การศึกษาลักษณะโครงสร้างของ Cistanche Deserticola polysaccharide และผลการป้องกันต่อการบาดเจ็บของเซลล์ที่เกิดจากกลูโคสสูง -2 การบาดเจ็บของเซลล์

1.2.5.8 การตรวจจับศักยภาพเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียล

hk -2 เซลล์ถูกฉีดวัคซีนใน {6- แผ่นที่ดีและเพาะเลี้ยง หลังจากการกระตุ้นที่สอดคล้องกันสื่อการเพาะเลี้ยงในแผ่น 6- แผ่นดีได้รับการสำลักและกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่แข็งแกร่ง (POS) ถูกเพิ่มเข้าไปในกลุ่มภายใต้ "1.2.5.6" ล้างครั้งหนึ่งครั้งด้วย PBS เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของอาหารเลี้ยงเซลล์และ 1 มล. JC -1 วิธีแก้ปัญหาการย้อมสีผสมกันอย่างทั่วถึงและวางไว้ในศูนย์บ่มเพาะเพาะเลี้ยงเซลล์ในที่มืดเป็นเวลา 20 นาที เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย JC -1 บัฟเฟอร์การย้อมสี (1 ×) และรวบรวมภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

 

 

 

 

ผลประโยชน์ cistanche

 

1.2.5.9 Hoechst33258 วิธีการตรวจจับเซลล์ apoptosis

สไลด์เซลล์ถูกวางไว้ใน 6- แผ่นที่ดีและ hk -2 เซลล์ในเฟสการเจริญเติบโตลอการิทึมถูกเพาะใน 6- แผ่นที่มีความหนาแน่นของเซลล์ 1 × 105 เซลล์/ดี หลังจากการแทรกแซงยาที่สอดคล้องกันชุดการย้อมสี Hoechst33258 ถูกใช้สำหรับการย้อมสี ตรวจพบเซลล์ apoptosis และรวบรวมภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

 

1.2.5.10 การซับแบบตะวันตกเพื่อตรวจจับ

การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4/NF-κBถูกวิเคราะห์โดยการจัดกลุ่มและรักษาเซลล์ตามวิธีการภายใต้ "1.2.5.6" หลังจากนั้นโปรตีนทั้งหมดในเซลล์จะถูกสกัดตามคำแนะนำของชุดสกัดโปรตีน ปริมาณโปรตีนดำเนินการโดยใช้วิธีการหาปริมาณโปรตีน Bicinchoninic acid (BCA) และโปรตีนถูก denatured และเก็บไว้ในตู้เย็นระดับ -20
10% โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส (SDS-PAGE), การถ่ายโอนเมมเบรน polyvinylidene (PVDF), ใส่เมมเบรนลงใน tween ที่ประกอบด้วยทริส -20 บัฟเฟอร์บัฟเฟอร์บัฟเฟอร์
เซลล์ถูกบ่มในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ Tris ด้วย Tween -20 (TBST) ห้องและบล็อกที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีปฐมภูมิถึง TLR4, NF-κB P65, P-NF-κB P65 และ -actin ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจจับเนื้อเยื่อไต(แอนติบอดีถูกเจือจางเป็นสารละลาย TBST ที่อัตราส่วนปริมาตร 1: 2000) ที่ 4 องศาข้ามคืน TBST
เมมเบรนถูกเจือจางด้วยแอนติบอดีรอง (แอนติบอดีและสารละลาย TBST ถูกเจือจางที่อัตราส่วนปริมาตร 1: 2000) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากล้างเมมเบรน 3 ครั้งด้วย TBST แล้ว ECL luminescent reagent ถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อตรวจจับและตรวจพบการแสดงออกของโปรตีนโดยการถ่ายภาพเจล ซอฟต์แวร์ Image J ใช้ในการวิเคราะห์ค่าโปรตีนสีเทาด้วย -actin เป็นข้อมูลอ้างอิงภายใน

1.3 การประมวลผลข้อมูล

SPSS 23. 0 และซอฟต์แวร์ GraphPad PRISM 6.01 ใช้สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล การทดสอบ Shapiro-Wilk ใช้เพื่อทดสอบความเป็นปกติของข้อมูลตัวอย่างและการทดสอบของ Brown-Forsythe หรือ Bartlett ใช้เพื่อทดสอบความเป็นเนื้อเดียวกันของความแปรปรวนของข้อมูลตัวอย่าง ข้อมูลการวัดที่มีการกระจายปกติและความเป็นเนื้อเดียวกันของความแปรปรวนแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (x± s) หมายถึงคำอธิบาย ANOVA ทางเดียวถูกใช้สำหรับการทดสอบและวิธีการของ Dunnett ถูกใช้สำหรับการเปรียบเทียบแบบคู่หากมีนัยสำคัญทางสถิติ
สำหรับการเปรียบเทียบการเปรียบเทียบความแปรปรวนที่ไม่เท่ากันนั้นใช้วิธี T3 ของ Dunnett โดยมี p <0 {0 5 แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติและ P <0.01 แสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างทั้งสองกลุ่ม

2 ผลลัพธ์และการวิเคราะห์

2.1 การกำหนดปริมาณน้ำตาลทั้งหมดกรดยูโรและโปรตีนของ CDPS

สมการการถดถอยเชิงเส้นของเนื้อหา polysaccharide คือ: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999 การทดลองแสดงให้เห็นว่าระหว่าง 7 ถึง 70 µg/ml มีความสัมพันธ์เชิงเส้นที่ดีระหว่างความเข้มข้นของกลูโคสมาตรฐาน (X) และค่าการดูดกลืนแสง (Y) เปอร์เซ็นต์ที่คำนวณได้ของเนื้อหา polysaccharide ในตัวอย่างคือ: 81.02%
สมการการถดถอยเชิงเส้นของกรด uronic มาตรฐานคือ: y=1. 1571x + 0. 0015, r=0. 9968 การทดลองแสดงให้เห็นว่าระหว่าง 20 ถึง 100 µg/ml มีความสัมพันธ์เชิงเส้นที่ดีระหว่างความเข้มข้นของกรด Uronic มาตรฐาน (X) และค่าการดูดซับ (Y) ปริมาณกรด Uronic ในตัวอย่างคือ: 4.43%
สมการการถดถอยเชิงเส้นโปรตีนมาตรฐานคือ: y=1. 2671x + 0. 2145, r=0. 9969 การทดลองแสดงให้เห็นว่าระหว่าง 20 ถึง 1 00 µg/ml มีความสัมพันธ์เชิงเส้นที่ดีระหว่างความเข้มข้นของโปรตีนมาตรฐาน (X) และค่าการดูดซับ (Y) ปริมาณโปรตีนในตัวอย่างคือ: 4.00%

 

2.2 การกระจายน้ำหนักโมเลกุลของ CDPS

น้ำหนักโมเลกุลของ CDPs ถูกกำหนดโดยการตรวจจับคอลัมน์การซึมผ่านของเจลการซึมผ่านของเจลที่มีประสิทธิภาพสูง ด้วย rt เป็น (x) และ lgmp เป็น (y), สมการของเส้นโค้งการสอบเทียบ LGMP-RT ถูกคำนวณเป็น: y=-0. 1951x + 11. 661, r²=0. 9956; RT คือ (x), LGMW คือ (y), สมการเส้นโค้งการสอบเทียบ LGMW-RT คือ: y=-0. 1973x + 11. 738, r²=0. 9956; RT คือ (x), lgmn คือ (y), เส้นโค้งการสอบเทียบ LGMN-RT สมการคือ: y=-0. 1964x + 11. 7, r²=0. 9955; ขึ้นอยู่กับเส้นโค้งมาตรฐานสูตรการคำนวณจะได้รับเพื่อคำนวณน้ำหนักโมเลกุลของแต่ละตัวอย่าง สเปกตรัมน้ำหนักโมเลกุลของตัวอย่างมีดังนี้และผลการคำนวณจะแสดงในตารางที่ 2 ผลการศึกษาพบว่า CDPs มียอดเขาหลายจุดและน้ำหนักโมเลกุลของโพลีแซคคาไรด์ส่วนใหญ่กระจายอยู่ระหว่าง 3 และ 8 kDa ดังแสดงในรูปที่ 1

 

 

2.3 องค์ประกอบ Monosaccharide CDPS

CDPs ได้รับการวิเคราะห์โดยไอออน chromatography และ chromatogram แสดงในรูปที่ 2 ผลการวิจัยพบว่าเมื่อเทียบกับเวลาเก็บรักษาของมาตรฐาน monosaccharide 16 monosaccharide, 5 monosaccharides ถูกตรวจพบใน CDPs โดยการเปรียบเทียบสเปกตรัมกับมาตรฐาน monosaccharide CDPs ส่วนใหญ่ประกอบด้วยกลูโคสกาแลคโตส, rhamnose, mannose และซูโครส , Arabinose อัตราส่วนโมลาร์คือ 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0.0255: 0.0178 จากอัตราส่วนโมลาร์จะเห็นได้ว่า CDPs ส่วนใหญ่ประกอบด้วยกลูโคสกาแลคโตสและ rhamnose ในหมู่พวกเขามีน้ำตาลกลูโคสคิดเป็น 73.405%บัญชีกาแลคโตสสำหรับ 5.381%และบัญชี Rhamnose คิดเป็น 5.02%

 

หมายเหตุ: man.mannose, glc n.glucosamine ไฮโดรคลอไรด์, rha.rhamnose, glc-ua.glucuronic acid, gal-ua.galacturonic acid, gal n.galactosamine hydrochloride, glc.glucose, gal.galactose, xyl.xylose, ara Arabinose, Fuc.fucose

2.4 การวิเคราะห์อินฟราเรดฟูริเยร์ CDPS

จุดสูงสุดใกล้ 3246 ซม. -1 เกิดจากการสั่นสะเทือนของ OH ที่ยืดออกของกลุ่มไฮดรอกซิลการดูดซับจุดสูงสุดใกล้กับ 2900 ซม. -1 คือจุดสูงสุดของการสั่นสะเทือน -1 การปรากฏตัวของ CDPS ของ Uronic Acid, 1374.31 cm -1: จุดสูงสุดการดูดซับนี้อาจเกี่ยวข้องกับการสั่นสะเทือนการเสียรูปของพันธะ CH โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเมธิล (-CH3) หรือเมทิลีน (-H 2-) กลุ่มของโพลีแซคคาไรด์ จุดสูงสุดของการดูดซับที่ 1018.38 ซม. -1 อาจเกี่ยวข้องกับการสั่นสะเทือนของพันธบัตร CO ซึ่งพบได้ทั่วไปในพันธะอีเธอร์หรือพันธบัตรเอสเตอร์ของโพลีแซคคาไรด์ ยอดการดูดซับที่อ่อนแอสามจุดในช่วงของ 1200-1000 cm -1 บ่งบอกถึงการมีอยู่ของ pyranose ใน CDPS ยอดการดูดซับที่ 870 และ 930 ซม. -1 ระบุว่าพันธะ glycosidic -type อาจมีอยู่ใน CDPs ดูรูปที่ 3.

 

2.5 ผลพิษของ CDPs ต่อเซลล์ปกติ -2 เซลล์

เมื่อเทียบกับ Con, ที่ 24 ชั่วโมงหลังจากการบริหารความมีชีวิตของเซลล์เริ่มลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากความเข้มข้นของ CDPS ถึง 1,000 ug/ml (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 การอภิปรายและข้อสรุป

โพลีแซคคาไรด์เป็นโพลีเมอร์น้ำหนักโมเลกุลสูงซึ่งประกอบด้วยโมโนแซคคาไรด์มากกว่า 10 ตัว มีรายงานว่า polysaccharides มีภูมิคุ้มกัน[15]. ในฐานะที่เป็นหนึ่งในสารที่ใช้งานทางเภสัชวิทยาหลักใน Cistanche Deserticola CDPs มีค่ายาอย่างมีนัยสำคัญ การศึกษาครั้งนี้มีลักษณะเฉพาะโครงสร้างของ CDPs และพบว่าพวกเขาสามารถปรับปรุงความเสียหายของ HK -2 เซลล์ที่เกิดจากสภาพแวดล้อมน้ำตาลสูง

 

โครงสร้างที่ซับซ้อนของโพลีแซคคาไรด์มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับกิจกรรมทางชีวภาพของพวกเขาซึ่งชนิดและสัดส่วนของโมโนแซคคาไรด์มวลโมเลกุลสัมพัทธ์ของโพลีแซคคาไรด์และประเภทของพันธะ glycosidic เป็นปัจจัยสำคัญที่มีอิทธิพล [16] มวลโมเลกุลสัมพัทธ์ในระดับปานกลางให้โพลีแซคคาไรด์ที่ใช้งานมากขึ้นและอาจแสดงกิจกรรมทางชีวภาพที่แข็งแกร่งขึ้น
อย่างไรก็ตามน้ำหนักโมเลกุลขนาดใหญ่จะเพิ่มความต้านทานต่อการส่งสัญญาณการดูดซับโพลีแซคคาไรด์ที่ขัดขวางและส่งผลกระทบต่อกิจกรรม ในทางกลับกันโพลีแซคคาไรด์น้ำหนักโมเลกุลขนาดเล็กอาจไม่สามารถสร้างโครงสร้างที่ใช้งานได้อย่างมีประสิทธิภาพส่งผลให้กิจกรรมลดลง [17] เมื่อสำรวจกิจกรรมทางชีวภาพของโพลีแซคคาไรด์มีความจำเป็นที่จะต้องพิจารณาองค์ประกอบ monosaccharide อย่างครอบคลุมมวลโมเลกุลสัมพัทธ์และประเภทพันธะ glycosidic [18] ในการศึกษานี้ chromatography ไอออนระบุว่า CDPs ส่วนใหญ่ประกอบด้วยกลูโคสกาแลคโตสและ rhamnose ซึ่งสอดคล้องกับรายงานของ Xu et al [19]. น้ำหนักโมเลกุลเฉลี่ยของน้ำหนักของ CDPs ที่วัดได้ด้วยเจลโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงคือ 3444, 4198 และ 8031 ​​kDa ตามลำดับ น้ำหนักโมเลกุลของสาม cistanche polysaccharides จากวัสดุยาประเภท Cistanche สี่ชนิดที่วัดโดย Yang และคณะ [20] มีความคล้ายคลึงกัน CDPs อาจมีพันธบัตร glycosidic -type และอาจมี -glucose หรือ -mannose โพลีแซคคาไรด์ที่ประกอบด้วย -glucose หรือ -mannose นั้นได้รับการยอมรับได้ง่ายขึ้นโดยตัวรับเช่น Toll -like 4 (TLR4) หรือ TLR2 [21]
DN เป็นหนึ่งในภาวะแทรกซ้อน microvascular ที่ร้ายแรงที่สุดของโรคเบาหวานและการเกิดโรคนั้นเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับความเครียดออกซิเดชั่นความผิดปกติของไมโตคอนเดรียและการตายของเซลล์ [22] การศึกษาครั้งนี้ศึกษาผลการป้องกันของ CDPs ต่อเซลล์ HK -2 สูงโดยการควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4/NF-κBและกลไกโมเลกุล

ภายใต้สภาวะกลูโคสสูงเซลล์ HK -2 แสดงความเครียดออกซิเดชันอย่างมีนัยสำคัญ [23] การศึกษาพบว่าระดับน้ำตาลสูงเพิ่มการผลิต ROS ภายในเซลล์อย่างมีนัยสำคัญ ปริมาณ ROS ที่มากเกินไปนี้สามารถทำลายไขมันเมมเบรนของเซลล์ได้โดยตรงซึ่งนำไปสู่การเพิ่มขึ้นของเนื้อหาของ MDA ผลิตภัณฑ์ lipid peroxidation [24] ในเวลาเดียวกันกิจกรรมของ SOD และ GSH-PX ซึ่งเป็นระบบป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระที่สำคัญลดลงอย่างมีนัยสำคัญแสดงให้เห็นว่าความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ได้รับความเสียหายอย่างรุนแรง [25] ความไม่สมดุลนี้ในระบบออกซิเดชัน-แอนทิโอซิเดชั่นส่งเสริมการแสดงออกและการเปิดใช้งานของ TLR4 [26] การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า ROS ที่มากเกินไปสามารถรับรู้ได้โดย TLR4 เป็นรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับอันตราย (หมาด) ซึ่งเป็นวงตอบรับเชิงบวก [27] ในการศึกษานี้การปรับสภาพ CDPS ลดระดับ ROS อย่างมีนัยสำคัญเพิ่มกิจกรรม SOD และ GSH-PX และลดปริมาณ MDA ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ครอบคลุมนี้แสดงให้เห็นว่า CDPs อาจควบคุมการตอบสนองต่อความเครียดออกซิเดชันผ่านหลายเป้าหมาย
ในเส้นทางการส่งสัญญาณ TLR4/NF-κBการเปิดใช้งาน TLR4 ส่งเสริมการเปิดใช้งานของ IKK complex โดยการสรรหาโปรตีนอะแดปเตอร์ดาวน์สตรีมซึ่งนำไปสู่ฟอสโฟรีเลชั่นและการย่อยสลายของIκB [28] การศึกษาครั้งนี้พบว่ากลูโคสสูงเพิ่มระดับฟอสโฟรีเลชั่นของIκBอย่างมีนัยสำคัญซึ่งนำไปสู่การโยกย้ายของ NF-κB p65 จากไซโตพลาสซึมไปยังนิวเคลียส การศึกษาแสดงให้เห็นว่าการโยกย้ายนิวเคลียร์ของ p65 ไม่เพียง แต่ทำให้เกิดความเครียดออกซิเดชันมากขึ้นเท่านั้น แต่ยังส่งผลกระทบต่อการทำงานของไมโตคอนเดรีย [29]
มันถูกสังเกตโดย JC -1 การย้อมสีที่การรักษาระดับน้ำตาลในระดับสูงทำให้เกิดศักยภาพเยื่อหุ้มเซลล์ยลลดลงอย่างมีนัยสำคัญแสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนจากการเรืองแสงสีแดงเป็นฟลูออเรสเซนต์สีเขียวแสดงให้เห็นว่าการไล่ระดับโปรตอนระหว่างเยื่อหุ้มชั้นในและด้านนอกของไมโตคอนเดรีย ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียยิ่งทำให้การผลิตของ ROS รุนแรงขึ้นทำให้เกิดวัฏจักรอุบาทว์ [30] การปรับสภาพ CDPS สามารถรักษาความเสถียรของศักยภาพของเยื่อหุ้มเซลล์ยลและผลการป้องกันนี้อาจเกิดขึ้นได้โดยการยับยั้งการแสดงออกของ TLR4 และการเปิดใช้งาน NF-κB
ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียและความเครียดออกซิเดชันถาวรในที่สุดนำไปสู่การตายของเซลล์ [31] การย้อมสี Hoechst เปิดเผยว่านิวเคลียสของเซลล์ในกลุ่มการรักษาระดับน้ำตาลในระดับสูงแสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของ apoptotic โดยทั่วไปเช่นการควบแน่นการควบแน่นและการกระจายตัว [32] การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับเส้นทางการตายของเซลล์ที่เป็นสื่อกลางในไมโตคอนเดรียล: การสูญเสียของเยื่อหุ้มเซลล์ยลที่มีศักยภาพนำไปสู่การปลดปล่อย cytochrome C, การเปิดใช้งานของ caspase cascade และในที่สุดเซลล์ apoptosis [33] สัณฐานวิทยานิวเคลียร์ของเซลล์ในกลุ่มการปรับสภาพ CDPS นั้นเป็นเรื่องปกติและการย้อมสีนั้นสม่ำเสมอแสดงให้เห็นว่า CDPs ป้องกันการตายของเซลล์โดยการรักษาการทำงานของไมโตคอนเดรียและยับยั้งความเครียดออกซิเดชั่น
โดยสรุปการศึกษานี้ตรวจพบตัวบ่งชี้ความเครียดออกซิเดชันอย่างเป็นระบบ (ROS, MDA, SOD, GSH-PX), ฟังก์ชั่นไมโตคอนเดรีย (JC -1) และการตายของเซลล์
ครั้งแรกโดยการปรับปรุงความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ลดระดับ ROS และลดการเปิดใช้งาน TLR4; ประการที่สองโดยการยับยั้งการแสดงออกของ TLR4 และฟอสโฟรีเลชั่นของIκBปิดกั้นการโยกย้ายนิวเคลียร์ของ NF-κB; ในที่สุดโดยการปรับปรุงการทำงานของไมโตคอนเดรีย, ยับยั้งการตายของเซลล์ ความตายจึงมีบทบาทป้องกัน DN เอฟเฟกต์การทำงานร่วมกันแบบหลายเป้าหมายนี้ทำให้ CDPS แสดงโอกาสในการใช้งานที่ดีในการรักษา DN ในการศึกษาครั้งต่อไปโครงสร้าง polysaccharide จะถูกกำหนดเพิ่มเติมโดยการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์, สเปกโทรสโกปีเรโซแนนซ์แม่เหล็กนิวเคลียร์และสเปกโตรมิเตอร์โครมาโตกราฟีก๊าซ นอกจากนี้ผลลัพธ์น้ำหนักโมเลกุลเฉลี่ยแสดงให้เห็นว่า CDPs เป็นโพลีแซคคาไรด์ที่ต่างกัน ต่อไปเราจะแยกและชำระ polysaccharides ที่เป็นเนื้อเดียวกันตรวจจับโครงสร้าง polysaccharide และกิจกรรมทางชีวภาพและชี้แจงความสัมพันธ์ของโครงสร้าง-กิจกรรม