ศึกษาผลกระทบของ acteoside (ส่วนผสมที่ใช้งานอยู่ใน Cistanche Deserticola) ต่อ NAFLD โดยการกระตุ้น autophagy

เชิงนามธรรม:

 

วัตถุประสงค์:ในการสำรวจฟังก์ชั่นการกระตุ้น autophagy ของสารออกฤทธิ์ acteoside (ACT) ใน Cistanche Deserticola และผลกระทบต่อโรคตับไขมันที่ไม่มีแอลกอฮอล์ (NAFLD)

วิธีการในการใช้ echinacoside และทำหน้าที่เป็นวัตถุวิจัย 1 0 0 μmol/L Act และ echinacoside (ECH) ถูกรวมเข้ากับ autophagy-lysosome inhibitor Bleomycin A1 สำหรับการแทรกแซงการแทรกแซง immunoblotting โปรตีนถูกใช้เพื่อตรวจจับระดับการแสดงออกสัมพัทธ์ของเครื่องหมาย autophagy microtubule โปรตีนที่เกี่ยวข้องโปรตีน 1 โซ่แสง 3 (LC 3- II) เซลล์ HepG2 ได้รับการแทรกแซงด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของการกระทำในหลอดทดลองและตรวจพบความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้วิธีเกลือ tetrazolium ในการแทรกแซงหลอดทดลองของเซลล์ HepG2 ที่มีความเข้มข้นต่างกันของการกระทำที่แตกต่างกันรวมกับ balofloxacin A1 และการตรวจจับ LC 3- ระดับโปรตีน แบบจำลอง NAFLD ที่สร้างขึ้นในหลอดทดลองโดยใช้การแทรกแซงยาเสพติดในการย้อมหยดไขมันโดยใช้วิธีการย้อมสีน้ำมันสีแดง O และตรวจจับระดับไตรกลีเซอไรด์ในเซลล์ สังเกตการแปลโปรตีน LC3 และหยดไขมันผ่านเทคโนโลยีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ ผลลัพธ์การกระทำสามารถกระตุ้น autophagy ในเซลล์ HepG2 อย่างมีนัยสำคัญและระดับการแสดงออกของ LC 3- II เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รับการปฏิบัติเพียงอย่างเดียว) (1.36 ± 0. 11, 0. ตามลำดับ) มีนัยสำคัญทางสถิติ (P0.05) 50 μmol/L ทำหน้าที่เหนี่ยวนำให้เกิด autophagy อย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ HepG2 และระดับการแสดงออกของ LC 3- II โปรตีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (1.83 ± 0.53, 0.35 ± 0.18 ตามลำดับ) ระดับ TG ของเซลล์ HepG2 ในกลุ่มการแทรกแซง ACT (19.11 ± 1.68) ต่ำกว่าในกลุ่ม NAFLD ในกลุ่มโมเดลเซลล์หลอดทดลอง (34.15 ± 1.90) และความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

คำสำคัญ:โรคตับไขมันที่ไม่มีแอลกอฮอล์;Cistanche Deserticola;acteoside; autophagy

 

TCM Herb Cistanche สำหรับการรักษาโรคตับไขมันที่ไม่มีแอลกอฮอล์ (NAFLD)

คลิกที่รูปเพื่อรับรายละเอียดเพิ่มเติม

 

ในช่วงไม่กี่ทศวรรษที่ผ่านมาไขมันที่ไม่มีแอลกอฮอล์โรคตับ(NAFLD) ได้กลายเป็นเรื่องธรรมดาที่สุดโรคตับเรื้อรังด้วยความชุกทั่วโลกประมาณ 25% ของประชากรผู้ใหญ่และได้รับการพิจารณาว่าเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับโรคเมตาบอลิซึม [1] แม้ว่าความน่าจะเป็นของภาวะแทรกซ้อนที่เกี่ยวข้องกับตับในผู้ป่วย NAFLD นั้นน้อยกว่า 10%แต่ NAFLD เป็นปัจจัยเสี่ยงต่อโรคที่เกี่ยวข้องกับตับเช่นโรคตับแข็งและมะเร็งตับปฐมภูมิซึ่งกำหนดภาระทางเศรษฐกิจอย่างมากต่อผู้ป่วย [2-5] แม้จะมีความสนใจเพิ่มขึ้นที่จ่ายให้กับ NAFLD แต่ NAFLD ในฐานะโรคเรื้อรังที่สำคัญยังไม่ได้รับความสนใจเพียงพอ ดังนั้นความเข้าใจในเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับการเกิดโรคของ NAFLD และการค้นหากลยุทธ์การรักษาที่มีประสิทธิภาพได้กลายเป็นปัญหาเร่งด่วนที่จะแก้ไข [6-7]

การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่า autophagy เซลล์มีบทบาทสำคัญในสรีรวิทยาของตับและพยาธิวิทยา [8] ความผิดปกติของ autophagy หรือ dysregulation เกี่ยวข้องกับโรคตับที่หลากหลายเช่นโรคตับที่เกี่ยวข้องกับแอลกอฮอล์[9], NAFLD [10], steatohepatitis ที่ไม่มีแอลกอฮอล์ [11] และมะเร็งตับ [12] ลักษณะทางพยาธิวิทยาของ NAFLD คือการสะสมของไตรกลีเซอไรด์ (TG) มากเกินไปและหยดไขมันที่เป็นกลางอื่น ๆ (LD) ในเซลล์ตับภายใต้การกระตุ้นที่ไม่มีแอลกอฮอล์ สำหรับตับเส้นทางหลักทั้งสองที่ควบคุม catabolism ของ LDS เหล่านี้คือ lipolysis และ autophagy
ทางเดิน lipolysis ถูกควบคุมโดยไลเปสเป็นกลางของไซโตพลาสซึมเช่นไลเปสที่ไวต่อฮอร์โมนและ adipose tg lipase ในเส้นทาง lipoautophagy ที่สอดคล้องกัน LDS อาจถูกเลือกโดยการสรรหาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ autophagy โดยตรงเพื่อสร้าง autophagosomes และจากนั้น LDS ห่อหุ้มด้วย autophagosomes จะถูกส่งไปยัง lysosomes และสลายตัวโดย lipase acid lipase ดังนั้นการเปิดใช้งาน lipoautophagy ในเซลล์ตับจึงกลายเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพสำหรับการป้องกันและรักษา NAFLD
Cistanche Deserticola เป็นยาสมุนไพรจีนที่มีค่าซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการปฏิบัติทางคลินิกในสูตรการแพทย์แผนจีน ในเวลาเดียวกันมันถูกใช้เป็นอาหารเสริมเพื่อสุขภาพมานานแล้ว Cistanche Deserticola มีส่วนผสมทางชีวภาพที่หลากหลายซึ่งสำคัญที่สุดคือ Cistanche Deserticola phenylethanol glycosides ในฐานะตัวแทนของ phenylethanoid glycosides, echinacoside (ECH) และ verbascoside (ACT) ได้รับรายงานว่ามีกิจกรรมทางชีวภาพที่สำคัญมากมายเช่นสารต้านอนุมูลอิสระ, ระบบประสาท, ภูมิคุ้มกันและการป้องกันตับ [13] ในแง่ของการป้องกันตับการศึกษาพบว่า ECH สามารถปกป้องตับได้โดยการลดผู้ไกล่เกลี่ยการอักเสบยับยั้งการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต- และลดระดับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับพังผืดของตับ ACT มีผลต่อการป้องกันอย่างมีนัยสำคัญต่อความเสียหายของตับเคมีและยาที่เกิดจากยาเช่นแอลกอฮอล์, คาร์บอนเตตราคลอไรด์และ lipopolysaccharide ACT ช่วยลดความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากสารเคมีที่เป็นพิษกำจัดออกซิเจนปฏิกิริยาที่สะสมอยู่ในตับและลดความเข้มข้นของ malondialdehyde ในเวลาเดียวกันมันจะเพิ่มกิจกรรม dismutase ของตับ superoxide dismutase อย่างมีนัยสำคัญและลดปริมาณกลูตาไธโอนและปรับปรุงความเสียหายทางจุลพยาธิวิทยาของตับและการตายของเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ อย่างไรก็ตามไม่มีรายงานวรรณกรรมที่เกี่ยวข้องว่า phenylethanoid glycosides ของ Cistanche deserticola มีส่วนร่วมในกระบวนการของ autophagy ในการป้องกันตับ จากการศึกษาครั้งนี้ใช้วิธีการทางชีววิทยาของเซลล์แบบดั้งเดิมและแบบจำลองเซลล์ในหลอดทดลองเพื่อสำรวจผลกระทบที่เกิดจาก autophagy ของ cistanche deserticola phenylethanoid glycosides และสำรวจการทำงานทางเภสัชวิทยาที่เป็นไปได้

 

1 วัสดุและวิธีการ

1.1 วัสดุ

1.1.1 การวิจัยวิชา ECH และ ACT ถูกนำมาใช้เป็นวิชาวิจัย

1.1.2 วัสดุเซลล์ HepG2 ถูกซื้อจาก Wuhan Punosai Life Science Co. , Ltd. , ECH (หมายเลขแบทช์: B21209) และ ACT (หมายเลขแบทช์: B20715, ความบริสุทธิ์ HPLC มากกว่าหรือเท่ากับ 98%) Trypsin ถูกซื้อจาก Hyclone Company, USA, ซีรั่มของทารกในครรภ์ (หมายเลขแบทช์: 04-002-1 A) ถูกซื้อจาก บริษัท BI, อิสราเอล, เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน (หมายเลขแบทช์: SV30010.01) ปักกิ่ง, จีน, TG (หมายเลขแบทช์: BC0625) ชุดตรวจจับถูกซื้อจาก บริษัท Solebao, ปักกิ่ง, จีน, น้ำมันสีแดง O (จำนวนล็อต: o 0625-100 g), dimethyl sulfoxide (จำนวนมาก: BCBZ1685) สารยับยั้ง Autophagy-lysosome Bafilomycin A1 (BAFA1 จำนวนล็อต: TLRL-BAF1) ถูกซื้อจาก Invitrogen, USA; Autophagy Activator Rapamycin (จำนวนล็อต: S17098) ซื้อจาก Shanghai Yuanye Biotechnology Co. , Ltd. , จีน; โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ Microtubule 1 โซ่แสง 3 (LC3, จำนวนล็อต: L7543, สปีชีส์: กระต่าย, อัตราส่วนการเจือจาง: 1: 1 000) และ -actin (จำนวนล็อต: zrb1312, สปีชีส์: กระต่าย, อัตราส่วนการเจือจาง: 1: {33 แอนติบอดีรองที่มีป้ายกำกับของ Horseradish peroxidase (จำนวนล็อต: 4010-05, สปีชีส์: แพะต่อต้านกระต่าย, อัตราส่วนการเจือจาง: 1: 1 000) ถูกซื้อจาก Biotech ทางใต้, USA, Alexa fluorescent antibody ซื้อจาก Sigma-Aldrich Company, USA และ Bodipy 493/501 (จำนวนล็อต: D3922) ถูกซื้อจาก บริษัท Invitrogen, USA

 

1.2 วิธี

1.2.1 การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์ HepG2 ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารนกอินทรีที่ปรับเปลี่ยนของ Dulbecco ของ Dulbecco ที่มีเซรั่มของทารกในครรภ์ 10%, 100 u/mL penicillin และ streptomycin 100 ug/mL ใน 37 องศา เมื่อการบรรจบกันของเซลล์ถึง 85%วัฒนธรรมย่อยการชุบการแทรกแซงและการดำเนินการอื่น ๆ

 

1.2.2 การตรวจจับโปรตีน immunoblotting

1.2.2.1 พระราชบัญญัติและการรักษาด้วย ECH

LC 3- ⅱระดับการแสดงออกของโปรตีนในเซลล์ HepG2 BAFA1 ในฐานะตัวยับยั้งโปรตอนปั๊มสามารถทำให้ LC 3- ⅱโปรตีนรวมกันในปริมาณมากในเซลล์จึงขยายความสามารถในการเหนี่ยวนำ autophagy ดังนั้นการใช้ BAFA1 แบบรวมกันสามารถใช้เป็นระบบตรวจสอบ autophagy เพื่อประเมินความสามารถในการเหนี่ยวนำ autophagy เซลล์ HepG2 ในระยะการเจริญเติบโตลอการิทึมถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์ 3.5 ซม. สำหรับการเพาะเลี้ยงข้ามคืน 100 μmol/L ACT, ECH และ BAFA1 ถูกนำมาใช้สำหรับการแทรกแซงเป็นเวลา 12 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟตก่อนระบายความร้อน (PBS) และ lysed ทันทีในบัฟเฟอร์ lysis โปรตีน RIPA เป็นเวลา 10 นาที supernatant ถูกปั่นแยกและความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบความเข้มข้นของโปรตีนกรด bicinchoninic หลังจากการหาปริมาณด้วยบัฟเฟอร์โซเดียมโดเดซิลซัลเฟตตัวอย่างจะถูกทำให้ร้อนที่ 95 องศาเป็นเวลา 10 นาทีเพื่อลดโปรตีน จากนั้นตัวอย่าง 30 ไมโครลิตรจะถูกนำมาใช้กับ micropipette และ electrophoresed บนเจล polyacrylamide
หลังจากอิเล็กโทรโฟเรซิสโปรตีนถูกถ่ายโอนจากเจลไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลสถูกบล็อกด้วยนม 1 0% ค้างคืนบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิเฉพาะที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง วิธี ECL ใช้สำหรับการพัฒนาสี พวกเขาถูกตั้งค่าเป็นกลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่า, กลุ่ม Rapamycin, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+Bafa1 Group, ECH+BAFA1 Group และ ACT+BAFA1 Group

 

1.2.2.2 ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ ACT แทรกแซงระดับการแสดงออกของ LC 3- ⅱโปรตีนในเซลล์ HepG2

เซลล์ HEPG2 ระยะการเจริญเติบโตของลอการิทึมถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเพาะเลี้ยงเซลล์ 3.5 ซม. สำหรับการเพาะเลี้ยงข้ามคืนและ 25, 50 และ 100 μmol/L ทำหน้าที่รวมกับ BAFA1 สำหรับการรักษาด้วยการแทรกแซง 12 ชั่วโมงและระดับการแสดงออกของ LC 3- กลุ่มควบคุม (กลุ่ม CON, การควบคุมเปล่า), กลุ่มอดอยาก (กลุ่ม STA, เซลล์การรักษาด้วยความอดอยาก HepG2), 25, 50 และ 100 μmol/L กลุ่ม ACT และ BAFA1 รวมกับกลุ่ม ACT 25, 50 และ 100 μmol/L

1.2.3 MTT วิธีการตรวจจับอัตราการรอดชีวิตของเซลล์ HepG2 ที่ได้รับการรักษาด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ ACT เป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง
เซลล์ HepG2 ในระยะการเจริญเติบโตลอการิทึมได้รับการฉีดวัคซีนในแผ่นดี 96- ที่มีความหนาแน่นของการฉีดวัคซีนปานกลางและเพาะเลี้ยงในศูนย์บ่มเพาะเป็นเวลา 12 ชั่วโมง 2 0, 40, 60, 80, และ 100 μmol/L ACT ถูกเพิ่มเป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง สารละลาย MTT 0.5 mg/ml ถูกเพิ่มในสภาพแวดล้อมที่มืดและบ่มในศูนย์บ่มเพาะ หลังจาก 4 ชั่วโมง supernatant ถูกทิ้งจะเพิ่ม 100 μlของ dimethyl sulfoxide ลงในแต่ละหลุมและเซลล์ถูกเขย่าในเครื่องปั่นอุณหภูมิคงที่ที่ 37 องศาเป็นเวลา 10 นาที ค่าความหนาแน่นของแสง (OD) ที่ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตรถูกตรวจพบโดยเครื่องหมายเอนไซม์และคำนวณอัตราการรอดชีวิตของเซลล์

 

1.2.4 ในการสร้างแบบจำลองเซลล์ NAFLD ในหลอดทดลอง

น้ำหนักของกรด palmitic (PA) ถูกชั่งน้ำหนักและละลายอย่างเต็มที่ในปริมาณของไอโซโพรพานอลเพื่อเตรียมสารละลายสต็อก 100 mmol/L PA ซึ่งถูกแบ่งและเก็บไว้ในตู้เย็นระดับ -20 สำหรับการใช้งานในภายหลัง สารละลายสต็อก PA ถูกเจือจางเป็น 100 μmol/L โดยใช้สื่อการเพาะเลี้ยงที่สมบูรณ์และเพิ่มซีรั่มอัลบูมินในซีรั่มที่ปราศจากกรดไขมัน 1% เซลล์ถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 3 ชั่วโมงเพื่อเตรียมสารละลายการเหนี่ยวนำ เซลล์ HepG2 ในระยะการเจริญเติบโตลอการิทึมถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยงเซลล์ 3.5 ซม. ที่ความหนาแน่นที่เหมาะสมสำหรับการเพาะเลี้ยงข้ามคืนและจากนั้นใช้วิธีการเหนี่ยวนำที่เตรียมไว้สำหรับการแทรกแซง

 

1.2.5 การแทรกแซง ACT NAFLD ในแบบจำลองเซลล์หลอดทดลอง TG และการย้อมสีน้ำมันสีแดง o น้ำมัน

 

1.2.5.1 การตรวจจับ TG

เซลล์ HepG2 ในระยะการเจริญเติบโตลอการิทึมถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยงเซลล์ 3.5 ซม. สำหรับการเพาะเลี้ยงตามกลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่ากลุ่มโมเดลและกลุ่มการแทรกแซง ACT กลุ่มโมเดลถูกเหนี่ยวนำด้วยสารละลายเหนี่ยวนำ 100 μmol/L PA และกลุ่มการแทรกแซง ACT ถูกเหนี่ยวนำด้วยสารละลายการเหนี่ยวนำ 100 μmol/L PA และ ACT 50 μmol/L ACT ถูกเพิ่มเข้ามาในเวลาเดียวกัน เวลาแทรกแซงคือ 24 ชั่วโมง ค่อยๆถอดสื่อการเพาะเลี้ยงแบบเก่าให้ล้างพื้นผิวเซลล์ด้วย PBS ที่ระบายความร้อนก่อนหนึ่งครั้งเพิ่ม 100 μl/จานของสารละลาย ripa lysis ที่ระบายความร้อนล่วงหน้า, lyse อย่างเต็มที่บนน้ำแข็งเป็นเวลา 15 นาที, centrifuge ที่ 4 องศาและ 12 000 r/นาทีเป็นเวลา 10 นาที คำแนะนำ KIT และในที่สุดก็แก้ไขระดับ TG ต่อมก. ของโปรตีน

1.2.5.2 การย้อมสีน้ำมันสีแดง o น้ำมัน

เซลล์ HepG2 ในระยะการเจริญเติบโตลอการิทึมถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยง 3.5 ซม. ที่ปกคลุมไปด้วยผ้าคลุมที่ผ่านการฆ่าเชื้อสำหรับวัฒนธรรมข้ามคืน 100 μmol/L PA เหนี่ยวนำให้เซลล์ก่อตัวเป็นหยดไขมัน ในเวลาเดียวกันพระราชบัญญัติ 50 μmol/L ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อการแทรกแซงเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
สไลด์เซลล์ถูกรวบรวมล้าง 3 ครั้งด้วย PBS ที่ระบายความร้อนก่อนกำหนดด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีล้างพื้นผิวเซลล์ด้วย PBS เพิ่มสารละลายการย้อมสีน้ำมันสีแดง o น้ำมันที่เตรียมไว้ที่อุณหภูมิห้องในสีเข้มเป็นเวลา 15 นาที ถ่ายภาพใต้กล้องจุลทรรศน์

 

1.2.6 การสังเกตการตรวจอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของ autophagosomes และหยดไขมันหลังการรักษาด้วย ACT

เซลล์ HepG2 ในระยะการเจริญเติบโตลอการิทึมถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเลี้ยง 3.5 ซม. ที่ปกคลุมไปด้วยผ้าคลุมที่ผ่านการฆ่าเชื้อสำหรับวัฒนธรรมข้ามคืน 1 0 0 μmol/L PA ถูกใช้เพื่อกระตุ้นการก่อตัวของหยดไขมันในเซลล์ ในเวลาเดียวกันพระราชบัญญัติถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อรักษาการแทรกแซงเป็นเวลา 24 ชั่วโมง สไลด์เซลล์ถูกรวบรวมล้าง 3 ครั้งด้วย PBS ที่ระบายความร้อนล่วงหน้า, คงที่ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีด้วยฟอร์มัลดีไฮด์ 4%, permeabilized ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาทีด้วยบัฟเฟอร์การซึมผ่านที่มี saponin 0.1% {{{{{{14 ด้วยแอนติบอดีรองที่ติดฉลากฟลูออเรสเซนต์เฉพาะบ่มที่อุณหภูมิห้องและอยู่ห่างจากแสงเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการฟักตัวแอนติบอดีสไลด์ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS, counterstained ด้วยโพรบเฉพาะหยดไขมันที่เฉพาะเจาะจง bodypy 493/503 ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีล้างด้วย PBS และปิดผนึกด้วยการต่อต้านการปิดผนึก กลุ่มควบคุมที่ว่างเปล่ากลุ่มการรักษา rapamycin และกลุ่มแทรกแซง ACT ถูกตั้งค่า

 

1.3 การวิเคราะห์ทางสถิติ

SPSS25. 0 ซอฟต์แวร์ทางสถิติถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล ข้อมูลเชิงปริมาณถูกแสดงเป็น x ± s ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวและการทดสอบ LSD-T P<0.05 was considered statistically significant.