การสร้างวัคซีน Recombinant Lactobacillus Casei ของ PEDV และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในหนู

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง: โรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในสุกร (PED) เป็นโรคติดต่อในลำไส้ที่เกิดจากเชื้อไวรัสโรคท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร (PEDV) โดยมีลักษณะการอาเจียน ท้องร่วง เบื่ออาหาร และภาวะขาดน้ำ ซึ่งก่อให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจครั้งใหญ่ทั่วโลก ในปัจจุบัน การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีนยังคงเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพที่สุดในการควบคุมการแพร่กระจายของโรค PED ในการศึกษานี้ เราได้สร้างสายพันธุ์ PEDVS ชนิดรีคอมบิแนนต์ L. casei-OMP16- ที่แสดงโปรตีน PEDVS ของ PEDV และโปรตีน OMP16 ของสายพันธุ์ Brucella abortus หากต้องการทราบภูมิคุ้มกันของวัคซีนตัวเลือก Recombinant L. casei-OMP16-PEDVS จึงถูกเปรียบเทียบกับ BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS และโปรตีนรีคอมบิแนนท์ BL21-PEDVS

ผลลัพธ์: ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเราสามารถตรวจพบระดับ IgG ที่สูงขึ้น, การทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง, IL-4, IL-10 และ INF- ในซีรั่มและ IgA ในอุจจาระของ L. casei-OMP16- หนูที่ได้รับวัคซีน PEDVS ซึ่งบ่งชี้ว่าวัคซีนตัวเลือก L. casei-OMP16- PEDVS สามารถกระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันของร่างกาย ภูมิคุ้มกันของเซลล์ และภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือกในระดับที่สูงขึ้น

บทสรุป: ดังนั้น L. casei-OMP16-PEDVS จึงเป็นวัคซีนที่มีศักยภาพในการป้องกันการติดเชื้อ PEDV

คำสำคัญ: PEDV, วัคซีน Lactobacillus casei, โปรตีน PEDV S, OMP16, การตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

การแนะนำ

โรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในสุกร (PED) เกิดจากเชื้อไวรัสโรคท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร (PEDV) โดยมีอาการต่างๆ ได้แก่ ท้องเสีย อาเจียน เบื่ออาหาร ขาดน้ำ และน้ำหนักลดในลูกสุกร [1, 2] สุกรทุกวัยสามารถติดเชื้อได้หลายอาการ และอัตราการเสียชีวิตของลูกสุกรก็สูงถึง 100% [3] ซึ่งนำไปสู่ความสูญเสียทางเศรษฐกิจครั้งใหญ่ทั่วโลก เพื่อควบคุมการแพร่กระจายของ PEDV วัคซีนส่วนใหญ่จึงถูกสร้างขึ้น เช่น วัคซีนเชื้อตายแบบเสริมอะลูมิเนียมไฮดรอกไซด์ วัคซีนโรคกระเพาะและลำไส้อักเสบชนิดไบวาเลนต์ที่ไม่ใช้งาน (TGEV) และวัคซีน PEDV และวัคซีน PEDV แบบลดทอน [4] แม้ว่าวัคซีนเหล่านี้จะมีบทบาทสำคัญในการควบคุม PED แต่วัคซีนเหล่านี้ล้วนมีข้อบกพร่อง วัคซีนเชื้อตายไม่สามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ได้ วัคซีนเชื้อตายนั้นไม่ปลอดภัยมากนัก และไม่สามารถกระตุ้นการผลิตแอนติบอดี IgA ที่จำเพาะต่อไวรัสได้เพียงพอสำหรับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือก จึงมีความจำเป็นและเร่งด่วนที่จะต้องพัฒนาวัคซีนชนิดใหม่เพื่อควบคุมโรคพีอีดี

Lactobacillus casei มักถูกพิจารณาว่าเป็นระบบพาหะที่ปลอดภัยสำหรับการส่งแอนติเจนแบบกำหนดเป้าหมายในการสร้างภูมิคุ้มกันทางปาก โดยมีผลดีต่อสุขภาพของมนุษย์และสัตว์ [5] ในขณะเดียวกันก็สามารถใช้เป็นระบบนำส่งเพื่อควบคุมการตอบสนองของเซลล์ T-helper และกระตุ้นการหลั่ง IgAs เฉพาะสำหรับภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือก [6] ในทางกลับกัน วัคซีน Lactobacillus casei recombinant นั้นให้ง่ายกว่า มีโอกาสเกิดปฏิกิริยาภูมิไวเกินน้อยกว่า และคุ้มค่ากว่าเมื่อเปรียบเทียบกับวัคซีนแบบดั้งเดิม จากรายงานดังกล่าว วัคซีน Lactobacillus casei recombinant ถูกนำมาใช้อย่างประสบความสำเร็จในการป้องกันและควบคุมไวรัส papilloma ของมนุษย์ โรคปอดบวมสเตรปโตคอคคัส และ Escherichia coli [7–9] นอกจากนี้ยังมีความพยายามคล้ายกันในการออกแบบวัคซีน PED นักวิจัยพบว่าสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์แลคโตคอคคัส แลคติสที่แสดงยีน S1 ของไวรัสท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกรสามารถกระตุ้นให้เกิด IL-4 และ IFN- ในระดับสูงในหนูที่ได้รับวัคซีน [10] วัคซีนต่อต้าน PEDV ที่ใช้ Lactobacillus casei จะแสดงเปปไทด์ Co1 ที่กำหนดเป้าหมายเซลล์แบบ microfold ผสมกับแอนติเจน COE ของ PEDV ยังสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่มีประสิทธิภาพ [11] เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพของวัคซีน PEDV ในการศึกษานี้ เราสร้างวัคซีนรีคอมบิแนนท์ Lactobacillus casei ใหม่ของ PED ซึ่งสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือก อารมณ์ขัน และเซลล์ให้แข็งแกร่งขึ้นต่อการติดเชื้อ PEDV ผ่านการบริหารช่องปาก PEDV ซึ่งเป็นสมาชิกของตระกูล Coronaviridae ประกอบด้วยโปรตีนโครงสร้างสี่ชนิดซึ่งประกอบด้วยโปรตีน glycosylated Spike (S) 150–220 kDa, โปรตีนเมมเบรน (M) 20–30 kDa, โปรตีนซองจดหมาย (E) 7 kDa, 58 kDa โปรตีนนิวคลีโอแคปซิด (N) [12] ที่นั่น โปรตีน S สามารถแบ่งออกเป็นโดเมน S1 (1–735 กรดอะมิโน) และ S2 (736-กรดอะมิโนตัวสุดท้าย) [13] และโปรตีน S1 รวมถึงบริเวณการจับรีเซพเตอร์และอีพิโทปการทำให้เป็นกลางหลัก [ 14]. สารเสริมวัคซีนทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นภูมิคุ้มกันและสามารถกระตุ้นและเพิ่มการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันต่อแอนติเจนที่ส่งร่วมกัน โปรตีน OMP16 ของสายพันธุ์ Brucella abortus ได้รับการตรวจสอบแล้วว่ากระตุ้นเซลล์เดนไดรต์ในร่างกาย กระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน th1 และเป็นวัคซีนเสริมด้วยตนเองที่มีแนวโน้มดี [15–17] ดังนั้นจึงมีการใส่โปรตีน OMP16 เข้าไปในวัคซีนรีคอมบิแนนท์กรณีแลคโตบาซิลลัสในการศึกษาของเรา จนถึงขณะนี้ มีรายงานการศึกษาเกี่ยวกับวัคซีน Lactobacillus casei recombinant ของ PEDV เพียงเล็กน้อย ดังนั้น การศึกษานี้จึงมีจุดมุ่งหมายเพื่อสร้างวัคซีนชนิดรับประทานสำหรับแลคโตบาซิลลัส คาเซอิ ชนิดใหม่ ซึ่งสามารถให้ภูมิคุ้มกันของร่างกาย ภูมิคุ้มกันของเซลล์ และภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือกได้ดีขึ้น เพื่อป้องกันการแพร่กระจายของ PED

สมุนไพรจีน cistanche plant-Antitumor

วัสดุและวิธีการ

สายพันธุ์แบคทีเรีย ไวรัส สภาวะการเพาะเลี้ยง พลาสมิด และไพรเมอร์

ผงซิสแทนเช่

สายพันธุ์แบคทีเรีย พลาสมิด และไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงอยู่ในตารางที่ 1 สายพันธุ์อ้างอิงมาตรฐานของ Lactobacillus casei ATCC 393 ได้รับการเพาะเลี้ยงในน้ำซุป de Man Rogosa และ Sharpe (MRS) ที่อุณหภูมิ 37 องศา [18] เพาะเลี้ยง BL21 (DE3) และ DH5 ในอาหาร Luria-Bertani (LB) ที่ 37 องศา [19] เพาะเลี้ยงสายพันธุ์ Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) และ DH5 ชนิดรีคอมบิแนนท์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่สอดคล้องกันด้วยยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมตามลำดับ Brucella abortus ปลูกในอาหารเลี้ยงเชื้อ Tryptic Soy Broth (TSB) หรือ Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) ที่อุณหภูมิ 37 องศา เซลล์ Vero ที่ติดเชื้อสายพันธุ์ PEDV ได้รับการเพาะเลี้ยงใน DMEM (Gibco, Langley, VA, USA) เสริมด้วยทริปซิน 10 ug/mL (Gibco, Langley, VA, USA) [20] พลาสมิด pVE5523 และ pET28a (+) เป็นเวกเตอร์การแสดงออกของ Lactobacillus casei และ Escherichia coli ตามลำดับ

ตารางที่ 1 ลักษณะของสายพันธุ์แบคทีเรีย พลาสมิด และไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้

การสร้างรีคอมบิแนนท์ Lactobacillus casei และสายพันธุ์ BL21

พลาสมิดนิพจน์รีคอมบิแนนท์ถูกสร้างขึ้นตามพลาสมิดและไพรเมอร์ในตารางที่ 1 ในตอนแรกลำดับบางส่วนของยีน PEDV S (กรดอะมิโน 493–708) ลำดับบางส่วนของยีน PEDV S ' (กรดอะมิโน 493–708) และลำดับบางส่วนของยีน Brucella abortus OMP16 (กรดอะมิโน 26–168) ถูกขยายโดยใช้คู่ไพรเมอร์ PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 และ OMP16-F/R ตามลำดับ ต่อมา วิธีการขยายที่ทับซ้อนกันได้ถูกนำมาใช้ในส่วนย่อยของ OMP16 และ PEDVS เพื่อสร้างชิ้นส่วน OMP{16}}PEDVS ใหม่ที่มีโพลีเปปไทด์ของตัวเชื่อมต่อ (GGGGSGGGGGGGGGS) ติดอยู่ตรงกลาง จากนั้น ชิ้นส่วน PEDVS ถูกแทรกเข้าไปในพลาสมิดของ pET28a ด้วยเอนไซม์จำกัด EcoRI/XbaI เพื่อสร้างพลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ pET28a-PEDVS และชิ้นส่วนใหม่ OMP16-PEDVS ถูกแทรกเข้าไปในพลาสมิดของ pET28a และ pVE5523 ด้วย EcoRI/XbaI และ SalI/EcoRV เอนไซม์จำกัดเพื่อสร้างพลาสมิดรีคอมบิแนนท์ pET28a-OMP16-PEDVS และ pVE5523-OMP16-PEDVS ตามลำดับ พลาสมิดชนิดลูกผสม (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS และ pVE5523-OMP16-PEDVS) ถูกแปลงเป็น BL21 (DE3) หรือ Lactobacillus casei ATCC393 โดยการเปลี่ยนรูปหรืออิเล็กโตรโพเรชันที่อิงตาม เอกสารรายงาน [21]

การวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนโดย Western blot

การแสดงออกของโปรตีนของสายพันธุ์ BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS และ L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS ตรวจพบตามวิธีการที่รายงานโดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [21–23] เพาะเลี้ยงสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ BL21-pET28a-PEDVS และ BL21-pET28a OMP16-PEDVS ในน้ำซุป LB และ IPTG ใช้ในการเก็บเกี่ยวเป็น pET28a-PEDVS และ pET28a-OMP{{22} } โปรตีน PEDVS เวกเตอร์ว่างถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ หลังจากการสลายเซลล์และการหมุนเหวี่ยง ส่วนลอยเหนือตะกอนและตะกอนจะถูกรวบรวม จากนั้น โปรตีนเป้าหมายถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์ Nickel affinity chromatography จากการศึกษาก่อนหน้านี้ [24] ในขณะเดียวกัน ส่วนลอยเหนือตะกอนทางวัฒนธรรมของสายพันธุ์ Recombinant L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS ก็เก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 9000×g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศา หลังจากนั้น ตัวอย่างที่มีบัฟเฟอร์การโหลดโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) ถูกต้มเป็นเวลา 10 นาที โปรตีนถูกแยกออกด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส (SDS-PAGE) 12% จากนั้นถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้ม PVDF (มิลลิพอร์, มิสซิสซอกา, ON, แคนาดา) Mem branes ถูกบล็อกด้วยนมพร่องมันเนย 5% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 องศาแล้วบ่มด้วย murine monoclonal anti-body ของโปรตีน S ข้ามคืนที่ 4 องศาและ HRP conjugated แพะต่อต้านเมาส์ IgG (ABclonal, หวู่ฮั่น, จีน) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 37 องศา . มองเห็นแถบโปรตีนโดยใช้ Clarity ™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)

การสร้างภูมิคุ้มกันและการเก็บตัวอย่าง

ภูมิคุ้มกันของวัคซีนแลคโตบาซิลลัส คาเซอิชนิดรีคอมบิแนนท์ได้รับการประเมินโดยใช้หนู BALB/c ปลอดเชื้อโรค (SPF) ตัวเมียอายุหกสัปดาห์ [10, 18] ซึ่งซื้อจากศูนย์สัตว์ของมหาวิทยาลัยเกษตรซานตง หนูทั้งหมด 50 ตัวถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม โดยมีหนู 10 ตัวในแต่ละกลุ่ม หนูได้รับภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีนรีคอมบิแนนท์แลคโตบาซิลลัส คาเซอิ และโปรตีนบริสุทธิ์ (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freund's complete adjuvant) ตามลำดับ เกณฑ์วิธีสร้างภูมิคุ้มกันถูกดำเนินการตามตารางที่ 2 และภูมิคุ้มกันแบบบูสเตอร์ถูกให้หลังจาก 13 วัน สำหรับการศึกษาทางซีรั่มวิทยา ซีรั่มถูกเก็บในวันที่ 0, 14 และ 28 วันหลังการฉีดวัคซีน (dpi) โดยการเจาะหลอดเลือดดำส่วนหางและเก็บไว้ที่ −20 องศาจนกระทั่งใช้งาน เก็บอุจจาระ 1 วันก่อนฉีดวัคซีนและทุกครั้งในการเสริม สำหรับการตรวจหา IgA อุจจาระถูกเจือจาง (น้ำหนัก/ปริมาตร) ด้วย 0.05 โมลาร์ โซเดียม EDTA ที่อัตราส่วน 1:4 หลังจากการเก็บรวบรวมและบ่มเป็นเวลา 14 ชั่วโมงที่ 4 องศาหลังจากการผสมที่เหมาะสม ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวมด้วยการหมุนเหวี่ยง 12,000×g และเก็บรักษาไว้ที่ − 20 องศาจนกระทั่งใช้งาน ที่ 28dpi; หนูสามตัวจากแต่ละกลุ่มถูกสังเวยและลำไส้ได้รับการประมวลผลเพื่อตรวจหา IgA ตามที่ผู้เขียนอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [10, 18, 23]

การวิเคราะห์การกำหนดระดับแอนติบอดี

ระดับของ IgG ในซีรั่มและ IgA ในอุจจาระวัดโดยวิธี ELISA โดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [18, 23] วิธีการดังต่อไปนี้: เพลตไมโครไตเตอร์โพลีสไตรีนถูกเคลือบข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยโปรตีน PEDVS 100 ไมโครลิตร 10 ไมโครลิตร, โปรตีน OMP16-PEDVS หรือสายพันธุ์ L. casei-OMP16-PEDVS ชนิดลูกผสม 100 ไมโครลิตร . หลังจากบล็อกด้วยนมพร่องมันเนย 5% ตัวอย่างที่เก็บมาจะถูกเจือจางตามลำดับใน PBS เติมเป็นสามเท่า และบ่มที่ 37 องศา เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้น แพะต่อต้าน IgG หรือแอนติบอดี IgA ของแพะที่ผันด้วย HRP (Invi trogen, USA) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม (1:5000) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา เพลตไมโครไทเตอร์โพลีสไตรีนถูกล้าง 5 ครั้งในระหว่างแต่ละขั้นตอน ในที่สุด 100 ไมโครลิตรของซับสเตรต TMB (เตตระเมทิลเบนซิดีนและ H2O2) ถูกเติมลงในแต่ละหลุมและ 50 ไมโครลิตรของสารละลายหยุดถูกเติมหลังจาก 10 นาที ค่า OD ที่ 630 นาโนเมตรถูกวัดโดยใช้เครื่องอ่านเพลทแบบมัลติโหมด (EnVision)

การทดสอบการทำให้ไวรัสเป็นกลาง

ตรวจสอบไทเทอร์แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของ PEDV ในซีรั่มตามวิธีการที่มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง [25, 26] โดยสรุป เซรั่มของหนูถูกทำให้ความร้อนหมดฤทธิ์ (56 องศาเป็นเวลา 30 นาที) จากนั้นเจือจางสองเท่าตามลำดับในเพลต 96 หลุม (คอร์นนิ่ง สหรัฐอเมริกา) โดยแต่ละตัวอย่างเพิ่มขึ้นสามเท่า จากนั้น ปริมาตรที่เท่ากันของสายพันธุ์ PEDV 200 TCID50 / 50 μL ถูกเติมลงในเพลต 96 หลุม และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา ของผสมถูกเติมไปยังเพลต 96 หลุมใหม่ที่เคลือบด้วยชั้นเดียวของเซลล์ Vero และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา จากนั้นเซลล์ถูกล้างและบ่มในตัวกลางบำรุงรักษาที่ 37 องศาใน 5% CO2 หลังจากผ่านไป 2 วัน จะสังเกตผลทางไซโตพาทิก (CPE) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว และความเข้มข้นของขนาดที่เป็นกลางถูกกำหนดให้เป็นความเข้มข้นต่ำสุดของแอนติบอดีในซีรั่ม

ตารางที่ 2 โปรโตคอลภูมิคุ้มกันของหนู BALB/c

การตรวจหาไซโตไคน์

เพื่อตรวจหาการหลั่งของไซโตไคน์ ส่วนลอยเหนือตะกอนได้มาจากหนูทดลอง (0, 14 และ 28 วัน) ระดับของ IL ที่หลั่งออกมา, IL-10 และ IFN- ถูกกำหนดโดยใช้ชุด ELISA เชิงพาณิชย์ (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ตามลำดับ ไซโตไคน์ถูกหาปริมาณจากเส้นโค้งมาตรฐานต่างๆ ที่เตรียมจากรีเอเจนต์มาตรฐานที่มาจากชุดอุปกรณ์ตามลำดับ และค่าความหนาแน่นของแสง (OD) ถูกตรวจพบที่ 450 นาโนเมตรจากแต่ละเพลตโดยใช้เครื่องอ่านเพลทแบบมัลติโหมด (EnVision) [23, 27]

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดได้มาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง และผลลัพธ์ถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การทดสอบทีแบบสองด้านและการวิเคราะห์ทางเดียวใน Graph Pad Prism 7 0 (GraphPad Software Inc., USA) ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญถูกกำหนดเป็น ∗ p < 0.05 และระดับต่างๆ ของความแตกต่างที่มีนัยสำคัญถูกกำหนดเป็น ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ และ p < 0.001 ตามลำดับ

ผลลัพธ์

การตรวจสอบสายพันธุ์ Lactobacillus casei และสายพันธุ์ BL21 ชนิดรีคอมบิแนนท์

ในการตรวจสอบพลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ที่สร้างขึ้น พลาสมิดของนิพจน์รีคอมบิแนนท์ pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS และ pVE5523-OMP16-PEDVS ถูกย่อยโดยใช้เอนไซม์จำกัด NcoI/XhoI และ ผลการย่อยของเอนไซม์แสดงในรูปที่ 1 ขนาดของแถบเป้าหมายในอิเล็กโตรโฟเรโตแกรมเหมือนกับผลลัพธ์ที่คาดหวัง และผลการจัดลำดับบ่งชี้ว่าพลาสมิดของการแสดงออกของรีคอมบิแนนท์ไม่มีการกลายพันธุ์ ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ถึงความสำเร็จในการสร้าง pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS และ pVE5523-OMP16-PEDVS รีคอมบิแนนต์พลาสมิด ผลลัพธ์ของ Western Blot แสดงให้เห็นว่าโปรตีนรีคอมบิแนนท์ pET28a-OMP16-PEDVS และ pET28a-PEDVS ถูกแสดงออกในส่วนเหนือตะกอนของ BL21-pET28a OMP16-PEDVS และ BL21- สายพันธุ์ pET28a-PEDVS ตามลำดับ นอกจากนี้ โปรตีน pVE5523-OMP16-PEDVS ยังได้รับการตรวจสอบในส่วนลอยเหนือตะกอนทางวัฒนธรรมของสายพันธุ์ L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS แถบเฉพาะจากรูปที่ 2 แสดงให้เห็นว่าโปรตีนรีคอมบิแนนท์ pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS และ pET28a-PEDVS ได้รับการเก็บเกี่ยวได้สำเร็จทั้งหมด (รูปที่ 2)

รูปที่ 1 ผลการย่อยด้วยเอนไซม์ของรีคอมบิแนนท์พลาสมิด ตอบ: ผลการย่อยด้วยเอนไซม์ของพลาสมิด pVE5523-OMP16-PEDVS M: D8000 DNA แลดเดอร์มาร์กเกอร์; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS พลาสมิด B: ผลการย่อยด้วยเอนไซม์ของพลาสมิด pet28a-OMP16-PEDVS และ pET28a-PEDVS M: D8000 DNA แลดเดอร์มาร์กเกอร์; 1: pet28a-OMP16-PEDVS พลาสมิด; 2: พลาสมิดของ pET28a-PEDVS

ระดับแอนติบอดีของ IgG ในซีรั่มของหนูที่ได้รับการฉีดวัคซีนป้องกัน

เพื่อประเมินภูมิคุ้มกันจำเพาะของตัวเลือกวัคซีนที่สร้างขึ้น หนู BALB/c ถูกเลือกและแบ่งออกเป็น 5 กลุ่ม จากนั้นวัดระดับ IgG ในซีรั่มและ IgA ในอุจจาระด้วยชุดตรวจ ELISA เชิงพาณิชย์ ผลการวิจัยพบว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในระดับ IgG ในกลุ่มที่ได้รับวัคซีน และแทบไม่พบแอนติบอดี IgG ในหนูทุกตัวก่อนการสร้างภูมิคุ้มกัน อย่างไรก็ตาม พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในเวลาต่อมาหลังจากการฉีดวัคซีนครั้งแรก และระดับแอนติบอดี IgG ในซีรั่มที่ 28 วันสูงกว่าใน 14 วัน ในบรรดาหนูกลุ่ม 5 ตัว หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันด้วย L. casei-OMP16- PEDVS และ BL21-OMP16-PEDVS-F แสดงภูมิคุ้มกันที่คล้ายคลึงกันและสูงที่สุด ดังนั้น L. casei-OMP16- PEDVS และ BL21-OMP16-PEDVS-F สามารถสร้างภูมิคุ้มกันที่สูงที่สุด ตามมาด้วย BL21-OMP16- PEDVS และ BL21-PEDVS (รูปที่ 3)

คุณประโยชน์อาหารเสริม cistanche - เพิ่มภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ระดับแอนติบอดีของ IgA ในอุจจาระของหนูที่ได้รับวัคซีนป้องกัน

เพื่อประเมินภูมิคุ้มกันจำเพาะของผู้ที่ได้รับวัคซีน ได้มีการประเมินระดับของแอนติบอดี IgA ในอุจจาระของหนูด้วย ผลการวิจัยพบว่าไม่มีแอนติบอดีต่อต้าน PEDVS IgA พิเศษอยู่ก่อนการสร้างภูมิคุ้มกัน อย่างไรก็ตาม แอนติบอดี IgA จำนวนมากในอุจจาระของ L. casei-OMP16-PEDVS ที่สร้างภูมิคุ้มกันโรคในหนูเมาส์ BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS และ BL21-PEDVS จับกลุ่มหนูที่ 14 วันหลังการฉีดวัคซีน ใน 28 วันหลังการฉีดวัคซีน ระดับแอนติบอดี IgA ของหนูที่ได้รับวัคซีน L. casei-OMP16-PEDVS ไปถึงระดับสูงสุด ในขณะเดียวกัน ระดับแอนติบอดีของ IgA ในอีกสามกลุ่มไม่ได้เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด ดังนั้น วัคซีนตัวเลือก L. casei OMP16-PEDVS สามารถกระตุ้นระดับแอนติบอดีที่สูงขึ้นในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน เมื่อเทียบกับ BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS และ BL21- PEDVS หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 4)

รูปที่ 2 การตรวจสอบโปรตีนการแสดงออกรีคอมบิแนนท์ M: เครื่องหมายโปรตีน; 1: โปรตีนที่หลั่งออกมาในรูปแบบรีคอมบิแนนท์ L. casei สายพันธุ์ pVE5523-OMP16-PEDVS; 2: โปรตีนบริสุทธิ์จากสายพันธุ์ BL21- pET28a-OMP16-PEDVS 3: โปรตีนบริสุทธิ์จากสายพันธุ์ BL21-pET28a-PEDVS

ระดับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของซีรั่มในหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน

เพื่อประเมินผลการป้องกันของวัคซีนตัวเลือกของ L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS และ BL21-PEDVS ในหนูเมาส์ มีการวัดระดับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง ผลการศึกษาพบว่าไม่มีการตรวจพบแอนติบอดีที่เป็นกลางก่อนที่จะได้รับวัคซีน ตรวจพบแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่ 14 วันหลังการฉีดวัคซีน และเพิ่มขึ้นที่ 14 วันหลังการฉีดวัคซีนกระตุ้น การตอบสนองของแอนติบอดีในหนูที่ได้รับ L. casei-OMP16-PEDVS มีฤทธิ์ต่อต้าน PEDV ที่รุนแรงกว่าในหนูที่รับประทานด้วย BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS และ BL21-PEDVS ดังนั้น วัคซีนตัวเลือก L. casei OMP16-PEDVS สามารถกระตุ้นระดับแอนติบอดีที่เป็นกลางสูงสุด ตามด้วย BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS และ BL21-PEDVS (รูปที่ 5)

ระดับไซโตไคน์

เพื่อเปรียบเทียบระดับการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ของ L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS และหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน BL21-PEDVS, IL- 4, IL-10 และ IFN- ถูกกำหนดหาตามลำดับ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าระดับของไซโตไคน์ IL-4, IL-10 และ IFN- ในซีรั่มของหนูล้วนต่ำมาก และไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญก่อนการสร้างภูมิคุ้มกัน ในขณะที่มีการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกันในผลลัพธ์ของ IL-4, IL-10 และ IFN- ที่ 14 วันหลังการฉีดวัคซีน ระดับของ IL-4, IL-10 และ IFN- ใน L. casei-OMP16-PEDVS หนูที่ได้รับวัคซีนสูงกว่า BL21- OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS และ BL21-PEDVS หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน ที่ 14 วันหลังการฉีดวัคซีนกระตุ้น ระดับ IL-4, IL-10 และ IFN- ที่สูงขึ้นใน L. casei-OMP16- หนูที่ได้รับภูมิคุ้มกัน PEDVS ถูกตรวจพบเมื่อเปรียบเทียบกับหนูอื่นๆ สามกลุ่ม ดังนั้น วัคซีนตัวเลือก L. casei-OMP16-PEDVS สามารถกระตุ้นระดับ IL-4, IL-10 และ IFN- สูงสุด ตามด้วย BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS และ BL21-PEDVS (รูปที่ 6)

รูปที่ 3 ระดับแอนติบอดี IgG ของวัคซีนตัวเลือกในซีรั่มของหนูที่ได้รับวัคซีน เซรั่มถูกรวบรวมในวันที่ 0, 14 และ 28 วันก่อนหรือหลังการสร้างภูมิคุ้มกันที่ตรวจโดยใช้ชุด ELISA เชิงพาณิชย์ และวัดที่ค่าการดูดกลืนแสง 450 นาโนเมตร แท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองอิสระสามครั้ง * p < 0.05, ** p < 0.01 และ **** p < 0.0001 แสดงถึงระดับที่เพิ่มขึ้นของความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ ตามลำดับ และ ns หมายถึงไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ

การอภิปราย

การระบาดครั้งใหญ่ของ PED ซึ่งเกิดจากสายพันธุ์ PEDV เกิดขึ้นในเดือนตุลาคม พ.ศ. 2553 ซึ่งส่งผลให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างมหาศาลในจีนและทั่วโลก [1] อย่างไรก็ตาม วัคซีนแบบดั้งเดิมทั้งหมดได้รับการออกแบบโดยใช้สายพันธุ์คลาสสิก CV777 ซึ่งไม่สามารถให้การป้องกันที่เพียงพอสำหรับสายพันธุ์ PEDV [4] เพื่อควบคุมการแพร่กระจายของ PEDV และลดการสูญเสียทางเศรษฐกิจ จึงมีการออกแบบวัคซีนใหม่ของสายพันธุ์ PEDV ด้วยเช่นกัน ปัจจุบัน วัคซีนเชื้อตาย PEDV และวัคซีนเชื้ออ่อนฤทธิ์ของสายพันธุ์ PEDV ล้วนได้รับการอนุมัติจากรัฐบาลจีน และล้วนมีแนวโน้มมีแนวโน้มในการควบคุม PED แต่ข้อบกพร่องก็มีอยู่ในวัคซีนชนิดใหม่ทั้งสองประเภทเช่นกัน PEDV ติดเชื้อในสุกรผ่านทางเดินอาหารและมีเนื้อเยื่อในลำไส้ tropism ดังนั้นภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือกจึงมีประสิทธิภาพมากกว่าภูมิคุ้มกันทั่วร่างกายในการป้องกัน PEDV เข้าสู่เซลล์เยื่อบุในลำไส้ และวัคซีนจะต้องให้การป้องกันเยื่อเมือกในลำไส้อย่างมีประสิทธิภาพ ดังนั้น ในการศึกษานี้ เราสร้างวัคซีนชนิดใหม่ที่สามารถกระตุ้นแอนติบอดี IgG และ IgA ที่จำเพาะต่อ PEDV ที่แข็งแกร่งยิ่งขึ้น Lactobacillus casei มีคุณสมบัติในการปรับภูมิคุ้มกันที่มีศักยภาพเป็นพาหะนำส่งวัคซีน และการแสดงออกของสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพบนผนังเซลล์ของแบคทีเรียนี้สามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เหมาะสม [28, 29] มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการแสดงแอนติเจนเฮเทอรอล ogous หลายชนิดของไวรัส papillomavirus ของมนุษย์ Streptococcus pneumonia และ Escherichia coli เป็นวัคซีนในสัตว์ทดลอง ซึ่งล้วนแสดงภูมิคุ้มกันที่ดีเยี่ยม [7–9] เมื่อเปรียบเทียบกับวัคซีนเชื้อตายและวัคซีนชนิดลดทอน วัคซีนเวกเตอร์ Lactobacillus casei ยังสามารถกระตุ้นระดับ IgA ที่สูงขึ้นและการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของเซลล์ได้ การศึกษาพบว่าแนวป้องกันแรกของ IgA ในลำไส้จะดีกว่า IgG ในการปกป้องลูกสุกรจากการติดเชื้อ PEDV [10, 30] ดังนั้นจึงมีแนวโน้มที่จะพัฒนาวัคซีนเวกเตอร์ Lactobacillus casei ชนิดหนึ่งของ PED จากรายงานดังกล่าว S โปรตีนของ PEDV สามารถแบ่งออกเป็นโดเมน S1 (กรดอะมิโน 1–735) และ S2 (736-กรดอะมิโนตัวสุดท้าย) [13] และโปรตีน S1 รวมถึงบริเวณที่จับตัวรับและ เอพิโทปที่ทำให้เป็นกลางหลัก [14] core neutralizing epitope (COE) สามารถกระตุ้นให้เกิดแอนติบอดีที่เป็นกลางต่อ PEDV ได้ [31, 32] เมื่อรวมกับการวิเคราะห์แอนติเจนแล้ว ลำดับบางส่วนของยีน S1 (1477–2124 bp) ได้รับเลือกเพื่อสร้างพลาสมิดชนิดรีคอมบิแนนท์ ชิ้นส่วนขนาดเล็กที่เลือกได้รับการพิสูจน์แล้วว่าไม่เพียงแต่มีภูมิคุ้มกันที่ดีเท่านั้น แต่ยังมีส่วนช่วยในการหลั่งแลคโตบาซิลลัส คาเซอิอีกด้วย ในทางกลับกัน Pasquevich พบว่า Brucella abortus โปรตีนเมมเบรนชั้นนอก 16 สามารถกระตุ้นเซลล์ dendritic ในร่างกาย กระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกัน th1 และเป็นวัคซีนเสริมด้วยตนเองที่น่ามีแนวโน้มในการต่อต้านโรคแท้งติดต่อที่ได้มาทั้งทางระบบและทางปาก [15] การวิจัยที่คล้ายกันว่าโปรตีนเมมเบรนชั้นนอกที่ไม่มีไขมัน omp16 จาก Brucella spp. เนื่องจากสารเสริมจมูกสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ th1 และปรับการตอบสนองต่อการแพ้ของโปรตีนในนมวัวของ th2 ก็ได้รับการพิสูจน์เช่นกัน [16] ดังนั้นจึงเลือกลำดับบางส่วนของยีน omp16 เพื่อสร้างพลาสมิดรีคอมบิแนนท์เพื่อปรับปรุงการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันในการศึกษาของเรา หากต้องการทราบว่าวัคซีน Lactobacillus casei ชนิดใหม่ที่แนะนำสามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายได้หรือไม่ จึงทำการวัดระดับ IgG, IgA และแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง ระดับแอนติบอดี IgG ของหนูที่ได้รับวัคซีนชนิดรีคอมบิแนนท์ L. casei-OMP16- PEDVS ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญกับหนูที่ได้รับวัคซีนชนิดรีคอมบิแนนท์ BL21-OMP16-PEDVS-F อย่างไรก็ตาม ระดับ IgA และแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางนั้นสูงกว่าระดับใน BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S และ BL{{47 }}หนูที่ได้รับวัคซีนลูกผสม PEDVS ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า L. casei-OMP16-PEDVS สามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายได้ดีขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งระดับแอนติบอดี IgA การศึกษาพบว่า IgA เป็นแนวป้องกันด่านแรกในลำไส้และจะดีกว่า IgG ในการปกป้องลูกสุกรจากการติดเชื้อ PEDV [30] การวิจัยยังยืนยันผลลัพธ์ด้วยว่าวัคซีนรีคอมบิแนนท์ของ L. casei-OMP16-PEDVS สามารถให้การป้องกันทางภูมิคุ้มกันแก่ PEDV ได้ดีขึ้น เพื่อสำรวจประเภทของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกิดจากรีคอมบิแนนท์ L. casei-OMP16-PEDVS ระดับของ IL-4, IL-10 และ IFN- ถูกตรวจพบเพื่อประเมินการทำงานของ T เซลล์เม็ดเลือดขาว ตามรายงาน IFN- มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองภูมิคุ้มกันของเซลล์ที่เกิดขึ้นเมื่อเชื้อโรคบุกรุกร่างกาย IL-4 มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองภูมิคุ้มกันของร่างกาย และส่งเสริมความทนทานต่อภูมิคุ้มกันและภูมิคุ้มกันของเยื่อเมือก [33], IL -10 มีบทบาทสำคัญในการต่อสู้กับการติดเชื้อจุลินทรีย์ในเยื่อเมือกและรักษาความสมบูรณ์ของเยื่อเมือกภายในลำไส้ [34] ในขณะเดียวกัน ผลลัพธ์ของการตรวจพบไซโตไคน์แสดงให้เห็นว่าหนูที่ได้รับวัคซีนรีคอมบิแนนท์ L. casei-OMP16-PEDVS สามารถกระตุ้นการแสดงออกของ IL-4, IL-10 และ IFN- ได้ดีขึ้น ซึ่ง สนับสนุนผลลัพธ์ที่วัคซีนรีคอมบิแนนท์ของ L. casei-OMP16-PEDVS สามารถกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกาย ระดับแอนติบอดี IgA และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ได้ดีขึ้น ตามลำดับ

รูปที่ 5 ระดับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของวัคซีนที่อยู่ในซีรั่มของหนูที่ได้รับวัคซีน ซีรั่มถูกรวบรวมในวันที่ 0, 14 และ 28 วันก่อนหรือหลังการสร้างภูมิคุ้มกัน และตรวจสอบผ่านการทดสอบการทำให้เป็นกลาง แท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองอิสระสามครั้ง * p < 0.05, ** p < 0.01 และ **** p < 0.0001 แสดงถึงระดับที่เพิ่มขึ้นของความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ ตามลำดับ และ ns หมายถึง ไม่มีนัยสำคัญ ความแตกต่าง

รูปที่ 6 การตรวจหาระดับไซโตไคน์จากซีรัมของหนูที่ได้รับวัคซีน เซรั่มถูกเก็บในวันที่ 0, 14 และ 28 วันก่อนหรือหลังการฉีดวัคซีน และตรวจสอบผ่านชุดอุปกรณ์ ELISA ที่มีจำหน่ายทั่วไป ค่าการดูดกลืนแสงถูกวัดที่ค่าการดูดกลืนแสง 450 นาโนเมตรสำหรับ IL-4 (a), IL-10 (b) และ IFN- (c) ตามลำดับ แท่งแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของการทดลองอิสระสามครั้ง * p < {{10}}.05, ** p < 0.01 และ **** p < 0.0001 แสดงถึงระดับที่เพิ่มขึ้นของความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ ตามลำดับ

บทสรุป

โดยสรุป L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS และ BL{{7 }}วัคซีนผู้สมัคร PEDVS ถูกสร้างขึ้นในการศึกษานี้ ในขณะเดียวกัน การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายและระดับการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของเซลล์ของวัคซีนตัวเลือกเหล่านี้ในหนูได้รับการประเมิน ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าหนูที่ได้รับวัคซีน L. casei-OMP16-PEDVS สามารถสร้าง IgG, IgA, แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง, IL-4, IL- 10 และ INF- ในระดับที่สูงกว่า เมื่อเปรียบเทียบกับ หนูที่ได้รับวัคซีน BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS และ BL21-PEDVS ดังนั้น วัคซีนชนิดรีคอมบิแนนท์ L. casei OMP16-PEDVS อาจปูพื้นฐานสำหรับการพัฒนาวัคซีนรีคอมบิแนนท์เยื่อเมือกที่ปลอดภัย มีประสิทธิภาพ และสะดวกสบายสำหรับการป้องกันการติดเชื้อ PEDV

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

อ้างอิง

1. Wang D, Fang L, S X. โรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในประเทศจีน ไวรัส Res 2559; 226:7–13.

2. ซูเอโยชิ เอ็ม, ซึดะ ที, ยามาซากิ เค, โยชิดะ เค, นาคาซาวะ เอ็ม, ซาโต เค และคณะ การตรวจสอบทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของโรคท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร เจคอมพ์พาทอล. 1995;113(1):59–67.

3. ซัน RQ, Cai RJ, เฉิน YQ, เหลียง PS, ซ่ง CXJEID การระบาดของโรคท้องร่วงในสุกรในลูกสุกรดูดนม ประเทศจีน โรคติดเชื้ออุบัติใหม่ 2555; 18(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. การพัฒนาวัคซีนลดทอนแบบผสมผสานเพื่อป้องกันไวรัสกระเพาะและลำไส้อักเสบที่ติดต่อได้และไวรัสโรคท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร Chin J Prev สัตวแพทย์ Med 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, เลียร์ RJ, Boersma WJ ศักยภาพของแลคโตบาซิลลัสในฐานะพาหะในการสร้างภูมิคุ้มกันในช่องปาก: การพัฒนาและลักษณะเบื้องต้นของระบบเวกเตอร์สำหรับการส่งแอนติเจนเป้าหมาย เจ ไบโอเทคโนล 1996;44(1–3):183.

6. ไช่ YT, เฉิงพีซี, แพน TM เทคโนโลยีชีวภาพ: ผลกระตุ้นภูมิคุ้มกันของแบคทีเรียกรดแลคติคเพื่อปรับปรุงการทำงานและประโยชน์ของระบบภูมิคุ้มกัน แอปเพิล ไมโครไบโอล ไบโอเทคโนล 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันในช่องปากด้วยวัคซีน Lactobacillus casei ที่แสดง human papillomavirus (HPV) type 16 E7 เป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพในการกระตุ้นเซลล์เม็ดเลือดขาวที่เป็นพิษต่อเซลล์เยื่อเมือกเพื่อต่อต้าน HPV16 E7 วัคซีน. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Areas APM และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันทางจมูกของหนูด้วย Lactobacillus casei ที่แสดง Pneumococcal Surface Protein A: การเหนี่ยวนำของแอนติบอดี การสะสมเสริม และการป้องกันบางส่วนต่อความท้าทายของ Streptococcus pneumoniae จุลินทรีย์ติดเชื้อ 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยสายพันธุ์ recombinant Lactobacillus casei ที่สร้าง K99 และโปรตีน fimbrial K88 ช่วยปกป้องหนูจาก Escherichia coli ที่เข้าสู่ลำไส้ วัคซีน. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K และคณะ การสร้างสายพันธุ์แลคโตค็อกคัส แลคติสชนิดรีคอมบิแนนท์ซึ่งแสดงยีน S1 ของไวรัสท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร และการวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันในหนู ไวรัสอิมมูนอล 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. การสร้างภูมิคุ้มกันในช่องปากด้วยวัคซีนป้องกันโรคท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร (PEDV) ที่ใช้ Lactobacillus casei ซึ่งแสดงเปปไทด์ Co1 ที่กำหนดเป้าหมายเซลล์แบบ microfold ผสมกับแอนติเจน COE ของ PEDV เจ แอพเพิล ไมโครไบโอล 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, HL. การวิเคราะห์ลำดับของจีโนมไวรัสโรคท้องร่วงในสุกรระหว่างยีนนิวคลีโอแคปซิดและโปรตีนขัดขวางเผยให้เห็น polymorphic ORF ไวรัสวิทยา 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. ความหลากหลายในยีนโปรตีนขัดขวางของไวรัสโรคท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกรที่แยกได้ในเกาหลี ไวรัส Res 2010;149(2): 175–82.

14. ซัน DB, เฟิง แอล, ชิ HY, เฉิน เจเอฟ, หลิว SW, เฉิน HY และอื่นๆ บริเวณโปรตีนขัดขวาง (aa 636789) ของไวรัสโรคท้องร่วงจากการแพร่ระบาดของสุกรเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการเหนี่ยวนำแอนติบอดีที่เป็นกลาง แอกต้า วิโรล. 2550;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, และคณะ มอยอิตีโปรตีนของโปรตีนเมมเบรนด้านนอกของ Brucella abortus 16 เป็นรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อโรคจากแบคทีเรียแบบใหม่ที่กระตุ้นเซลล์เดนไดรต์ ในร่างกาย ชักนำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ Th1 และเป็นวัคซีนเสริมด้วยตนเองที่น่ามีแนวโน้มจะป้องกันโรคบรูเซลโลซิสที่ได้มาทั้งทางระบบและทางปาก เจ อิมมูนอล. 2010;184(9):5200.

16. ไอบาเนซ เออี, สมัลดินี่ พี, โคเรีย แอลเอ็ม, เดลปิโน เอ็มวี, ปาซิฟิโก แอลจีจี, โอลิเวร่า เอสซี, และคณะ โปรตีนเมมเบรนชั้นนอกที่ไม่เป็นของเหลว Omp16 (U-Omp16) จาก Brucella spp. เนื่องจากสารเสริมจมูกกระตุ้นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ Th1 และปรับการตอบสนองต่อการแพ้ของ Th2 ต่อโปรตีนนมวัว กรุณาหนึ่ง 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, และคณะ ภูมิคุ้มกัน: การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยโปรตีนเมมเบรนด้านนอกของสายพันธุ์ Brucella ชนิดรีคอมบิแนนท์ Omp16 หรือ Omp19 ในสารเสริมจะกระตุ้นให้เกิด CD4+ และ CD8+ ทีเซลล์ที่จำเพาะ เช่นเดียวกับการป้องกันทั้งระบบและในช่องปากต่อการติดเชื้อ Brucella abortus ติดเชื้อภูมิคุ้มกัน 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W และคณะ วัคซีนแลคโตบาซิลลัสชนิดรีคอมบิแนนท์ในช่องปากมุ่งเป้าไปที่เซลล์ไมโครพับในลำไส้และเซลล์เดนไดรต์เพื่อส่งอีพิโทปที่ทำให้เป็นกลางของไวรัสท้องร่วงจากโรคระบาดในสุกร โรงงานเซลล์จุลินทรีย์ 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. การแสดงออกที่แตกต่างกันและลักษณะทางชีวเคมีของไนเตรตแบบดูดซึมและไนไตรท์รีดักเตสเผยให้เห็นการปรับตัวและศักยภาพของ Bacillus megaterium NCT-2 ในดินที่มีความเค็มทุติยภูมิ อินท์ เจ ไบโอล แมคโครมอล 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, และคณะ Caerin1.1 ยับยั้งการเจริญเติบโตของไวรัสโรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในสุกร ในหลอดทดลอง โดยการจับกับไวรัสโดยตรง ไวรัส 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. เทคโนโลยีชีวภาพ: การแสดงลักษณะของ pMC11 ซึ่งเป็นพลาสมิดที่มีต้นกำเนิดของการจำลองแบบคู่ที่แยกได้จาก Lactobacillus casei MCJ และการสร้างเวกเตอร์กระสวยด้วยแต่ละแบบจำลอง แอปเพิล ไมโครไบโอล ไบโอเทคโนล 2014;98(13):5977.

22. เซียวนา ดับบลิว ลิ ดับบลิว ซูเว่ย เอช ซันติง เอ็ม เหม่ยหลิง วาย เหวิน เอส และคณะ การจัดส่งโปรไบโอติกทางปากแสดงเปปไทด์กำหนดเป้าหมายเซลล์ Dendritic ผสมกับไวรัสโรคท้องร่วงจากการแพร่ระบาดของสุกร COE Antigen: กลยุทธ์วัคซีนที่มีแนวโน้มต่อต้าน PEDV ไวรัส 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, และคณะ การสร้าง recombinant Lactobacillus casei ที่แสดงโปรตีน BVDV E2 และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในหนู เจ ไบโอเทคโนล 2018;270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, อุปกรณ์ B. การเพิ่มประสิทธิภาพของการแสดงออกและการทำให้บริสุทธิ์ของโดเมน recombinant S1 ของโปรตีน Spike ของไวรัสโรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในสุกร (PEDV- S1) ใน Escherichia coli เทคโนโลยีชีวภาพ อุปกรณ์เทคโนโลยีชีวภาพ 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, และคณะ โดเมนสิ่งที่แนบมากับเซลล์ของโปรตีนขัดขวางของไวรัสโรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในสุกรเป็นเป้าหมายสำคัญของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง เจ วิโรล. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, และคณะ การบริหารช่องปากของไมโครสเฟียร์ที่บรรจุ PEDV ที่เคลือบแล้วทำให้เกิดภูมิคุ้มกันจำเพาะ PEDV ในลูกสุกรหย่านม วัคซีน. 2019;09(014):161–6.

27 Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. ผลของไวรัสโรคท้องร่วงจากการแพร่ระบาดของสุกรต่อเซลล์ dendritic ที่ได้มาจากสุกร monocyte และเซลล์ dendritic ในลำไส้ สัตวแพทย์ไมโครไบโอล. 2016;106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. กิจกรรมกระตุ้นภูมิคุ้มกันและต้านการอักเสบที่เกิดจากการบริหารช่องปากของโปรไบโอติกสายพันธุ์แลคโตบาซิลลัส casei การอักเสบ 2549;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. การป้องกันพิษจากบาดทะยักหลังจากการบริหาร intragastric ของแบคทีเรียกรดแลคติคชนิดรีคอมบิแนนท์สองตัว: ผลกระทบของความมีชีวิตของสายพันธุ์และความคงอยู่ในร่างกาย วัคซีน. 2002;20(27–28):3304–9.

30. เพลง DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS และอื่นๆ ประสิทธิภาพทางปากของไวรัส DR13 สายพันธุ์ Vero Cell ที่ทำให้สุกรระบาดของโรคอุจจาระร่วง เรส เวท วิทย์. 2550;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, และคณะ โดเมน S1 ของโปรตีนขัดขวางไวรัสโรคอุจจาระร่วงในสุกรเป็นแอนติเจนของวัคซีน วิโรล เจ. 2016;13:1.

32. ช้าง SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW และคณะ เซลล์: การจำแนกบริเวณอีพิโทปที่สามารถกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางต่อไวรัสโรคอุจจาระร่วงจากโรคระบาดในสุกร โมล เซลล์. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, และคณะ การมีส่วนร่วมที่แตกต่างกันของ B7–1 และ B7–2 ต่อการพัฒนาเยื่อบุตาอักเสบจากภูมิแพ้จากการทดลองของ murine อิมมูนอล เลตต์. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y และคณะ IL-22 ยับยั้งการติดเชื้อของโคโรนาไวรัสในลำไส้และโรตาไวรัสในสุกรโดยการเปิดใช้งานเส้นทางสัญญาณ STAT3 แอนติไวรัสเรส 2017;142:68–75.