดปกติที่เกี่ยวข้องกับอายุ ความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย หรือมะเร็ง.

การตรวจจับและการวัดค่า DNA ของไซโตพลาสมิโตคอนเดรียอาจมีความสำคัญในการทำความเข้าใจกลไกการเกิดโรคและความชราต่างๆ และอาจกลายเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพและเป็นเป้าหมายในการรักษาโรคได้

เราได้พัฒนาวิธีการกึ่งปริมาณเพื่อประเมิน DNA ของไมโตคอนเดรียนอกมดลูกที่รั่วเข้าไปในไซโตพลาสซึม และเราจะอธิบายวิธีการโดยละเอียดในที่นี้ บทความนี้ช่วยให้สามารถประเมินการรั่วไหลของ DNA ของไมโตคอนเดรียได้อย่างเป็นกลาง และมีประโยชน์ในการศึกษาโรคทางโรคต่างๆ

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. เส้นเซลล์ การรักษา siRNA และการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณ (qPCR)

เซลล์ HeLa ได้มาจากเซลล์มะเร็งปากมดลูกจากผู้ป่วยเพศหญิง (ATCC,CCL-2) เพาะเลี้ยงเซลล์ HeLa ที่ 37 ◦C ต่ำกว่า 5% CO2 ใน Modified EagleMedium (DMEM) ของ Dulbecco (Nacalai Tesque, เกียวโต, ญี่ปุ่น) เสริมด้วย bovineserum ของทารกในครรภ์ 10% (FBS) (Biowest, Nuaillé, ฝรั่งเศส) และสารละลายเพนิซิลลิน – สเตรปโตมัยซิน ( 100 ยูนิต/มลเพนิซิลลิน จี และ 100 ไมโครกรัม/มล. สเตรปโตมัยซิน ซัลเฟต, วาโกะ, โอซาก้า, ญี่ปุ่น)

หนึ่งวันก่อนการทรานส์เฟกชัน เซลล์ HeLa ถูกชุบที่ความหนาแน่น 600 เซลล์/ไมโครลิตร การแสดงออกของยีนที่น่าสนใจถูกเงียบในเซลล์ HeLa โดยใช้ Stealth RNAi siRNA (ปัจจัยการถอดรหัสยล A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidase, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) ใน Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิต (ความเข้มข้น RNA สุดท้ายคือ 10 นาโนโมลาร์)

สามวันหลังจากการล้มลงของ siRNA RNA ของเซลล์ทั้งหมดจะถูกแยกออกโดยใช้ TRIzolreagent ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Thermo Fisher Scientific) เทมเพลต cDNA ถูกสังเคราะห์จาก RNA บริสุทธิ์โดยใช้ชุดการสังเคราะห์ StrandcDNA แรกของ ProtoScript II (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) พร้อมไพรเมอร์ oligo (dT) 20 qPCR ดำเนินการโดยใช้ TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu ประเทศญี่ปุ่น) และวิเคราะห์ด้วย Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio) ไพรเมอร์ PCR ที่ใช้ในการศึกษาปัจจุบัน ได้แก่ GBA ไปข้างหน้า (TGCTGCTCCAACATCCTTGCC), GBA ย้อนกลับ (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM ไปข้างหน้า (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM ย้อนกลับ (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), กลีเซอรอลดีไฮด์-3-ฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส (GAPDH) ไปข้างหน้า (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) และ GAPDH ย้อนกลับ (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA)

การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism เวอร์ชัน 9.3.1 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, San Diego, CA, USA) การทดสอบทีของนักเรียนสองด้านใช้เพื่อเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยเลขคณิตระหว่างสองกลุ่ม ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ยและ ± ค่าคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย

2.2. การตรวจหาอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของ DNA ไมโตคอนเดรียนอกมดลูกและการวิเคราะห์ภาพ

หนึ่งวันก่อนการเปลี่ยนถ่าย เซลล์ HeLa ถูกชุบที่ความหนาแน่น 600 เซลล์/µL การแสดงออกของยีนที่สนใจถูกปิดเสียงในเซลล์ HeLa โดยใช้ Stealth RNAi siRNA(Thermo Fisher Scientific) ใน Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (ThermoFisher Scientific) ตาม คำแนะนำของผู้ผลิต (ความเข้มข้น RNA สุดท้ายคือ 10 นาโนโมลาร์)

สามวันหลังจากการล้มลงของ siRNA เซลล์จะถูกย้อมด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ สำหรับการตรวจหา DNA ของไมโตคอนเดรีย, แอนติบอดีต่อต้าน dsDNA (Abcam,Cambridge, UK, โคลน 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 หรือ EMD Millipore, Billerica,MA, USA, โคลน AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) แสดงอัตราส่วนสัญญาณต่อเสียงรบกวนที่ดีกว่า Hoechst 33258, DAPI หรือ Picogreen ที่นี่เราได้รวมแอนติบอดีปฐมภูมิสามชนิดเข้าด้วยกัน: แอนติบอดีต่อต้าน dsDNA (35I9 DNA) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), แอนติบอดีต่อต้านฮิสโตน-H2B (Abcam, Cat# ab134211) และแอนติบอดีต้านความร้อน ช็อคโปรตีน-60 (Hsp60)แอนติบอดี (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444)

สามารถเลือกแอนติบอดีอื่นๆ หรือติดแท็กฟลูออเรสเซนต์ด้วยฮิสโตน หรือสามารถใช้ Hsp60 เป็นทางเลือกก็ได้ แต่จำเป็นต้องปรับเงื่อนไขของการย้อมสีสามเท่าให้เหมาะสมสำหรับแต่ละการผสม

ล้างเซลล์สองครั้งด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) และตรึงด้วยเมทานอลเย็นน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 °C หรืออีกทางหนึ่ง สามารถใช้พาราฟอร์มัลดีไฮด์ (PFA) 4% สำหรับการตรึง แต่สัญญาณพื้นหลังดูเหมือน ดีกว่ามากในกลุ่มตัวอย่างที่คงที่ด้วย PFA หลังจากการตรึง เซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วยน้ำเกลือที่มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟตด้วย Tween 20 (PBST) เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละเซลล์ เซลล์ถูกซึมผ่านด้วย PBS ที่มี 0.2% (w/v) ไทรทัน X-100 เป็นเวลา 10 นาที

หลังจากการล้างสามครั้งด้วย PBST เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้ง, เซลล์ถูกบ่มด้วย 2% (w/v)ซีรัมอัลบูมินของวัว (BSA) ใน PBST เป็นเวลา 30 นาที เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิเดี่ยว, แอนติบอดีต้านฮิสโตน-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211) เจือจางใน 2%(w/v) BSA ใน PBST O/N ที่ 4 —C หลังจากล้างด้วย PBST สามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้ง เซลล์จะถูกบ่มด้วย Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) เจือจางใน 2% (w/v) BSA ใน PBST เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (RT)

หลังจากล้างสามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้งด้วย PBST เซลล์จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิและแอนติบอดีต่อต้าน dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam,Cat# ab27156, RRID: AB_470907) และสารต่อต้าน -แอนติบอดี Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) เจือจางใน 2% (w/v) BSA ใน PBST ถูกนำไปใช้เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ RT หรือข้ามคืน (O/N) ที่ 4°ซ.

หลังจากล้างด้วย PBST สามครั้งเป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้ง เซลล์จะถูกบ่มด้วย Alexa Fluor ที่ดูดซับข้ามสูง 680-IgG (H+L) ของ Donkey anti-Rabbit (H+L) ที่ถูกดูดซับข้ามสูง (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043 , RRID: AB_2534018) ​​และ Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) เจือจางใน 2% (w/v) BSA ใน PBST เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT

ล้างเซลล์สามครั้งด้วย PBST เป็นเวลา 5 นาทีในแต่ละครั้ง และวิเคราะห์ชิ้นงานโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล A1R+ (Nikon, โตเกียว, ญี่ปุ่น)

For more information:1950477648nn@gmail.com