ความเป็นพิษต่อเซลล์แบบคัดเลือกของสารสมุนไพร Acteoside ต่อเซลล์เนื้องอกและข้อมูลเชิงลึกด้านกลไกของมัน
Mar 14, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
คริสตินา ไชโมนิดี และคณะ
บทคัดย่อ
ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติมีลักษณะเฉพาะด้วยโครงสร้างที่หลากหลายมาก ดังนั้นจึงเป็นแหล่งที่มีเอกลักษณ์เฉพาะสำหรับการระบุสารต้านเนื้องอกชนิดใหม่ ในที่นี้เรารายงานว่าสารสมุนไพรแอคทีโอไซด์การแยกโดยวิธีพฤกษเคมีขั้นสูงจากใบ Lippia citriodora แสดงให้เห็นถึงความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เพิ่มขึ้นต่อเซลล์เนื้องอกในระยะแพร่กระจาย ออกฤทธิ์ร่วมกับสารที่เป็นพิษต่อเซลล์ต่างๆ และเซลล์มะเร็งที่ดื้อต่อเคมีที่ไวต่อการกระตุ้นแอคทีโอไซด์ไม่เป็นพิษในบริบทของเซลล์ทางสรีรวิทยา ในขณะที่เพิ่มโหลดออกซิเดชัน ส่งผลต่อการทำงานของโมดูลโปรตีโอสแตติก และยับยั้งเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีนในเซลล์เนื้องอก การบริหารทางช่องท้องหรือทางปาก (ผ่านทางน้ำดื่ม) ของแอคทีโอไซด์ในรูปแบบเมาส์เมลาโนมาควบคุมการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระในเนื้องอก ทว่า มีเพียงการนำส่งในช่องท้องเท่านั้นที่ยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกและกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอก การวิเคราะห์การระบุ/การวิเคราะห์เชิงปริมาณของแมสสเปกโตรเมทรีพบว่าการส่งมอบแอคทีโอไซด์ส่งผลให้ความเข้มข้นของสารประกอบในพลาสมาและเนื้องอกของหนูที่ได้รับการบำบัดสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการบริหารช่องปาก ซึ่งชี้ให้เห็นว่าผลการต่อต้านเนื้องอกในร่างกายขึ้นอยู่กับเส้นทางของการบริหารให้และความเข้มข้นที่ได้รับในเนื้องอก ในที่สุด การศึกษาแบบจำลองโมเลกุลและการทดสอบกิจกรรมของเอนไซม์พบว่าแอคทีโอไซด์ยับยั้งโปรตีนไคเนสซี สรุปได้ว่าแอคทีโอไซด์ถือเป็นโครงสร้างทางเคมีสำหรับการพัฒนาสารต่อต้านเนื้องอกชนิดใหม่
คำสำคัญ:แอคทีโอไซด์, มะเร็ง, สารประกอบธรรมชาติ, ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน, โปรตีโอสตาซิส, การปรับภูมิคุ้มกัน
1. บทนำ
การก่อมะเร็งมีลักษณะเฉพาะโดยการลดการควบคุมของวิถีการส่งสัญญาณของเซลล์หลายๆ ทาง และสัมพันธ์กับการเกิดออกซิเดชันของเซลล์ การจำลองแบบ เมตาบอลิซึม ความเป็นพิษต่อพันธุกรรม และโปรตีนที่เป็นพิษต่อเซลล์ [1] ในการปรับตัวและเอาชนะฟีโนไทป์ของความเครียดเหล่านี้ เซลล์มะเร็งจะควบคุม (นอกเหนือจากการก่อมะเร็ง) วิถีทางที่ไม่ก่อให้เกิดมะเร็งหลายเส้นทางโดยมีเป้าหมายเพื่อระงับหรือ (อย่างน้อย) บรรเทาความเครียดอย่างต่อเนื่อง ในบรรดาวิถีทางที่ไม่ก่อมะเร็งต่างๆ ที่พบว่ามีการควบคุมบ่อยครั้งระหว่างการสร้างเนื้องอกคือโมดูลของเครือข่ายโปรตีโอสตาซิส (PN) พร้อมกับการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระในระดับเซลล์ [2,3]
ส่วนประกอบสำคัญของ PN คือกลไกการย่อยสลายหลักสองแบบ ได้แก่ Autophagy- Lysosome pathway (ALP) และ Ubiquitin-Proteasome Pathway (UPP) พร้อมด้วยเครือข่ายของโมเลกุลพี่เลี้ยง ALP ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการเสื่อมสลายของมวลรวมโปรตีนและออร์แกเนลล์ที่เสียหาย [4] ในขณะที่ UPP จะย่อยสลายโปรตีนอายุสั้นปกติและโปรตีนที่พับผิดหรือกางออกที่ไม่สามารถซ่อมแซมได้ [5–8] 26Seukaryotic proteasome ถูกสร้างขึ้นจากอนุภาคควบคุม 19S (RP) และอนุภาค 20 Score (CP); หลังประกอบด้วยวงแหวน heptameric เรียงซ้อนกันสี่วง (สองแบบล้อมรอบสองแบบ) ที่สร้างโครงสร้างคล้ายลำกล้อง กิจกรรมโปรตีโอโซมเปปติเดสที่เหมือนไคโมทริปซิน (CT-L), โพรทีอาโซมเหมือน (TL) และคล้ายแคสเปส (CL) ตั้งอยู่ที่หน่วยย่อยโปรตีอาโซม 5, 2 และ 1 ตามลำดับ [6] ประสิทธิภาพทางคลินิกที่แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนของสารยับยั้งโปรตีอาโซม Bortezomib (Velcade® หรือชื่อเรียกอีกอย่างว่า PS-341) และ Carfifilzomib ในการต่อต้านมะเร็งทางโลหิตวิทยาต่างๆ [9] ได้ให้ "การพิสูจน์แนวคิด" ของการกำหนดเป้าหมาย UPP เป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มสำหรับ การรักษาโรคมะเร็ง เครือข่ายที่ซับซ้อนของเส้นทางการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระในเซลล์ซึ่งมักถูกควบคุมในระหว่างการก่อมะเร็ง [3,10] รวมถึงเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่นเดียวกับปัจจัยการถอดรหัสหลายอย่างที่กระตุ้นการตอบสนองของจีโนม เหล่านี้รวมถึง forkhead box O (Foxo) และปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับนิวเคลียสอีรีทรอยด์ 2-แฟคเตอร์ (Nrf-2) Nrf-2 เป็นศูนย์กลางในการปกป้องเซลล์จากความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและ/หรือซีโนไบโอติก เนื่องจากกระตุ้นการแสดงออกของสารต้านอนุมูลอิสระและยีนระยะที่ 2 [11-13]
เราและคนอื่นๆ ได้เสนอเมื่อเร็วๆ นี้ว่าการกำหนดเป้าหมายการพึ่งพาเนื้องอกเหล่านี้ (กล่าวคือ โมดูลโปรตีโอสแตติก และ/หรือวิถีการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระ) หรือการเพิ่มระดับเซลล์ของ ROS ในบริบทของจีโนไทป์ที่แปลงสภาพแล้ว เสนอหน้าต่างการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับการฆ่าเซลล์เนื้องอกที่เลือกได้ [3 ,14]; ในการสนับสนุน มีรายงานรายงานการฆ่าเซลล์มะเร็งโดยเลือกโมเลกุลขนาดเล็กที่เพิ่มระดับ ROS ของเซลล์ [2] เป็นที่คาดหวังว่าแนวทางเชิงผสมผสาน ซึ่งรวมถึงการกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต้านเนื้องอก [15] มีแนวโน้มว่าจะขยายขอบเขตการรักษาให้สูงสุดโดยการยับยั้ง PN และการตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระ และ/หรือโดยการเพิ่มระดับ ROS ของเซลล์
ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ (สารสกัดหรือสารประกอบบริสุทธิ์) (NPs) จากแหล่งต่างๆ (พืช สิ่งมีชีวิตในทะเล จุลินทรีย์ ฯลฯ) ได้รับการคัดกรองความสามารถในการทำหน้าที่เป็นสารต้านเนื้องอกเนื่องจากความหลากหลายทางโครงสร้างและความซับซ้อนทางเคมีที่รุนแรง pleiotropically ปรับเส้นทางการส่งสัญญาณมือถือหลายทาง [16] ตามรายงาน NPs กระตุ้นการตอบสนองต่อการอักเสบ การต่อต้านเนื้องอก และ/หรือการป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อ [16,17] และยังหลบเลี่ยงการดื้อยาหลายชนิด [18,19] ในกลุ่มเหล่านี้ สารประกอบฟีนอล (รวมถึงฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์) ได้รับความสนใจอย่างมากเนื่องจากมีบทบาทรายงานในการป้องกันและ/หรือการรักษาโรคต่างๆ ของมนุษย์
Acteoside หรือที่เรียกว่าการใช้งานหรือ verbascoside [20] เป็นฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ที่แยกได้จากใบเลี้ยงคู่จำนวนมาก มีรายงานว่า Acteoside ทำกิจกรรมทางชีววิทยาที่น่าสนใจบางอย่าง รวมถึงคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และควบคุมการตายของเซลล์ [21,22] อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการระบุถึงศักยภาพในการต่อต้านเนื้องอก เรารายงานที่นี่ว่า acteoside นั้นมีความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เพิ่มขึ้นต่อเซลล์มะเร็งของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมโดยไม่มีผลกระทบที่เป็นพิษชัดเจนในบริบทของเซลล์ทางสรีรวิทยา นอกจากนี้ แอคทีโอไซด์ยังยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกเมลาโนมาในเมาส์รุ่น Vivo โดยกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอก
ผลกระทบของcistanche แอคทีโอไซด์
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. วัสดุพืชและการสกัด
ซื้อใบ Lippia citriodora (Lamiaceae) แห้ง (4.5 กก.) จากตลาดท้องถิ่นในกรุงเอเธนส์ ประเทศกรีซ ใบถูกบดให้เป็นผงและสกัดโดยการกวนด้วยเครื่องกลเป็นเวลา 12 ชั่วโมงด้วยเมทานอล (2 × 20 ลิตร) สารสกัดเมทานอลถูกระเหยจนแห้งและล้างด้วยของผสมของ CH2Cl2/MeOH 98/2 (15 ลิตร) เรซิดิวที่ไม่ละลายน้ำถูกแยกออกและทำให้แห้ง, ทำให้เกิดผงสีเขียว-เหลือง (450 ก.)
2.2. การทำให้บริสุทธิ์ของแอกทีโอไซด์และการวิเคราะห์ UPLC-HRMS
ส่วนหนึ่ง (10 ก.) ของเรซิดิวที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ถูกนำไปยังโครมาโตกราฟีแบบสวนทางกันโดยใช้เครื่องมือ fast centrifugal partition chromatography (FCPC) (Kromaton, France); ของผสมของ EtOAc/EtOH/H2O ที่อัตราส่วน 5/0.5/4.5 ถูกใช้เป็นระบบตัวทำละลายแบบไบเฟส เศษส่วนที่รวบรวมได้อยู่ภายใต้โครมาโตกราฟีแบบชั้นบาง จากนั้นสังเกตโครมาโตแกรมภายใต้หลอด UV (254 และ 365 นาโนเมตร) และมองเห็นได้ด้วยการพ่นด้วยเมทานอลวานิลลินซัลเฟตตามด้วยการให้ความร้อนเป็นเวลาสองนาที แอกทิโอไซด์ 2.1 กรัม (ความบริสุทธิ์ มากกว่าหรือเท่ากับ 90 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกแยกออกโดยกระบวนการดังกล่าว การระบุแอกทีโอไซด์ดำเนินการโดยนิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์ (NMR) และแมสสเปกโตรเมทรี (MS) สเปกตรัม ในขณะที่ความบริสุทธิ์ของมันถูกกำหนดขึ้นโดยการวิเคราะห์ UPLC-MS และ NMR; ดูรายละเอียดได้ที่ Suppl. วัสดุและวิธีการ
2.3. เส้นเซลล์
ไฟโบรบลาสต์ของตัวอ่อนปอดของมนุษย์ (เซลล์ IMR90) พร้อมด้วย B16.F1, B16.F10, YAC-1 และ WEHI-164 สายพันธุ์ของเซลล์หนูได้รับมาจาก American Tissue Culture Collection (ATCC) สายพันธุ์ของเซลล์ osteosarcoma ของมนุษย์ U2 OS และ Sa OS ได้รับการบริจาคจาก Prof. V. Gorgoulis (คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยแห่งชาติและ Kapodistrian แห่งเอเธนส์ ประเทศกรีซ) ในขณะที่เซลล์ KH OS osteosarcoma และกลุ่มเซลล์ osteosarcoma ที่ทนต่อเคมี การบริจาคของ Dr. E. Gonos (National Hellenic Research Foundation, Greece) เซลล์มะเร็งในหนูเมาส์สายพันธุ์ C5N และ A5 อยู่ในแบบจำลองการก่อมะเร็งที่ผิวหนังของหนูหลายขั้นตอน [24,25] และได้รับบริจาคจาก Prof. A. Balmain (Comprehensive Cancer Center, University of California, USA) มีการรายงานสภาพการเพาะเลี้ยงของสายพันธุ์ของเซลล์ที่ใช้แล้วใน Suppl วัสดุและวิธีการ
ประโยชน์ของcistanche แอคทีโอไซด์
2.4. เมลาโนมาเมาส์ นายแบบ
หนู C57BL/6 (น้ำหนัก 25–30 กรัม อายุ 6-8 สัปดาห์) ได้รับจากสถาบันเฮลเลนิก ปาสเตอร์ และเลี้ยงภายใต้อุณหภูมิควบคุม (22 องศา ) และช่วงแสง (แสง 12 ชม. มืด 12 ชม. ) พร้อมน้ำและอาหารฟรี หนูเมาส์ถูกฉีดวัคซีนใต้ผิวหนังด้วยเซลล์เมลาโนมา 105 B16.F1 (ใน 100 ไมโครลิตร PBS) และถูกกำหนดแบบสุ่มให้กับ 3 กลุ่ม (n=5/กลุ่ม) เมื่อเนื้องอกมองเห็นได้ชัดเจน (วันที่ 11) หนูได้รับแอกทิโอไซด์ผ่านสองเส้นทาง ทั้งทางช่องท้อง (IP) (1 มก./เมาส์ เจือจางใน 200 ไมโครลิตร PBS; รวม 6 ปริมาณที่รับประทานวันเว้นวัน) หรือรับประทานโดยการดื่มน้ำ (OR) (2.5 มก./เมาส์; รวม 13 ครั้งเป็นเวลา 13 วันติดต่อกัน) หนูเมาส์ควบคุมถูกบริหารให้ PBS การเติบโตของเนื้องอกจะถูกบันทึกทุก 2 วันโดยการวัดแกนหลักและแกนรองของเนื้องอกที่ก่อตัวขึ้นด้วยคาลิปเปอร์ดิจิตอล การวัดถูกแปลงเป็นปริมาตรเนื้องอกโดยใช้สูตร: ปริมาตรเนื้องอก (cm3)=แกนหลัก × แกนรอง 2 × 0.5 ในวันที่ 28 สัตว์ถูกทำการุณยฆาตโดยปากมดลูกเคลื่อน และม้ามถูกกำจัดออกอย่างปลอดเชื้อ การทดลองซ้ำสามครั้งด้วยการค้นพบที่คล้ายคลึงกัน
เซลล์ม้ามถูกแยกออกจากม้ามที่ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและทดสอบทันทีสำหรับความเป็นพิษต่อเซลล์ของพวกมันเทียบกับเป้าหมายของเซลล์ B16.F1, YAC-1 และ WEHI-164 ความเป็นพิษต่อเซลล์ได้รับการประเมินตามการตรวจหาการสัมผัส CD107 บนผิวเซลล์ อันเป็นผลมาจากการเสื่อมสภาพของเซลล์เอฟเฟกเตอร์ ม้ามโต (105 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะเลี้ยงร่วมกันกับเป้าหมายในไมโครเพลทด้านล่างของ 96-หลุมที่อัตราส่วนเอฟเฟกเตอร์ต่อเป้าหมาย (E: T) ที่ 100:1 ที่ 37 องศาใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 โมโนโคลนอลแอนติบอดีต้าน CD107a และแอนติ-CD107b ที่คอนจูเกต FITC (25 ไมโครลิตร/มิลลิลิตร) และโมเนนซิน (6 ไมโครลิตร/มิลลิลิตร; ทั้งหมดมาจาก BD Biosciences) ถูกเติมในแต่ละหลุม เซลล์ถูกเก็บเกี่ยว 6 ชั่วโมงต่อมาและวิเคราะห์โดยใช้โฟลว์ไซโตมิเตอร์ของ FACSCanto II ในแบบคู่ขนาน เนื้องอกถูกตัดออกและประมวลผลสำหรับการสอบวิเคราะห์ปลายน้ำตามที่อธิบายไว้ใน Suppl วัสดุและวิธีการ
cistanche แอคทีโอไซด์
