SIRT5-การดัดแปลง Desuccinylation ที่เกี่ยวข้องมีส่วนช่วยในการป้องกันภาวะหัวใจล้มเหลวจาก Quercetin และ Cardiomyocytes ที่ได้รับกลูโคสสูงซึ่งได้รับบาดเจ็บจากข้อบังคับของการเฝ้าระวังคุณภาพไมโตคอนเดรีย ส่วนที่ 1

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

การเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจแสดงถึงการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาเบื้องต้นที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานคาร์ดิโอไมโอแพทีและภาวะหัวใจล้มเหลว และนำไปสู่ความสอดคล้องของกล้ามเนื้อหัวใจลดลงด้วยการทำงานของหัวใจ diastolic และ systolic ที่บกพร่อง เควอซิทิน สารออกฤทธิ์ในพืชสมุนไพรหลายชนิด มีฤทธิ์รักษาโรคหลอดเลือดหัวใจ ที่นี่ เราตรวจสอบว่า SIRT5- และ IDH2- desuccinvlation ที่เกี่ยวข้องกันนั้นเกี่ยวข้องกับกลไกพื้นฐานของการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจในภาวะหัวใจล้มเหลวหรือไม่ ในขณะที่สำรวจยารักษาโรคที่เกี่ยวข้องสำหรับการเฝ้าระวังคุณภาพยล แบบจำลองหนูเมาส์ของการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและหัวใจล้มเหลว ที่จัดตั้งขึ้นโดยการบีบตัวของหลอดเลือดตามขวาง (TAC) ถูกบริหารให้ด้วยเควอซิทิน (50 มก./กก.) ทุกวันเป็นเวลา 4 สัปดาห์ เซลล์ HL-1 ถูกบำบัดก่อนด้วยเควอซิทินและบำบัดด้วยกลูโคส(30 มิลลิโมลาร์)ในหลอดทดลองสูง การทำงานของหัวใจ, Western blotting, PCR เชิงปริมาณ, การทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอ็นไซม์ และการวิเคราะห์อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์การเฝ้าระวังคุณภาพของไมโตคอนเดรีย ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และการตอบสนองต่อการอักเสบในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ ในขณะที่ระดับของ succinylation IDH2 ถูกตรวจพบโดยใช้การกระตุ้นภูมิคุ้มกัน การเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและภาวะหัวใจล้มเหลวเพิ่มขึ้นหลังจาก TAC โดยมีฟังก์ชันการขับของหัวใจผิดปกติ หลังการบำบัดด้วยน้ำตาลกลูโคสสูง การทำงานของเซลล์ HL-1 ถูกยับยั้ง ทำให้เกิดการผลิตออกซิเจนชนิดรีแอกทีฟมากเกินไป และการยับยั้งกิจกรรม I/II ที่ซับซ้อนของระบบทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรียและไมโตคอนเดรียสารต้านอนุมูลอิสระ เอนไซม์กิจกรรม เช่นเดียวกับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นและการตอบสนองต่อการอักเสบ การเฝ้าระวังคุณภาพไมโตคอนเดรียที่ไม่สมดุลและสภาวะสมดุล และการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้น เควอซิทินยับยั้งการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและการทำงานของหัวใจดีขึ้นโดยเพิ่มการเผาผลาญพลังงานของไมโตคอนเดรียและควบคุมการหลอมรวม/ฟิชชันของไมโตคอนเดรียและการสังเคราะห์ไมโตคอนเดรียในขณะที่ยับยั้งการตอบสนองต่อการอักเสบและการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน นอกจากนี้ TAC ยังยับยั้งการแสดงออกของ SIRT5 ที่ระดับไมโตคอนเดรียและเพิ่มความอิ่มตัวของ IDH2 อย่างไรก็ตาม เควอซิทินส่งเสริมการสลายของ IDH2 โดยการเพิ่มการแสดงออกของ SIRT5 นอกจากนี้ การรักษาด้วย si-SIRT5 ได้ยกเลิกผลการป้องกันของ quercetin ต่อความมีชีวิตของเซลล์ ดังนั้น เควอซิทินอาจส่งเสริมการสลายของ IDH2 ผ่าน SIRT5 รักษาไมโตคอนเดรียสภาวะสมดุล,ปกป้องหนูคาร์ดิโอไมโอไซต์ภายใต้สภาวะการอักเสบและปรับปรุงพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจซึ่งจะช่วยลดอุบัติการณ์ของภาวะหัวใจล้มเหลว

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

1. บทนำ

ภาวะหัวใจล้มเหลวเป็นภาวะที่นำไปสู่การเติมเต็มของหัวใจห้องล่างหรือการทำงานของการดีดออกอันเนื่องมาจากโรคหัวใจอินทรีย์หรือการทำงานต่างๆ และแสดงถึงระยะสุดท้ายของโรคหัวใจและหลอดเลือดต่างๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งผู้ที่เป็นโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายจากเบาหวาน ดังนั้น ภาวะหัวใจล้มเหลวจึงถูกเรียกว่า "สนามรบสุดท้ายของโรคหลอดเลือดหัวใจจากเบาหวาน" ในการปฏิบัติทางคลินิก [1] ในช่วงสองสามทศวรรษที่ผ่านมา งานวิจัยส่วนใหญ่มุ่งเน้นไปที่การรักษาอาการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจจากเบาหวาน การไหลเวียนของโลหิตในหัวใจ และการควบคุมระบบเกาะเล็กเกาะน้อย โรคเบาหวานในผู้ป่วยที่มีภาวะหัวใจล้มเหลวเกิดขึ้นเร็วกว่าในผู้ป่วยที่ไม่มีโรคหลอดเลือดหัวใจ ความดันโลหิตสูง หรือโรคเบาหวานอย่างมีนัยสำคัญ ภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายมีความเสี่ยงต่อปัจจัยต่างๆ เช่น ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การตอบสนองต่อการอักเสบ ความผิดปกติของการเผาผลาญพลังงานของไมโตคอนเดรีย และการเสื่อมสภาพของเซลล์ [2] เนื่องจากสาเหตุหลักของการเปลี่ยนแปลงของหัวใจห้องล่าง [3] การเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจสามารถส่งเสริมการปฏิบัติตามของกล้ามเนื้อหัวใจลดลงและการทำงานของหัวใจซิสโตลิกและไดแอสโตลิกบกพร่อง ในที่สุด ปริมาตรหรือแรงดันเกินในระยะยาวสามารถนำไปสู่ภาวะหัวใจล้มเหลว ดังนั้น การลุกลามจากโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายจากเบาหวานไปเป็นภาวะหัวใจล้มเหลวจึงมาพร้อมกับการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจอย่างรุนแรงหรือภาวะหัวใจโตเกิน [4,5] ด้วยเหตุนี้ การปรับปรุงการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจตายจึงช่วยชะลอภาวะหัวใจล้มเหลวและปรับปรุงการทำงานของหัวใจ และกลายเป็นแนวทางใหม่ในการรักษาภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายจากเบาหวานและภาวะหัวใจล้มเหลว [6]

Mitochondria ศูนย์กลางการเผาผลาญพลังงานของเซลล์ ผลิตพลังงานผ่านออกซิเดชัน ฟอสโฟรีเลชั่น เพื่อตอบสนองความต้องการพลังงานสูงของหัวใจ [7,8] กิจกรรมทางสรีรวิทยาที่สำคัญหลายอย่างที่เกิดขึ้นในหัวใจ เช่น การหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจและการรักษาสภาวะสมดุลภายในเซลล์ จำเป็นต้องมี ATP [9-11] ไมโตคอนเดรียมีระบบการควบคุมคุณภาพของตนเองเพื่อรักษาและฟื้นฟูโครงสร้างและการเผาผลาญพลังงานโดยควบคุมการแยกตัวของไมโตคอนเดรีย การหลอมรวม การสร้างชีวภาพ และไมโทฟาจี [12,13] ระบบเฝ้าระวังนี้สามารถปกป้องไมโตคอนเดรียและคาร์ดิโอไมโอไซต์จากการกระตุ้นความเครียด [8,13] นอกจากนี้ ความเสียหายของกล้ามเนื้อหัวใจจากโรคคาร์ดิโอไมโอแพทีจากเบาหวานอาจเกี่ยวข้องกับความผิดปกติของไมโตคอนเดรียที่เกิดจากความไม่สมดุลในการเฝ้าระวังคุณภาพของไมโตคอนเดรีย

Cistanche สามารถปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

ดังนั้นการทำงานปกติทางสรีรวิทยาของหัวใจจึงต้องการไมโตคอนเดรียที่ทำงานได้อย่างสมบูรณ์และครบถ้วน อันที่จริง การผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาไมโตคอนเดรีย (ROS) ที่มากเกินไปหรือความเสียหายต่อระบบต้านอนุมูลอิสระของกล้ามเนื้อหัวใจนั้นสัมพันธ์กับการขยายตัวของหัวใจห้องล่างและการเปลี่ยนแปลงของผนัง ซึ่งอาจนำไปสู่การเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและหัวใจล้มเหลว จากการศึกษาพบว่ามีความผิดปกติในลักษณะสัณฐานวิทยาและโครงสร้างของไมโทคอนเดรียของกล้ามเนื้อหัวใจในผู้ป่วยเบาหวานที่มีความซับซ้อนด้วยภาวะหัวใจล้มเหลวและโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายจากเบาหวาน นอกจากนี้ยังมีรายงานความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์ยลและความผิดปกติของโครงสร้างในแบบจำลองสุนัขของภาวะหัวใจล้มเหลว ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียที่ลดลง การเปิดรูพรุนการเปลี่ยนผ่านของยลการซึมผ่านของไมโตคอนเดรีย (mPTP) ผิดปกติ การสังเคราะห์ ATP ที่ลดลง และการผลิต ROS ที่มากเกินไปก็ได้รับการตรวจพบเช่นกัน [14,15] ดังนั้น การเฝ้าสังเกตคุณภาพไมโตคอนเดรียโดยกำหนดเป้าหมายมวลไมโตคอนเดรียและสภาวะสมดุลอาจเป็นประโยชน์ในการยับยั้งความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตอบสนองต่อการอักเสบ ซึ่งจะช่วยปรับปรุงการเกิดพังผืด [16] ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตอบสนองต่อการอักเสบเป็นปัจจัยสำคัญที่กระตุ้นการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและมักอยู่ร่วมกันที่บริเวณรอยโรคเดียวกันในโรคหลอดเลือดหัวใจต่างๆ [16,17] เมื่อภาวะแทรกซ้อนทางระบบหัวใจและหลอดเลือดที่หลากหลายหรือโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายจากการเผาผลาญเกิดขึ้นพร้อมกับการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจเฉียบพลันหรือเรื้อรัง ระบบภูมิคุ้มกันจะทำงานโดยปล่อยปัจจัยการอักเสบจำนวนมากที่ก่อให้เกิดการบาดเจ็บจากความเครียดออกซิเดชัน กระตุ้นการทำงานของไฟโบรบลาสต์ของกล้ามเนื้อหัวใจ และทำให้เกิดการเผาผลาญคอลลาเจนผิดปกติ เนื้อร้ายของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ และเนื้อเยื่อ การเสื่อมสภาพจึงนำไปสู่โรคกล้ามเนื้อหัวใจตายในที่สุดและภาวะหัวใจล้มเหลว [18, 19] Sirtuin 5(SIRT5) มีการแพร่กระจายอย่างกว้างขวางในนิวเคลียส ไซโตพลาสซึม และไมโตคอนเดรีย แม้ว่า SIRT5 จะแสดงฤทธิ์ของดีอะซีไทเลส แต่ก็สามารถควบคุมไลซีน ซัคซินิเลชัน [20] ผ่านสัญญาณการแปลเปอร์รอกซิโซม N-terminal PTS2 ทำให้ SIRT5 สามารถป้อนเปอร์รอกซิโซมเพื่อลดการผลิต H, O ภายในเซลล์ จึงมีบทบาทสำคัญในการเกิดออกซิเดชันของเซลล์ นอกจากนี้ มีรายงานว่า SIRT5 ส่งเสริม desuccinylation เป็นกลไกป้องกันในภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายเฉียบพลัน [21-23] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ภาวะหัวใจขาดเลือดเฉียบพลันและภาวะขาดออกซิเจนอาจทำให้การแสดงออกของ SIRT5 เพิ่มขึ้นผ่านทางวิถี PGC-l /PPAR-y ซึ่งนำไปสู่การสลายตัวของโปรตีนหลักที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญพลังงานของ cardiomyocyte ตามมา ดังนั้นจึงให้ผลในการป้องกันเซลล์เหล่านี้ [24] การปรับเปลี่ยน SIRT5 หลังการแปลเกิดขึ้นเป็นหลักในไมโตคอนเดรีย นอกจากนี้ ที่เกิดขึ้นภายในไมโทคอนเดรีย NADP บวกกับไอโซซิเตรตดีไฮโดรจีเนส 2(IDH2) ที่ขึ้นกับขึ้นอยู่กับการทำงานปกติของระบบต้านอนุมูลอิสระยลที่เกี่ยวข้องกับกลูตาไธโอน (GSH-) ซึ่งรวมถึงกิจกรรมของกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส(GPX)[25] นอกจากนี้ IDH2 ยังให้ NADPH แก่กลูตาไธโอนรีดักเตสและไธโอรีดอกซินรีดักเตส ดังนั้นจึงทำให้เกิดผลด้านกฎระเบียบในการปกป้องไมโตคอนเดรียจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [26] อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาเพียงไม่กี่ชิ้นที่ประเมินกฎระเบียบของ SIRT5 และ IDH2 succinylation ในภาวะหัวใจล้มเหลว

เควอซิทินเป็นฟลาโวนอยด์ที่มีอยู่อย่างแพร่หลายในธรรมชาติ การศึกษาทางเภสัชวิทยาได้รายงานว่าเควอซิทินสามารถชะลอความเสียหายของการทำงานของเยื่อบุผนังหลอดเลือดและความเสียหายที่ปลายหัวใจได้ [27] เควอซิทินยังมีบทบาทกำกับดูแลในการป้องกันโรคพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจ [28] และสามารถควบคุมการทำงานของไอส์เลตเพิ่มเติมได้ ยิ่งไปกว่านั้น ก่อนหน้านี้เราพบว่าเควอซิทินสามารถควบคุมความเครียดของไมโทฟาจีและเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัมผ่าน SIRT1/TMBIM6 ปรับปรุงการเผาผลาญพลังงานของยล และปกป้อง myocytes หัวใจของมนุษย์ [27] อย่างไรก็ตาม กลไกการกำกับดูแลที่เป็นรากฐานของผลกระทบของเควอซิทินต่อ SIRT5 succinylation และผลในการป้องกันเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจตายยังคงไม่ชัดเจน ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่า succinylation ที่ควบคุมโดย SIRT5 ส่งผลต่อการเจริญเติบโตของการเผาผลาญของเซลล์ผ่านการเฝ้าระวังคุณภาพของไมโตคอนเดรียและสภาวะสมดุลของไมโตคอนเดรีย เราพบว่าการลบ SIRT5 อาจทำให้ succinylation เพิ่มขึ้น ซึ่งจะส่งผลต่อการทำงานของ cardiomyocyte และ myocardial fibrosis

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.สัตว์และยารักษา.

ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดดำเนินการตามคำแนะนำของ NIH สำหรับการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ในสถาบันการแพทย์แผนจีนของมหาวิทยาลัยซานตง โดยสังเขป หนูทดลอง C57BL/6] เพศผู้ 30 ตัว (8-อายุสัปดาห์) จำนวน 30 ตัวจากศูนย์สัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์แผนจีนแห่งมณฑลซานตง และสุ่มแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม:(1)การผ่าตัดหลอก ( 2) การหดตัวของหลอดเลือดตามขวาง (TAC) และ (3)TAC บวก quer-cetin กลุ่ม TAC plus quercetin ถูกบริหารให้ในช่องท้องด้วย quercetin 50 มก./กก. ทุกวัน (Shanghai Yuanye Biotechnology Company, Shanghai, China) เป็นเวลา 15 วัน หนู Sham และ TAC ถูกบริหารให้ด้วยการฉีดน้ำเกลือปกติภายในช่องท้องที่สอดคล้องกัน

2.2. การก่อตั้งแบบจำลองสัตว์

สร้างแบบจำลองภาวะหัวใจล้มเหลวโดยใช้ TAC [29] โดยสังเขป หนูได้รับยาสลบโดยการฉีดเข้าเส้นเลือดดำของ pentobarbital(50 มก./กก.; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) และต่อเครื่องช่วยหายใจหลังจากทำการผ่าตัดทรวงอก หลอดเลือดแดงเอออร์ตาถูกมัดด้วยเส้นไหม 8-0 เส้นระหว่างหลอดเลือดแดงด้านขวาและหลอดเลือดแดงร่วมด้านซ้าย และลดลงเหลือ 25-30 เปอร์เซ็นต์ของพื้นที่หน้าตัดเดิมด้วยเข็ม 27 G

2.3. การเพาะเลี้ยงเซลล์.

HL{{0}} myocytes ถูกจัดเตรียมโดยศูนย์ทดลองของมหาวิทยาลัยการแพทย์แผนจีนแห่งมหาวิทยาลัยซานตง เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Claycomb ที่มีซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์, เพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 100U/มล., นอราดรีนาลีน 0.1 มิลลิโมลาร์ และแอล-กลูตามีน 2 มิลลิโมลาร์ เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาและ 5 เปอร์เซ็นต์ CO, [30] ซื้อกลูโคสจาก Sigma-Aldrich Quercetin ได้รับจาก Shanghai Yuanye Biotechnology Company เซลล์ถูกสุ่มเป็นกลุ่มทดลองสี่กลุ่ม:(1)กลุ่มควบคุม (2)กลูโคสสูง(HG),(3)HG บวกเควอซิทิน และ(4)HG บวกเควอซิติน บวก si-SIRT5 เซลล์ HL-1 ถูกบำบัดด้วยกลูโคสสูง (30 มิลลิโมล/ลิตร) และเควอซิติน(150 มก./ลิตร) สำหรับการถ่าย RNA ที่รบกวนขนาดเล็ก (siRNA) นั้น Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ถูกใช้เพื่อถ่ายโอน siRNA 50nM เข้าไปในเซลล์ HL-1 24 ชั่วโมงก่อนการรักษา siRNA ทั้งหมดได้มาจาก Jikai Biology (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน)

2.4. โฟลว์ไซโตเมทรี

ในการวิเคราะห์ระดับการตายของเซลล์ HL-1 เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (Gibco, Grand Island, NY, USA) โดยตรึงด้วยเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ล้างแล้วใส่ในโพรพิเดียม ไอโอไดด์ 50 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร วิธีการแก้. หลังจากผ่านไป 30 นาที เซลล์จะถูกแขวนลอยใหม่ และโฟลว์ไซโตเมทรีถูกดำเนินการเพื่อตรวจหาอะพอพโทซิสตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

2.5.การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

ความอยู่รอดของเซลล์ HL-1 ถูกประเมินค่าโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT เซลล์ถูกเพาะในเพลต 12-หลุมที่ความหนาแน่น 50,000 เซลล์/หลุม หลังจาก 22 ชม. เซลล์ถูกเสริมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดและฟักเป็นเวลา 24 ชม. หลังจากนั้นจึงกำหนดความมีชีวิตของเซลล์โดยการสอบวิเคราะห์ MTT [31]

2.6.การทดสอบภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์

ชุดทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) ใช้เพื่อวิเคราะห์กิจกรรมเชิงปริมาณของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและปัจจัยการอักเสบในเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อหัวใจตายของหนูเมาส์และเซลล์ HL-1 โดยสรุป โฮโมจีเนตของเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อหัวใจและเซลล์แขวนลอย HL-1 ถูกรวบรวม

2.7.อัตราการบริโภคออกซิเจน

อัตราการใช้ออกซิเจนของเซลล์ HL-1 ในกลุ่มต่างๆ ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบความดันไมโตคอนเดรียเซลล์ซีฮอร์ส XF (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ในขณะที่วัดอัตราการเป็นกรดนอกเซลล์ด้วยไกลโคไลซิส XF ของม้าน้ำ ชุดทดสอบอัตรา (Agilent Technologies) การทดสอบทั้งสองดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต 2.8. PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ แยกอาร์เอ็นเอทั้งหมดโดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol และความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอถูกวิเคราะห์โดยอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส cDNA สายแรกถูกสังเคราะห์โดยใช้ชุดการสังเคราะห์ cDNA ของ iScript (1 ไมโครลิตรของ RNA ทั้งหมด Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ในปริมาตรรวม 20μL ใช้ระบบ CFX96 RT-PCR (Bio-Rad) เพื่อวิเคราะห์ระดับของ cDNA สองครั้งโดยใช้ไพรเมอร์จำเพาะ 500×10-nM ในแต่ละการทดลอง ใช้ cDNA ผสมที่เจือจางอย่างต่อเนื่องเพื่อประเมินประสิทธิภาพของการวิเคราะห์ PCR การแสดงออกของยีนถูกหาปริมาณสัมพันธ์กับค่าเฉลี่ยทางเรขาคณิตของยีนดูแลทำความสะอาด และการแสดงออกของยีนเป็นวิธี [32] กำหนดโดยใช้ 2-AACT

2.9.การวิเคราะห์ทางสถิติ.

ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวถูกใช้เพื่อตรวจสอบความแตกต่างระหว่างหลายกลุ่ม และทำการทดสอบหลังเฉพาะกิจของ Student-Newman-Keuls การทดสอบแบบสองด้านถูกใช้เพื่อเปรียบเทียบสองกลุ่ม การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SPSS 22.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) นัยสำคัญทางสถิติตั้งไว้ที่ P<>

3. ผลลัพธ์

3.1. Quercetin บรรเทาอาการกล้ามเนื้อหัวใจตายมากเกินไปและความผิดปกติของหัวใจหลัง TAC หนูเมาส์ C57BL/6J เพศผู้ถูกสุ่มแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม (กลุ่มควบคุม, การทำงานของ TAC และ TACoperation บวกกับเควอซิติน) เควอซิทินได้รับการดูแลให้ในกลุ่ม TAC บวกกับเควอซิติน (50 มก./กก. ทุก 12 ชม.) เจ็ดสัปดาห์หลังจาก TAC หนูประมาณ 20 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มโมเดล TAC และ 10 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มที่ได้รับ quercetin เสียชีวิต เมื่อเทียบกับในกลุ่มปฏิบัติการหลอก การทำงานของหัวใจในกลุ่ม TAC เสื่อมลงอย่างเห็นได้ชัดหลังจากผ่านไป 3 สัปดาห์ (รูปที่ 1(a)-1(i)) อย่างไรก็ตาม การทำงานของหัวใจในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยเควอซิทินดีขึ้นเมื่อเทียบกับหนูที่ไม่ได้รับการรักษาด้วยเควอซิทิน (รูปที่ 1(a)-1())

จากนั้นเราประเมินการขยายตัวของกล้ามเนื้อหัวใจในหนูทดลอง TAC หลังการรักษาด้วย TAC ร่วมกับเควอซิตินโดยใช้การย้อมสีฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน, WGA และ TUNEL 8 สัปดาห์หลังจาก TAC (รูปที่ 1(j)-1(ม.)) เมื่อเทียบกับในกลุ่มปฏิบัติการหลอก ระดับของการเจริญเติบโตมากเกินไปของหัวใจและการขยายตัวของคาร์ดิโอไมโอไซต์หรือการเสียชีวิตในหนูเมาส์ TAC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1(j)-1(m)); อย่างไรก็ตาม ผลกระทบนี้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการบำบัดด้วยเควอซิทิน (รูปที่ 1(j)-1(m))

3.2. เควอซิทินลดระดับของกล้ามเนื้อหัวใจตายและระดับการอักเสบหลังจาก TAC

เราตรวจพบระดับคอลลาเจนเนส I ในกล้ามเนื้อหัวใจของกลุ่มต่างๆ โดยอิมมูโนฮิสโตเคมี ระดับคอลลาเจนเนส I/II ในกล้ามเนื้อหัวใจของกลุ่มแบบจำลองเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก TAC (รูปที่ 2(h)-2(i)); ผลกระทบนี้กลับกันโดย quercetin (รูปที่ 2(h)-2(I) นอกจากนี้เรายังประเมินระดับของการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจในกลุ่มต่างๆ โดยการย้อมสี Masson ระดับของการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจในกลุ่มแบบจำลองคือ

เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก TAC; การรักษาด้วยเควอซิทินทำให้ปรากฏการณ์นี้กลับกันและปกป้องเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อหัวใจ (ภาพที่ 2(a) และ 2(b))

พังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจตายเป็นกระบวนการทางพยาธิวิทยาที่ซับซ้อนซึ่งส่วนใหญ่เกิดจากความดันเกินในระยะยาวและปฏิกิริยาการอักเสบ ปัจจัยกระตุ้นการอักเสบหลายอย่าง เช่น TGF- , TNF- , IL-13, IL-18 และ MMP สามารถมีส่วนร่วมในการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจได้ ดังนั้นเราจึงตรวจพบปัจจัยที่ทำให้เกิดการอักเสบ (TNF- , IL-13 และ IL-18) ​​จำนวนมากโดย ELISA ในขณะที่ระดับการถอดรหัสของ TGF- และ MMP-9 ถูกตรวจพบโดย RT-PCR. ระดับการแสดงออกของระดับ TNF- , IL-13 และ IL-18 และ mRNA ของ TGF- และ MMP-9 ในกลุ่มแบบจำลองสูงกว่าระดับในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 2( ค)-2(ก)). เควอซิทินพลิกกลับปรากฏการณ์นี้และยับยั้งการอักเสบ (รูปที่ 2(c)-2(g)) เพื่อตรวจสอบว่ากลไกการรักษาของเควอซิทินเกี่ยวข้องกับ SIRT5 และ IDH2 หรือไม่ เราตรวจพบ mRNA และการแสดงออกของโปรตีนของ SIRT5 และ IDH2 ระดับการแสดงออกของ mRNA และโปรตีนถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก TAC(รูปที่ 2(m)-2(p) เควอซิทินกลับผลกระทบเหล่านี้ ซึ่งบ่งชี้ว่า quercetin กำหนดเป้าหมาย SIRT5 และ IDH2 เพื่อป้องกันการพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและหัวใจล้มเหลว (รูปที่ 2( ม.)-2(p)).

เพื่อตรวจสอบกลไกการป้องกันของ quercetin ต่อการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจหรือการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจหลังจาก TAC เพิ่มเติม เราได้ตรวจสอบการผลิต ROS ในเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อหัวใจและพบว่า TAC เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจาก TAC (รูปที่ 2 (k) และ 2 (I) ในขณะที่ quercetin ยับยั้ง การผลิต RO มากเกินไป(รูปที่ 2(k) และ 2()) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าผลการป้องกันของ quercetin ต่อการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจหรือการบาดเจ็บของกล้ามเนื้อหัวใจนั้นสัมพันธ์กับการควบคุมสภาวะสมดุลของรีดอกซ์

3.3. เควอซิทินช่วยลดอาการบาดเจ็บจากการอักเสบของ HL-1 ที่เกิดจากกลูโคสสูงโดยการควบคุมความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ผลการทดลองดังกล่าวแสดงให้เห็นในเบื้องต้นว่าเควอซิทินสามารถปรับปรุงการทำงานของหัวใจและยับยั้งระดับของการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจในหนูหลังจาก TAC ผลการป้องกันอาจเกี่ยวข้องกับกฎระเบียบของ SIRT5 และปัจจัยต้านการอักเสบ อย่างไรก็ตาม เหตุการณ์เหล่านี้เกิดขึ้นผ่านกลไกการกำกับดูแลโดยตรงหรือไม่นั้นยังไม่ชัดเจน เพื่อศึกษากลไกการกำกับดูแลของเควอซิทินภายใต้สภาวะที่มีน้ำตาลกลูโคสสูง เราเหนี่ยวนำให้เกิดการบาดเจ็บของเซลล์ HL-1 ด้วยน้ำตาลกลูโคสสูง บำบัดเซลล์เหล่านี้ด้วยเควอซิติน และทำให้ SIRT5 ล้มลงด้วย siRNA ตรวจพบกิจกรรมของเซลล์โดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT และ CCK-8 ระดับการตายของเซลล์ถูกตรวจพบโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD), GSH, TrxR และมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) ตรวจพบโดยใช้ ELISA เราใช้ CCK-8 เพื่อวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์ HL-1 ภายใต้ความเข้มข้นของกลูโคสที่ต่างกัน ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 3(j) ความมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ความเข้มข้นของกลูโคสสูงที่ 30 มิลลิโมลาร์ MTT และโฟลว์ไซโตเมทรีเปิดเผยว่าสภาวะที่มีกลูโคสสูงยับยั้งการทำงานของเซลล์ เพิ่มการตายของเซลล์และการผลิต ROS และเร่งการตายของเซลล์ (รูปที่ 3(a)-3(e)) เมื่อเทียบกับในกลุ่มควบคุม การกระตุ้นด้วยน้ำตาลกลูโคสสูงเพิ่มกิจกรรม MDA และยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น SOD, GSH และ TrxR (รูปที่ 3(f)-3(i))

เควอซิทินยับยั้งการทำงานของ MDA เพิ่มกิจกรรมของ SOD, GSH และ TrxR(รูปที่ 3(f)-3(I) ยับยั้งการตายของเซลล์และการผลิต ROS (รูปที่ 3(a)-3(e )) และการทำงานของเซลล์ที่ดีขึ้น (รูปที่ 3(c)) อย่างไรก็ตาม การบำบัดด้วย si-SIRT5 ร่วมกับเควอซิตินช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการทำงานของ MDA เพิ่มระดับของการตายของเซลล์และการผลิต ROS และยับยั้งการทำงานของเซลล์ (รูปที่ 3(a){ {8}}(i)) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า quercetin ควบคุมความไม่สมดุลในสถานะรีดอกซ์ที่ถูกกระตุ้นโดยกลูโคสสูงและปกป้อง HL-1 cardiomyocytes กฎข้อบังคับนี้อาจเกี่ยวข้องโดยตรงกับ SIRT5

3.4. เควอซิทินช่วยลดการบาดเจ็บจากการอักเสบของ HL-1 ที่มีกลูโคสสูงโดยการส่งเสริม SIRT5-การดัดแปลงการขับน้ำตาลกลูโคสที่เกี่ยวข้อง

ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันส่งผลโดยตรงต่อโครงสร้างและหน้าที่ของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ และสามารถกระตุ้นโมเลกุลส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจโดยตรง เช่น MMP ทำให้เกิดการเจริญเติบโตมากเกินไปและการตายของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจตาย ซึ่งเกี่ยวข้องกับการผลิต ROS ที่มากเกินไป ร่วมกับปฏิกิริยาการอักเสบ . การผลิต ROS ที่มากเกินไปสามารถสร้างความเสียหายให้กับโมเลกุลขนาดใหญ่ของไมโตคอนเดรียที่หรือใกล้กับบริเวณที่ก่อตัวได้ ความเสียหายของโครงสร้างไมโตคอนเดรียและการล่มสลายของการทำงานในภาวะหัวใจล้มเหลวนั้นสัมพันธ์กับระดับ ROS ที่เพิ่มขึ้น ซึ่งส่วนใหญ่แสดงออกโดยการเพิ่มระดับของไมโตคอนเดรียลลิพิดเปอร์ออกไซด์และการทำงานของเอ็นไซม์ที่ลดลงของคอมเพล็กซ์ระบบทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรีย I, III และ IV อย่างไรก็ตาม เมแทบอลิซึมของพลังงานใน

รูปที่ 2: Quercetin (Que) ช่วยลดการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและระดับการอักเสบหลังจากการหดตัวของหลอดเลือดตามขวาง (TAC) (a) การย้อมสี Masson (b) พื้นที่เส้นใย ( เปอร์เซ็นต์ ). (ce) ตรวจพบระดับการแสดงออกของ IL-18, TNF- และ IL-13 โดยใช้ ELISA (f, g)mRNA expression ของ MMP_9 และตรวจพบ TGF-B โดยใช้ RT -PCR.(hj) Expression of collagenase(collage) I/Ill ตรวจพบโดยใช้อิมมูโนฮิสโตเคมี (k, I) การเปลี่ยนแปลงของ ROS (mp) ตรวจพบการแสดงออกของโปรตีน/อาร์เอ็นเอของ SIRT5 และ IDH2 ค่าเฉลี่ย± SD;*P<>

mitochondria ถูกควบคุมโดย succinylation ผลการทดลองก่อนหน้านี้ระบุว่าผลการรักษาของ quercetin ต่อการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและหัวใจล้มเหลวนั้นสัมพันธ์กับ SIRT1

ในการศึกษาปัจจุบัน การวิเคราะห์ระดับ mRNA ของ SIRT5 และ IDH2 ในเซลล์ HL-1 ที่กระตุ้นกลูโคสสูงและการตกตะกอนทางภูมิคุ้มกันแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ IDH2 ในเซลล์ HL-1 ถูกยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญหลังการกระตุ้นด้วยกลูโคสสูง ในขณะที่ระดับซัคซินิเลชันของ IDH2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4(a)-4(d)) ยิ่งกว่านั้น หลังจากการแทรกแซงของเควอซิทิน การแสดงออกของ mRNA ของ SIRT5 และ IDH2 และระดับของดีซัคซินิเลชัน IDH2 เพิ่มขึ้น(รูปที่ 4(a)-4(d)) เพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมถึงผลของ SIRT5-succinylation ที่เป็นสื่อกลางต่อห่วงโซ่ทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรีย เราได้ประเมินคอมเพล็กซ์ระบบทางเดินหายใจของไมโตคอนเดรีย I, III และ IV หลังจากการกระตุ้นด้วยกลูโคสสูง ระดับของสารเชิงซ้อนเหล่านี้ก็ลดลง อย่างไรก็ตาม quercetin กลับปรากฏการณ์นี้ (รูปที่ 4(e)-4(g))

ผลการกำกับดูแลของเควอซิทินต่อสารเชิงซ้อนเกี่ยวกับทางเดินหายใจของไมโทคอนเดรียและการซัคซินิเลชัน IDH2 ยังถูกยับยั้งหลังการบำบัดด้วย si-SIRT5 (รูปที่ 4(a)-4(g)) ดังนั้น SIRT5-การดีซัคซินิเลชันที่เป็นสื่อกลางของ IDH2 อาจเป็นกลไกควบคุมที่สำคัญของการเกิดพังผืดของกล้ามเนื้อหัวใจและภาวะหัวใจล้มเหลว นอกจากนี้ เควอซิทินอาจปรับปรุงการตอบสนองต่อการอักเสบและการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันโดยผ่านทาง SIRT5-ดีซัคซินิเลชันที่อาศัยสื่อกลางของ IDH2; อย่างไรก็ตาม กลไกการกำกับดูแลของสภาวะสมดุลยลต้องมีการวิเคราะห์เพิ่มเติม

3.5. เควอซิทินช่วยลดอาการบาดเจ็บจากการอักเสบของ HL-1 ที่เกิดจากกลูโคสสูงโดยควบคุมการเผาผลาญพลังงานของไมโตคอนเดรียและ NLRP3

เมแทบอลิซึมของพลังงานยลถูกควบคุมโดย succinylation อย่างไรก็ตาม ภาวะหัวใจล้มเหลวหรือภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายที่เกิดจากปัจจัยต่างๆ เกี่ยวข้องกับกลไกทางพยาธิวิทยาที่สำคัญของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและความผิดปกติของการเผาผลาญพลังงานของยลในสภาวะอักเสบ ดังนั้นเราจึงตรวจสอบผลกระทบด้านกฎระเบียบของเควอซิทินต่อการเผาผลาญพลังงานยลและสภาวะสมดุล การวิเคราะห์ด้วยอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์แสดงให้เห็นว่า NLRP3 แสดงออกอย่างมากหลังจากการกระตุ้นด้วยกลูโคสสูง ซึ่งกลับกันโดยเควอซิทิน (รูปที่ 5(f) และ 5(g)) นอกจากนี้ การบำบัดด้วย si-SIRT5 ยังขจัดผลกระทบด้านกฎระเบียบของเควอซิทินต่อ NLRP3 (รูปที่ 5(f) และ 5(g))

กฎระเบียบของสภาวะสมดุลยลสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการกระตุ้น NLRP3 ในความเป็นจริง NF-xB สามารถจำกัดการเปิดใช้งาน NLRP3 ได้โดยการกำจัดไมโตคอนเดรียที่เสียหาย [33, 34] เราพบว่าเควอซิทินส่งผลต่อสภาวะสมดุลยลโดยการควบคุม NLRP3 HL กระตุ้นกลูโคสสูง-1

เซลล์แสดงความผิดปกติที่ร้ายแรงของการเผาผลาญพลังงานยล ระดับ ATP, การหายใจพื้นฐาน, การหายใจสูงสุด และการหายใจสำรองของไมโตคอนเดรียลดลงอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ การเปิด mPTP เพิ่มขึ้นอย่างผิดปกติ (รูปที่ 5(a)-5(e)) เควอซิทินย้อนกลับผลกระทบเหล่านี้และฟื้นฟูการเผาผลาญพลังงานยลและการปิด mPTP (รูปที่ 5(a)-5(e)) อย่างไรก็ตาม การบำบัดด้วย si-SIRT5 กลับด้านการควบคุมที่ชักนำโดยเควอซิทินต่อเมแทบอลิซึมของพลังงานยลและ mPTP(รูปที่ 5(a)-5(e)) ดังนั้นการผลิต ROS ที่มากเกินไปพร้อมกับการอักเสบและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันสามารถนำไปสู่การบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันของไมโตคอนเดรีย และ NLRP3 สามารถโต้ตอบกับการเผาผลาญพลังงานของยล Mitochondria อาจเป็น "ม้าโทรจัน" ของการอักเสบซึ่งสอดคล้องกับผลการศึกษาก่อนหน้านี้ [35]

บทความนี้คัดลอกมาจาก Hindawi Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, Article ID 5876841, 17 หน้า https://doi.org/10.1155/2021/5876841