จุดที่มีช่องโหว่ใน SARS-CoV-2 Spike กระตุ้นให้เกิดแอนติบอดีที่มีการป้องกันในวงกว้างต่อตัวแปรย่อย Omicron ที่แตกต่างกันในการต้านจุลชีพ

วิวัฒนาการอย่างรวดเร็วของกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงของไวรัสโคโรนา 2 (SARS-CoV-2) สายพันธุ์ Omicron ได้เน้นย้ำถึงความจำเป็นในการระบุแอนติบอดีที่มีความสามารถในการทำให้เป็นกลางในวงกว้าง เพื่อแจ้งแนวทางการรักษาโมโนโคลนอลและกลยุทธ์การฉีดวัคซีนในอนาคต ในที่นี้ เราได้ระบุ S728-1157 ซึ่งเป็นแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้าง (bnAb) ซึ่งมุ่งเป้าไปที่ตำแหน่งที่มีผลผูกพันกับตัวรับ (RBS) ที่ได้มาจากบุคคลที่ติดเชื้อ WT SARS-CoV ก่อนหน้านี้-2 ก่อนการแพร่กระจายของ ตัวแปรของความกังวล (VOCs) S728-1157 แสดงให้เห็นการทำให้เป็นกลางข้ามแบบกว้างของแวเรียนต์หลักทั้งหมดซึ่งรวมถึง D614G, เบตา, เดลต้า, คัปปา, Mu และโอไมครอน (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB) นอกจากนี้ S728-1157 ยังป้องกันแฮมสเตอร์จากความท้าทายในสิ่งมีชีวิตด้วยไวรัส WT, Delta และ BA.1 การวิเคราะห์เชิงโครงสร้างแสดงให้เห็นว่าแอนติบอดีนี้กำหนดเป้าหมายอีพิโทปคลาส 1/RBS-A ในโดเมนการจับรีเซพเตอร์ผ่านทางอันตรกิริยาที่ไม่ชอบน้ำและแบบขั้วหลายอย่างกับส่วนเติมเต็มของสายโซ่หนักของมันซึ่งกำหนดบริเวณ 3 (CDR-H3) นอกเหนือจากโมทีฟทั่วไปใน CDR-H1/ CDR-H2 ของแอนติบอดีคลาส 1/RBS-A ที่สำคัญ อีพิโทปนี้สามารถเข้าถึงได้ง่ายกว่าในสถานะเปิดและพรีฟิวชัน หรือในโครงสร้างสไปค์ที่ทำให้เสถียรด้วยเฮกซาโพรลีน (6P) เมื่อเปรียบเทียบกับโครงสร้างไดโพรลีน (2P) โดยรวมแล้ว S728-1157 แสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการรักษาในวงกว้าง และอาจแจ้งการออกแบบวัคซีนที่เน้นเป้าหมายเพื่อต่อต้านสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ในอนาคต

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

การแนะนำ

นับตั้งแต่เริ่มมีการระบาดใหญ่ในเดือนธันวาคม 2019 ไวรัสโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงชนิดไวรัสโคโรนา 2 (SARS-CoV-2) ได้ส่งผลให้มีผู้ป่วยโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (COVID-19) มากกว่า 660 ล้านราย และมากกว่า 6.5 ราย เสียชีวิตนับล้านคนทั่วโลก แม้ว่าการพัฒนาอย่างรวดเร็วและการจำหน่ายวัคซีนและการบำบัดรักษาได้จำกัดผลกระทบของโควิด-19 ได้ในระดับมาก การเกิดขึ้นของตัวแปรที่น่ากังวล (VOCs) ที่หมุนเวียนยังคงเป็นภัยคุกคามที่สำคัญเนื่องจากมีโอกาสในการหลบเลี่ยงภูมิคุ้มกันเพิ่มเติม และทำให้เกิดโรคได้ดีขึ้น รุ่น D614G เป็นรุ่นแรกสุดที่ถือกำเนิดและแพร่หลายไปทั่วโลกหลังจากนั้น เมื่อเปรียบเทียบกับ WT ตัวแปร D614G มีความสามารถในการแพร่เชื้อเพิ่มขึ้นมากกว่าการทำให้เกิดโรคที่เพิ่มขึ้น ดังนั้นจึงไม่น่าจะลดประสิทธิภาพของวัคซีนในการทดลองทางคลินิก (1) ระหว่างการเกิดขึ้นของ D614G จนถึงเดือนตุลาคมปี 2021 มีการพัฒนาสารอินทรีย์ระเหยง่ายที่สำคัญเพิ่มเติม 4 ชนิดทั่วโลก รวมถึงอัลฟ่า เบต้า แกมมา และเดลต้า ในบรรดาตัวแปรเหล่านี้ เดลต้ากลายเป็นภัยคุกคามระดับโลกที่ร้ายแรงเนื่องจากมีการแพร่กระจาย ความรุนแรงของโรคที่เพิ่มขึ้น และการหลีกเลี่ยงภูมิคุ้มกันบางส่วน ดังที่แสดงโดยความสามารถที่ลดลงของซีรั่มโพลีโคลนอลและ mAbs ในการต่อต้านความเครียดนี้ (2–6) หลังจากนั้นไม่นาน ในเดือนพฤศจิกายน ปี 2021 ตัวแปร Omicron ก็ได้รับการระบุและประกาศเป็น VOC ใหม่ ตัวแปรนี้มีจำนวนการกลายพันธุ์มากที่สุดจนถึงปัจจุบันและดูเหมือนว่าจะแพร่กระจายได้เร็วกว่าสายพันธุ์ก่อนหน้า (7, 8) ปัจจุบัน มีเชื้อสายย่อยของ Omicron มากมายที่นำไปสู่ผู้ป่วยโรคโควิด-19 รายใหม่ โดยที่ BQ.1, BQ.1.1 และ XBB.1.5 มีความโดดเด่นเหนือ BA.5 และคิดเป็นผู้ป่วยรายใหม่ส่วนใหญ่ทั่วโลกในขณะนั้น ของการเขียน ตัวแปร Omicron สามารถหลีกหนีการรับรู้โดยภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับวัคซีนป้องกันเชื้อโควิด-19 ได้ในระดับที่แตกต่างกัน ซึ่งช่วยลดศักยภาพในการทำให้เป็นกลางของแอนติบอดีในซีรั่มจากบุคคลและบุคคลที่ได้รับการฉีดวัคซีน mRNA ครบแล้วซึ่งอยู่ในช่วงพักฟื้นและได้รับการเสริมด้วยไบวาเลนต์ WT/BA.5 ใหม่ได้อย่างมีนัยสำคัญ วัคซีน mRNA (9, 10) ในทำนองเดียวกัน ตัวแปร Omicron สามารถหลีกเลี่ยงการผูกมัดของ mAbs ในการรักษาที่ได้รับอนุญาตใช้ในกรณีฉุกเฉิน (EUA) หลายประการ แม้ว่าสิ่งเหล่านี้เคยแสดงให้เห็นว่ามีประสิทธิภาพกับ VOC ก่อนหน้านี้ (10–12) เนื่องจากการวางตัวเป็นกลางต่อ Omicron ที่ลดลงและภัยคุกคามต่อ VOC ในอนาคตอย่างต่อเนื่อง จึงมีความจำเป็นเร่งด่วนในการระบุแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้างและมีประสิทธิภาพ ซึ่งสามารถป้องกันเชื้อสาย SARS-CoV-2 ที่หลากหลายและพัฒนาขึ้นได้ ในการศึกษานี้ เราได้ระบุ mAb ที่เป็นโดเมนซึ่งมีผลผูกพันกับตัวรับที่มีศักยภาพ (RBD-reactive) จากเลือดส่วนปลายของบุคคลที่มีการพักฟื้น SARS-CoV-2 ซึ่งทำให้อัลฟ่า เบต้า คัปปา เดลต้า มู และแวเรียนต์ของโอไมครอน (BA.1, BA.2, BA.2.75, BA.4, BA.5, BL.1 และ XBB) mAb, S728-1157 นี้ลดปริมาณไวรัส BA.1 Omicron, Delta และ WT ในปอดและเยื่อเมือกในจมูกลงอย่างมีนัยสำคัญตามความท้าทาย ในร่างกาย ในหนูแฮมสเตอร์ S728-1157 ผูกรีเซพเตอร์ มัด ไซต์ (RBS) ที่ถูกเปิดเผยโดยสมบูรณ์เมื่อ RBD บนสไปค์อยู่ในโครงสร้างด้านบน mAb ใช้ลวดลายที่พบใน CDR-H1 และ CDR-H2 ที่พบได้ทั่วไปในแอนติบอดีคลาส 1/RBS-A ของ IGHV3-53/3-66 (13, 14) แต่ยังผ่านการสัมผัสกับ CDR ที่ไม่ซ้ำกันอย่างกว้างขวางด้วย -H3 เพื่อหลีกเลี่ยงการกลายพันธุ์ในการเพิ่มของ VOCs สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการออกแบบที่มีเหตุผลของการเพิ่มวัคซีนในอนาคตซึ่งครอบคลุมตัวแปร Omicron ควรได้รับการแก้ไขเพื่อให้นำเสนอการเพิ่มขึ้นอย่างคงที่ในการกำหนดค่าส่วนใหญ่ขึ้นไปเพื่อเหนี่ยวนำคลาส 1/RBS-A mAbs ที่มีคุณสมบัติ CDR-H3 ที่คล้ายกันได้อย่างเหมาะสมที่สุด

ประโยชน์ของ cistanche - เสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน

ผลลัพธ์

การแยก mAbs ที่เกิดปฏิกิริยา RBD ที่แสดงรูปแบบการวางตัวเป็นกลางและศักยภาพที่หลากหลาย ก่อนการแพร่กระจายของเชื้อสาย Omicron ก่อนหน้านี้เราได้ระบุลักษณะ 43 mAbs โดยกำหนดเป้าหมาย epitopes ที่แตกต่างกันบนโปรตีนขัดขวาง รวมถึงโดเมน N-terminal (NTD), RBD และหน่วยย่อย 2 (S2) แอนติบอดีเหล่านี้ไม่สามารถทำให้สายพันธุ์ SARS-CoV-2 เป็นกลางที่หมุนเวียนอยู่ในขณะนั้นได้ (15) ในการศึกษานี้ แผงเพิ่มเติมของ mAbs ที่ทำปฏิกิริยา RBD ถูกแสดงออกมาจากบุคคลที่ตอบสนองสูง 3 รายที่ติดตั้งการตอบสนอง IgG ต่อต้านขัดขวางที่แข็งแกร่งตามที่กำหนดไว้ก่อนหน้า (16) (ตารางเสริม 1 และ 3; เอกสารเสริมมีให้ทางออนไลน์พร้อมบทความนี้; https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1) แม้ว่าสัดส่วนของเซลล์ B ที่มีผลผูกพันกับ RBD ขัดขวางจะคล้ายกันในผู้ตอบสนองสูงเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ตอบสนองระดับกลางและต่ำ (รูปที่ 1, A – C) แต่อัตราการกลายพันธุ์มากเกินไปของโซมาติกสายโซ่หนักนั้นสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มผู้ตอบสนองสูง (รูปที่ 1) , D และ E) ซึ่งบ่งชี้ว่าบุคคลเหล่านี้อาจมีศักยภาพสูงสุดในการสร้าง mAbs ข้ามปฏิกิริยาที่มีศักยภาพ (16) แอนติบอดีเหล่านี้ถูกตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อต่อต้านการกลายพันธุ์ของ RBD เพื่อระบุการจำแนกประเภทของอีพิโทป (17) ในบรรดา mAbs ที่ทำปฏิกิริยา RBD 14 ตัว เราได้ระบุ 4 คลาส 2 mAbs, 2 คลาส 3 mAbs และ 8 mAbs ที่ไม่จัดประเภท ซึ่งแสดงให้เห็นการลดลงเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยในการจับกับการกลายพันธุ์ RBD สำคัญใดๆ ที่ทดสอบ (รูปที่ 1F) ที่ต้องสังเกต แอนติบอดีคลาส 2, คลาส 3 และคลาส 4 สอดคล้องกับอีพิโทป RBS BD, S309 และ CR3022 โดยประมาณในการศึกษาก่อนหน้า (13, 18) mAbs RBD คลาส 2 และ 3 ไม่รู้จักการกลายพันธุ์ RBD หลายตัวแปรที่มีการแทนที่ K417N/E484K/L452R/ N501Y ซึ่งเป็น RBD ที่ออกแบบเทียมเพื่อรวมการกลายพันธุ์ที่สำคัญสำหรับการหลบหนีของไวรัส (17, 18) และไม่ได้แสดงให้เห็นถึงปฏิกิริยาข้ามใดๆ กับ RBD ของ SARS-CoV-1 และกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจตะวันออกกลาง (MERS)-CoV (รูปที่ 1F) ในทางหน้าที่แล้ว mAbs RBD คลาส 2 และ 3 ทำให้ D614G และแวเรียนต์เดลต้าเป็นกลางได้อย่างมีประสิทธิภาพ แต่กิจกรรมการทำให้เป็นกลางถูกจำกัดมากกว่าต่อเบตา คัปปา และมู (รูปที่ 1G) ไม่มีแอนติบอดีคลาส 2 หรือ 3 ใดที่วิเคราะห์ได้ทำให้แวเรียนต์ของ Omicron ที่ทดสอบใดๆ เป็นกลาง

ในทางตรงกันข้าม mAbs ที่ไม่จำแนกประเภทส่วนใหญ่จับกับ RBD หลายตัวแปรและทำปฏิกิริยาข้ามกับ SARS-CoV-1 RBD (รูปที่ 1F) ในบรรดาสิ่งเหล่านี้ เราได้ระบุ 3 mAbs, S451-1140, S626-161 และ S728-1157 ซึ่งแสดงให้เห็นศักยภาพในการวางตัวเป็นกลางสูงเมื่อเทียบกับ D614G และเบต้าที่เป็นกลางข้าม, Delta, Kappa, Mu และ Omicron BA.1 ที่มีความเข้มข้นในการยับยั้ง 99% (IC99) ในช่วง 20–2,500 ng/mL (รูปที่ 1G) ด้วยศักยภาพในการวางตัวเป็นกลางในวงกว้างของ 3 mAbs เหล่านี้ นอกเหนือจากแพลตฟอร์มการทดสอบคราบจุลินทรีย์แล้ว เรายังดำเนินกิจกรรมการวางตัวเป็นกลางกับ BA.2.75, BL.1 (BA.2.75+R346T), BA.4, แท้ ไวรัส BA.5 และ XBB โดยใช้การทดสอบการทำให้เป็นกลางการลดโฟกัส (FRNT) (รูปที่ 1G) ในจำนวนนี้ S728-1157 แสดงฤทธิ์การทำให้เป็นกลางสูงเทียบกับแผงของแวเรียนต์ของ Omicron ซึ่งรวมถึง BA.1, BA.2, BA.4 และ BA.5 โดยมี IC99 สูงถึง 100 ng/mL ตามที่วัดโดย การตรวจคราบจุลินทรีย์ สถานการณ์ที่คล้ายกันถูกสังเกตโดยใช้ FRNT โดยที่ S728-1157 ยังคงรักษากิจกรรมการวางตัวเป็นกลางในระดับสูงกับ BA.2.75, BL.1, BA.4, BA.5 และ XBB โดยมี IC50 ในช่วง 8–300 ng /มล. (รูปที่ 1G) S451-1140 ทำให้ BA.1, BA.2, BA.2.75 และ BL.1 เป็นกลางอย่างมีศักยภาพ แต่ไม่ใช่ BA.4 และ BA.5 ตามที่สังเกตพบในแพลตฟอร์มการสอบวิเคราะห์การทำให้เป็นกลางทั้งสองแบบ ในทางกลับกัน S626-161 ไม่ได้แสดงให้เห็นฤทธิ์การทำให้เป็นกลางต้านแวเรียนต์ของ Omicron นอกเหนือจากแวเรียนต์ BA.1 (รูปที่ 1G) แม้ว่า S626-161 จะมีความสามารถในการวางตัวเป็นกลางต่อ VOC ที่ทดสอบได้ต่ำกว่าแอนติบอดีอีก 2 ตัว แต่เป็น mAb เพียงอย่างเดียวที่แสดงปฏิกิริยาข้ามไม่เพียงแต่กับ SARS CoV-1 RBD เท่านั้น แต่ยังสามารถทำให้ค้างคาวเป็นกลางได้อีกด้วย โคโรน่าไวรัส WIV-1 และ RsSHC014 (รูปที่ 1, F และ G) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า S626-161 จดจำอีพิโทปที่อนุรักษ์ไว้ซึ่งใช้ร่วมกันระหว่างสายเลือดอาร์โบไวรัสเหล่านี้ แต่ไม่มีอยู่ใน BA.2 และสายพันธุ์ต่อมา นอกจากนี้ เมื่อเปรียบเทียบกับ S728-1157 และ S451-1140 แล้ว S626-161 มี CDR-H3 ที่ยาวกว่าซึ่งสามารถให้ความสามารถที่เพิ่มขึ้นในการจดจำแพทช์ของสารตกค้างที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงที่ใช้ร่วมกันระหว่างอาร์โบไวรัส ตามที่อธิบายไว้ ในการศึกษาก่อนหน้า (19) (รูปที่ 1 เพิ่มเติม) เมื่อเปรียบเทียบยีนแปรผันของอิมมูโนโกลบูลินหนัก (IGHV) และสายโซ่เบา (IGLV หรือ IGKV) ของ 3 mAbs เหล่านี้กับฐานข้อมูล mAbs ที่ทำให้เป็นกลางของ SARS-CoV-2 ที่มีอยู่ (13, 15, 20–27) เราพบว่าสายโซ่หนัก ยีนแปรผันที่ใช้โดย S728-1157 (IGHV3-66), S451-1140 (IGHV3-23) และ S626-161 (IGHV4-39) มี ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าเข้ารหัสแอนติบอดีต่อ SARS-CoV-2 ที่ทำให้เป็นกลางที่มีศักยภาพหลายตัวโดยมุ่งเป้าไปที่ RBD (21, 22, 28, 29) อย่างไรก็ตาม มีเพียง S728-1157 เท่านั้นที่มีการจับคู่ยีนที่แปรผันของสายโซ่หนักและสายโซ่เบาเฉพาะที่ไม่ได้ถูกรายงานในฐานข้อมูล (ตารางเสริม 3) ซึ่งบ่งชี้ว่ามันไม่ใช่สำเนาพันธุ์สาธารณะ

รูปที่ 1 การจำแนกลักษณะเฉพาะของ mAbs ที่ทำปฏิกิริยากับ RBD ที่แยกได้จากผู้ป่วยระยะพักฟื้น COVID-19

3 mAbs เหล่านี้ (S451-1140, S626-161 และ S728-1157) ได้รับการกำหนดลักษณะเพิ่มเติมเพื่อกำหนดความกว้างในการจับกับ VOC ของ SARSCoV-2 (รูปที่ 2, A และ B) . การขัดขวางที่มีความเสถียรก่อนฟิวชั่นซึ่งประกอบด้วย 2-การแทนที่โพรลีนในหน่วยย่อย S2 (2P; ไดโพรลีน) ได้รับการแสดงให้เห็นว่าเป็นภูมิคุ้มกันที่เหนือกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการพุ่งขึ้นของ WT และเป็นพื้นฐานของ SARS-CoV หลายชนิดในปัจจุบัน-2 วัคซีนรวมทั้งวัคซีนที่ใช้ mRNA (30, 31) เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีรายงานว่าโปรตีนขัดขวางที่เสถียรด้วย 6 โพรลีน (6P; เฮกซาโพรลีน) เพื่อเพิ่มการแสดงออกและมีเสถียรภาพมากกว่าโครงสร้างไดโพรลีนดั้งเดิม ด้วยเหตุนี้ จึงได้รับการเสนอให้ใช้ในวัคซีนป้องกันโควิด-19 รุ่นต่อไป (32, 33) เพื่อตรวจสอบว่ามีความแตกต่างด้านแอนติเจนระหว่างโครงสร้างไดโพรลีนและเฮกซาโพรลีนสไปค์หรือไม่ อิมมูโนเจนทั้งสองถูกรวมไว้ในแผงทดสอบของเรา ตามที่วัดโดย ELISA เราพบว่า 3 mAbs จับแอนติเจนสไปค์ 6P-WT ในระดับที่สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับสไปค์ WT-2P (รูปที่ 2, A และ B) mAbs ทั้ง 3 ตัวแสดงการจับที่เทียบเคียงได้กับการเพิ่มขึ้นของไวรัสอัลฟ่า เบต้า แกมมา และเดลต้า เทียบกับของ WT-2P (รูปที่ 2, A และ B) อย่างไรก็ตาม ปฏิกิริยาการจับของ 3 mAbs เหล่านี้ลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับแผงของแอนติเจนในตระกูล Omicron (รูปที่ 2, B และ C) การจับ S451-1140 มีความไวต่อการกลายพันธุ์ที่พบใน BA.1 และ BA.2 ส่งผลให้เกิดการจับลดลงอย่างมากและ 31- ลดลงสองเท่าในการทำให้เป็นกลางต่อแวเรียนต์เหล่านี้เมื่อเปรียบเทียบกับ WT-2 P แอนติเจนและไวรัส D614G ตามลำดับ (รูปที่ 2B) mAb การทำให้เป็นกลางข้าม sarbecovirus, S626-161 ยังแสดง 1.2- ถึง 3.5-พับลดการจับกับแอนติเจน BA.1 ที่พุ่งสูงขึ้น ซึ่งอาจเป็นสาเหตุสำหรับ {{45} } การลดลงเท่าตัวในกิจกรรมการวางตัวเป็นกลางเทียบกับ BA.1 (รูปที่ 1G และรูปที่ 2, B และ C) สำหรับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้างที่มีศักยภาพมากที่สุด (bnAb), S728-1157 การจับกับแอนติเจนของ Omicron ลดลงในระดับที่น้อยกว่า (ตั้งแต่ 1.1- ถึง 4.4- เท่า) เมื่อเปรียบเทียบกับ WT-2P เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและไม่ได้รับผลกระทบจากฤทธิ์ในการทำให้เป็นกลาง (รูปที่ 1G และรูปที่ 2, B และ C) การลดลงอย่างมากในการจับ mAb ที่ทำให้เป็นกลางของ Omicron กับสไปค์ BA.1 อาจเนื่องมาจากการเปลี่ยนแปลงในการเคลื่อนที่และเกี่ยวข้องกับการอัดแน่นของโครงสร้างขาลงของ Omicron 3-RBD และความชอบสำหรับ 1- เพิ่ม RBD ที่ช่วยในการหลบเลี่ยงแอนติบอดี ตามที่รายงานโดยการศึกษาก่อนหน้านี้ (34) การกลายพันธุ์ที่ทำให้เสถียรของ 2P และ 6P ยังมีผลกระทบที่แตกต่างกันในตัวแปร Omicron โดยที่ 3 mAbs ทั้งหมดแสดงมากกว่า 28-การจับกับ Spike BA เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่า1-6P เมื่อเทียบกับ BA1-2P แต่เพิ่มการเชื่อมโยงกับเวอร์ชัน BA.2 และ BA.4/5 6 P ที่เพิ่มขึ้นเล็กน้อยเท่านั้น เมื่อเทียบกับเวอร์ชัน 2P ของพวกเขา 1.2 × ถึง 1.4 × ซึ่งแนะนำการเข้าถึง mAbs ที่ทำให้เป็นกลางของ Omicron ดีขึ้นเล็กน้อยกับเวอร์ชัน hexapole โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับโครงสร้าง BA.1 ที่มีหนามแหลม นอกเหนือจาก ELISA แล้ว ไบโอเลเยอร์อินเทอร์เฟอโรเมทรี (BLI) ยังถูกใช้เพื่อหาปริมาณอัตราการจับและค่าคงที่สมดุล (kon, koff และ KD) ของ 3 mAbs เหล่านี้ไปยังแผงของแอนติเจนขัดขวาง (รูปที่ 2 เพิ่มเติม) อัตรา kon การจดจำของการจับแอนติเจนแบบแฟรกเมนต์ (Fab) กับสไปค์ของเฮกซาโพรลีนคือ 1.5- ถึง 3.3-พับเร็วขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับสไปค์ไดโพรลีน (รูปที่ 2, B และ C), แสดงให้เห็นว่า แอนติบอดีที่จับกับโครงสร้าง 6P เร็วกว่าโครงสร้าง 2P สิ่งนี้อาจถูกคาดหวังไว้ถ้าอีพิโทปสามารถเข้าถึงได้มากขึ้นบน RBD ในสถานะเปิดบนเดือยเฮกซะโพรลีน ยกเว้น S626- 161 Fabs แยกตัวออกจากสไปค์เฮกซาโพรลีนช้ากว่า (มี koff ต่ำกว่า) มากกว่าสไปค์ไดโพรลีน ในลักษณะที่ว่า KD ทั้งหมดแสดงให้เห็นว่า S728-1157 และ S{451-1140 จับกับ เข็มเฮกซาโพรลีนที่มีความสัมพันธ์กันมากขึ้น (รูปที่ 2, B และ C เพิ่มเติม) การเพิ่มขึ้นของการจับกับเฮกซาโพรลีนขัดขวางนั้นมีความโดดเด่นมากยิ่งขึ้นสำหรับ IgG ที่สมบูรณ์โดยแบบจำลองอันตรกิริยา 1:2 ดังที่แสดงโดย S728-1157 และ S451- 1140 mAbs ซึ่งสอดคล้องกับการเผยออกของเอพิโทปหลายตัวที่มีความเสถียร 6P ซึ่งทำให้ ความอยากอาหารดีขึ้น (รูปที่ 2, A และ C เพิ่มเติม) เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเอพิโทปที่เป็นเป้าหมายอาจเข้าถึงได้ง่ายกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับสไปค์ที่มีความเสถียร 6P เมื่อ RBD อยู่ในสถานะเปิด ดำเนินการวิเคราะห์โครงสร้างต่อไปเพื่อตรวจสอบการคาดเดานี้

รูปที่ 2 การเชื่อมความกว้างของ mAbs ที่ทำให้เป็นกลางของ Omicron

การวิเคราะห์เชิงโครงสร้างของ mAbs ที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้าง ในการประมาณค่าครั้งแรกของ epitopes ที่ผูกไว้ การทดสอบการแข่งขันของ ELISA ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบว่า mAbs ที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้างทั้ง 3 รายการนี้ใช้การทับซ้อนกันใดๆ กับแผง mAbs ปัจจุบันของเราหรือไม่ ซึ่งเป็นชุดของ mAbs ที่มีความจำเพาะของ epitope ที่ทราบจากการศึกษาก่อนหน้านี้ (15, 25, 35) และ mAbs อีก 2 ชนิดที่ใช้งานทางคลินิกในปัจจุบัน ได้แก่ LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) และ REGN10933 (Regeneron) (37) ตำแหน่งการจับของ S451-1140 และ S728-1157 ทับซ้อนกันบางส่วนกับ CC12.3 (23, 25) ซึ่งเป็นแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางคลาส 1 และแอนติบอดีคลาส 2 ส่วนใหญ่ รวมถึง LY-CoV555 และ REGN10933 แต่ไม่ใช่ ด้วยแอนติบอดีคลาส 3 และคลาส 4 (รูปที่ 3A) S626-161 มีการทับซ้อนที่เห็นได้ชัดเจนในบริเวณการจับกับคลาส 1 CC12.3, แอนติบอดีคลาส 4 หลายตัว ซึ่งรวมถึง CR3022 และแอนติบอดีที่ไม่จำแนกประเภทอื่นๆ ในขณะที่มีการทับซ้อนกันบางส่วนกับแอนติบอดีคลาส 2 หลายตัวและแอนติบอดีคลาส 3 เดี่ยว (รูปที่ 3เอ) ในทำนองเดียวกัน การทดสอบ BLI แบบแข่งขันเผยให้เห็นว่า S451-1140 และ S728-1157 แข่งขันกันอย่างรุนแรงเพื่อจับกับ WT-6P ในขณะที่ S626-161 ไม่ได้แข่งขันกัน (รูปเสริม) 3). โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้แนะนำว่า S451-1140 และ S728-1157 จดจำเอพิโทปที่คล้ายกันซึ่งแตกต่างจาก S626-161

รูปที่ 3 กลไกการวางตัวเป็นกลางในวงกว้างของ S728-1157

แอนติบอดี S728-1157 ถูกเข้ารหัสโดย IGHV3-66 และครอบครองส่วนเสริมที่กำหนดบริเวณ 3 (CDR-H3) แบบสั้น โดยเฉพาะอย่างยิ่ง mAbs ที่ผูก RBS ในโหมดการเชื่อมโยง 1 (เช่น RBS-A หรือไซต์คลาส 1) ระบุโดย CC12.1, CC12.3, B38 และ C105 (13, 18, 23, 29, 38, 39) มีแนวโน้มที่จะใช้ IGHV3-53 หรือ 3-66 และมีความไวต่อการกลายพันธุ์ของ VOC (40) อย่างไรก็ตาม บริเวณ CDR-H3 ของ S728-1157 มีความโดดเด่นอย่างมากจากแอนติบอดีอื่นๆ ของประเภทนี้ ซึ่งอาจอธิบายถึงแอคติวิตีที่กว้างกว่าของมัน เพื่อให้เข้าใจถึงพื้นฐานโครงสร้างของการวางตัวเป็นกลางในวงกว้างโดย S 728-1157 ที่ epitope นี้ เราได้แก้ไขโครงสร้างกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอน (cryo-EM) (รูปที่ 3B) ของ IgG S 728-1157 ที่ซับซ้อนด้วยขัดขวาง WT { {31}}P-Mut7 ซึ่งเป็นเวอร์ชันของ WT ขัดขวาง-6P มีพันธะอินเตอร์โปรโตเมอร์ไดซัลไฟด์ที่ C705 และ C883 ที่ความละเอียดโดยรวมประมาณ 3.3 Å (รูปที่ 4E เพิ่มเติม) ด้วยการใช้การขยายแบบสมมาตร การจำแนกประเภทแบบเน้น และวิธีการปรับแต่ง เราได้รับความละเอียดเฉพาะที่อินเทอร์เฟซ RBD-Fv เป็นประมาณ 4 Å (รูปที่ 4E เพิ่มเติมและตารางเสริม 8) โครงสร้างผลึกของ S728-1157 Fab ถูกกำหนดที่ความละเอียด 3.1 Å และใช้เพื่อสร้างแบบจำลองอะตอมที่ส่วนต่อประสาน RBD-Fv โครงสร้างของเรายืนยันว่า S 728-1157 เชื่อมโยง epitope RBS-A (หรือคลาส 1) ในโครงสร้าง RBD-up (รูปที่ 3B และรูปที่ 4E เพิ่มเติม) คล้ายกับ IGHV อื่น ๆ 3-53/{{55} } แอนติบอดี (รูปที่ 3C) การอุดตันของสเตียรอยด์ของตำแหน่งการจับกับเอนไซม์ที่แปลงแอนจิโอเทนซิน 2 (ACE2) โดย S728-1157 อธิบายถึงศักยภาพในการวางตัวเป็นกลางในระดับสูงต่อโรค SARS-CoV-2 โมทีฟ 32NY33 และโมทีฟ 53SGGS56 (23) ใน S728-1157 CDR-H1 และ -H2 โต้ตอบกับ RBD ในลักษณะเกือบจะเหมือนกับ CC12.3 (รูปที่เสริม 4, B และ C) อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับ VH 98DF99 ใน CC12.3, VH 98DY99 ใน S728-1157 CDR-H3 ก่อรูปอันตรกิริยาที่กว้างขวางมากขึ้น ซึ่งรวมถึงทั้งอันตรกิริยาที่ไม่ชอบน้ำและแบบมีขั้วกับ RBD ซึ่งอาจอธิบายถึงการทำให้เป็นกลางในวงกว้างต้าน VOCs (รูปที่ 3D และตารางเสริม 6 และ 7) ไดไกลซีน VH 100GG101 ใน S728- 1157 CDR-H3 ยังอาจอำนวยความสะดวกในการจับที่กว้างขวางมากขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับ VH Y100 ใน CC12.3, น่าจะเนื่องมาจากความยืดหยุ่นในเรซิดิวของไกลซีนที่นำไปสู่การจัดโครงที่แตกต่างกันของส่วนปลายของ CDR -H3 ลูปและการเลื่อนสัมพัทธ์ของสารตกค้างที่ 98DY99

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

แม้ว่า VOC ของ Omicron จะมีการกลายพันธุ์อย่างกว้างขวางใน RBD แต่สารตกค้างเหล่านี้ส่วนใหญ่ไม่มีปฏิกิริยากับ S728-1157 เนื่องจากยังคงสังเกตเห็นการจับ (รูปที่ 4A เพิ่มเติม) จากแบบจำลอง WT-6P-Mut7 + Fab S728-1157 ที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของเรา, Y505 ถึง VL Q31 และ E484 ถึง VH Y99 ได้รับการทำนายว่าจะสร้างพันธะไฮโดรเจน (รูปที่ 4D เพิ่มเติมและตารางเสริม 6 ) ซึ่งมีศักยภาพที่จะถูกรบกวนโดยการกลายพันธุ์ของ Omicron Y505H และ E484A อย่างไรก็ตาม การกลายพันธุ์ Y505H จะยังคงยอมให้มีพันธะไฮโดรเจนกับ VL Q31 และการกลายพันธุ์ E484A จะเพิ่มสายด้านข้างที่ไม่ชอบน้ำอีกสายหนึ่งใกล้กับเรซิดิวที่ไม่ชอบน้ำ VL Y99, F456 และ Y489 การสัมผัสเหล่านี้อาจอธิบายในบางส่วนถึงกลไกที่ทำให้ S728-1157 สามารถคงฤทธิ์การทำให้เป็นกลางได้ แม้ว่าจะลดลง เมื่อเทียบกับแอนติเจน BA.1 ที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว (รูปที่ 1G และรูปที่ 2B) ในทางกลับกัน แอนติเจน BA.1 อาจเกี่ยวข้องกับการกลายพันธุ์ของ Omicron ซึ่งเปลี่ยนแปลงภูมิทัศน์โครงสร้างของโปรตีนสไปค์ (34) อย่างไรก็ตาม สารตกค้างที่กลายพันธุ์ทางร่างกายหลายชนิด เช่น VH L27, L28, R31, F58 และ VL V28 และ Q31 ใน S728-1157 เกี่ยวข้องกับการโต้ตอบกับ SARS-CoV-2 RBD (รูปที่ 1 เพิ่มเติมและ ตารางเสริม 7) ซึ่งอาจมีส่วนทำให้เกิดปฏิกิริยาในวงกว้างเมื่อเปรียบเทียบกับ CC12.3 โดยรวมแล้ว การศึกษาเชิงโครงสร้างของเราเผยให้เห็นพื้นฐานของการทำให้ S728-1157 เป็นกลางในวงกว้าง ซึ่งสามารถรองรับการกลายพันธุ์ส่วนใหญ่ใน SARS-CoV-2 VOC

รูปที่ 4 ประสิทธิภาพในการป้องกันของ bnAbs ต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ในหนูแฮมสเตอร์

S728-1157 ลดการจำลองของ SARS-CoV-2 BA.1 Omicron, Delta และ WT SARS-CoV-2 ในหนูแฮมสเตอร์ซีเรีย เพื่อประเมินประสิทธิภาพในการป้องกันของ mAbs ที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้าง เราใช้แบบจำลองการติดเชื้อหนูแฮมสเตอร์ซีเรียสีทองที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับ SARS-CoV-2 หนูแฮมสเตอร์ได้รับ mAbs ทดสอบของเรา 5 มก./กก. หรือกลุ่มควบคุมไอโซไทป์ที่กำหนดเป้าหมายแอนติเจนที่ไม่เกี่ยวข้อง (อีโบลาไวรัสไกลโคโปรตีน) ผ่านการฉีดเข้าช่องท้อง 1 วันหลังการติดเชื้อไวรัส SARS CoV-2 เก็บเนื้อเยื่อปอดและจมูก 4 วันหลังการติดเชื้อ (รูปที่ 4A) การให้ยาเพื่อการรักษาของ S728-1157 ส่งผลให้ระดับไตเตอร์ของ WT, BA.1 Omicron และตัวแปรเดลต้าลดลงทั้งในกังหันทางจมูกและปอดของแฮมสเตอร์ที่ติดเชื้อ (รูปที่ 4, B–D) สิ่งที่น่าสนใจคือผลของ S728-1157 ในปอดนั้นน่าทึ่งมาก โดยลดปริมาณไวรัส WT และ BA.1 Omicron ลงประมาณ 104PFU โดยที่ระดับไวรัสของตัวแปร BA.1 Omicron ถูกยกเลิกโดยสิ้นเชิง (รูปที่ 4C) ตรงกันข้ามกับการวางตัวเป็นกลาง ในหลอดทดลอง (รูปที่ 1G) S451-1140 ไม่ได้ลดการจำลองแบบของไวรัส BA.1 Omicron ในปอดและกังหันจมูก ซึ่งบ่งชี้ถึงการตัดการเชื่อมต่อระหว่างการวางตัวเป็นกลาง ในหลอดทดลอง และการป้องกัน ใน ร่างกาย สำหรับโคลนนี้ (รูปที่ 4E) . ในการเปรียบเทียบ การบริหารให้ S626-161 ส่งผลให้ไตเตอร์ของไวรัสในปอดลดลงอย่างมีนัยสำคัญเล็กน้อยภายหลังความท้าทาย WT และ BA.1 (รูปที่ 4, F และ G) ข้อมูลเหล่านี้เน้นย้ำว่า เพื่อกำหนด mAbs ป้องกันอย่างกว้างๆ ได้อย่างแม่นยำ จำเป็นต้องมีการประเมินประสิทธิภาพการป้องกันควบคู่ไปกับกิจกรรมการวางตัวเป็นกลาง ในอนาคตข้างหน้า เป็นเรื่องน่าสนใจที่จะตรวจสอบว่าความสามารถในการป้องกันของ S728-1157 ขึ้นอยู่กับ Fc มากน้อยเพียงใด โดยรวมแล้ว S728-1157 แสดงถึง mAb ที่มีแนวโน้มพร้อมประสิทธิภาพการวางตัวเป็นกลางในวงกว้างต่อตัวแปร SARS CoV-2 ที่สามารถลดการจำลอง WT, Delta และ BA.1 ในสิ่งมีชีวิตได้อย่างมาก

การติดเชื้อ SARS-CoV-2 แทบจะไม่กระตุ้น mAbs ที่ทำให้เป็นกลางแบบ S728-1157 ที่มีศักยภาพ เมื่อพิจารณาถึงศักยภาพในการวางตัวเป็นกลางและการป้องกันโรคของ S728-1157 เราจึงพยายามประเมินว่าแอนติบอดีที่มีลักษณะคล้าย S728–1157 มักถูกกระตุ้นในการตอบสนองของโพลีโคลนอลในผู้ป่วย SARS-CoV-2 หรือไม่ เพื่อประเมินสิ่งนี้ เราทำการทดสอบ ELISA แบบแข่งขันโดยใช้ซีรั่มพักฟื้นเพื่อตรวจหาไทเทอร์ของแอนติบอดีต้าน RBD ที่สามารถแข่งขันเพื่อการจับกับ S728-1157 (รูปที่ 5A) กลุ่มตัวอย่างถูกแบ่งออกเป็น 3 กลุ่มตามขนาดของการตอบสนองของแอนติบอดีตามที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ (15, 16) แม้ว่าผู้ตอบสนองในระดับสูงและปานกลางจะมีระดับของ S728-1157 ซึ่งเป็นซีรั่มแอนติบอดีที่แข่งขันได้สูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ตอบสนองในระดับต่ำ (รูปที่ 5B) แต่ระดับไตเตอร์นั้นค่อนข้างต่ำในทุกกลุ่ม ซึ่งบอกเป็นนัยว่าไม่ใช่เรื่องแปลกที่จะได้รับ S{{ แอนติบอดีที่มีลักษณะคล้าย 18}} ในซีรั่มโพลีโคลนอลหลังการติดเชื้อ WT SARS-CoV-2 นอกจาก S728-1157 แล้ว เรายังทดสอบการแข่งขันของซีรั่มพักฟื้นกับ mAbs อื่นๆ รวมถึง S451- 1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933, CR3022 และ CC12.3 เช่นเดียวกับ S728-1157 เราสังเกตว่าแอนติบอดีที่มีระดับไทเทอร์ค่อนข้างต่ำแข่งขันกับ S451-1140, S626-161, LY-CoV555, REGN10933 และ CC12.3 ในซีรั่มโพลีโคลนอลจากผู้ป่วยระยะพักฟื้นส่วนใหญ่ บุคคล (รูปที่ 5, C–F และ H) อย่างไรก็ตาม ผู้ตอบสนองที่สูงมีแนวโน้มที่จะมี titers ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับ mAbs ที่ทำให้เป็นกลางมากกว่าผู้ตอบสนองต่ำ (รูปที่ 5, B–F และ H) ในทางตรงกันข้าม แอนติบอดีที่มุ่งเป้าไปที่ไซต์อีพิโทป CR3022 จะเด่นชัดกว่าในบุคคลที่พักฟื้น ซึ่งบ่งชี้ถึงการเสริมสมรรถนะของแอนติบอดี RBD คลาส 4 ในซีรั่มโพลีโคลนอล (รูปที่ 5G) น่าสังเกตที่ ไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในระดับไทเตอร์ของ CR3022 ในกลุ่มผู้ตอบสนองทั้ง 3 กลุ่ม ซึ่งบ่งชี้ว่าแอนติบอดีไซต์ CR3022- ได้รับการกระตุ้นอย่างสม่ำเสมอในระหว่างการติดเชื้อ WT SARS-CoV{-2 ในคนส่วนใหญ่ สิ่งที่น่าสนใจเมื่อเปรียบเทียบกับ CC12.3 นั้น S728-1157 ถูกตรวจพบที่ 4- ระดับที่ต่ำกว่าในซีรั่มของผู้ตอบสนองสูง ดังนั้นแม้ว่าแอนติบอดีคลาส 1 จะถูกกระตุ้นบ่อยครั้งจากการติดเชื้อตามธรรมชาติและการฉีดวัคซีน (14, 20, 28, 29, 41–43) ข้อมูลของเราแนะนำว่าแอนติบอดีที่มีลักษณะคล้าย S728–1157 ซึ่งเป็นตัวแทนของเซตย่อยของคลาสนี้ค่อนข้างหายาก

นอกจากนี้เรายังตรวจสอบความแตกต่างของปฏิกิริยาต่อ 2P เทียบกับขัดขวางที่เสถียร 6P ในกลุ่มผู้ป่วยพักฟื้นของเรา (รูปที่ 5, I – K) เราพบว่ากลุ่มผู้ตอบสนองทั้ง 3 กลุ่มติดตั้งแอนติบอดีต่อปฏิกิริยาต่อต้านขัดขวางต่อ WT ที่เสถียรของ 6P ในระดับที่สูงกว่า WT ที่เสถียรของ 2P โดยปัจจัย 6– ถึง–11– เท่า (รูปที่ 5J) ซึ่งบ่งชี้ว่า เอพิโทปแอนติเจนที่สำคัญแสดงหรือทำให้เสถียรได้ดีกว่าบนแอนติเจนที่ทำให้เสถียร 6P เมื่อใช้ตัวอย่างเดียวกัน ผู้ตอบสนองสูงและปานกลางยังมีแอนติบอดีต่อต้านขัดขวางต่อ BA ในระดับที่ต่ำกว่า1-2P มากกว่า BA1-6P เพิ่มขึ้น 4 ถึง 5 เท่า (รูปที่ 5K) สิ่งที่น่าสังเกตคือ ผู้ตอบสนองระดับต่ำมีการเปลี่ยนแปลงรอยพับเล็กน้อยในปฏิกิริยาการจับกับสไปค์ BA.1 Omicron-2P และ 6P (2-การลดลงเท่า) เมื่อเทียบกับ WT-2P และสไปค์ 6P ({ {28}}การพับลดลง) (รูปที่ 5, J และ K) ซึ่งเสนอแนะว่าแอนติบอดีในซีรั่มที่ต้าน BA.1 เอพิโทปที่ทำปฏิกิริยากับโอไมครอนอาจถูกจำกัดมากกว่าในผู้รับการทดลองที่มีการตอบสนองต่ำ โดยรวมแล้วข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่ามีการปรับปรุงการจับตัวของโพลีโคลนอลที่เกิดจากการติดเชื้อตามธรรมชาติกับเข็มที่เสถียร 6P ทั้งสำหรับไวรัส WT และ Omicron

แอนติบอดีที่มีลักษณะคล้าย S728–1157 ได้รับการกระตุ้นอย่างเหมาะสมที่สุดในบริบทของภูมิคุ้มกันแบบลูกผสม การติดเชื้อ SARS-CoV-2 หลักโดยไม่ได้รับวัคซีนกลายเป็นเรื่องยากในโลกปัจจุบัน และการศึกษาหลายชิ้นรายงานว่าภูมิคุ้มกันของ SARS-CoV-2 แตกต่างกันไปในบุคคลที่มีประวัติการฉีดวัคซีน/การติดเชื้อโดยเฉพาะ จากผลที่ตามมา ต่อไปเราจึงพยายามตรวจสอบว่าการสัมผัสร่วมกันแบบใด นอกเหนือจากการติดเชื้อ WT ด้วย SARS-CoV ของบรรพบุรุษ-2 เพียงอย่างเดียว ที่จะชักนำแอนติบอดีที่มีลักษณะคล้าย S728–1157 ในพลาสมาได้อย่างมีประสิทธิภาพจากวัคซีนที่ใช้ mRNA แบบโมโนวาเลนท์ที่มีและไม่มีมาก่อน การติดเชื้อ. เราได้รับตัวอย่างทางชีวภาพที่จำเป็นจากกลุ่มการศึกษา Protection Associated with Rapid Immunity to SARS-CoV-2 (PARIS) ซึ่งติดตามบุคลากรทางการแพทย์มาอย่างยาวนานนับตั้งแต่เริ่มมีการระบาดใหญ่ (44) เราเลือกตัวอย่างพลาสมาจากผู้เข้าร่วมการศึกษาที่ได้รับการฉีดวัคซีนครบแล้ว (2 × ฉีดวัคซีน) ที่มีและไม่มีการติดเชื้อ รวมถึงจากผู้เข้าร่วมที่ได้รับการส่งเสริม (3 × ฉีดวัคซีน) ที่มีและไม่มีการติดเชื้อ นอกจากนี้เรายังรวมตัวอย่างจากผู้เข้าร่วมการศึกษาที่ได้รับวัคซีน mRNA แบบไบวาเลนต์ (WA1/2020 ของบรรพบุรุษบวก Omicron BA.5) (รูปที่ 6A และตารางเสริม 2) การติดเชื้อที่ลุกลามอย่างรวดเร็วในผู้เข้าร่วมที่ได้รับการฉีดวัคซีนกระตุ้นเกิดขึ้นในช่วงเวลาที่เชื้อสาย Omicron ได้เข้ามาแทนที่เชื้อสาย SARS-CoV-2 อื่นๆ ทั้งหมดในเขตมหานครนิวยอร์ก เราพบว่าบุคคลที่ได้รับการฉีดวัคซีนสองครั้งมีระดับไทเทอร์ของแอนติบอดีในซีรัมที่แข่งขันได้ S728-1157 ต่ำที่สุดในบรรดาตัวอย่าง 5 กลุ่มที่ทดสอบ (รูปที่ 6B) โดยเฉพาะอย่างยิ่งระดับเหล่านี้มีความคล้ายคลึงกับระดับที่สังเกตได้ในกลุ่มผู้ป่วยที่ได้รับการพักฟื้นและไม่ได้รับการฉีดวัคซีนของเรา (ผู้เผชิญเหตุทั้งหมด; รูปที่ 5B) ในการเปรียบเทียบ บุคคลที่มีประวัติการติดเชื้อตามธรรมชาติ รวมถึงผู้ป่วยพักฟื้นที่ได้รับวัคซีน 2 ใน 3 โดส และบุคคลที่เคยประสบกับการติดเชื้อที่ลุกลามและได้รับวัคซีนกระตุ้นแบบไบวาเลนต์ มีระดับการกระตุ้น S728-1157 สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับผู้ที่ไม่ติดเชื้อ แต่บุคคลที่ได้รับการฉีดวัคซีนแล้ว (รูปที่ 6B) แม้ว่ากลุ่มขนาดยา 3- ที่ไม่ติดเชื้อจะแสดงการเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยเท่านั้นเมื่อเทียบกับกลุ่มขนาดยา 2- แต่การแยกย่อยตามประเภทของวัคซีนบ่งชี้ว่า BNT162b2 และ mRNA ในปริมาณที่สามที่คล้ายคลึงกัน-1273 เพิ่ม S{{ อย่างมีนัยสำคัญ 38}}เช่น การทำให้ไทเทอร์ของแอนติบอดีเป็นกลาง 2.72 × และ 2.85 × ตามลำดับ (รูปที่ 6, C และ D) โปรดทราบว่า ในบรรดาผู้เข้าร่วมที่มีการสัมผัสกันทั้งหมด 3 ครั้งซึ่งมีการขัดขวางไม่ว่าด้วยวิธีใดก็ตาม S728-1157- เช่น แอนติบอดีไทเตอร์นั้นสูงกว่า 3 เท่าในวัคซีนดับเบิ้ลที่ได้รับการพักฟื้น เมื่อเทียบกับวัคซีน 3 ชนิดที่ไม่มีการติดเชื้อ ซึ่งบ่งชี้ว่า SARS-CoV{{ 51}} การติดเชื้อจะชักนำโคลนโนไทป์นี้ได้อย่างเหมาะสมยิ่งขึ้น ในบรรดากลุ่มภูมิคุ้มกันลูกผสม เราสังเกตว่าบุคคลที่ได้รับการส่งเสริมส่วนใหญ่ที่มีความก้าวหน้าและได้รับวัคซีนกระตุ้นชนิดไบวาเลนต์มีระดับแอนติบอดี S728-1157 ที่สูงขึ้นเพียงเล็กน้อยเท่านั้น เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการฉีดวัคซีนระยะพักฟื้นก่อน omicron ซึ่งเสนอแนะว่า S{{53 }} titer น่าจะเข้าใกล้ที่ราบสูงหลังจากสัมผัส 3 ครั้ง นอกจากนี้เรายังตรวจสอบไทเตอร์ของโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่แข่งขันกับ CC12.3 และ CR3022 นอกเหนือจาก S728-1157 บุคคลทุกคนมีระดับของ CC12 ค่อนข้างสูง3- และ CR3022-เหมือนกับแอนติบอดี โดยไม่ขึ้นกับจำนวนและประเภทของการสัมผัส (รูปที่ 5 เพิ่มเติม) ซึ่งตรงกันข้ามกับสิ่งที่เราสังเกตเห็นสำหรับ S728-1157- เหมือนแอนติบอดี โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และการฉีดวัคซีน mRNA มีส่วนทำให้เกิด S728-1157- เช่นเดียวกับการกระตุ้นแอนติบอดี โดยการติดเชื้อมีบทบาทสำคัญมากกว่าในผู้ที่ได้รับวัคซีน

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

ท้ายที่สุด ในการเปรียบเทียบการตอบสนองต่อการขัดขวางที่เสถียรของ 2P- กับ 6P ในกลุ่มการฉีดวัคซีน mRNA เราพบว่ากลุ่มส่วนใหญ่ดึงเอาแอนติบอดีในระดับที่ใกล้เคียงกันกับโครงสร้างทั้งสอง ข้อยกเว้นนี้คือกลุ่มที่ได้รับวัคซีนสามเท่าที่ไม่ติดเชื้อ ซึ่งแสดงให้เห็นปฏิกิริยาต่อ 2P ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าจะเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยเท่านั้น เมื่อเทียบกับการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของ 6P (รูปที่ 6E) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าตรงกันข้ามกับการติดเชื้อตามธรรมชาติ (รูปที่ 5, J และ K) การฉีดวัคซีนเพียงอย่างเดียวทำให้เกิดการตอบสนองแบบโพลิโคลนอลที่ถูกจำกัดไว้เฉพาะอีพิโทปในโครงสร้าง Spike-2P ซึ่งสอดคล้องกับ Spike{{12 }}P สูตรวัคซีนปัจจุบัน ท้ายที่สุดแล้ว การค้นพบนี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่าการรักษาเสถียรภาพของวัคซีน SARS-CoV-2 ในอนาคตให้คงอยู่ระดับ 6P อาจมีประโยชน์หลักในการกระตุ้นให้เกิดโคลนโนไทป์ของแอนติบอดีที่มีการป้องกันในวงกว้าง เช่น S728-1157

รูปที่ 5 การแข่งขันแอนติบอดีในซีรั่มระยะพักฟื้นด้วย mAbs ที่ทำปฏิกิริยากับ RBD เป็นกลางในวงกว้าง และการเปรียบเทียบการตอบสนองของแอนติบอดีในซีรั่มกับเดือยที่มีความเสถียร 6P กับ 2P

รูปที่ 6 การแข่งขันแอนติบอดีในซีรั่มที่ได้รับการฉีดวัคซีน mRNA ด้วย mAb ที่ทำปฏิกิริยากับ RBD ที่ทำให้เป็นกลางด้วย S728-1157 และการเปรียบเทียบการตอบสนองของแอนติบอดีในซีรั่มกับสไปค์ที่มีความเสถียร 6P กับ 2P

การอภิปราย

ในการศึกษานี้ เราระบุ bnAb ที่มีศักยภาพซึ่งแยกได้จากเซลล์หน่วยความจำ B ของบุคคลที่ฟื้นตัวจากการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ในช่วงระลอกแรกของการระบาดของ COVID-19 bnAb, S728- 1157 นี้รักษาปฏิกิริยาการจับที่สำคัญและมีฤทธิ์ทำให้เป็นกลางอย่างสม่ำเสมอกับ VOC ของ SARS-CoV-2 ที่ทดสอบทั้งหมด ซึ่งรวมถึง Omicron BA.1, BA.2, BA.2.75, BL.1 ( BA.2.75+R346T), BA.4, BA.5 และ XBB และสามารถลดไทเตอร์ของไวรัสที่ติดเชื้อได้อย่างมากหลังจากการติดเชื้อ Delta และ BA.1 ในหนูแฮมสเตอร์

เราพบว่าซีรั่มพักฟื้นจากกลุ่มร่วมรุ่นของเรามีแอนติบอดีที่มีความเข้มข้นต่ำซึ่งสามารถแข่งขันกับ S728-1157 (แอนติบอดีคลาส 1/ RBS-A) และเอพิโทป mAbs คลาส 2 สิ่งนี้เสนอแนะว่า S728-1157 ค่อนข้างมีลักษณะเฉพาะจากแอนติบอดีอื่นๆ ที่กำหนดเป้าหมายอีพิโทปคลาส 1 และถูกเหนี่ยวนำไม่บ่อยนักในกลุ่มหน่วยความจำ B เซลล์จำเพาะ RBD แต่กลุ่มการติดเชื้อตามธรรมชาติของเราดูเหมือนจะกระตุ้นให้เกิดแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายไปที่อีพิโทป CR3022 (คลาส 4) แอนติบอดีที่มีความจำเพาะนี้มักจะเกิดปฏิกิริยาข้ามแต่มีฤทธิ์เป็นกลางน้อยกว่าแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมาย RBS (14, 17) ข้อมูลเหล่านี้เป็นส่วนเสริมจากการค้นพบครั้งก่อนของเราที่แสดงให้เห็นว่าแอนติบอดีคลาส 3/S309 จำนวนมากในซีรั่มระยะพักฟื้นอาจนำไปสู่การทำให้ฤทธิ์เป็นกลางต่อตัวแปรอัลฟ่าและแกมมา ในขณะที่การขาดแอนติบอดีคลาส 2 อาจส่งผลให้ความสามารถในการวางตัวเป็นกลางต่อเดลต้าลดลง (15) . อย่างไรก็ตาม ความกว้างของการออกฤทธิ์ของแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมาย RBS ส่วนใหญ่ (RBS-A/คลาส 1, RBS-B, C/คลาส 2 และ RBS-D, S309/คลาส 3) เทียบกับแวเรียนต์ของ Omicron ได้รับการรายงานว่ามีข้อจำกัดอย่างมาก (11, 40, 45)

ความท้าทายหลักที่ก้าวไปข้างหน้าคือการกำหนดวิธีปรับปรุงการกระตุ้นแอนติบอดี้ที่มีปฏิกิริยาข้ามในวงกว้างไปยัง epitopes RBS ที่อนุรักษ์ไว้ ในเรื่องนี้ เราสังเกตที่นี่ว่าบุคคลที่มีภูมิคุ้มกันแบบลูกผสมมีไทเตอร์ของแอนติบอดีที่คล้ายกัน 728-1157- สูงกว่าบุคคลที่ฉีดวัคซีนโดยไม่ได้รับการติดเชื้อก่อนหน้านี้อย่างมีนัยสำคัญ ที่สำคัญ ปรากฏการณ์นี้ถูกบันทึกไว้แม้ว่าจำนวนการสัมผัสจะถูกควบคุม (เช่น ในวัคซีนคู่ที่ได้รับการพักฟื้นเทียบกับวัคซีนสามตัวที่ไม่ติดเชื้อ) ซึ่งบ่งชี้ว่าองค์ประกอบบางอย่างของภูมิคุ้มกันที่เกี่ยวข้องกับการติดเชื้อ (หรือสูตรวัคซีนที่สามารถเลียนแบบภูมิคุ้มกันประเภทนี้ได้) เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการกระตุ้นให้เกิดโคลนโนไทป์นี้ สิ่งนี้สอดคล้องกับหลักฐานการทดลองที่บันทึกไว้ว่าบุคคลที่มีภูมิคุ้มกันแบบลูกผสมมีโปรไฟล์ปฏิกิริยาของแอนติบอดีที่กว้างกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับผู้ที่มีการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่เกิดจากการฉีดวัคซีนหรือการติดเชื้อขั้นต้นเท่านั้น (9)

โครงสร้างในที่นี้แสดงให้เห็นว่า S728-1157 จับอีพิโทป RBS-A/คลาส 1 ใน RBD ที่มีโครงสร้างด้านบน เอพิโทปนี้ดูเหมือนจะสามารถเข้าถึงได้ง่ายกว่าบนเดือยที่มีความเสถียร 6P ซึ่งได้รับการรายงานว่ามี RBD 2 ตัวในตอนเหนือของรัฐ เมื่อเปรียบเทียบกับเดือย 2P ซึ่งนำเสนอเพียง 1 (30, 33, 46, 47) และแอนติบอดีของเรา เฉพาะสำหรับการแสดงขัดขวางที่มีโครงสร้างดีขึ้น S728-1157 ถูกแยกออกหลังการติดเชื้อตามธรรมชาติ ในบริบทดังกล่าว โอกาสที่จะเหนี่ยวนำให้เกิดโคลนคล้าย S728-1157 มีแนวโน้มที่จะสูงกว่า เนื่องจาก RBD จะต้องสามารถนำโครงสร้างที่เพิ่มมากขึ้นมาใช้ แม้จะชั่วคราว เพื่อผูกกับ ACE2 ดังนั้นจึงเผยให้เห็นเอพิโทปนี้ ไม่เหมือนกับแอนติบอดี IGHV3-53/3-66 RBS-A/คลาส 1 ส่วนใหญ่ S728-1157 สามารถรองรับการกลายพันธุ์ที่สำคัญในการเพิ่ม VOC อย่างรวดเร็วโดยใช้อันตรกิริยาที่กว้างขวางระหว่าง CDR-H3 และ RBD (29, 48–50) S728-1157 ยังใช้สายเบาที่แตกต่างกัน (IGLV3-9) เมื่อเปรียบเทียบกับแอนติบอดีที่กว้างน้อยกว่าอื่นๆ เช่น CC12.3 (IGKV3-20) ซึ่งอาจส่งผลต่ออันตรกิริยาในการจับโดยรวม อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ของเราบ่งชี้ว่ามีพันธะไฮโดรเจนน้อยกว่าระหว่างสายโซ่เบา S728-1157 และ RBD เมื่อเทียบกับ CC12.3 (ตารางเสริม 7) แม้ว่าเรซิดิวสัมผัสของ CDR-H3 ส่วนใหญ่ที่สำคัญสำหรับปฏิกิริยาข้ามของ VOC ในอันตรกิริยานี้ถูกเข้ารหัสเจิร์มไลน์และไม่ถูกนำเข้าโดยการกลายพันธุ์ทางร่างกาย, เรซิดิวที่ถูกกลายพันธุ์ทางร่างกายหลายตัวในบริเวณเฟรมเวิร์คหรือ CDR-H1, CDR-H2 และ CDR-L1 คือ เกี่ยวข้องกับการโต้ตอบกับ SARS-CoV-2 RBD ในด้านหนึ่ง สิ่งนี้เสนอแนะว่าเซลล์หน่วยความจำ B ซึ่งเข้ารหัสแอนติบอดีคลาส IGHV3-53/66 สามารถได้รับระดับของปฏิกิริยาข้ามที่คล้ายคลึงกันโดยการทำให้สัมพรรคภาพเจริญเต็มที่เพิ่มเติม ในทางกลับกัน สิ่งนี้ยังบ่งชี้ถึงความเป็นไปได้ในการออกแบบอิมมูโนเจนที่กำหนดเป้าหมายไปที่เจิร์มไลน์ซึ่งกำหนดเป้าหมาย 728-1157- เช่น เซลล์ B ไร้เดียงสา แม้ว่าการออกแบบวัคซีนที่สามารถกระตุ้นแอนติบอดีที่มีลักษณะคล้าย S728-1157 โดยเฉพาะด้วย CDR-H3 บางประเภทที่สามารถเอาชนะการกลายพันธุ์ของ VOC อาจเป็นเรื่องท้าทาย แต่ก็น่าสนับสนุนว่ามีการสังเกตการจำกัดยีน IGHV ใน SARS-CoV ที่มีศักยภาพอื่นๆ{ {58}} การทำให้การศึกษา mAbs เป็นกลาง (13, 15, 20–27) อีกทางหนึ่งอาจเป็นไปได้ด้วยการสร้างภูมิคุ้มกันซ้ำด้วยอิมมูโนเจน RBD ที่ได้รับการปรับปรุงตามที่เคยรายงานไว้สำหรับเชื้อโรคอื่น ๆ (51–55)

แม้ว่าการกลายพันธุ์จำนวนมากถูกสังเกตพบในตำแหน่งของแอนติเจน RBS-A/คลาส 1 (18) ที่เกี่ยวข้องกับอีพิโทป S728-1157, เรซิดิวสัมผัส RBD ทั้งหมด 13 จาก 15 รายการและ CDR-H{9} 2 จาก 3 รายการ }สารตกค้างจากการสัมผัส RBD จะถูกเก็บรักษาไว้ภายใน Omicron และ VOC อื่นๆ ทั้งหมด สิ่งนี้เสนอแนะว่าบริเวณ RBD ซึ่งพบอีพิโทป S728-1157 อาจรวมถึงเรซิดิวที่สำคัญสำหรับการทำหน้าที่ไดนามิกและสมรรถภาพของไวรัส และด้วยเหตุนี้จึงทนทานต่อการกลายพันธุ์และการเคลื่อนตัวของแอนติเจนได้น้อยกว่าเรซิดิวของตำแหน่ง RBS-A/คลาส 1 ที่อยู่รอบๆ หากเป็นกรณีนี้ แนวโน้มสำหรับอีพิโทปเฉพาะนี้ที่จะสูญเสียไปในขณะที่ตัวแปรของไวรัสวิวัฒนาการควรลดลง ซึ่งจะทำให้การแสดงคุณลักษณะของ S728-1157 และแอนติบอดีและอีพิโทปที่คล้ายกันมีความสำคัญสำหรับวัคซีนต้านทานตัวแปรหรือการพัฒนาทางการรักษา mAb โดยสรุป การศึกษาของเราระบุ bnAbs ที่อาจแจ้งการออกแบบภูมิคุ้มกันสำหรับวัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ที่ได้รับการพิสูจน์แล้ว หรือทำหน้าที่เป็นยารักษาโรค mAb ที่ต้านทานต่อวิวัฒนาการของ SARS CoV-2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในแง่ของศักยภาพและความกว้างที่รวมกัน S728-1157 ดูเหมือนจะเป็นแอนติบอดีที่ดีที่สุดในประเภทเดียวกันที่แยกได้จนถึงปัจจุบัน เนื่องจากแอนติบอดีนี้จับกันได้ง่ายขึ้นด้วยการรักษาความเสถียรของ 6P จึงคาดการณ์ว่าจะถูกกระตุ้นเป็นพิเศษโดยโปรตีนสไปค์รีคอมบิแนนท์ที่มีความเสถียร 6P หรือไวรัสทั้งหมด ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการดัดแปลงเฮกซาโพรลีนอาจเป็นประโยชน์ต่อโครงสร้างของวัคซีนในอนาคต เพื่อที่จะป้องกัน SARS-CoV ในอนาคตได้อย่างเหมาะสมที่สุด แวเรียนต์ -2 และอาร์โบไวรัสอื่นๆ

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

วิธีการ

การแยกโมโนโคลนอลแอนติบอดี PBMC ถูกแยกออกจากตัวกรองการลดเม็ดเลือดขาวและแช่แข็งตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (24) บี เซลล์ถูกทำให้สมบูรณ์จาก PBMC ผ่านทาง FACS เซลล์ถูกย้อมด้วยโพรบ CD19, CD3 และแอนติเจนที่คอนจูเกตกับโอลิโก-ฟลูออโรฟอร์ เซลล์ที่สนใจถูกระบุเป็น CD3– CD19+ Antigen+ mAbs ทั้งหมดถูกสร้างขึ้นจากเซลล์ที่เรียงลำดับแอนติเจนที่ติดแท็กโอลิโกซึ่งระบุผ่าน RNA-Seq เซลล์เดียวตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (15, 24) ข้อมูลเซลล์ B เดี่ยวที่สร้างขึ้นในการศึกษานี้ได้ถูกฝากไว้ที่ Gene Expression Omnibus: GSE171703 และ GSM5231088–GSM5231123

บีเซลล์ที่จำเพาะต่อแอนติเจนถูกเลือกเพื่อสร้าง mAbs ตามความเข้มของแอนติเจน-โพรบที่วิเคราะห์โดย JMP Pro 15 ยีนของแอนติบอดีสายหนักและสายเบาถูกสังเคราะห์โดย Integrated DNA Technologies (IDT) และโคลนเข้าไปใน IgG1 ของมนุษย์และสายโซ่เบา κ หรือ แล ของมนุษย์ เวกเตอร์นิพจน์โดยชุดประกอบ Gibson ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (56) สายหนักและสายเบาของ mAb ที่สอดคล้องกันถูกทรานส์เฟกแบบชั่วคราวไปในเซลล์ HEK293T (ATCC) หลังจากการทรานส์เฟกชันเป็นเวลา 18 ชั่วโมง เซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกถูกเสริมด้วยไฮบริโดมามีเดียมลอยเหนือตะกอนที่ปราศจากโปรตีน (PFHM-II, Gibco) ส่วนเหนือตะกอนที่มี mAb ที่หลั่งออกมาถูกเก็บเกี่ยวในวันที่ 4 และบริสุทธิ์โดยใช้โปรตีน A-agarose เม็ด (Thermo Fisher Scientific) ตามรายละเอียดก่อนหน้านี้ (56) ลำดับของสายโซ่หนักและสายเบาของแอนติบอดีที่มีคุณสมบัติเฉพาะอย่างดีได้มาจากโปรตีนดาต้าแบงค์ (PDB), LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG), CR3022 (PDB ID: 6W7Y) และ REGN1{{ 125}}933 (PDB ID: 6XDG) และถูกสังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) จัดทำโดย Meng Yuan ที่สถาบันวิจัย Scripps (ซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) การแสดงออกของโปรตีนสไปค์รีคอมบิแนนท์ ลูกผสม D614G SARS-CoV-2 ชนิดรีคอมบิแนนท์ (FL) ขัดขวาง, BA.2-6P, BA.4/5-6P, BQ.1-6P, BQ. 1.1-6P, XBB-6P, WT RBD, พันธุ์กลาย RBD เดี่ยว (R346S, K417N, K417T, G446V, L452R, S477N, F486A, F486Y, N487Q, Y489F, Q493A, Q493N, N501Y, Y505A และ Y505F) พันธุ์กลาย RBD แบบรวมกัน (K417N/E484K/L452R/NN501Y), SARS-CoV-1 RBD และ MERS-CoV RBD ถูกสร้างขึ้นภายในองค์กร โดยสรุป แอนติเจนชนิดลูกผสมถูกแสดงออกโดยใช้เซลล์ Expi293F (Thermo Fisher Scientific) ยีนที่สนใจถูกโคลนเป็นเวกเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (AbVec ดัดแปลงภายในบริษัท) และแปลงสภาพโดยใช้ชุด ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) ตามระเบียบการของผู้ผลิต ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกเก็บเกี่ยวในวันที่ 4 หลังจากการทรานส์เฟกชันและบ่มด้วยกรดไน-ไนไตรโลไตรอะซิติก (Ni-NTA) อะกาโรส (เชียเกน) การทำให้บริสุทธิ์ดำเนินการโดยใช้คอลัมน์การไหลของแรงโน้มถ่วงและชะด้วยบัฟเฟอร์ที่มีอิมิดาโซลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (57, 58) สารที่ถูกชะถูกบัฟเฟอร์และแลกเปลี่ยนกับ PBS โดยใช้หน่วยการหมุนเหวี่ยงของแอมิคอน (มิลลิพอร์) เดือย FL แบบรีคอมบิแนนท์ทำให้เสถียรโดยการกลายพันธุ์ 2P ของแวเรียนต์ B.1.1.7 Alpha, B.1.351 Beta, P.1 Gamma, B.1.617.2 Delta, BA.1, BA.2 และ BA.4 Omicron และถูก ผลิตในห้องปฏิบัติการ Sather ที่สถาบันวิจัยเด็กซีแอตเทิล RBD K417V, N439K และ E484K และ recombinant FL Spike WT-2P และ 6P ผลิตขึ้นในห้องปฏิบัติการ Krammer ที่ Icahn School of Medicine ที่ Mount Sinai SARS-CoV-2-6P-Mut7 และ Spike BA1-6P ได้รับการออกแบบและผลิตตามที่อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้า (59) ลำดับโปรตีนและทรัพยากรสำหรับแอนติเจนแต่ละตัวแสดงอยู่ในตารางเสริม 4 ELISA โปรตีนรีคอมบิแนนท์ SARS-CoV-2 สไปค์/RBD ถูกเคลือบบนเพลตไมโครไตเตอร์ที่จับกับโปรตีนสูง (โคสตาร์) ที่ 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน PBS ที่ 50 ไมโครลิตร/หลุม และเก็บไว้ข้ามคืนที่ 4 องศา ล้างเพลตด้วย PBS ที่มี 0.05% ทวีน 20 (PBS-T) และปิดกั้นด้วย 150 ไมโครลิตรของ PBS ที่มี 20% FBS เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา โมโนโคลนอล แอนติบอดีถูกเจือจางเป็นลำดับ 3-เท่าโดยเริ่มต้นจาก 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ใน PBS และบ่มในบ่อเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา จากนั้นเพลตถูกล้างและบ่มด้วยแอนติบอดีต้าน IgG แพะที่คอนจูเกตด้วย HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098), 1:1,000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา หลังจากการล้าง ซับสเตรต Super AquaBlue ELISA (eBioscience) 100 ไมโครลิตรถูกเติมต่อหลุม วัดการดูดซับที่ 405 นาโนเมตรบนไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (Bio-Rad) การสอบวิเคราะห์ได้รับมาตรฐานโดยใช้แอนติบอดีควบคุม S144-509 (15) โดยมีลักษณะเฉพาะการจับที่ทราบในทุกเพลต และเพลตได้รับการพัฒนาจนกระทั่งการดูดกลืนแสงของตัวควบคุมไปถึง OD ที่ 3.0 mAbs ทั้งหมดได้รับการทดสอบซ้ำกัน และการทดลองแต่ละครั้งดำเนินการสองครั้ง

เซรั่มเอลิซ่า. เพลตไมโครไทเตอร์ที่จับกับโปรตีนสูงถูกเคลือบด้วยรีคอมบิแนนท์แอนติเจน SARS-CoV-2 ที่ 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรใน PBS ข้ามคืนที่ 4 องศา ล้างเพลตด้วย PBS 0.05% ทวีนและปิดกั้นด้วย 200 ไมโครลิตร PBS 0.1% ทวีน + 3% นมผงพร่องมันเนยเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง (RT) ตัวอย่างพลาสมาถูกทำให้ความร้อนหมดฤทธิ์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 56 องศา ก่อนทำการทดลองทางเซรุ่มวิทยา พลาสมาถูกเจือจางตามลำดับ 2-เท่าใน PBS 0.1% Tween + 1% นมผงพร่องมันเนย เพลตถูกบ่มด้วยการเจือจางในซีรัมเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แอนติบอดีรองที่ต้าน Ig ของแพะที่คอนจูเกตด้วย HRP เจือจางที่ 1:3,000 ด้วย PBS 0.1% Tween + 1% นมผงพร่องมันเนยถูกใช้เพื่อตรวจจับการจับของแอนติบอดี หลังจากการฟักตัว 1 ชั่วโมง เพลตได้รับการพัฒนาด้วยสารละลาย SigmaFast OPD 100 ไมโครลิตร (Sigma-Aldrich) เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นใช้ 50 μL 3M HCl เพื่อหยุดปฏิกิริยาการพัฒนา วัดการดูดกลืนแสงที่ 490 นาโนเมตรบนไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (Bio-Rad) ไทเทอร์จุดสิ้นสุดถูกคาดการณ์จากกราฟมาตรฐานซิกมอยด์ 4PL (โดยที่ x คือความเข้มข้นของล็อก) สำหรับแต่ละตัวอย่าง ขีดจำกัดการตรวจจับ (LOD) ถูกกำหนดให้เป็นค่าเฉลี่ย + 3 SD ของสัญญาณ OD ที่บันทึกโดยใช้พลาสมาจากบุคคลในช่วงก่อน SARS-CoV-2 การคำนวณทั้งหมดดำเนินการในซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 9.0)

การแข่งขันเอลิซา เพื่อกำหนดการจัดหมวดหมู่อีพิโทปเป้าหมายของ mAbs ที่ไวต่อปฏิกิริยา RBD, ELISA แบบแข่งขันถูกดำเนินการโดยใช้ mAbs อื่นๆ ที่มีลักษณะเฉพาะในการจับอีพิโทปที่รู้จักในฐานะ mAbs ของคู่แข่ง mAbs ของคู่แข่งถูกไบโอไทนิเลตโดยใช้ EZ-Link sulfo-NHS-ไบโอติน (เทอร์โม ฟิชเชอร์ ไซแอนทิฟิค) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ RT ไบโอตินส่วนเกินของ mAbs ที่เติมไบโอตินถูกกำจัดออกด้วยคอลัมน์แยกเกลือแบบแยกเกลือแบบ Zeba spin 7k (MWCO) (Thermo Fisher Scientific) เพลตถูกเคลือบด้วยแอนติเจน RBD 2 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรข้ามคืนที่ 4 องศา เพลตถูกปิดกั้นด้วย PBS–20% FBS เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ RT และมีการเติม 2-การเจือจางเท่าของ mAbs ของคลาสหรือซีรัมที่ไม่ทราบแน่ชัด โดยเริ่มต้นที่ 20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรของ mAbs และการเจือจางของซีรั่มในอัตราส่วน 1:10 หลังจากการบ่มแอนติบอดีเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ RT, mAb ของคู่แข่งที่ถูกเติมไบโอตินถูกเติมที่ความเข้มข้นสองเท่าของค่าคงที่การแยกตัวของมัน (KD) และบ่มเป็นเวลาอีก 2 ชั่วโมงที่ RT ร่วมกับ mAb หรือซีรัมที่ถูกเติมก่อนหน้านี้ ล้างเพลตและบ่มด้วยสเตรปตะวิดินที่ควบกับ HRP 100 ไมโครลิตร (เทคโนโลยีชีวภาพภาคใต้) ที่การเจือจาง 1:1,000 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา เพลตได้รับการพัฒนาด้วยสารตั้งต้น Super AquaBlue ELISA (eBioscience) เพื่อทำให้การสอบวิเคราะห์เป็นมาตรฐาน mAb ที่ถูกเติมไบโอตินของคู่แข่งถูกเติมลงในหลุมโดยไม่มี mAbs หรือซีรั่มที่แข่งขันกันใดๆ เป็นตัวควบคุม ข้อมูลถูกบันทึกเมื่อการดูดกลืนแสงของหลุมควบคุมถึง OD ที่ 1.0–1.5 จากนั้น เปอร์เซ็นต์การแข่งขันระหว่าง mAbs จะถูกคำนวณโดยการหาร OD ที่สังเกตได้ของกลุ่มตัวอย่างด้วย OD ที่ได้มาจากกลุ่มควบคุมเชิงบวก ลบค่านี้ออกจาก 1 และคูณด้วย 100 สำหรับซีรัม OD จะถูกแปลงเป็น log10 และวิเคราะห์โดยการถดถอยแบบไม่เชิงเส้นเพื่อกำหนด 50 ค่า % ความเข้มข้นของการยับยั้ง (IC50) โดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 9.0) ข้อมูลถูกแปลงเป็น Log1P และพล็อตเป็นตัวแทนกราฟของการเจือจางในซีรัมซึ่งกันและกันของ IC50 ของการเจือจางในซีรัมที่สามารถบรรลุการแข่งขัน 50% กับ mAb ของคู่แข่งที่สนใจ mAbs ทั้งหมดถูกทดสอบซ้ำกัน แต่ละการทดลองดำเนินการ 2 ครั้งอย่างอิสระ และค่าจากการทดลองอิสระ 2 รายการถูกหาค่าเฉลี่ย

การตรวจคราบจุลินทรีย์ การตรวจวิเคราะห์คราบจุลินทรีย์ดำเนินการด้วยไวรัสแวเรียนต์ SARS-CoV-2 บนเซลล์ Vero E6/TMPRSS2 (คอลเลกชันทรัพยากรชีวภาพการวิจัยของญี่ปุ่น (JCRB)) (ตารางเสริม 5) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงเพื่อให้ได้มาซึ่งการรวมตัวกัน 90% ก่อนที่จะถูกทริปซิไนซ์และเพาะที่ความหนาแน่น 3 × 104 เซลล์/หลุมในเพลตหลุม 96- ในวันต่อมา แวเรียนต์ SARS-CoV-2 102 PFU ถูกบ่มด้วย mAbs ที่เจือจางแบบพับ 2- เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ของผสมแอนติบอดี-ไวรัสถูกบ่มด้วยเซลล์ Vero E6/TMPRSS2 เป็นเวลา 3 วันที่ 37 องศา เพลตถูกตรึงด้วยเมทานอล 20% แล้วย้อมด้วยสารละลายคริสตัลไวโอเล็ต ความเข้มข้นในการยับยั้งที่สมบูรณ์ (IC99) ถูกคำนวณโดยใช้บันทึก (ตัวยับยั้ง) กับการตอบสนองที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (ความชันที่แปรผัน) ดำเนินการใน GraphPad Prism (เวอร์ชัน 9.0) mAbs ทั้งหมดได้รับการทดสอบซ้ำกัน และการทดลองแต่ละครั้งดำเนินการสองครั้ง การทดสอบการวางตัวเป็นกลางของการลดโฟกัส การทดสอบการวางตัวเป็นกลางของการลดโฟกัส (FRNT) ถูกนำมาใช้เพื่อกำหนดกิจกรรมการทำให้เป็นกลางในฐานะแพลตฟอร์มเพิ่มเติม นอกเหนือจากการทดสอบคราบจุลินทรีย์ การเจือจางแบบอนุกรมของซีรัมเริ่มต้นที่ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 1:20 ผสมกับไวรัสที่ก่อให้เกิดโฟกัส 103 หน่วยต่อหลุม และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา ตัวอย่างซีรั่มก่อนการแพร่ระบาดที่รวมกลุ่มทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุม ของผสมแอนติบอดี-ไวรัสถูกเพาะเชื้อบนเซลล์ Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) ในจานหลุม 96- และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา สารละลายเมทิลเซลลูโลสที่มีปริมาตรเท่ากันถูกเติมลงในแต่ละหลุม เซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 16 ชั่วโมงที่ 37 องศา แล้วตรึงด้วยฟอร์มาลิน หลังจากกำจัดฟอร์มาลินออกแล้ว เซลล์จะถูกสร้างภูมิคุ้มกันด้วย mAb ของหนูที่ต้าน SARS-CoV-1/2 นิวคลีโอโปรตีน [โคลน 1C7C7 (Sigma-Aldrich)] ตามด้วยอิมมูโนโกลบุลินต่อต้านหนูเมาส์ที่มีฉลาก HRP (Sigma- อัลดริช; A8924) เซลล์ที่ติดเชื้อจะถูกย้อมด้วย TrueBlue Substrate (SeraCare Life Sciences) แล้วล้างด้วยน้ำกลั่น หลังจากการทำให้แห้ง หมายเลขโฟกัสถูกหาปริมาณโดยใช้เครื่องวิเคราะห์ ImmunoSpot S6, ซอฟต์แวร์ ImmunoCapture และซอฟต์แวร์ BioSpot (เทคโนโลยีเซลลูลาร์) IC50 ถูกคำนวณจากค่าประมาณค่าจากบันทึก (ตัวยับยั้ง) กับการตอบสนองที่ทำให้เป็นมาตรฐาน โดยใช้ความชันแปรผัน (พารามิเตอร์ 4 ตัว) การถดถอยแบบไม่เชิงเส้นที่ดำเนินการใน GraphPad Prism (เวอร์ชัน 9.0)

อ้างอิง

1. Hou YJ และคณะ ตัวแปร SARS-CoV-2 D614G แสดงการจำลองแบบที่มีประสิทธิภาพจากภายนอกร่างกายและการส่งผ่าน ในสิ่งมีชีวิต ศาสตร์. 2020;370(6523):1464–1468.

2. การ์เซีย-เบลทราน WF และคณะ สายพันธุ์ SARS CoV-2 หลายสายพันธุ์หลบหนีจากการวางตัวเป็นกลางโดยภูมิคุ้มกันของร่างกายที่เกิดจากวัคซีน เซลล์ 2021;184(9):2523.

3. วอลล์อีซี และคณะ การทำให้ฤทธิ์ของแอนติบอดีเป็นกลางต่อสารอินทรีย์ระเหยง่ายของ SARS-CoV-2 B.1.617.2 และ B.1.351 โดยการฉีดวัคซีน BNT162b2 มีดหมอ 2021;397(10292):2331–2333.

4. เอดารา วีวี และคณะ การตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางจากการติดเชื้อและวัคซีนต่อสายพันธุ์ SARS-CoV-2 B.1.617 N ภาษาอังกฤษ J Med 2021;385(7):664–666.

5. โจว ดี และคณะ หลักฐานการหลบหนีของ SARS-CoV-2 ตัวแปร B.1.351 จากซีรั่มธรรมชาติและที่เกิดจากวัคซีน เซลล์ 2021;184(9):2348–2361.

6. Weisblum Y และคณะ หลบหนีจากการทำให้แอนติบอดีเป็นกลางโดยตัวแปรโปรตีนขัดขวางของ SARS-CoV-2 เอไลฟ์. 2020;9:e61312.

7. Graham F. การบรรยายสรุปรายวัน: ตัวแปรไวรัสโคโรนาของ Omicron ทำให้นักวิทยาศาสตร์ตื่นตัว ธรรมชาติ. 2021;.

8. คาริม SSA, คาริม คิวเอ. ตัวแปร Omicron SARS-CoV-2: บทใหม่ของการแพร่ระบาดของโควิด-19 มีดหมอ 2021;398(10317):2126–2128.

9. คาร์เรโน เจเอ็ม และคณะ การออกฤทธิ์ของการพักฟื้นและเซรั่มวัคซีนต้าน SARS-CoV-2 Omicron ธรรมชาติ. 2021;602(7898):682–688.

10. หวัง คิว และคณะ คุณสมบัติการหลีกเลี่ยงแอนติบอดีที่น่าตกใจของสายพันธุ์ย่อย BQ และ XBB ของ SARS-CoV{2}} ที่เพิ่มขึ้น เซลล์ 2022;186(2):279–286.

11. แวนบลาร์แกน แอลเอ และคณะ ไวรัส SARS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron ที่ติดเชื้อจะหลุดรอดจากการทำให้เป็นกลางโดยโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ใช้รักษาโรค แนท เมด. 2022;28(3):490–495.

12. ทาคาชิตะ อี และคณะ ประสิทธิภาพของแอนติบอดีและยาต้านไวรัสต่อเชื้อ Covid-19 ตัวแปร Omicron N ภาษาอังกฤษ J Med 2022;386(10):995–998.

13. หยวน เอ็ม และคณะ การจดจำโดเมนการจับรีเซพเตอร์ SARS-CoV-2 โดยการทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง ชุมชน Biochem Biophys Res 2021;538:192–203.

14. Barnes CO และคณะ โครงสร้างแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของ SARS-CoV-2 จะแจ้งกลยุทธ์ในการรักษา ธรรมชาติ. 2020;588(7839):682–687.

15. ช่างรอบ เอส และคณะ การทำให้เป็นกลางข้ามสายพันธุ์ของ SARS-CoV-2 ที่เกิดขึ้นใหม่ที่น่ากังวลโดยแอนติบอดีที่มุ่งเป้าไปที่เอพิโทปที่แตกต่างกันซึ่งมีการขัดขวาง เอ็มบิโอ 2021;12(6):e0297521.

16. กัธมิลเลอร์ เจเจ และคณะ ความรุนแรงของการติดเชื้อ SARS-CoV-2 เชื่อมโยงกับภูมิคุ้มกันของร่างกายที่เหนือกว่าต่อการติดเชื้อที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว เอ็มบิโอ 2021;12(1):e02940–20.

17. กรีนีย์ เอเจ และคณะ การจับคู่การกลายพันธุ์กับ SARS-CoV-2 RBD ที่หลุดรอดจากการจับโดยแอนติบอดีประเภทต่างๆ แนทคอม. 2021;12(1):4196.

18. หลิว เอช วิลสัน ไอโอวา เอพิโทปที่ทำให้เป็นกลางในการป้องกันใน SARS-CoV-2 รายได้อิมมูนอล 2022;310(1):76–92.

19. เจ็ตต์ แคลิฟอร์เนีย และคณะ ปฏิกิริยาข้ามในวงกว้างในอาร์โบไวรัสที่แสดงโดยชุดย่อยของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่ได้มาจากผู้บริจาค COVID-19 ตัวแทนเซลล์ 2021;36(13):109760.

20. เบราเวอร์ PJM และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่มีศักยภาพจากผู้ป่วยโควิด-19 สามารถกำหนดเป้าหมายของความเปราะบางได้หลายเป้าหมาย ศาสตร์. 2020;369(6504):643–650.

21. ปินโต ดี และคณะ การทำให้เป็นกลางข้ามของ SARS CoV-2 โดยโมโนโคลนอลแอนติบอดี SARS-CoV ของมนุษย์ ธรรมชาติ. 2020;583(7815):290–295.

22. ร็อบเบียนี DF และคณะ การตอบสนองของแอนติบอดีแบบมาบรรจบกันต่อ SARS-CoV-2 ในบุคคลที่พักฟื้น ธรรมชาติ. 2020;584(7821):437–442.

23. หยวน เอ็ม และคณะ พื้นฐานเชิงโครงสร้างของการตอบสนองของแอนติบอดีที่ใช้ร่วมกันต่อ SARS-CoV-2 ศาสตร์. 2020;369(6507):1119–1123.

24. ดูแกน HL และคณะ การทำโปรไฟล์ภูมิคุ้มกันของเซลล์บีหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 เผยให้เห็นวิวัฒนาการของแอนติบอดีต่อเป้าหมายของไวรัสที่ไม่ทำให้เป็นกลาง ภูมิคุ้มกัน 2021;54(6):1290–1303.

25. โรเจอร์ส ทีเอฟ และคณะ การแยกแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของ SARS CoV-2 ที่มีศักยภาพและการป้องกันโรคในสัตว์ขนาดเล็ก ศาสตร์. 2020;369(6506):956–963.

26. ชมิทซ์ เอเจ และคณะ แอนติบอดีสาธารณะที่เกิดจากวัคซีนจะป้องกัน SARS-CoV-2 และสายพันธุ์ใหม่ๆ ภูมิคุ้มกัน 2021;54(9):2159–2166.e6.

27. ชิอาร์ และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของมนุษย์มุ่งเป้าไปที่ตำแหน่งการจับตัวรับของ SARS-CoV-2 ธรรมชาติ. 2020;584(7819):120–124.

28. เฉา วาย และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่มีศักยภาพต่อโรค SARS-CoV-2 ระบุได้โดยการจัดลำดับเซลล์เดียวที่มีปริมาณงานสูงของเซลล์ B ของผู้ป่วยพักฟื้น เซลล์ 2020;182(1):73–84.

29. Barnes CO และคณะ โครงสร้างของแอนติบอดีของมนุษย์ที่จับกับการเพิ่มขึ้นของ SARS-CoV-2 จะเผยให้เห็นเอพิโทปทั่วไปและคุณสมบัติที่เกิดซ้ำของแอนติบอดี เซลล์ 2020;182(4):828–842.

30. คอร์เบตต์ แคนซัส และคณะ การออกแบบวัคซีน mRNA ของ SARS-CoV-2 ทำได้โดยการเตรียมพร้อมสำหรับเชื้อโรคต้นแบบ ธรรมชาติ. 2020;586(7830):567–571.

31. อมานัส เอฟ และคณะ การแนะนำโพรลีนสองตัวและการกำจัดตำแหน่งที่แตกแยกโพลีบาซิกทำให้วัคซีน SARS-CoV ที่มีสไปค์แบบรีคอมบิแนนท์-2 มีประสิทธิภาพสูงขึ้นในแบบจำลองเมาส์ เอ็มไบโอ 2021;12(2):e02648–20.

32. ซัน ดับเบิลยู และคณะ ไวรัสโรคนิวคาสเซิลแสดงโปรตีนขัดขวางที่เสถียรของ SARS-CoV-2 กระตุ้นให้เกิดการตอบสนองของภูมิคุ้มกันในการป้องกัน แนทคอม. 2021;12(1):6197.

33. เซียห์ ซีแอล และคณะ การออกแบบตามโครงสร้างของเดือย SARS-CoV-2 ที่มีความเสถียรก่อนฟิวชั่น ศาสตร์. 2020;369(6510):1501–1505.

34. Gobeil SM และคณะ ความหลากหลายของโครงสร้างของ SARS-CoV-2 Omicron ขัดขวาง โมล เซลล์. 2022;82(11):2050–2068.

35. หยวน เอ็ม และคณะ อีพิโทปที่เป็นความลับที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในโดเมนการจับตัวรับของ SARS-CoV-2 และ SARS-CoV ศาสตร์. 2020;368(6491):630–633.

36. สตาร์ เทนเนสซี และคณะ แผนที่ที่สมบูรณ์ของการกลายพันธุ์ของ SARS-CoV-2 RBD ที่หลุดรอดจากโมโนโคลนอลแอนติบอดี LY-CoV555 และค็อกเทลของมันด้วย LY-CoV016 เซลล์ตัวแทน Med 2021;2(4):100255.

37. บอม เอ และคณะ แอนติบอดี REGN-COV2 ป้องกันและรักษาการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ในลิงแสมและหนูแฮมสเตอร์ ศาสตร์. 2020;370(6520):1110–1115.

38. หวู่ NC และคณะ โหมดการจับทางเลือกของแอนติบอดี IGHV3-53 กับโดเมนการจับตัวรับ SARS-CoV-2 ตัวแทนเซลล์ 2020;33(3):108274.

39. อู๋ วาย และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของมนุษย์ที่ไม่ใช่คู่แข่งกันจะปิดกั้นไวรัส COVID-19 ที่เกาะติดกับตัวรับ ACE2 ศาสตร์. 2020;368(6496):1274–1278.

40. หยวน เอ็ม และคณะ การขยายสาขาเชิงโครงสร้างและการทำงานของการเคลื่อนตัวของแอนติเจนในสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ล่าสุด ศาสตร์. 2021;373(6556):818–823.

41. หยาน คิว และคณะ เจิร์มไลน์ IGHV3-53-แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางซึ่งมุ่งเป้า RBD ที่เข้ารหัสมักปรากฏอยู่ในรายการแอนติบอดีของผู้ป่วยโควิด-19 การติดเชื้อจุลินทรีย์อุบัติใหม่ 2021;10(1):1097–1111.

42. จาง คิว และคณะ แอนติบอดีสาธารณะ IGHV3- 53/3-66 ที่มีศักยภาพและป้องกันได้ และการกลายพันธุ์แบบหลบหนีที่ใช้ร่วมกันของพวกมันบนระดับสูงสุดของ SARS-CoV-2 แนทคอม. 2021;12(1):4210.

43. วัง ซี และคณะ แอนติบอดีที่ได้รับวัคซีน mRNA ต่อ SARS-CoV-2 และตัวแปรที่หมุนเวียน ธรรมชาติ. 2021;592(7855):616–622.

44. ไซมอน วี และคณะ ปารีสและสปาร์ตา: การค้นหาจุดอ่อนของโรค SARS-CoV-2 เอ็มสเฟียร์ 2022;7(3):e0017922.

45. สตาร์ เทนเนสซี และคณะ แอนติบอดี RBD ของ SARS-CoV-2 ที่เพิ่มความกว้างและความต้านทานต่อการหลบหนีสูงสุด ธรรมชาติ. 2021;597(7874):97–102.

46. ​​กำแพง AC และคณะ โครงสร้าง การทำงาน และแอนติเจนของไกลโคโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 เซลล์ 2020;181(2):281–292.

47. เฮนเดอร์สัน อาร์ และคณะ การควบคุมโครงสร้างไกลโคโปรตีนที่ขัดขวาง SARS-CoV-2 แนท สตรัคท์ โมลไบโอล. 2020;27(10):925–933.

48. เชรษฐา LB และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้างเพื่อต่อต้านสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ที่เกิดขึ้นใหม่ อิมมูนอลด้านหน้า 2021;12:752003.

49. กรีนีย์ เอเจ และคณะ แอนติบอดีที่กระตุ้นโดยการฉีดวัคซีน mRNA-1273 จะจับกับโดเมนการจับตัวรับในวงกว้างมากกว่าการจับจากการติดเชื้อ SARS-CoV-2 วิทย์แปลเมด 2021;13(600):eabi9915.

50. ไรน์เก เอสเอ็ม และคณะ การติดเชื้อ SARS-CoV-2 แบบเบต้าจะกระตุ้นแอนติบอดีจำเพาะเชื้อสายและปฏิกิริยาข้ามที่มีศักยภาพ ศาสตร์. 2022;375(6582):782–787.

51. แวร์มเมิร์ต เจ และคณะ แอนติบอดีที่มีปฏิกิริยาข้ามในวงกว้างมีส่วนสำคัญต่อการตอบสนองของเซลล์บีของมนุษย์ต่อการติดเชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่สายพันธุ์ H1N1 ประจำปี 2009 เจเอ็กซ์พีเมด 2011;208(1):181–193.

52. กัตมิลเลอร์ เจเจ และคณะ การสัมผัสแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้างที่เกิดจากไวรัส H1N1 ที่กำลังระบาดโดยมุ่งเป้าไปที่อีพิโทปของส่วนหัวของเฮแม็กกลูตินิน วิทย์แปลเมด 2021;13(596):eabg4535.

53. บาจิก จี และคณะ วิศวกรรมแอนติเจนไข้หวัดใหญ่มุ่งเน้นไปที่การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่ออีพิโทปของไวรัสที่อยู่รองลงมาแต่มีการป้องกันในวงกว้าง จุลินทรีย์โฮสต์ของเซลล์ 2019;25(6):827–835.

54. แนชบาเกาเออร์ อาร์ และคณะ วิธีวัคซีนไวรัสไข้หวัดใหญ่สากลที่ใช้ไคเมริกเฮแม็กกลูตินิน กระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันในวงกว้างและยาวนานในการทดลองระยะที่ 1 แบบสุ่มและมีกลุ่มควบคุมด้วยยาหลอก แนท เมด. 2021;27(1):106–114.

55. แองเจเลตติ ดี และคณะ ภูมิคุ้มกันที่เหนือกว่าเพื่อกำหนดเป้าหมาย epitopes ที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้าง Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(27):13474–13479.

56. กัตมิลเลอร์ เจเจ และคณะ วิธีที่มีประสิทธิภาพในการสร้างโมโนโคลนอลแอนติบอดีจากบีเซลล์ของมนุษย์ วิธีการ โมล ไบโอล 2019;1904:109–145.

57. อมานัส เอฟ และคณะ การตรวจทางเซรุ่มวิทยาเพื่อตรวจหาการเปลี่ยนแปลงของซีโรคอนเวอร์ชันของ SARS-CoV-2 ในมนุษย์ แนท เมด. 2020;26(7):1033–1036.

58. ชตัดล์บาเออร์ ดี และคณะ การเปลี่ยนแปลงของซีโรคอนเวอร์ชันของ SARS-CoV-2 ในมนุษย์: โปรโตคอลโดยละเอียดสำหรับการตรวจทางเซรุ่มวิทยา การผลิตแอนติเจน และการตั้งค่าการทดสอบ Curr Protoc ไมโครไบโอล 2020;57(1):e100.

59. ตอร์เรส เจแอล และคณะ ข้อมูลเชิงลึกเชิงโครงสร้างของโมโนโคลนอลแอนติบอดีของมนุษย์ที่มีฤทธิ์ทำลายล้าง pan ที่มีศักยภาพสูง Proc Natl Acad Sci สหรัฐอเมริกา 2022;119(20):e2120976119.

60. ซูโลเวย์ ซี และคณะ กล้องจุลทรรศน์โมเลกุลอัตโนมัติ: ระบบ Leginon ใหม่ เจ สตรัคท์ ไบโอล 2005;151(1):41–60.

61. แลนเดอร์ GC และคณะ Appion: ไปป์ไลน์ที่ขับเคลื่อนด้วยฐานข้อมูลแบบรวมเพื่ออำนวยความสะดวกในการประมวลผลภาพ EM เจ สตรัคท์ ไบโอล 2009;166(1):95–102.

62. โวส NR และคณะ DoG Picker และ TiltPicker: เครื่องมือซอฟต์แวร์ที่อำนวยความสะดวกในการเลือกอนุภาคในกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบอนุภาคเดี่ยว เจ สตรัคท์ ไบโอล 2009;166(2):205–213.

63. เพตเตอร์เซน EF และคณะ UCSF Chimera--ระบบการแสดงภาพสำหรับการวิจัยเชิงสำรวจและการวิเคราะห์ เจ คอมพิวท์ เคม. 2004;25(13):1605–1612.

64. ปัญจานี เอ และคณะ การปรับแต่งที่ไม่สม่ำเสมอ: การทำให้เป็นมาตรฐานแบบปรับได้ช่วยปรับปรุงการสร้างไครโอ-EM อนุภาคเดี่ยว วิธีการแนท 2020;17(12):1214–1221.

65. Zhang K. Gctf: การกำหนดและแก้ไข CTF แบบเรียลไทม์ เจ สตรัคท์ ไบโอล 2016;193(1):1–12.

66. ซีวานอฟ เจ และคณะ เครื่องมือใหม่สำหรับการกำหนดโครงสร้าง cryo-EM ความละเอียดสูงแบบอัตโนมัติใน RELION-3 เอไลฟ์. 2018;7:e42166.

67. คาซานัล เอ และคณะ การพัฒนาในปัจจุบันในคูทสำหรับการสร้างแบบจำลองโมเลกุลขนาดใหญ่ของกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบไครโอและข้อมูลทางผลึกศาสตร์ โปรตีนวิทยา 2020;29(4):1069–1078.

68. เฟรนซ์ บี และคณะ แก้ไขข้อผิดพลาดในโครงสร้างไกลโคโปรตีนด้วยโรเซตตาโดยอัตโนมัติ โครงสร้าง. 2019;27(1):134–139.

69. คลาโฮลซ์ บีพี. การหามาและการขัดเกลาแบบจำลองอะตอมในผลึกศาสตร์และไครโอ-EM: เครื่องมือ Phenix ล่าสุดที่อำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์โครงสร้าง Acta Crystallogr D โครงสร้างไบโอล 2019;75(พอยต์ 10):878–881.

70. เพตเตอร์เซน EF และคณะ UCSF ChimeraX: การแสดงภาพโครงสร้างสำหรับนักวิจัย นักการศึกษา และนักพัฒนา โปรตีนวิทยา 2021;30(1):70–82.

71. Otwinowski Z, Minor W. การประมวลผลข้อมูลการเลี้ยวเบนรังสีเอกซ์ที่รวบรวมในโหมดการสั่น วิธีการใช้เอนไซม์ 1997;276:307–326.

72. แมคคอย เอเจ และคณะ ซอฟต์แวร์ผลึกศาสตร์ Phaser J Appl Crystallogr. 2007;40(พอยต์ 4):658–674.

73. เฉียง เอ็ม และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต่อ SARS CoV-2 ได้รับการคัดเลือกจากคลังแอนติบอดีของมนุษย์ที่สร้างขึ้นเมื่อหลายสิบปีก่อน วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต (Weinh) 2022;9(1):e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: เครื่องมือสร้างแบบจำลองสำหรับกราฟิกโมเลกุล แอกต้า คริสตัลล็อกร์ ดี ไบโอล คริสตัลล็อกเกอร์ 2004;60(พอยต์ 12 พอยต์ 1):2126–2132.

75. อดัมส์ พีดี และคณะ PHENIX: ระบบที่ใช้ Python ที่ครอบคลุมสำหรับโซลูชันโครงสร้างโมเลกุลขนาดใหญ่ แอกต้า คริสตัลล็อกร์ ดี ไบโอล คริสตัลล็อกเกอร์ 2010;66(พอยต์ 2):213–221.

76. มงเทียล-การ์เซีย ดี และคณะ Epitope-Analyzer: เครื่องมือบนเว็บที่ใช้โครงสร้างเพื่อวิเคราะห์ epitopes ที่ทำให้เป็นกลางในวงกว้าง เจ สตรัคท์ ไบโอล 2022;214(1):107839.