ประโยชน์ของแอกทีโอไซด์ - รักษาไกลโอบลาสโตมา

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

แทวุงฮวัง;ดงฮุนคิม; DA BI KIM1;TAE WON JANG;GUN‑HWA KIM;MINHO MOON;KYUNG AH YOON;DAE EUN CHO;JAE HO PARK;JWA‑JIN KIM'

1. บทนำ

ไกลโอบลาสโตมาเป็นเนื้องอกในสมองที่เป็นมะเร็งชนิดที่พบได้บ่อยที่สุด และเป็นเนื้องอกในสมองปฐมภูมิที่ลุกลามและทำลายล้างมากที่สุด (1,2) โดยมีอัตราการรอดชีวิตเฉลี่ยประมาณ 18 เดือนด้วยการบำบัดรักษาหลายรูปแบบ การตัดสินใจในการรักษาในปัจจุบันมีจำกัด และรวมถึงการฉายรังสี เคมีบำบัด และการผ่าตัดร่วมกับสารอัลคิเลตติ้งเทโมโซโลไมด์ (TMZ) (3,4) แม้จะมีการรักษาเชิงรุกผู้ป่วยด้วยglioblastomaโดยทั่วไปมีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี (5) TMZ เป็นยาเคมีบำบัดที่สำคัญที่ใช้ในการรักษาทางคลินิกของมะเร็งglioblastoma(6-8); เป็นสารอัลคิเลตในซีรีย์ สามารถเจาะเกราะกั้นเลือดสมอง (9-11) ในระหว่างการลุกลามของเนื้องอกไกลโอบลาสโตมาที่เป็นมะเร็งและการบุกรุกไปทั่วสมอง การดื้อยาที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องต่อ TMZ จะทำให้ประสิทธิภาพในการรักษาลดลง (12,13) ดังนั้น ยารักษาแบบใหม่จึงตอบโจทย์glioblastomaกำลังหาอยู่อย่างเร่งด่วน

การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่าเซลล์ glioma ได้รับการตายของเซลล์ผ่าน autophagy หรือการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ประเภท II เพื่อตอบสนองต่อ TMZ (14,15) สามารถยับยั้ง autophagy ได้โดย 3-methyladenine (3‑MA) ผ่านการแปลง micro-associated protein 1 light chain 3 (LC3)‑I เป็น LC3‑II ซึ่งจะช่วยลดglioblastomaการตายของเซลล์ (16,17); อย่างไรก็ตาม บทบาทของ autophagy ขึ้นอยู่กับบริบทของเซลล์ ยกเว้นบทบาทที่เป็นพิษต่อเซลล์ระหว่างการทำงานของ TMZ การเหนี่ยวนำ autophagy โดยความเครียดของเซลล์เป็นกระบวนการ cytoprotective ที่กำจัดการรวมตัวของไซโตพลาสซึม ออร์แกเนลล์ และโมเลกุลขนาดใหญ่ในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมผ่านระบบไลโซโซมที่เกิดจากความเครียด ในทางกลับกัน เซลล์ที่เกี่ยวข้องกับการรักษาสภาวะสมดุลจะได้รับพลังงานผ่านกระบวนการ catabolic (18,19) บทบาทที่ซับซ้อนของ autophagy แนะนำว่า autophagy activator อาจมีผลต้านมะเร็งร่วมกับการรักษา TMZ โดยการกระตุ้นglioblastomaautophagy ของเซลล์โดยไม่ก่อให้เกิดผลเสียหรือให้ประโยชน์กับเนื้อเยื่อปกติ ข้อสังเกต TMZ มีผลการรักษาเสริมฤทธิ์ร่วมกับวิตามินดี รวมถึงการยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์และ autophagy ที่เพิ่มขึ้นในglioblastomaเซลล์. นอกจากนี้ การรวมกันของ TMZ และวิตามินดี ยังแสดงให้เห็นถึงฤทธิ์ต้านมะเร็งในร่างกาย ซึ่งรวมถึงขนาดเนื้องอกที่ลดลงและอัตราการรอดชีวิตที่ยาวนานขึ้น การศึกษาเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการรักษาแบบผสมผสานอาจมีผลต้านมะเร็งแบบเสริมฤทธิ์กันผ่านกลไกการย่อยอัตโนมัติใน TMZ-basedglioblastomaการบำบัด (15).

แอคทีโอไซด์เป็นฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่มีการกระจายอย่างกว้างขวางในยาสมุนไพรจีนโบราณหลายชนิด (20,21) การกระทำทางเภสัชวิทยาหลายประการ ได้แก่ สารต้านอนุมูลอิสระ ต้านมะเร็ง ต้านการอักเสบ ต้านไต และ antitastatic มีส่วนเกี่ยวข้องกับแอคทีโอไซด์(22-24) การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าแอคทีโอไซด์มีผลในการป้องกันการบาดเจ็บของตับที่เกิดจากคาร์บอนเตตระคลอไรด์และ D-galactosamine กลไกที่อยู่เบื้องหลังผลการป้องกันของแอกทีโอไซด์มีแนวโน้มว่าจะเกี่ยวข้องกับความสามารถในการยับยั้งการกระตุ้นทางชีวภาพโดยใช้ P450 และผลการกำจัดอนุมูลอิสระที่เกิดจากการสัมผัสคาร์บอนเตตระคลอไรด์ (25,26)

ดังนั้น หลักฐานแสดงให้เห็นว่าทั้งแอคทีโอไซด์และ TMZ กระตุ้นผลต้านมะเร็งผ่านการตายของเซลล์ อย่างไรก็ตาม ความสัมพันธ์และผลต้านมะเร็งในบริบทของglioblastomaยังคงต้องชี้แจง ดังนั้น วัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบฤทธิ์ต้านมะเร็งที่เสริมฤทธิ์กันของแอคทีโอไซด์รวมกับ TMZ ในglioblastomaการบำบัด ทำการทดสอบความมีชีวิตของเซลล์เพื่อวิเคราะห์ผลต้านมะเร็งของการรักษาแบบผสมผสานใน C6glioblastomaเซลล์ (หนูglioblastomaเซลล์ไลน์) และผลลัพธ์ถูกนำมาเปรียบเทียบกับการรักษาที่ตามมาด้วย TMZ เพียงอย่างเดียว เพื่อศึกษาเพิ่มเติมถึงกลไกการตายของเซลล์ที่เกิดจาก cotreatment withแอคทีโอไซด์และ TMZ, apoptosis และยีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ในเซลล์ C6

แอคทีโอไซด์ต้านเนื้องอก

2. วัสดุและวิธีการ

การเพาะเลี้ยงเซลล์:

หนู C6glioblastomaสายเซลล์ถูกซื้อจาก American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) เซลล์ได้รับการเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะปลอดเชื้อที่อุณหภูมิ 37˚C ในสภาพแวดล้อมที่ชื้นโดยมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ในตัวกลางของ Eagle (DMEM) ที่ดัดแปลงของ Dulbecco เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (FBS) และยาปฏิชีวนะและยาต้านเชื้อรา 1 เปอร์เซ็นต์ (ทั้งหมด Welgene, Daegu ,เกาหลี).

วัสดุจากพืช:

Abeliophyllum distichum Nakai [บัตรกำนัลหมายเลข Park1001(ANH)] ถูกรวบรวมในสวนสนุก Misun‑hyang, Seongbul‑Mountain Recreation Forest, เกาหลี

การเหนี่ยวนำแคลลัส:

เพื่อชักนำให้เกิดแคลลัส (27) แยกเอาใบขยายขนาด 1‑cm2 ออกจากพืชสด เพาะเชื้อบนอาหาร Murachige และ Skoog (ซูโครส 4 เปอร์เซ็นต์, วุ้น 0.9 เปอร์เซ็นต์ที่เสริมด้วยกรดแนฟทาลีนอะซิติก 1 มก./ลิตร และ 1 มก./ลิตร 2,4‑ไดคลอโร ฟีน็อกซี แอซิติก แอซิด, pH 5.7) ที่ 25˚C แคลลัสถูกกระตุ้น 20 วันต่อมา ปริมาณเพียงพอของแอคทีโอไซด์ได้มาจากวัฒนธรรมย่อยเพื่อแยกและทำให้บริสุทธิ์แอคทีโอไซด์จากแคลลัส (รูปที่ 1) สารบริสุทธิ์หลายรุ่นแอคทีโอไซด์ถูกนำมาใช้ในการทดลองแต่ละครั้ง การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการสามครั้งโดยใช้ชุดงานที่แตกต่างกัน

การแยกและการทำให้บริสุทธิ์:

เศษส่วนของเอทิลอะซิเตตถูกทำให้เข้มข้นในสุญญากาศและใช้เป็นตัวอย่างสำหรับการทำแอกทิโอไซด์ให้บริสุทธิ์แอคทีโอไซด์ถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์โดยระบบ Accelerated Chromatographic Isolation (Isolera™ Spektra, Biotage, Uppsala, Sweden) โดยใช้ SNAP KPHOSPHO‑SIL และ SNAP Ultra Cartridges (Biotage) ดิแอคทีโอไซด์ทำให้บริสุทธิ์จากแคลลัสถูกวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้แอกทิโอไซด์มาตรฐานโดยการวิเคราะห์ HPLC‑PDA สุดท้าย ได้แอกทีโอไซด์ที่มีความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับร้อยละ 95 จากแคลลัส และใช้เป็นตัวอย่างสำหรับเคมีบำบัดของยาที่ใช้เทโมโซโลไมด์glioblastoma.

3‑(4,5‑Dimethylthiazol‑2‑l)‑,5‑diphenyltetrazolium bromide (MTT) การทดสอบ:

เพื่อระบุความเข้มข้นการยับยั้งสูงสุดครึ่งหนึ่ง TMZ (ค่า IC50) เทียบกับเซลล์ C6 เซลล์ 1x104 เซลล์ในสารแขวนลอยเซลล์เดียวถูกเพาะลงในแต่ละหลุมของเพลต 96 หลุมและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 37˚C ก่อนการบำบัดด้วย TMZ ที่ระบุ ความเข้มข้น (1, 5, 10 และ 20 มิลลิโมลาร์) ที่37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการหาค่า TMZ IC50 เป็น 5 มม. เซลล์ถูกบำบัดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงด้วย TMZ 5 mM, 50 µMแอคทีโอไซด์หรือการรวมกันของทั้งสอง (5 mM TMZ และ 50 µMแอคทีโอไซด์). สารละลาย MTT (5 มก./มล.) ถูกเติมในแต่ละหลุม (10 ไมโครลิตร) และเพาะเลี้ยงที่ 37˚C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อจากนั้น ตัวกลางถูกกำจัดออกและเติม DMSO ที่ปริมาตร 200 ไมโครลิตรแต่ละตัวและทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที การดูดกลืนแสงที่ 595 นาโนเมตรถูกวัดเพื่อกำหนดหาความมีชีวิตของเซลล์

การทดสอบการรักษาบาดแผล:

สารแขวนลอยเซลล์ C6 ใน 1 มล. ถูกเพาะเลี้ยงในจาน 12 หลุมและเติบโตเพื่อบรรจบกัน เซลล์ได้รับการรักษาด้วย TMZแอคทีโอไซด์, หรือ TMZ plusแอคทีโอไซด์แล้วขูดด้วยปิเปตทิปขนาด 10‑µl ที่ปราศจากเชื้อเพื่อสร้างบาดแผล ที่ 0 และ 24 ชั่วโมงหลังการทำแผล ภาพดิจิทัลของกระบวนการสมานแผลถูกจับโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว การย้ายเซลล์ถูกวัดปริมาณโดยการวัดขนาดของแผลเป็นที่ 0 และ 24 ชั่วโมงโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ ImageJ 1.43u/Java1.6.0_22 ซอฟต์แวร์ (NIH, Bethesda, Maryland, USA) การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการสามครั้งและดำเนินการวัดเป็นสามเท่า

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง:

เซลล์ C6 ถูกบำบัดด้วย TMZแอคทีโอไซด์, หรือ TMZ plusแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 24 ชม. เซลล์ถูกสลายบนน้ำแข็งโดย RIPA (25 mM Tris‑HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 เปอร์เซ็นต์ Nonidet P‑40, 1 เปอร์เซ็นต์ sodium deoxycholate, 0.1 เปอร์เซ็นต์ SDS) lysis buffer เสริมด้วยค็อกเทลสารยับยั้งโปรตีเอสและฟอสฟาเตส (โรช บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการปั่นแยกที่ 18,341 xg เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4˚C ได้ส่วนลอยเหนือตะกอน ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดยใช้ Bradford Protein Assays (Bio‑rad, Hercules, CA, USA) ปริมาณโปรตีนทั้งหมดเท่ากัน (30 ไมโครกรัม) ถูกบรรจุลงในหลุมเดียวและแยกส่วนผ่านอิเล็กโตรโฟรีซิสผ่าน SDS‑PAGE 10–15 เปอร์เซ็นต์ โปรตีนถูกถ่ายด้วยไฟฟ้าไปยังเยื่อพอลิไวนิลลิดีนไดฟลูออไรด์ (EMD Millipore, Bedford, MA, USA) หลังจากการฟักไข่ในสารละลายบล็อคที่มีนมไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ในน้ำเกลือ Tween/Tris‑buffer เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง บลตถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่เจือจาง 1:1,000‑เจือจาง (cat. no. 9662, caspase 3; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), B0‑cell lymphoma 2 (sc‑ 7382, Bcl‑2), โปรตีน X ที่เกี่ยวข้องกับ Bcl‑2‑สัมพันธ์ (แมวหมายเลข 2772, Bax), ฟอสโฟรีเลต (p‑)p53 (sc‑101762), total‑p53 (sc‑6243), ‑actin (cat. หมายเลข 4970; ทั้งหมด; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA), LC‑3 (L8918, Sigma; Merck KGaA, Darmstadt, Germany), Rab7 (cat. no. 9367, Cell Signaling Technology, Inc. ), p62 (cat. no. 114), p‑p38 (cat no. 9211), total‑p38 (cat no. 9212), p‑c‑Jun N‑terminal kinase (cat. no. 9251, p ‑JNK), total‑JNK (cat. no. 9252), p‑extracellular signal-driven kinase (cat. no. 9101, p‑ERK), Total‑ERK (cat. no. 9102; all Cell Signaling Technology, Inc. .) ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4˚C ตามมาด้วยการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (1:2,000; LF‑SA8001A, Goat Anti‑Mouse IgG‑HRP) หรือ LF‑SA8002A (Goat Anti‑Rabbit IgG‑HRP), AB Frontier, Seoul, Korea.) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจึงมองเห็นโปรตีนได้จากการสัมผัสกับ Chemi‑Doc (Bio‑Rad Laboratories, Inc., Hercules, cA, USA)

การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์:

โปรตีนเมมเบรนที่เกี่ยวข้องกับไลโซโซม 1 (LAMP1) และ LC3 เป็นเครื่องหมายสำหรับไลโซโซมและออโตฟาจี เซลล์ (1x105 เซลล์/หลุม) ถูกเตรียมบนฝาครอบแก้วที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ในสามเท่า หลังการรักษาด้วย TMZแอคทีโอไซด์, หรือ TMZ plusแอคทีโอไซด์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 30 นาที บล็อกด้วยซีรั่มไก่ปกติ 5 เปอร์เซ็นต์ (S‑3000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA), 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X ‑100 แล้วบ่ม 1 ชั่วโมงสำหรับการซึมผ่านและเพื่อขัดขวางปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนที่ไม่จำเพาะ จากนั้นเซลล์ถูกบ่มด้วยสารต้าน LAMP1 (1:200; sc‑19992, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) และสารต้าน LC3 (1:400; PM036, MBL International, Woburn, MA, USA) ค้างคืนที่ 4˚ ค. จากนั้นล้างเซลล์ด้วย PBS สองครั้งและฟักเป็นเวลา 2 ชั่วโมงในความมืดด้วยส่วนผสมของแอนติบอดีรองของ Alexa Fluor 488 และ 594 (1:200; Alexa Fluor 488 (A‑11008) และ 594 (A‑11007) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) และล้างอีกครั้งด้วย PBS นิวเคลียสถูกย้อมโดยใช้ 4,6‑diamidino‑2‑phenylindole (Sigma; Merck KGaA) จากนั้นล้างด้วย PBS สองครั้ง จากนั้นจึงติดตั้งสไลด์และถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลเลเซอร์ LSM‑700

รูปที่ 1 โครงสร้างทางเคมีของแอกทิโอไซด์

โฟลว์ไซโตเมทรี

เซลล์ได้รับการวิเคราะห์สำหรับ Mitotracker Green และ MitoSOX โดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้โฟลว์ไซโตมิเตอร์ FACSCanto II ตามที่ระบุโดยผู้ผลิต (BD Biosciences) หลังจากล้างด้วย PBS สองครั้ง เซลล์ถูกตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องและซึมผ่านด้วย 0.25 เปอร์เซ็นต์ Triton X‑100 ใน PBS เป็นเวลา 20 นาที เซลล์ถูกย้อมด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4˚C (1:200) และจากนั้นด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงบนน้ำแข็ง หลังจากล้างด้วย PBS สองครั้ง เซลล์ถูกตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และตรวจวิเคราะห์ทันที ข้อมูลโฟลว์ไซโตเมทรีถูกรวบรวมโดยใช้เซลล์ 10,000 เซลล์และถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo 7.6.1 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA)

การวิเคราะห์ทางสถิติ:

ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ GraphPad Prism 50 และแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ข้อผิดพลาดมาตรฐานของค่าเฉลี่ย ข้อมูลถูกวิเคราะห์ด้วยการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวด้วยการทดสอบภายหลังการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Tukey สำหรับการเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยระหว่างกลุ่มต่างๆ พี<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Cistanche Echinacoside: ต่อต้านการตายของเซลล์

3. ผลลัพธ์

3.1 Cotreatment ด้วย TMZ และ acteoside suppressesglioblastomaการเพิ่มจำนวนเซลล์และการย้ายถิ่น

การรักษาร่วมกับ TMZ และแอคทีโอไซด์ยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์ C6 TMZ ลดความมีชีวิตของเซลล์ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 2A) ในขณะที่แอคทีโอไซด์เพียงอย่างเดียวไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญที่ระดับการรักษาใดๆ (รูปที่ 2B) หลังจากการฟักไข่ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี TMZ ที่มีหรือไม่มีแอกทีโอไซด์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง การสอบวิเคราะห์ MTT ถูกดำเนินการเพื่อเปรียบเทียบความเป็นพิษต่อเซลล์ของระดับการบำบัดที่ต่างกัน TMZ ยับยั้งการมีชีวิตของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่แอคทีโอไซด์ไม่ได้ยับยั้งการเติบโตของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ การบำบัดร่วมกับ TMZ และแอกทีโอไซด์ทำให้เซลล์มีชีวิตลดลงอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 2C) การรักษาด้วย TMZ หรือแอคทีโอไซด์เพียงอย่างเดียวทำให้ความสามารถในการสมานแผลลดลง (รูปที่ 3A) วัดระยะทางของบาดแผล ( เปอร์เซ็นต์ ) โดยใช้ผลลัพธ์ที่แสดงในรูปที่ 3A ด้วยซอฟต์แวร์ ImageJ ระยะห่างของแผลเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษาแบบผสมผสาน (รูปที่ 3B) เมื่อเทียบกับการรักษาแต่ละครั้ง ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการบำบัดด้วย TMZ และแอคทีโอไซด์เป็นตัวยับยั้งที่มีประสิทธิผลของglioblastomaการเพิ่มจำนวนเซลล์และการย้ายถิ่น

3.2 Acteoside และ TMZ ส่งผลต่อการตายของเซลล์ C6

ผลการวิเคราะห์ western blot พบว่าระดับของ caspase-3, Bax และ phosphorylated p53 ที่แยกออกสูงขึ้น และระดับของ Bcl‑2 ลดลงหลังการรักษาด้วย TMZ และแอคทีโอไซด์มากกว่าการติดตามการรักษาด้วย TMZ เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4A)แอคทีโอไซด์จากนั้นจึงสังเกตการทำงานของไมโทคอนเดรียที่อาศัยสื่อกลางและการสร้างสปีชีส์ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) ซึ่งเป็นสื่อกลางสำคัญของการส่งสัญญาณอะพอพโทติกในเซลล์ C6 ที่ได้รับการบำบัดด้วย TMZ ในการตรวจสอบมวลไมโตคอนเดรีย การวิเคราะห์การคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นการเรืองแสงได้ดำเนินการโดยใช้ MitoTracker Green การบำบัดด้วย TMZ และแอคทีโอไซด์ส่งผลให้มีมวลยลสูงกว่าการรักษาด้วย TMZ เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4B) การสร้าง ROS สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการบำบัดด้วย TMZ และแอกทีโอไซด์มากกว่าการรักษาด้วย TMZ เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 4C) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสร้าง ROS และการทำงานของไมโตคอนเดรียมีความสำคัญในการตายของเซลล์ที่เกิดจากการรักษาด้วย TMZ บวกแอกทีโอไซด์ การบำบัดด้วย TMZ และแอกทีโอไซด์ทำให้เกิด autophagy ในเซลล์ C6 มีรายงานว่า TMZ ทำให้เกิด autophagy (28,29); ดังนั้นการศึกษาในปัจจุบันจึงได้ตรวจสอบขอบเขตที่การกระตุ้น autophagy โดย TMZ ร่วมกับการรักษาด้วยแอกทีโอไซด์ เซลล์ C6 ถูกบำบัดด้วย TMZ โดยมีหรือไม่มีแอกทิโอไซด์ หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง และเซลล์ถูกย้อมสำหรับอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์เพื่อตรวจหา LAMP1 และ LC3 เป็นเครื่องหมายของ autophagy ระดับการแสดงออกที่สูงขึ้นของ LAMP1 และ LC3 ถูกสังเกตพบหลังการบำบัดแบบผสมผสาน (รูปที่ 5A) นอกจากนี้ยังตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy และพบว่า TMZ เหนี่ยวนำให้เกิดการแปลง LC3‑I เป็น LC3‑II ซึ่งเป็นลายเซ็นของการสร้าง autophagosome อัตราการแปลงของ LC3‑I เป็น LC3‑II สูงขึ้นหลังจากการบำบัดด้วย TMZ และแอคทีโอไซด์มากกว่าการรักษาด้วย TMZ เพียงอย่างเดียว ระดับการแสดงออกของ Rab7 และ p62 บ่งชี้การเหนี่ยวนำ autophagy ในเซลล์ที่บำบัดด้วย TMZ (รูปที่ 5B) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการบำบัดด้วย TMZ และแอกทิโอไซด์ช่วยเพิ่มกระบวนการ autophagic ในglioblastomaเซลล์.

3.3 Acteoside กระตุ้นการแสดงออกของยีน MAPK pathway ในการรักษาโดยใช้ TMZ

การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า TMZ ควบคุมเส้นทาง MAPK รวมถึง p38, JNK และ ERK (30) ดังนั้นการศึกษาครั้งนี้จึงได้ศึกษาว่าแอคทีโอไซด์ส่งผลต่อการแสดงออกของยีน MAPK ที่เกี่ยวข้องกับ TMZ เซลล์ C6 ได้รับการบำบัดด้วย TMZ โดยมีหรือไม่มีแอคทีโอไซด์. หลังจาก 24 ชั่วโมง การรักษาด้วย TMZ ส่งผลให้ระดับการแสดงออกของ p-p38, p-JNK และ p-ERK สูงขึ้น การแสดงออกของยีนที่ควบคุมโดย TMZ สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วย TMZ ร่วมกับแอคทีโอไซด์มากกว่าการรักษาด้วย TMZ เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 6) ข้อสังเกตเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแอคทีโอไซด์ส่งผลกระทบต่อกลไกการรักษาตาม TMZ ผ่านทางเส้นทาง MAPK

แอคทีโอไซด์ แอนตี้-glioblastoma

การอภิปราย

ผลการศึกษาปัจจุบันพบว่าการรักษาร่วมกับ TMZ ร่วมกับแอคทีโอไซด์ให้ศักยภาพในการรักษาglioblastomaการรักษาและให้หลักฐานที่แสดงว่าการแพ้เคมีกับการรวมกันของ TMZ และแอคทีโอไซด์สามารถเกิดขึ้นได้ผ่านการเพิ่มประสิทธิภาพ autophagy เป็นการกลายพันธุ์ของglioblastomaเซลล์สามารถนำไปสู่การหยุดการทำงานของวิถี apoptotic การเหนี่ยวนำ autophagy โดย TMZ plusแอคทีโอไซด์cotreatment อาจเป็นตัวแทนของวิธีการอื่นสำหรับglioblastomaการบำบัด อย่างไรก็ตาม ไม่ว่า autophagy เป็นกลไกเดียวสำหรับglioblastomaบำบัดด้วย TMZ plusแอคทีโอไซด์ยังคงต้องชี้แจง

Autophagy เป็นกลไกของเซลล์ที่จำเป็นสำหรับการย่อยสลายโปรตีนและออร์แกเนลล์ของไซโตพลาสซึม ความได้เปรียบแบบ catabolic ของการเหนี่ยวนำ autophagy อาจมีความสำคัญในสภาวะที่ตึงเครียด ดังนั้นการชักนำให้เกิด autophagy อาจเป็นกลไกการปรับตัวสำหรับการป้องกันการตายของเซลล์ (31‑33) การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่า autophagy ที่ลดลงมีความสัมพันธ์กับมะเร็ง (34‑36) นอกจากนี้ โปรตีนและวิถีการส่งสัญญาณหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับ autophagy ถูกกำจัดออกระหว่างการเปลี่ยนแปลงของมะเร็ง ส่งผลให้กิจกรรม autophagic ลดลง ระดับการแสดงออกของ LC3 ที่สูงยังสัมพันธ์กับอัตราการรอดชีวิตที่เพิ่มขึ้นในผู้ป่วยglioblastomaด้วยคะแนนประสิทธิภาพต่ำ (37,38) ในทำนองเดียวกัน ผลการศึกษาปัจจุบันระบุว่าการฟื้นฟู autophagy ปกติอาจเป็นกลยุทธ์ที่แฝงอยู่สำหรับglioblastomaบำบัดและอาจทำหน้าที่เป็นกลไกในการจำกัดการเติบโตของเซลล์เนื้องอกที่ผิดปกติ

ใน autophagy ปกติ ส่วนประกอบ cytoplasmic เฉพาะจะถูกแยกออกภายใน autophagosomes ซึ่งจะหลอมรวมกับไลโซโซมเพื่อย่อยสลายและนำกลับมาใช้ใหม่ (39,40) เมื่อ autophagy ถูกควบคุม อัตราการก่อตัวของ autophagosome จะเกินอัตราการย่อยสลายของ lysosomal เงื่อนไขนี้เรียกว่าความเครียด autophagic หากความเครียดหรือภาวะ autophagy ผิดปกติยังคงดำเนินต่อไป การตายของเซลล์อาจเกิดขึ้นได้จากการสูญเสียพลังงานหรือการเปลี่ยนแปลงในสมดุล beclin‑1/Bcl‑2 อะพอพโทซิสยังสามารถถูกกระตุ้นโดยภาวะไม่ปกติของออโตฟาโกโซม การกลืนกินออร์แกเนลล์ของไซโตพลาสซึม รวมถึงไมโทคอนเดรียหรือเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม (41) มีข้อเสนอแนะว่า autophagy ทั่วไปสามารถกระตุ้นการตายของเซลล์ในระหว่างการหมุนเวียนของไซโตพลาสซึมและออร์แกเนลล์ตามปกติในเซลล์ที่มีสุขภาพดี ในกระบวนการนี้ เซลล์ 'กินเนื้อ' ตัวเองจากภายใน ซึ่งเป็นลักษณะสำคัญของการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมประเภท II แม้ว่ากลไกโดยที่แอคทีโอไซด์ช่วยเพิ่มผลการรักษาของ TMZ-basedglioblastomaการรักษายังคงต้องได้รับการอธิบายอย่างเต็มที่ ผลของการต้านมะเร็งที่แสดงโดยการรักษาแบบผสมผสานที่ตรวจสอบในการศึกษานี้อาจเกี่ยวข้องกับกลไกการย่อยอัตโนมัติเหล่านี้

แอคทีโอไซด์เป็นฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่ได้จากพืช (22,26) การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานเกี่ยวกับกิจกรรมทางชีวภาพต่างๆ ของแอกทีโอไซด์ การเปลี่ยนแปลงระดับการแสดงออกของ caspase-3 และ LC3 แบบแยกในการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการบำบัดด้วย TMZ และแอคทีโอไซด์ทำให้เกิด apoptosis และ autophagy ในเซลล์ C6 (รูปที่ 4 และ 5) การรักษาแบบผสมผสานแสดงให้เห็นว่ามีผลเสริมฤทธิ์กันต่อglioblastomaเซลล์. แม้ว่ากลไกที่เป็นไปได้อื่น ๆ ของผลเสริมฤทธิ์กันเหล่านี้ยังคงได้รับการอธิบาย แต่การศึกษานี้ระบุว่าการชักนำให้เกิด autophagy เป็นกลไกการฆ่าเนื้องอกที่สำคัญของแอคทีโอไซด์ปฏิกิริยาเคมีระหว่าง TMZ-basedglioblastomaการบำบัด

Acteoside รักษา glioblastoma

อ้างอิง

1. Friedman HS, Kerby T และ Calvert H: Temozolomide และการรักษา glioma ที่เป็นมะเร็ง Clin Cancer Res 6: 2585-2597, 2000.

2. Mrugala MM และ Chamberlain MC: กลไกการเกิดโรค: Temozolomide และglioblastoma-มองไปสู่อนาคต แนท คลินิก แพร อ่อนอล 5: 476‑486, 2008.

3. Agarwala SS และ Kirkwood JM: Temozolomide ซึ่งเป็นสารอัลคิเลตแบบใหม่ที่มีกิจกรรมในระบบประสาทส่วนกลางอาจช่วยปรับปรุงการรักษามะเร็งผิวหนังระยะลุกลามขั้นสูง เนื้องอกวิทยา 5: 144‑151, 2000

4.Stevens MF, Hickman JA, Stone R, Gibson NW, Baig GU, Lunt E และ Newton cG: Antitumor imidazotetrazines 1. การสังเคราะห์และเคมีของ 8‑carbamoyl‑3‑(2‑chloroethyl)imidazo[5,1‑d]‑1,2,3, 5‑tetrazine‑4(3 H)‑one ซึ่งเป็นสารต้านเนื้องอกในวงกว้างแบบใหม่ ตัวแทน. เจ เมด เคม 27: 196‑201, 1984.

5. Fulda S: การรักษาglioblastoma. การตายของเซลล์ 9: 121, 2018

6. Chen PH, Shen WL, Shih CM, Ho KH, Cheng CH, Lin CW, Lee CC, Liu AJ และ Chen KC: วิถีทาง Notch3 ที่ยับยั้งด้วย CHAC1 เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษต่อเซลล์ไกลโอมาที่เกิดจากเทโมโซโลไมด์ เภสัชวิทยาทางระบบประสาท 116: 300-314, 2017

7. Oshiro S, Tsugu H, Komatsu F, Ohmura T, Ohta M, Sakamoto S, Fukushima T และ Inoue T: ประสิทธิภาพของการรักษา temozolomide ในผู้ป่วยที่มี glioma คุณภาพสูง ต้านมะเร็ง Res 29: 911‑917, 2009.

8. Van den Bent MJ: การรักษาแบบเสริมของ gliomas คุณภาพสูง Ann Oncol 17 (Suppl 10): x186‑x190, 2006.

9. Shen W, Hu JA และ Zheng JS: กลไกของผลต้านเนื้องอกที่เกิดจาก temozolomide ในเซลล์ glioma J Int Med Res 42: 164-172, 2014.

10.Barciszewska AM, Gurda D, Głodowicz P, Nowak S และ Naskręt‑Barciszewska MZ: กลไก epigenetic ใหม่ของการกระทำ temozolomide ในเซลล์ glioma กรุณา หนึ่ง 10: e0136669, 2015.