ผลประโยชน์ของเวอร์บาสโคไซด์จากสมุนไพร Cistanche

ติดต่อ : ออเดรย์ Hu Whatsapp / hp : 0086 13880143964 อีเมล์ :audrey.hu@wecistanche.com

เวอร์บาสโคไซด์ปกป้องหนูจากเนื้อตายเน่าของก๊าซ Clostridial โดยการยับยั้งการทํางานของอัลฟาท็อกซินและเพอร์ฟริงโกไลซินโอ

เนื้อตายเน่าก๊าซส่วนใหญ่เกิดจากแบคทีเรียแบบไม่ใช้ออกซิเจน Clostridium perfringens (C. perfringens) ทําให้เสียชีวิตภายใน 48 ชั่วโมงของการโจมตี มีกลยุทธ์การรักษาที่ จํากัด และเกี่ยวข้องกับอัตราการตายที่สูงมาก ทั้ง C. perfringens alpha-toxin (CPA) และ perfringolysin O (PFO) เป็นปัจจัยความรุนแรงที่สําคัญในการพัฒนาเนื้อตายเน่าก๊าซซึ่งบ่งชี้ว่าเป็นเป้าหมายในการรักษา ที่นี่เราพบว่าเวอร์บาสโคไซด์, กฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์กระจายอย่างกว้างขวางใน ยาสมุนไพรจีน Cistancheสามารถยับยั้งกิจกรรมทางชีวภาพของทั้ง CPA และ PFO ได้อย่างมีประสิทธิภาพในการทดสอบ hemolytic

การโอลิโกเมอไรเซชันของ PFO ถูกยับยั้งอย่างน่าทึ่งโดย verbascoside แม้ว่าจะไม่พบกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียเวอร์บาสโคไซด์การรักษาป้องกันเซลล์ Caco-2 จากความเสียหายที่เกิดจาก CPA และ PFO นอกจากนี้หนูที่ติดเชื้อยังรักษาด้วยเวอร์บาสโคไซด์แสดงให้เห็นอย่างมีนัยสําคัญบรรเทาความเสียหาย,ลดภาระแบคทีเรียและอัตราการตายลดลง. โดยสรุปแล้วverbascoside มีผลการรักษาที่มีประสิทธิภาพต่อความรุนแรงของ C. perfringens ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกายโดยกําหนดเป้าหมาย CPA และ PFO ไปพร้อมๆ กัน ผลลัพธ์ของเราให้กลยุทธ์ที่มีแนวโน้มและสารประกอบตะกั่วที่เป็นไปได้สําหรับการติดเชื้อ C. perfringens โดยเฉพาะเนื้อตายเน่าก๊าซ

คําสําคัญ: อัลฟา-ท็อกซิน, ป้องกันการติดเชื้อ, คลอสตริเดียมเพอร์ฟรินเจน, เนื้อตายเน่าแก๊ส, เพอร์ฟริงโกไลซิน O, เวอร์บาสโคไซด์

Clostridium perfringens (C. perfringens) เป็นแบคทีเรียแบบไม่ใช้ออกซิเจนแกรมบวกที่มีการกระจายอย่างกว้างขวางในธรรมชาติและในลําไส้ของมนุษย์ (Fraser and Collee, 1975) C. perfringens สามารถหลั่งสารพิษหลักสี่ชนิด (α, β, ε และ Ì) และแบ่งออกเป็นห้า serotypes, A–E (Titball, 2005) ในมนุษย์ C. perfringens สามารถทําให้เกิดโรคต่าง ๆ เช่นอาหารเป็นพิษและเนื้อตายเน่าก๊าซซึ่งหลังสามารถเกิดขึ้นได้ในสัตว์เช่นแมววัวควายสุนัขแกะม้าและแพะ (Verherstraeten et al., 2015) ระยะฟักตัวของเนื้อตายเน่าก๊าซนั้นสั้นและการติดเชื้อสามารถเกิดขึ้นได้ภายใน 6-8 ชั่วโมง (Uzal et al., 2015) ที่ร้ายแรงกว่านั้นมากกว่า 50% ของผู้ติดเชื้อจะยังคงพัฒนาโรคโลหิตเป็นพิษอย่างเป็นระบบต่อไปซึ่งนําไปสู่ความตายในที่สุด ดังนั้นหากไม่มีการบริหารการรักษาอย่างทันท่วงทีและมีประสิทธิภาพเนื้อตายเน่าก๊าซอาจนําไปสู่ความสูญเสียทางเศรษฐกิจที่ร้ายแรง (Low et al., 2018) อย่างไรก็ตามการรักษาตามปกติเช่นการรักษาด้วยยาปฏิชีวนะและการผ่าตัดรักษาเนื้อตายเน่าทั้งหมดมีข้อเสียบางประการรวมถึง แต่ไม่ จํากัด เพียงการดื้อยาปฏิชีวนะและการบาดเจ็บจากการตัดแขนขาให้กับผู้ป่วย (Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et al., 2010; Park et ออสมานและเอลฮารีรี, 2013). ดังนั้นจึงจําเป็นต้องหาวิธีการหรือแนวคิดใหม่ ๆ สําหรับการรักษาเนื้อตายเน่าก๊าซ

เนื้อตายเน่าก๊าซ Clostridial เป็นโรคติดเชื้อที่สําคัญซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากการทํางานร่วมกันของสารพิษ C. perfringens (CPA) และ perfringolysin O (PFO) (Hifumi et al., 2018) CPA ซึ่งเป็นตระกูลของเอนไซม์สังกะสี -Metallo phospholipase ของแบคทีเรียผลิตโดย C. perfringens ทั้งหมดถูกเข้ารหัสโดยโครโมโซมเป็นสารพิษที่สําคัญใน C. perfringens และจัดแสดงทั้งฟอสโฟไลเปส C และ sphingomyelinase กิจกรรม (van Bunderen et al., 2010; 2010) Masataka et al., 2015). ในปี 1990 Awad et al. (1995) ใช้การกลายพันธุ์ของ CPA เพื่อทดสอบแบบจําลองเมาส์แบบใช้แก๊สเนื้อตายเน่าและพบว่าสายพันธุ์ที่ขาดยีน CPA แสดงให้เห็นว่าการก่อโรคลดลงและความเสียหายของเนื้อเยื่อน้อยลงหลังจากการติดเชื้อ งานนี้ยืนยันว่า CPA เป็นสารพิษที่สําคัญในเนื้อตายเน่าก๊าซ ในปี 2000 อัลเบอร์โตได้ทําการศึกษาเชิงลึกโดยการสร้างแบบจําลองระดับโมเลกุลของการกลายพันธุ์ของสารพิษและสามลูปในโดเมน C-terminal และกิจกรรม hemolytic และความเป็นพิษต่อเซลล์ของกลายพันธุ์ลดลงเมื่อเทียบกับชนิดป่า มันแสดงให้เห็นว่ากิจกรรม sphingomyelinase และโดเมน C-terminal มีความจําเป็นสําหรับความเป็นพิษของกล้ามเนื้อในร่างกาย (Alape-Giron et al., 2000) PFO ซึ่งเป็นไซโตไลซินที่ขึ้นกับคอเลสเตอรอล (CDC) ทําปฏิกิริยากับเยื่อหุ้มเซลล์เป็นโมโนเมอร์และคอมเพล็กซ์ที่เตรียมไว้จะถูกแทรกเข้าไปในเยื่อหุ้มเซลล์ bilayer โดย oligomerization ในที่สุดก็ไลซิ่งเซลล์โฮสต์ (Johnson and Heuck, 2014) แม้ว่า PFO ไม่จําเป็นสําหรับการเสียชีวิต แต่ก็อาจทําให้เกิดพิษต่อเซลล์แมคโครฟาจในระยะแรกของ myonecrosis และมีความสําคัญต่อการก่อตัวของลิ่มเลือดอุดตันในช่วงปลายของการติดเชื้อซึ่งก่อให้เกิดการเกิดโรคของเนื้อตายเน่าของก๊าซ (Verherstraeten et al., 2015) CPA สามารถรวมกับ PFO เพื่อทําลายนิวโทรฟิลที่สะสมอยู่ในบริเวณที่ติดเชื้อและก่อให้เกิดความผิดปกติของเซลล์บุผนังหลอดเลือดอาการบวมน้ําและขาดเลือดในที่สุดก็นําไปสู่การขาดออกซิเจนของเนื้อเยื่อและให้สภาพแวดล้อมแบบไม่ใช้ออกซิเจนที่เอื้ออํานวยต่อการเจริญเติบโตและการสืบพันธุ์ของ C. perfringens (Bryant and Stevens, 1996) ดังนั้นการศึกษานี้จึงมุ่งเป้าไปที่ CPA และ PFO และมีจุดมุ่งหมายเพื่อเปิดเผยวิธีการใหม่ในการรักษาเนื้อตายเน่าของก๊าซ

ในการศึกษานี้สารยับยั้งสารพิษสองชนิดได้รับการตรวจคัดกรองจากสารประกอบธรรมชาติ 17 ชนิดโดยการฟอกเลือดเพื่อค้นหาสารยับยั้งเนื้อตายเน่าของก๊าซที่อาจเกิดขึ้น ข้อมูล hemolytic สําหรับสารประกอบต่าง ๆ แสดงไว้ในตารางที่ 1 ในบรรดาสารประกอบธรรมชาติ 17 ชนิด verbascoside มีฤทธิ์ยับยั้งสารพิษทั้งสองได้ดีที่สุด ดังนั้นเราจึงเลือก verbascoside เป็นสารประกอบเป้าหมายสําหรับการศึกษานี้ เวอร์บาสโคไซด์มีการกระจายอย่างกว้างขวางในสมุนไพรสมุนไพรจีนต่างๆเช่น cistanche และถูกแยกออกและสกัดจากเวอร์บาสโคไซด์โดยนักวิทยาศาสตร์ชาวอิตาลีในปี 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). การศึกษาแสดงให้เห็นว่าเวอร์บาสโคไซด์มีผลทางชีวภาพและเภสัชวิทยามากมายเช่นคุณสมบัติต้านการอักเสบ, สารต้านอนุมูลอิสระ, ต้านเชื้อแบคทีเรีย, ยาต้านเชื้อรา, เชื้อราและคีเลชั่นและสามารถใช้ในเครื่องสําอางบํารุงผิวและการเตรียมการเฉพาะที่รายงานอื่น ๆ ได้แสดงให้เห็นว่า verbascoside สามารถดูดซึมได้อย่างเต็มที่ภายใน 1 ชั่วโมงและมีความเข้มข้นของเลือดสูงและการดูดซึมในการจัดส่งผ่านวิธีการฉีดต่างๆไม่เกิน 25% (Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai et al., 2017; Dai Feng et al., 2018). จากกิจกรรมทางเภสัชวิทยาดังกล่าวการศึกษานี้พบและศึกษาการยับยั้งผลกระทบของเวอร์บาสโคไซด์ในเนื้อตายเน่าก๊าซผ่านชุดของการทดลองในหลอดทดลองและในร่างกาย

เวอร์บาสโคไซด์ยับยั้งกิจกรรม Hemolytic ของ PFO และ CPA

มีรายงานว่าฟลาโวนอยด์บางชนิดเป็นสารยับยั้งที่มีประสิทธิภาพต่อสารพิษที่สร้างรูขุมขน (Li et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., 2013; Li et al., วังและคณะ, 2017; โจวและคณะ, 2560). ที่นี่พบว่า verbascoside ซึ่งเป็นฟีนิลโพรพานอยด์สามารถยับยั้งกิจกรรม hemolytic ของสารพิษ PFO และ CPA ที่หลั่งออกมาจาก C. perfringens เมื่อความเข้มข้นของ verbascoside อยู่ในช่วง 2 ถึง 32 |ig / mL การรักษาด้วย verbascoside ยับยั้งกิจกรรม hemolytic ของสารพิษเหล่านี้อย่างมีนัยสําคัญในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับขนาดยาซึ่งบ่งชี้ว่า verbascoside เป็นตัวยับยั้งที่มีประสิทธิภาพของทั้ง PFO และ CPA

เวอร์บาสโคไซด์ไม่ส่งผลกระทบต่อการเติบโตของ C. perfringens

นอกจากนี้เรายังทําการศึกษา MIC และเส้นโค้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียเพื่อตรวจสอบกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของ verbascoside กับ C. perfringens โดยเปิดเผยผลการทดสอบ MIC (รูปที่ 2A) >256 |ig / mL ในทํานองเดียวกันผลเส้นโค้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย (รูปที่ 2B) บ่งชี้ว่า verbascoside ไม่ส่งผลกระทบต่อการเจริญเติบโตตามปกติของแบคทีเรีย ผลลัพธ์ของเราร่วมกันบ่งชี้ว่าการรักษาด้วยคําต่อคําไม่มีอิทธิพลต่อความมีชีวิตของ C. perfringens ที่ความเข้มข้นที่จําเป็นสําหรับการยับยั้งกิจกรรม PFO และ CPA

เวอร์บาสโคไซด์ปกป้องเซลล์จากความเสียหายที่เกิดจาก PFO หรือ CPA

Clostridium perfringens alpha-toxins และ PFO ใน C. perfringens เป็นสารพิษหลักที่ทําให้เกิดเนื้อตายเน่าของก๊าซ ดังนั้น, ไม่ว่า verbascoside สามารถปกป้องเซลล์จากสารพิษทั้งสองนี้ยังถูกตรวจสอบ. ก่อนอื่นเราทําการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ด้วยยา verbascoside ซึ่งไม่ทําลายเซลล์ (รูปที่ 3A) จากนั้นสารประกอบนี้ถูกเพิ่มเข้าไปในระบบการเพาะเลี้ยงร่วมของเซลล์และ PFO หรือ CPA Vเออร์บาสโคไซด์ยับยั้งความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารพิษทั้งสองนี้ในเซลล์ Caco-2 เมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่ได้รับการรักษาด้วย verbascoside ความเสียหายที่เกิดจากสารพิษต่อเซลล์ Caco-2 ที่ได้รับการรักษาด้วย verbascoside ที่ 0.5 Jig / mL ลดลงอย่างมีนัยสําคัญในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับขนาดยา โดยเฉพาะอย่างยิ่งสําหรับโปรตีน PFO เซลล์ได้รับการปกป้องอย่างมีประสิทธิภาพที่ความเข้มข้นของยา 0.25 ig/ mL (P< 0.05).="" a="" subsequent="" cell="" viability/death="" assay="" (figures="" 3d-k)="" was="" further="" employed="" to="" prove="" this="" protective="" effect.="" as="" expected,="" verbascoside="" treatment="" visibly="" protected="" against="" cell="" injury="" induced="" by="" pfo="" or="" cpa.="" taken="" together,="" our="" results="" established="" that="" verbascoside="" significantly="" inhibits="" the="" cell="" damage="" induced="" by="" pfo="" or="" cpa="" in="" a="" dose-dependent="">

เวอร์บาสโคไซด์ยับยั้งกิจกรรม Hemolytic PFO โดยการลด Oligomerization ของมัน

กิจกรรม hemolytic ของ PFO จะต้องมาพร้อมกับการเกิดขึ้นของ oligomerization และการก่อตัวของรูขุมขน (Johnson and Heuck, 2014) ที่นี่ oligomerization ของ PFO เกิดจาก KCl และเลือดกระต่ายและตรวจพบ oligomerization PFO (รูปที่ 4) เผยให้เห็นความเข้มของแถบ oligomerization ลดลงเมื่อความเข้มข้นของ verbascoside เพิ่มขึ้น ผลการวิจัยของเราร่วมกันชี้ให้เห็นว่าการรักษาด้วย verbascoside ยับยั้ง oligomerization ของ PFO และลดกิจกรรม hemolytic ของสารพิษนี้

เวอร์บาสโคไซด์ปกป้องหนูจากการติดเชื้อ C. perfringens

แบบจําลองกล้ามเนื้อขาของเนื้อตายเน่าของเมาส์ถูกสร้างขึ้นเพื่อตรวจสอบว่าการป้องกันที่สังเกตได้ในหลอดทดลองสามารถสังเกตได้ในร่างกายหรือไม่ ขาของหนูที่ติดเชื้อ ATCC13124 ในทางตรงกันข้ามจํานวนเซลล์อักเสบในกลุ่มยาลดลงอย่างมีนัยสําคัญและเนื้อเยื่อไม่บุบสลายหลังจากการรักษาด้วยคําต่อคํา นอกจากนี้จํานวนแบคทีเรียที่ฝังรากอยู่ในกล้ามเนื้อขาก็ลดลงอย่างมีนัยสําคัญหลังการรักษาด้วยเวอร์บาสโคไซด์ ดังแสดงในผลการทดลอง 93.33% ของหนูที่ติดเชื้อเสียชีวิตภายใน 32 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ตามที่คาดไว้อัตราการรอดชีวิตของหนูที่ได้รับ verbascoside เพิ่มขึ้น 33.33% เนื่องจากมีเพียง 60% ของหนูที่ติดเชื้อที่เสียชีวิต (P = 0.015 โดยการทดสอบอันดับบันทึก) นอกจากนี้ การรักษาด้วย verbascoside ยังชะลอระยะเวลาการเสียชีวิตสูงสุดเกือบ 8 ชั่วโมง (จาก 32 ชั่วโมงสําหรับหนูที่ติดเชื้อ ATCC 13124 เป็น 40 ชั่วโมงสําหรับหนูที่ได้รับการรักษาด้วยคําต่อคํา) และสามารถขยายเวลาอันมีค่าที่จําเป็นสําหรับการช่วยเหลือทางคลินิกได้ เมื่อนํามารวมกันผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าในหนู verbascoside สามารถให้การป้องกันที่มีประสิทธิภาพอย่างเป็นระบบต่อการเน่าเปื่อยของก๊าซที่เกิดจาก C. perfringens

ในฐานะที่เป็นแบคทีเรียแบบไม่ใช้ออกซิเจนแกรมบวก C. perfringens มีการกระจายอย่างกว้างขวางในธรรมชาติและสามารถหลั่งสารพิษหลายชนิดซึ่งอาจนําไปสู่โรคต่าง ๆ ในมนุษย์และสัตว์รวมถึงเนื้อตายเน่าก๊าซ (Fraser and Collee, 1975; Fraser and Collee, 1975) Verherstraeten et al., 2015). เนื้อตายเน่าก๊าซส่วนใหญ่เกิดจากการรวมกันของสารพิษและ theta ที่หลั่งออกมาจาก C. perfringens ซึ่งอาจนําไปสู่การตายของสัตว์ที่ติดเชื้อส่งผลให้เกิดความสูญเสียทางเศรษฐกิจอย่างมาก อย่างไรก็ตามจนถึงปัจจุบันวิธีที่มีประสิทธิภาพในการรักษาเนื้อตายเน่าก๊าซ ได้แก่ ออกซิเจนไฮเปอร์บาริกการผ่าตัดและยาปฏิชีวนะ ในหมู่พวกเขาการผ่าตัดอาจทําให้เกิดความเสียหายทางกายภาพอย่างมีนัยสําคัญต่อผู้ป่วยและมีผลกระทบที่ไม่สะดวกต่อชีวิตหลังการผ่าตัด พบยีนต้านทานเตตราไซคลีนจํานวนมากใน C. perfringens แยกจากสวีเดนนอร์เวย์เดนมาร์กและสถานที่อื่น ๆ ดังนั้นจึงจําเป็นต้องมีกลยุทธ์หรือตัวแทนใหม่ ๆ เพื่อต่อสู้กับการติดเชื้อแบคทีเรียนี้ (Park et al., 2010; Park et al., 2010) ออสมานและเอลฮารีรี, 2013). ในการศึกษานี้ phenylpropanoid verbascoside ซึ่งแตกต่างจากการรักษาด้วยยาต้านแบคทีเรียแบบดั้งเดิม (ยาปฏิชีวนะ) สามารถยับยั้งกิจกรรม hemolytic ของทั้ง CPA และ PFO ซึ่งเป็นสารพิษที่สร้างรูขุมขนที่สําคัญสองชนิดที่มีส่วนสําคัญอย่างยิ่งต่อการก่อโรค C. perfringens ในระดับเซลล์, verbascoside ยังสามารถปกป้องเซลล์ Caco-2 จากสารพิษทั้งสองนี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพที่ความเข้มข้นต่ํา (0.25-2 ig/mL). โดยเฉพาะอย่างยิ่ง, verbascoside สามารถลดกิจกรรมของสารพิษโดยการยับยั้ง oligomerization ของ PFO. ผลลัพธ์เหล่านี้สามารถให้ข้อมูลพื้นฐานที่เพียงพอสําหรับการวิจัยในร่างกาย