Stx2 ทำให้เกิดการแสดงออกของยีนที่แตกต่างและรบกวนยีนจังหวะ Circadian ในท่อใกล้เคียงⅡ

3. การอภิปราย

3.1. พยาธิวิทยาของท่อใกล้เคียงในผู้ป่วย STEC และแบบจำลองสัตว์

Oliguria เป็นสัญลักษณ์ของเนื้อร้ายท่อเฉียบพลัน(เอทีเอ็น). เนื่องจาก ATN เซลล์เยื่อบุผิวที่หลุดลอกจะขัดขวางรูของท่อเพื่อลดการไหลของของไหลซึ่งจะปรากฏเป็น oliguria ในผู้ป่วย STEC ภาวะก้อนเนื้อในตับและเนื้องอกมักพบบ่งชี้ถึง ATN การลดลงของการทำงานของ tubule ใกล้เคียงในระยะก่อนหน้าของโรคติดเชื้อ STEC แสดงให้เห็นว่าการเพิ่มขึ้นของ 2MG และ NAG ในปัสสาวะ [3,33] B2MG เป็นโปรตีนขนาดเล็ก 12 kDa ที่ถูกกรองอย่างอิสระผ่าน glomeruli และดูดซึมได้อย่างสมบูรณ์โดย tubules ที่ใกล้เคียงในสภาวะปกติ อย่างไรก็ตาม เมื่อท่อส่วนใกล้เคียงได้รับความเสียหาย ปริมาณ 2 มก. ในปัสสาวะจะเพิ่มขึ้น จึงทำหน้าที่เป็นตัวชี้วัดทางชีวภาพสำหรับการทำงานของท่อส่วนใกล้เคียง NAG เป็นเอนไซม์ไลโซโซมขนาดใหญ่ 130 kDa และกลูโคซิเดสหลักในท่อส่วนใกล้เคียง เนื่องจากมีขนาดใหญ่ glomerulus จึงไม่สามารถกรอง NAG ได้ ในขณะที่ tubules ที่ใกล้เคียงที่เสียหายจะหลั่ง NAG ในปัสสาวะ ดังนั้นการเพิ่มขึ้นของ NAG ในปัสสาวะจึงเป็นอีกหนึ่งตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับความเสียหายของท่อใกล้เคียง จุลพยาธิวิทยาของไต เช่น fibrin-obstructed capillaries มักพบผู้ป่วย STEC; อย่างไรก็ตาม ข้อมูลปัสสาวะข้างต้นบ่งชี้ถึงความเสียหายของท่อใกล้เคียงในโรคก่อนหน้านี้ นอกจากนี้ ปัสสาวะของผู้ป่วย STEC ยังมีเฝือกที่ประกอบด้วยเยื่อบุผิวท่อ ซึ่งเป็นผลมาจากการหลุดของเซลล์ท่อใกล้เคียงที่เสียหาย [1] ในแบบจำลองสัตว์ การหลุดของเซลล์ท่อส่วนใกล้เคียงมักพบทั้งในการติดเชื้อ STEC และแบบจำลองการฉีด Stx [25–27,34] ในการศึกษาปัจจุบัน เราพบว่าการหลุดของเซลล์ tubular ใกล้เคียงในไตของหนูที่ถูกฉีด Stx2- บ่งชี้ว่า Stx2- ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของ tubular ใกล้เคียง (รูปที่ 1) นอกจากนี้เรายังตรวจพบ Stx2 receptor Gb3 ทั้งในเมาส์และtubules ใกล้เคียงไตของมนุษย์ด้วยการแสดงออกด้าน luminal ที่บ่งบอกถึงปฏิสัมพันธ์โดยตรงของ Stx2 กับ tubules ที่ใกล้เคียง (รูปที่ 2 และ 3) PDK4 phosphorylates pyruvate dehydrogenase เพื่อยับยั้งการทำงานของมัน ส่งผลให้การใช้กลูโคสลดลง และการเผาผลาญไขมันเพิ่มขึ้นเพื่อตอบสนองต่อการอดอาหารและความอดอยากเป็นเวลานาน ช่วยปกป้องเซลล์เยื่อบุผิวที่แยกออกจากกันจากการตายของเซลล์ที่เกิดจากการหลุดออก (anoikis) [35] PDK4 ในตอนแรกมีจุดสูงสุดที่ 4 ชั่วโมง จากนั้นอีกจุดสูงสุดที่ 8 ชั่วโมง (รูปที่ 5A) ลดลงที่ 12 ชั่วโมง แต่จากนั้นเพิ่มขึ้นทีละน้อยจนถึง 72 ชั่วโมง โดยบันทึก2-การเปลี่ยนแปลงพับและจบลงด้วย 3 (12-การเปลี่ยนแปลงแบบพับ) (รูปที่ 5A) การหลุดออกของเซลล์เยื่อบุผิวเกิดขึ้นในเซลล์ท่อใกล้เคียงของหนูทดลอง Stx2- (การหลุดลอก) โดยมีสัณฐานวิทยาที่ค่อนข้างสมบูรณ์ (รูปที่ 1) ซึ่งอาจสะท้อนถึงการควบคุม PDK4

CISTANCHE TUBULOSA EXTRACT POWDER สำหรับไต

เนื่องจาก NHERF1 (SLC9A3R1) มีส่วนช่วยในการเกาะติดของเซลล์ปกติกับเมทริกซ์นอกเซลล์ [36] การจัดระเบียบโครงร่างโครงร่างของเซลล์แอกติน และการรักษาสัณฐานวิทยาของเซลล์ การแสดงออกที่ลดลงของยีนนี้อาจมีผลกระทบ เช่น การหลุดของเซลล์ (รูปที่ 5K)

ผลของ Stx2 ต่อ tubules ใกล้เคียงดูเหมือนจะเป็นปัจจัยสำคัญสำหรับโรคติดเชื้อ STEC; อย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนที่เน้นไปที่เซลล์ท่อใกล้เคียง ในวิฟ ไม่สามารถทำได้มาก่อน ผู้ดูแลและคณะ [37] แสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน (DEGs) ในไตของหนูที่ถูกฉีด LPS ของ Stx2+ โดยที่ยีนก่อนหน้านี้และที่มีการเปลี่ยนแปลงส่วนใหญ่ส่วนใหญ่มาจากอิทธิพลของ LPS และยีนที่มีการเปลี่ยนแปลงช้ามากนั้นมาจากผลของ Stx2 . ข้อมูลของพวกเขาแสดงให้เห็นข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าเกี่ยวกับการแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันของไต แต่ไม่ได้แยกประเภทของเซลล์ที่รับผิดชอบต่อการเปลี่ยนแปลงนั้น ในการศึกษาปัจจุบัน เราพยายามค้นหา DEG ที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ tubular ใกล้เคียงโดยการเปรียบเทียบข้อมูล microarray จากเมาส์ไตและท่อใกล้เคียงหลักของมนุษย์เซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย Stx2

3.2. ปัจจัยใกล้เคียงของท่อที่เกี่ยวข้องใน Stx2-พยาธิวิทยาที่เหนี่ยวนำที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรม Stx2 ที่ทราบในเซลล์แสดงออก Gb3

3.2.1. กิจกรรม (I) การส่งสัญญาณที่เกิดจาก Stxs Binding กับ Gb3

หน่วยย่อย B ของ Stxs กระตุ้นให้เกิด src tyrosine kinase ที่ไม่ใช่ตัวรับ ใช่ ฟอสโฟรีเลชั่น [4] Phosphorylated Yes กระตุ้นโมเลกุลการส่งสัญญาณดาวน์สตรีมโดยกิจกรรมไคเนสของมัน และนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงร่างโครงร่างของเซลล์ [5] ฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับใช่ (YAP) ใน Y357 โดยใช่เป็นที่ทราบกันดีว่ากระตุ้นการโยกย้ายนิวเคลียร์ของ YAP โดยทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นร่วมในการถอดรหัสเพื่อกระตุ้นยีนเป้าหมายเช่น CTGF [38] โปรตีนจากเซลล์ Matricell CYR61 (CCN1) และ CTGF (CCN2) จะถูกหลั่งไปยังเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) และมีส่วนช่วยในการรักษาการยึดเกาะของเซลล์-ECM โดยการจับตัวรับอินทิกรินและโปรตีโอไกลแคน (HSPGs) ที่ยึดติดกับผิวเซลล์ [39,40] โมเลกุลสำคัญของการถอดความ CCN1 และ 2 คือ YAP และจะถูกทำให้ไม่ใช้งาน (ฟอสโฟรีเลตที่ซีรีนเรซิดิว 127) ในสภาวะปกติภายใต้วิถีการส่งสัญญาณของฮิปโป เมื่อตรวจพบการยึดเกาะระหว่างเซลล์และเซลล์ต่ำ YAP (S127) จะไม่ถูกฟอสโฟรีเลชั่นอีกต่อไปเพื่อให้เข้าสู่นิวเคลียส และการถอดรหัสของ CCN1 และ 2 จะเพิ่มขึ้น [41–43] CCN1 และ 2 ทำหน้าที่เป็นโมเลกุลสมานแผลเพื่อซ่อมแซมเนื้อเยื่อที่สูญเสียไปจากเซลล์ [38,44] ในชุดข้อมูลของเรา CCN1 และ 2 มีจุดสูงสุดเล็กน้อยที่จุดเวลาก่อนหน้า (6 ชั่วโมง) สิ่งนี้อาจสะท้อนถึงการเปิดใช้งานใช่ที่เกิดจากการจับ Stx2 ชั่วโมงต่อมา การลอกคราบอาจกระตุ้นการเปิดใช้งาน YAP เพิ่มเติมโดยการปิดเส้นทางการส่งสัญญาณฮิปโปเพื่อกระตุ้นการแสดงออกของ CCN1 และ 2 มากขึ้นในเวลา 12 ชั่วโมงหรือหลังจากนั้น (รูปที่ 5C)

3.2.2. กิจกรรม (II) การกระตุ้นให้เกิด ER-Stress/UPR

Stxs ไปถึง ER โดยที่ชิ้นส่วน A1 และหน่วยย่อย B ที่แยกออกจะเลียนแบบโปรตีนที่กางออก [9,10,45,46] โปรตีนที่ควบคุมกลูโคส 78 kDa (Grp78, การจับกับโปรตีนอิมมูโนโกลบุลิน (Bip)) กำลังยึดโปรตีนหลัก UPR สามชนิดคือเอนไซม์ที่ต้องการอิโนซิทอล-1 (Ire-1), โปรตีนไคเนส R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK ) และการเปิดใช้งานปัจจัยการถอดรหัส 6 (ATF6) ในเมมเบรน ER ในระหว่างสภาวะปกติ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากความสัมพันธ์ที่สูงกว่าของ Grp78 กับโปรตีนที่กางออก มันจึงปล่อยโปรตีนที่ยึดไว้เหล่านั้นออกมา ATF6 ถูกกระตุ้นหลังจากการปลดปล่อยและเพิ่ม CHOP (DDIT3) และโปรตีนการจับ X-box 1 (XBP-1) mR NAs ในขณะที่ Ire-1 ต่อ XBP-1 mRNA เพื่อสร้าง XBP{{ 22}} ซึ่งมีส่วนช่วยในการถอดรหัส CHOP (DDIT3) การเปิดใช้งาน PERK นำไปสู่การเปิดใช้งาน ATF4 ที่เพิ่ม mRNA ของ CHOP (DDIT3) ด้วย ดังนั้นการเพิ่มขึ้นของ CHOP (DDIT3) mRNA จึงเป็นจุดเด่นของ UPR [47,48] มีการรายงาน Stxs เพื่อชักนำ UPR และ CHOP (DDIT3) ได้รับการควบคุมในชุดข้อมูลของเรา (รูปที่ 5D – G)

GDF15 อยู่ในตระกูล Transforming Growth Factor Beta (TGF) เมื่อเร็ว ๆ นี้ GDF15 แสดงให้เห็นว่าเป็นสื่อกลางในการลดน้ำหนักที่เกิดจากยาเมตฟอร์มินที่เป็นโรคเบาหวาน [49] ในหนูที่ให้ยาเมตฟอร์มิน ทางปาก GDF15 mRNA ในลำไส้และไตเพิ่มขึ้น ส่งผลให้ GDF15 ในซีรั่มสูงขึ้น การหมุนเวียน GDF15 ทำงานผ่านตัวรับที่จำกัดก้านสมองเพื่อระงับการบริโภคอาหารและลดน้ำหนักตัว [50] ในหนูที่ได้รับเมตฟอร์มิน GDF15 ของไตที่เพิ่มขึ้นอย่างน้อยส่วนหนึ่งอยู่ภายใต้การควบคุมของ CHOP (DDIT3) ในชุดข้อมูลไตของหนูที่ถูกฉีด Stx2- CHOP (DDIT3) เพิ่มขึ้นในตอนแรกที่ 4 ชั่วโมงโดยมีจุดสูงสุดเพียงเล็กน้อย และจากนั้นก็เริ่มมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นจนถึง 48 ชั่วโมง โดยที่ยังคงระดับของบันทึกไว้ได้{{16 }}พับเปลี่ยนประมาณ 1.3 (รูปที่ 5E) ตามการวิเคราะห์คลัสเตอร์ STRING GDF15 ได้รับการป้อนข้อมูลที่ใช้งานจากปัจจัยการถอดรหัส CHOP (DDIT3) และ ATF3 (รูปที่ 5E) [51,52] น้ำหนักของหนูทดลองที่ฉีด Stx2-เริ่มลดลงหรือเบี่ยงเบนไปจากการควบคุมน้ำเกลือหลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง (รูปที่ S3B) การเพิ่มขึ้นของ GDF15 mRNA ในไตที่ 12 ชั่วโมงอาจส่งผลต่อก้านสมองในการลดการบริโภคอาหาร ซึ่งในทางกลับกันจะปรากฏเป็นการลดน้ำหนัก (รูปที่ 5E และ S3B) เนื่องจากระดับการแสดงออกของ GDF15 ยังคงสูงต่อไปหลังจาก 24 ชั่วโมง หนูเมาส์จึงลดน้ำหนักต่อไป (รูปที่ 5E และ S3B)

เมื่อเกิดความเครียดจาก ER PERK จะถูกปล่อยออกมาจาก Grp78 (Bip) และโอลิโกเมอไรซ์เป็นฟอสโฟรีเลทและยับยั้ง eIF2 ซึ่งนำไปสู่การปราบปรามการแปลทั่วโลก ยกเว้นโปรตีนที่ตอบสนองต่อ UPR บางตัว เช่น ATF4, CHOP และ Grp78 GADD34 (โปรตีนฟอสฟาเตส 1 หน่วยย่อยกฎระเบียบ 15A (PPP1R15A)) เป็นหนึ่งในโปรตีนที่เพิ่มขึ้นภายใต้การยับยั้งที่เกี่ยวข้องกับฟอสโฟรีเลต eIF2 (eIF2 (P)) และการควบคุมในชุดข้อมูลของเรา (รูปที่ 5D, G) GADD34 เป็นโปรตีนฟอสฟาเตส-1 ที่ลดฟอสโฟรีเลท eIF2 (P) เพื่อควบคุมการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนที่เกิดจาก UPR ในเชิงลบ [53] นิพจน์ GADD34 (PPP1R15A) กลายเป็นการเปลี่ยนแปลงของ log2-fold ที่มากกว่า 1 หลังจาก 12 ชั่วโมงของ Stx2 ในชุดข้อมูลของเรา และยังคงเพิ่มขึ้นต่อไปจนกระทั่ง 24 ชั่วโมงเมื่อมันอยู่ในที่ราบสูง (การเปลี่ยนแปลงของ log2- fold เท่ากับ 2.1) และรักษาสิ่งนี้ไว้ ระดับจนถึงจุดสิ้นสุด (รูปที่ 5D,G) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่า UPR ที่เหนี่ยวนำโดย Stx2- มีการตอบรับเชิงลบหลังจาก 12 ชั่วโมง การถอดความและการแปลที่เพิ่มขึ้นของ CHOP (DDIT3, GADD153) เป็นจุดเด่นของ ER-stress และรูปแบบการแสดงออกที่แตกต่างกันคล้ายกับ GADD34 ยกเว้น log2 ที่ใหญ่กว่า 1 เกิดขึ้นหลังจาก 24 ชั่วโมงและค่อยๆ ราบสูงหลังจากนั้น (log2 เท่ากับ 1.3) (รูปที่ 5D, G) นอกจากนี้ CEBPB ซึ่งเป็นพันธมิตรการลดขนาดที่โดดเด่นของ CHOP ยังได้รับการควบคุมในชุดข้อมูลของเรา (รูปที่ 5D, G) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแม้ว่าความเครียด ER ที่เกิดจาก Stx2- จะเริ่มต้นตั้งแต่ช่วงแรกๆ ของหลักสูตร แต่ก็จะเพิ่มผลกระทบสูงสุด 24 ชั่วโมง และรักษาระดับความเครียด ER นี้ไว้จนกระทั่งสิ้นสุด ในขณะที่แขนตอบรับเชิงลบก็สร้างสมดุลในตัวเองไปพร้อมๆ กัน

3.2.3. แอคติวิตี (III), แอคติวิตีโปรตีนยับยั้งไรโบโซม (RIP)

โดยการแยกอะดีนีนออกจาก rRNA ทำให้ Stxs ยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนเดอโนโว rRNA ที่ถูกทำลายมีอิทธิพลต่อการเปลี่ยนแปลงของสัณฐานวิทยาของไรโบโซม ซึ่งกระตุ้นการถ่ายโอนสัญญาณ [11] ที่เรียกว่าการตอบสนองความเครียดจากไรโบพิษ (RSR) ซึ่งนำไปสู่การกระตุ้นการทำงานของยีนที่มีลักษณะเฉพาะ (ดูย่อหน้าถัดไป)

3.2.4. กิจกรรม (IV), กิจกรรมตอบสนองต่อความเครียดจากไรโบเป็นพิษ (RSR)

ZAK (MAPKKK) เป็นไคเนสที่รู้จักใน RSR และกระตุ้นการทำงานของไคเนสเทอร์มินัล JUN N (JNK) และเส้นทาง p38 MAPK [12,15] Stx1 กระตุ้นให้เกิดการแสดงออกของ JUN และ FOS mRNA ในเซลล์เยื่อบุผิวในลำไส้ของมนุษย์ และเหตุการณ์นี้จำเป็นต้องมี Stx1 ที่มีฤทธิ์เป็นบวกของ RIP ซึ่งคิดว่าอยู่ภายใต้การควบคุมของ RSR [15] โมเลกุลดาวน์สตรีม RSR อีกตัวหนึ่งคือ p38 MAPK เป็นที่ทราบกันว่ากระตุ้นยีนตอบสนองตั้งแต่เนิ่นๆ เช่น JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 และ ATF3 [54] ซึ่งทั้งหมดนี้แสดงออกมาอย่างแตกต่างในชุดข้อมูลของเรา วิถีทาง JNK และ p38 MAPK เป็นที่รู้กันว่าเป็นเหตุการณ์ปลายน้ำที่ถูกกระตุ้นของ Ire-1 ภายใต้ UPR (รูปที่ 4B,D และ 5B,E,F) [47] ด้วยเหตุนี้ Stxs อาจเปิดใช้งานเส้นทางทั้งสองนี้ผ่านทาง RSR และ/หรือ UPR วิถีทางไคเนสที่ควบคุมสัญญาณนอกเซลล์ (ERK) 1/2 ยังแสดงให้เห็นว่าอยู่ปลายน้ำของ RSR [55] และยีน DUSP1 (MKP1) เป็นที่รู้กันว่าถูกกระตุ้นโดยวิถีทาง ERK1/2 [56] Stx1 และอะนิโซมัยซิน (ตัวยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนอีกชนิดหนึ่ง) สามารถกระตุ้นการแสดงออกของ DUSP1 ในเซลล์ Caco-2 ได้ [57] ในชุดข้อมูลของเรา มีการกระตุ้นการแสดงออกของ DUSP1 และสิ่งนี้อาจบ่งบอกถึงการเปิดใช้งาน ERK1/2 (รูปที่ 4B, D)

3.2.5. กิจกรรม (V) การถอดรหัสยีนโดยเฉพาะที่นำไปสู่ไซโตไคน์

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 หลังจาก 24 และ 48 ชั่วโมง ตามลำดับ (รูปที่ 5F) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่ายีนหมวกภายใต้วิถีทาง NF-κB, IκB (คลาสสิก) และ RelB (ทางเลือก) ได้รับการเหนี่ยวนำ เนื่องจากการแสดงออกที่แตกต่างกันของ CHOP (DDIT3) เกิน log2 มากกว่า 1 หลังจาก 24 ชั่วโมง ไตของหนูจึงได้รับ UPR ดังนั้น จึงเปิดใช้งาน PERK phosphorylates eukaryotic Translation Initiation Factor 2 subunit alpha (eIF2) เพื่อยับยั้งการแปลความหมายของ NFKBIA [60] ด้วยเหตุนี้ การเพิ่มขึ้นของ NFKBIA mRNA อาจไม่ยับยั้งเส้นทาง NF-κB มากนัก ดังนั้นจึงอนุญาตให้ถอดรหัสปัจจัยการอักเสบได้ (รูปที่ 5L)

สบเบ และคณะ [61] แสดงให้เห็นว่าทั้งเส้นทางคลาสสิก (RelA-p50) และทางเลือก (RelB-p52) NF-κBมีการใช้งานในหนูฉีด Stx ที่ตรวจจับการควบคุมของไซโตไคน์เป้าหมาย RelA CCL20, CXCL1 และ CXCL10 ที่แสดงออกแตกต่างกันในของเรา ชุดข้อมูล (รูปที่ 5L)

3.2.6. แอคติวิตี (VI), อะพอพโทซิสที่ชักนำโดย Stxs

พบ caspase 3 ที่แยกออกมาในการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ Stxs [13,15,62] ได้แสดงให้เห็นว่าการเปิดใช้งานแคสเปส-3 หรือการเหนี่ยวนำของการตายของเซลล์โดย Stxs เกิดขึ้นในบริบทของ RSR และ UPR ใน RSR ที่เกิดจาก Stxs ทั้งเส้นทาง p38 MAPK และ JNK เกี่ยวข้อง [15] เช่นเดียวกับการรายงานการเปิดใช้งาน ERK [55] ในทางกลับกัน UPR เป็นที่ทราบกันดีว่ากระตุ้นเส้นทาง NF-κB, JNK และ p38 MAPK CHOP (DDIT3) ภายใต้ UPR แสดงให้เห็นว่าเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ [63] และยังแสดงให้เห็นในการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ Stxs ด้วย [13] มีรายงานการมีส่วนร่วมของ JNK ในการตายของเซลล์ที่เกิดจาก UPR เช่นกัน [64] ในชุดข้อมูลของเรา DEG หลายรายการ เช่น CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN และ JUNB เกี่ยวข้องกับ RSR และ UPR (รูปที่ 5B,F)

3.3. ความผิดปกติของ Circadian โดย Stx2

การเพิ่มขึ้นของซีรั่ม endothelin-1 (ET-1, EDN1) เกิดขึ้นในผู้ป่วย STEC-HUS [65] นอกจากนี้ จากการทดลอง Stx2 ทำให้เกิดการแสดงออกของ EDN1 โดยการเปิดใช้งานการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับ MAPK [66] ในขณะที่ UPR เป็นที่รู้กันว่าทำให้เกิดการถอดรหัส EDN1 [67] ในชุดข้อมูลของเรา การแสดงออกของ EDN1 ที่เกิดจากการรักษา Stx2 ทั้งในไตของหนูและเซลล์ tubular ใกล้เคียงของมนุษย์ (รูปที่ 5G) เนื่องจากการแสดงออกของยีน EDN1 เป็นตัวส่วนร่วมของไตของหนูและเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของมนุษย์ จึงแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ EDN1 เกิดขึ้นอย่างน้อยในบางส่วนในเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียง ในร่างกาย นอกเหนือจากเซลล์บุผนังหลอดเลือด นอกจากนี้ ET ที่หลั่งออกมา-1 ยังกระตุ้นการแสดงออกของ EGR1 ผ่านการเปิดใช้งาน MAPK [68] ข้อมูลของเรายืนยันการควบคุม EGR1 ในเวลาเมื่อมีการควบคุม EDN1 (รูปที่ 5H) EGR1 กระตุ้นให้เกิดการแสดงออกของปัจจัยสำคัญจังหวะการเต้นของหัวใจ PER1 [69] ดังนั้น จึงปรับความกว้างของปัจจัยการเต้นของหัวใจอื่นๆ (รูปที่ 5H)

ในการควบคุมวงจรชีวิต เฮเทอโรไดเมอร์ของ CLOCK-BAML1 (ARNTL) จะควบคุม PER1 และ CRY1 ในทางกลับกัน เฮเทอโรไดเมอร์ PER1-CRY1 จะจับกับ CLOCK-BAML1 (ARNTL) เพื่อระงับการถอดรหัสเพิ่มเติมของตัวเอง ดังนั้นจึงทำให้เกิดวงวนเชิงลบของจังหวะการเต้นของหัวใจ ดังนั้นจุดสูงสุดของการแสดงออกของยีนควบคุมเชิงบวก (CLOCK และ BAML1 (ARNTL)) และยีนควบคุมเชิงลบ (PER1 และ CRY1) เกิดขึ้นในอีกชั่วโมงหนึ่งซึ่งเมื่อ CLOCK และ BAML1 (ARNTL) มีการแสดงออกเพิ่มขึ้น PER1 และ CRY1 จะลดลง และรูปแบบจะเปลี่ยนไปในชั่วโมงต่อๆ ไป เมื่อเราเพิ่มบันทึก2-ค่าการเปลี่ยนแปลงพับของ CLOCK และ BAML1 (ARNTL) ลงในกราฟ (รูปที่ 5J) ในช่วงเวลาก่อนหน้า PER1 และ BAML1 (ARNTL) แสดงรูปแบบจังหวะที่ตรงกันข้ามกับจุดสูงสุดที่แหลมคม/แคบ อย่างไรก็ตาม หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมง ยอดเขาก็เริ่มทื่อและเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องโดยไม่มีจังหวะ นี่หมายความว่า Stx2 มีอิทธิพลต่อจังหวะการทำงานของไตรวมถึงภายใน tubules ที่ใกล้เคียง แม้ว่าจำเป็นต้องมีการทดลองยืนยันเพิ่มเติม ข้อมูลของเรารวมกับวรรณกรรมตีพิมพ์ที่อธิบายผลกระทบของ PER1 ต่อการควบคุมวงจรการทำงานของไตต่อสิ่งเร้า [70,71] แนะนำการมีส่วนร่วมของ Stx2 ที่เป็นไปได้ในการรบกวนจังหวะวงจรชีวิตและผลกระทบต่อการทำงานของท่อใกล้เคียงโดยการลดยีนนาฬิกาไต - ปัจจัยควบคุมเช่น SGLT1 (SLC5A1) (รูปที่ 5K) อันที่จริง เราสังเกตเห็นกลูโคซูเรียในหนูที่ถูกฉีด Stx{2-ซึ่งสืบพันธุ์ในการศึกษาอื่นด้วยหนูที่ถูกฉีด Stx1- [21] ซึ่งบ่งชี้ถึงความผิดปกติของ SGLT1 (SLC5A1) ในท่อส่วนใกล้เคียง (ตารางที่ 3) เท่าที่เราทราบ นี่เป็นรายงานแรกที่บ่งชี้การมีส่วนร่วมของ Stx2 ในการรบกวนจังหวะการทำงานของไต

4. ข้อสรุป

เราได้พิจารณายีนที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกที่เกี่ยวข้องกับท่อใกล้เคียงซึ่งถูกเปลี่ยนแปลงโดย Stx2 การแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนเหล่านี้สันนิษฐานว่าเป็นผลมาจากกิจกรรมของ Stx2 เช่น การเหนี่ยวนำ UPR, RSR ที่เกี่ยวข้องกับการลดความบริสุทธิ์ของ rRNA และการส่งสัญญาณที่เกิดจากการจับตัวรับพลาสมาเมมเบรน Gb3 ยีนที่แสดงออกมากที่สุด GDF15 อาจส่งผลต่อการลดน้ำหนักที่เกิดจาก Stx2 ผ่านทางตัวรับที่จำกัดก้านสมองโดยการลดการบริโภคอาหาร เมทริกซ์นอกเซลล์และการยึดเกาะของเซลล์อาจได้รับอิทธิพลจาก PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 และ CTGF ที่ทำให้เกิดพยาธิวิทยาที่จำเพาะของ Stx{15}} และการหลุดลอก ยิ่งไปกว่านั้น การรบกวนจังหวะการเต้นของหัวใจของไตโดย Stx2 อาจส่งผลให้เกิดข้อบกพร่องในการทำงานของท่อใกล้เคียง เช่น การดูดซึมกลูโคสกลับคืนมา

5. วัสดุและวิธีการ

5.1. สัตว์ หนู

(C57BL/6, ตัวผู้, 19–22 กรัม, ปลอดเชื้อโรคโดยเฉพาะ) ซื้อจาก Charles River Laboratories Japan, Inc. (โยโกฮาม่า, ญี่ปุ่น) อาหารและน้ำได้รับอย่างไม่จำกัด หนูถูกดูแลรักษาด้วยวงจรแสง-มืดมาตรฐาน 12 ชั่วโมง: 12 ชั่วโมง โดยจะเปิดไฟเวลา 7.00 น. และปิดเวลา 19.00 น. อุณหภูมิห้องของสัตว์จะถูกเก็บไว้ประมาณ 24 °C ขั้นตอนทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลสัตว์ของมหาวิทยาลัย

5.2. เนื้อเยื่อไตของมนุษย์

การศึกษานี้ใช้เนื้อเยื่อซากศพที่ไม่มีการระบุตัวตน และถือว่าได้รับการยกเว้นตามแนวทางการสืบสวนของมนุษย์ของมหาวิทยาลัย

5.3. การเพาะเลี้ยงเซลล์

การเพาะเลี้ยงเซลล์ปฐมภูมิของเซลล์เยื่อบุผิวท่อไต (RPTEC) ของมนุษย์ซื้อจาก Clonetics (Walkersville, MD, USA) และคงไว้ที่อุณหภูมิ 37 ◦ C, บรรยากาศ CO2 5% เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางการเจริญเติบโตของเซลล์เยื่อบุไตที่เสริมด้วยปัจจัยการเจริญเติบโตของผิวหนังชั้นนอกของมนุษย์, ไฮโดรคอร์ติโซน, เอพิเนฟริน, อินซูลิน, ไตร-ไอโอโดไทโรนีน, ทรานสเฟอร์ริน, GA-1000 และ FBS

5.4. การทำให้บริสุทธิ์ของการกำจัด LPS-Free Stx2 LPS จาก Stx2 ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [72] โดยสรุป คอลัมน์ที่ผันแอนติบอดี anti-Stx2 11E10 ถูกนำมาใช้เพื่อให้ได้เศษส่วน Stx2 และต่อมาเศษส่วนก็ถูกส่งผ่าน Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) เพื่อถอด LPS เศษส่วนของ Stx2 ถูกกรองด้วยตัวกรอง 0.2 µm และระดับ LPS ถูกทดสอบด้วยการทดสอบ Limulus amebocyte lysate (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA) เศษส่วนของ Stx2 ถูกกำหนดหาว่ามีหน่วยเอนโดทอกซินน้อยกว่า 0.03 (EU)/มิลลิลิตร ประเภทตัวแปร Stx2 คือ Stx2a

5.5. การบริหารให้ Stx2 แก่หนูเมาส์ ขนาดยา 2LD50 (5 ng Stx2/น้ำหนักตัว 20 กรัม) ซึ่งฆ่าหนูเมาส์ภายในสี่วัน (รูปที่ S3A) ถูกฉีดให้กับหนูเมาส์ในช่องท้องในปริมาตร 0.1 มล. ในน้ำเกลือที่ปราศจาก LPS (บริษัทโอสึกะ ฟาร์มาซูติคอล ประเทศญี่ปุ่น) การฉีดสารพิษเสร็จสิ้นระหว่างเวลา 7.00 น. ถึง 9.00 น. ซึ่งหนูในหลักสูตรที่ใช้เวลานานกว่าจะได้รับ Stx2 เวลา 7.00 น. และตามด้วยการสุ่มตัวอย่าง 24, 48 และ 72 ชั่วโมงเวลา 7.00 น.

5.6. การเก็บตัวอย่างปัสสาวะและการวัดระดับน้ำตาลในเลือด หลังจากการฉีด Stx2 เป็นเวลา 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 และ 84 ชั่วโมง จะมีการถ่ายปัสสาวะและปล่อย 10 µL ลงบนสไลด์เคมีแห้งของ Fuji GLU- วัด P III (FUJIFILM, คานากาว่า, ญี่ปุ่น) และกลูโคสในปัสสาวะด้วย Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) ที่โรงงานที่จัดการโดย ปัสสาวะจากการฉีด pre-Stx2 ถูกใช้เป็นตัวอย่าง 0 ชั่วโมง การเก็บปัสสาวะดำเนินการกับหนูสองตัว

5.7. การประมวลผลเนื้อเยื่อ หลังจากการฉีด Stx2 เป็นเวลา 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 และ 72 ชั่วโมง หนูสามตัวต่อช่วงเวลาถูกการุณยฆาตโดย CO2 และไตถูกรวบรวม ไตครึ่งหนึ่งได้รับการแก้ไขด้วยน้ำเกลือพาราฟอร์มัลดีไฮด์/ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 4% เป็นเวลา 7 วันที่อุณหภูมิ 4 °C และประมวลผลในส่วนพาราฟิน อีกครึ่งหนึ่งของไตถูกใช้เพื่อแยก RNA สำหรับการวิเคราะห์ไมโครเรย์ หนูสามตัวที่ไม่มีการบำบัดใดๆ ถูกใช้เป็นตัวควบคุมปกติ (ไร้เดียงสาหรือ 0 ชั่วโมง) หนูสามตัวถูกฉีดด้วย PBS (พาหะนำยา) และเสียสละที่ 72 ชั่วโมงและทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมพาหะนำโรคเพื่อแสดงว่ามีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในการแสดงออกของยีนเมื่อเปรียบเทียบกับการควบคุมปกติ

5.8. ส่วนพาราฟินที่เป็นคราบกรด-ชิฟฟ์ (PAS) เป็นระยะถูกทำให้ชุ่มชื้นและย้อมด้วยสารละลายกรดเป็นระยะ 0.5% ตามด้วยการล้างด้วยน้ำกลั่น ส่วนต่างๆ ถูกถ่ายโอนไปยังรีเอเจนต์ของชิฟฟ์ หลังจากล้างส่วนต่างๆ ด้วยสารละลายโซเดียมไบซัลไฟต์ 0.6% อย่างละเอียดแล้ว พวกมันถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลิน

5.9. การบำบัด Stx2 ในเซลล์ RPTEC ของมนุษย์ RPTEC ได้รับการบำบัดด้วย Stx2 10 ng/mL เป็นเวลา 6, 13 และ 19 ชั่วโมง ภายใต้อุณหภูมิ 37 °C, CO2 5% การบำบัด RPTEC ที่ไม่มี Stx2 ถูกใช้เป็นตัวควบคุม มีการจำลองทางชีวภาพสองครั้งต่อจุดเวลา หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกใช้สำหรับการสกัด RNA

5.10. การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์แบบลอยฟรี สำหรับการประมวลผลส่วนที่ลอยอย่างอิสระ เมาส์ปกติได้รับการแก้ไขอย่างครบถ้วนตามที่อธิบายไว้ใน Obata และคณะ [69]. จากนั้นไตของหนูจะถูกผ่าและแช่ใน PFA/PBS 4% เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 4 ◦C โดยกวนเบาๆ ล้างเนื้อเยื่อด้วย PBS และป้องกันความเย็นด้วยซูโครส 30%/PBS ที่ 4 ◦C ข้ามคืนหรือจนกระทั่งจมลงสู่ด้านล่าง ส่วนแช่แข็งหนา (50 ไมโครเมตร) ถูกตัดด้วยไมโครโตมแบบเลื่อนที่มีการตั้งค่าแช่แข็ง ส่วนต่างๆ ถูกปิดกั้นด้วยแอนติบอดีต่อต้านหนู IgM แพะ 1:50 ใน PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงและบ่มด้วยแอนติบอดีต่อต้าน Gb3/CD77 1:100 ในการปิดกั้น สารละลายหรือการควบคุมไอโซไทป์ (IgM ของหนู) ในความเข้มข้นที่ตรงกันเป็นแอนติบอดีหลักสำหรับข้ามคืนที่ 4 ◦C หลังจากการล้าง ส่วนต่างๆ จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (ต่อต้านหนู IgM Alexa Fluor 488, การเจือจาง 1:2000 ใน PBS) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 4 —C ส่วนต่างๆ ถูกย้อมสำหรับโพรบอื่น AQP1 (การเจือจาง 1: 1, 000, Sigma-Aldrich Japan, โตเกียว, ญี่ปุ่น) และ CD31 (550274, การเจือจาง 1:50, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) พร้อมแอนติบอดีทุติยภูมิต่อต้านกระต่าย IgG Alexa Fluor 546 (การเจือจาง 1:2000 ใน PBS) และ IgG ต่อต้านเมาส์ Alexa Fluor 647 (การเจือจาง 1:2000 ใน PBS) ตามลำดับ หลังจากล้างด้วย PBS คราบฟีนิลินโดล 40 ,6-ไดอามิดิโน-2-ฟีนิลินโดล (DAPI, D21490, เทอร์โม ฟิชเชอร์) ถูกทำให้เสร็จเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ◦C ส่วนต่างๆ ถูกจุ่มลงในของเหลวในบ่อของจานหลุม 96- (รูปตัวยู) โดยมีการทาสีเล็กๆ ทุกครั้งที่เปลี่ยนสารละลาย ขั้นตอนการล้างเสร็จสิ้นในบ่อขนาดใหญ่ เช่น ในจานหลุม 12- หรือ 6- สารยึดติดที่มีน้ำถูกใช้สำหรับการปกปิด สำหรับการเตรียมเนื้อเยื่อของมนุษย์ ไตหลังชันสูตรได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลิน 20% เป็นเวลา 2 สัปดาห์และประมวลผลเพื่อการเตรียมแบบลอยอิสระเช่นเดียวกับที่ทำกับเนื้อเยื่อของหนู โดยมีข้อยกเว้นหนึ่งประการคือแอนติบอดีต้าน CD31 ของมนุษย์ (CBL468, การเจือจาง 1:20, Merck KGaA, ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี) ถูกนำมาใช้

5.11. การวิเคราะห์ไมโครเรย์

ครึ่งหนึ่งของไตถูกแช่ใน RNALater 2 มล. (Ambion, Austin, TX, USA) ที่ 4 ° C และ RNA ทั้งหมดถูกสกัดด้วยชุด Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA) ใช้อาร์เรย์ Mouse Genome 43 0 A 2. 0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) ได้รับไฟล์ CEL และปรับให้เป็นมาตรฐานด้วยค่าเฉลี่ยหลายชิป (RMA) ที่แข็งแกร่ง การคำนวณหมายเลขสำเนา RNA และการเปลี่ยนแปลงแบบพับเทียบกับ 0 ชั่วโมงถูกดำเนินการใน R (v.3.6.0) พร้อมแพ็คเกจของมัน affy [73] และ RankProd 2.0 [74] ข้อมูลจะแสดงในบันทึก2-ค่าการเปลี่ยนแปลงพับ ชุดข้อมูลถูกฝากไว้ที่ Gene Expression Omnibus (GEO) (หมายเลขภาคยานุวัติ GSE172465) จากเซลล์ RPTEC RNA ทั้งหมดถูกสกัดด้วย RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tokyo, Japan) โอลิโกนิวคลีโอไทด์ไมโครอาร์เรย์จีโนมมนุษย์ทั้งหมด (ไมโครอาร์เรย์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ DNA 44K, Agilent Technologies, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ใช้สำหรับการทดลองไมโครเรย์ ตัวอย่าง RNA ทั้งหมดถูกนำมาใช้ในการเตรียมโพรบ cDNA ที่มีป้ายกำกับ Cy5- และ Cy3- ตัวอย่างที่ติดฉลากฟลูออโรฟอร์ถูกผสมบนสไลด์แก้วแต่ละอันแล้วล้าง จากนั้นสแกนด้วยเครื่องสแกน DNA microarray (รุ่น G2505A; Agilent Technologies) ซอฟต์แวร์การแยกคุณสมบัติและการวิเคราะห์รูปภาพ (Agilent Technologies) ถูกใช้เพื่อค้นหาและวิเคราะห์ทุกจุดในอาเรย์และเพื่อรวมความเข้ม ซึ่งจากนั้นจะถูกกรองและทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้วิธีการปรับให้เรียบของ Scatterplot ที่ถ่วงน้ำหนักในเครื่อง ความสามารถในการทำซ้ำของการวิเคราะห์ไมโครเรย์ได้รับการประเมินโดยการสลับสีย้อมซ้ำสองครั้งในการทดลองแต่ละครั้ง เปรียบเทียบความแตกต่างในการแสดงออก mRNA ระหว่างกลุ่มควบคุมและ RPTEC ที่ได้รับการบำบัดด้วย Stx2- ที่เก็บเกี่ยวที่ 6, 10 หรือ 19 ชั่วโมง ข้อมูลรูปแบบ TXT จากซอฟต์แวร์ GeneSpring ใช้เพื่อระบุชื่อยีนจาก ID โพรบ และแปลงการเปลี่ยนแปลงแบบพับเป็นการเปลี่ยนแปลง2-แบบพับ ชุดข้อมูลถูกฝากไว้ที่ GEO (หมายเลขภาคยานุวัติ GSE172466)

5.12. การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศของข้อมูลไมโครเรย์และการแสดงภาพ ในไตของเมาส์และข้อมูลไมโครเรย์ของ RPTEC ยีนที่เหมือนกันในทั้งสองอย่างและที่ซึ่งการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกมากกว่า 2-เท่าลดลงหรือเพิ่มขึ้น (หรือบันทึก2-การเปลี่ยนแปลงเท่าตัว มีขนาดเล็กกว่า −1 หรือใหญ่กว่า 1) ณ จุดเวลาใดก็ได้ที่ถูกเลือกโดย R ยิ่งไปกว่านั้นในข้อมูล microarray ของไตของเมาส์ การปรับเปลี่ยนยีนที่เหมาะกับเส้นโค้งลูกบาศก์ถูกเลือกโดยใช้แพ็คเกจ R maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ maSigPro.html (เข้าถึงล่าสุดเมื่อ 4 มกราคม 2022)] [75] เส้นโค้งลูกบาศก์มีความเหมาะสมเพื่อรองรับการเพิ่มขึ้นหรือลดลงของยีนเหล่านั้นในช่วงเวลาหนึ่ง ระดับพหุนามที่สูงกว่า เช่น เส้นโค้งลูกบาศก์ ช่วยให้สามารถเลือกยีนที่มีการเปลี่ยนแปลงหลายอย่างในช่วงเวลาได้ดีกว่าเส้นโค้งกำลังสอง ยีนที่มีพฤติกรรมตามวิถีที่คล้ายกันถูกรวมกลุ่มกันและรูปแบบการลดลง/เพิ่มขึ้นของพวกมันถูกมองเห็นด้วยแผนที่ความร้อนโดยใช้แพ็กเกจ R gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (เข้าถึงล่าสุดเมื่อวันที่ 4 มกราคม 2022)] [76]. อภิปรัชญาของยีน (GO) ได้รับมอบหมายและฟังก์ชันของ GO ในบรรดายีนทั่วไปได้รับการเสริมสมรรถนะโดยใช้ Metascape [//metascape.org (เข้าถึงล่าสุดเมื่อวันที่ 4 มกราคม 2565)] [77] วิเคราะห์การเชื่อมต่อ/ความสัมพันธ์ของยีนทั่วไปโดยใช้ STRING [https://string-db.org/ (เข้าถึงล่าสุดเมื่อวันที่ 4 มกราคม 2565)] [78] ค้นหาความสัมพันธ์ระหว่างยีนทั่วไปด้วยตนเอง รวมถึงการใช้ฟังก์ชันการขุดข้อความของ STRING

อ้างอิง

1. จิอันโตนิโอ ค.; วิตาโค ม.; เมนดิลาฮาร์ซู, F.; รัตตี้, อ.; Mendilaharzu, J. กลุ่มอาการเม็ดเลือดแดงแตก-ยูเรมิก.เจ. กุมาร.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. วิทสกี้ BH; ซูซูกิ ย.; สเตราส์, ล.; Churg, J. The hemolytic-uremic syndrome: การศึกษาการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาของไตเช้า. เจ. ปฐอล.1969, 57, 627–647. 

3. ทาเคดะ ต.; โดฮี ส.; อิการาชิ ต.; ยามานากะ ต.; โยชิยะ เค.; Kobayashi, N. การด้อยค่าของเวโรทอกซินของการทำงานของท่อก่อให้เกิดความเสียหายของไตที่พบในกลุ่มอาการ hemolytic uraemicเจติดเชื้อ1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. คาตากิริ YU; โมริ ต.; นากาจิมะ เอช.; คาตากิริ ค.; ทากุจิ ต.; ทาเคดะ ต.; คิโยคาว่า น.; Fujimoto, J. การเปิดใช้งานไคเนสตระกูล Src ใช่เกิดจากสารพิษของ Shiga จับกับ globotriaosyl ceramide (Gb3/CD77) ในไมโครโดเมนที่มีความหนาแน่นต่ำและไม่ละลายน้ำในผงซักฟอกเจ. ไบโอล. เคมี.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. ทาเคโนะอุจิ เอช.; คิโยคาว่า น.; ทากุจิ ต.; มัตซุย เจ.; คาตากิริ YU; โอคิตะ, เอช.; โอคุดะ, เค.; Fujimoto, J. Shiga สารพิษจับกับ globotriaosyl ceramide ทำให้เกิดสัญญาณภายในเซลล์ที่เป็นสื่อกลางในการเปลี่ยนแปลงโครงร่างโครงกระดูกในเซลล์ที่ได้มาจากมะเร็งไตของมนุษย์เจ. เซลล์วิทย์.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [ผับเมด] 

6. การ์เรด โอ.; ฟาน เดียร์ส บี.; Sandvig, K. ความแตกแยกที่เกิดจาก Furin และการกระตุ้นการทำงานของสารพิษ Shigaเจ. ไบโอล. เคมี.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. พล.ต. I.; เฟอร์รารี่ ดี.; Söling, HD การลดพันธะโปรตีนไดซัลไฟด์ในสภาพแวดล้อมออกซิไดซ์ สะพานไดซัลไฟด์ของอหิวาตกโรคทอกซิน A-subunit จะลดลงในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมกุมภาพันธ์ เลตต์.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. สปูนเนอร์, RA; วัตสัน, พีดี; มาร์สเดน ซีเจ; สมิธ ดี.ซี.; มัวร์, KAH; คุก เจแปน; ลอร์ดเจเอ็ม; Roberts, LM โปรตีนไดซัลไฟด์ไอโซเมอเรสลดไรซินไปยังสายโซ่ A และ B ในเรติคูลัมเอนโดพลาสมิกไบโอเคม เจ.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. หยู ม.; Haslam, DB Shiga Toxin ถูกขนส่งจาก Endoplasmic Reticulum หลังจากมีปฏิสัมพันธ์กับ Luminal Chaperone HEDJ/ERdj3ติดเชื้อ ภูมิคุ้มกัน2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. ฟัลกิแยร์ ต.; โยฮันเนส, L. Shiga สารพิษ B-หน่วยย่อยจับกับพี่เลี้ยง BiP และโปรตีนนิวเคลียส B23ไบโอล เซลล์2006, 98, 125–134. [CrossRef]