เควอซิทินช่วยปรับปรุงสถานะการทำงานของกล้ามเนื้อหัวใจตายในหนูที่เป็นเบาหวานชนิดที่ 2

ติดต่อสอบถามเพิ่มเติมได้ที่tina.xiang@wecistanche.com

วัตถุประสงค์. ข้อมูลที่เกิดขึ้นใหม่บ่งชี้ว่าความเครียดออกซิเดชันมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการเกิดโรคของโรคหัวใจและหลอดเลือดในผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 (T2DM) การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินผลของฟลาโวนอยด์ที่มีมากที่สุดในอาหารของมนุษย์เควอซิทิน(Q) เกี่ยวกับสถานะรีดอกซ์ของกล้ามเนื้อหัวใจในหนูที่มี T2DM

วิธีการ. T2DM ถูกกระตุ้นในหนู Wistar เพศผู้โดยการรับประทานอาหารที่มีแคลอรี่สูง (เป็นเวลา 14 สัปดาห์) และฉีดสเตรปโตโซโตซินสองครั้ง (25 มก./กก. ต่อน้ำหนักตัว) สองครั้งในอาหารสี่สัปดาห์ สัปดาห์ละครั้งเป็นเวลาสองสัปดาห์ Q ถูกบริหารให้ทางช่องท้องโดยทางสายยางในขนาด 10 หรือ 50 มก./กก. ของน้ำหนักตัวเป็นเวลา 8 สัปดาห์ โดยเริ่มตั้งแต่วันที่ 8 หลังจากการฉีดสเตรปโตโซโตซินครั้งสุดท้าย หนูควบคุมได้รับบัฟเฟอร์ซิเตรตและเจ็ดวันหลังจากการฉีด STZ ครั้งสุดท้าย ระดับกลูโคสพื้นฐานถูกวัดในสัตว์ทั้งหมด

ผลลัพธ์. การบริหาร Q เพิ่มความไวต่ออินซูลินในหนูเบาหวานโดยมีผลเด่นชัดมากขึ้นในขนาด 50 มก./กก. bw นอกจากนี้ Q ยังลดการเกิดออกซิเดชันของอนุมูลอิสระในไมโตคอนเดรียหัวใจของสัตว์ที่เป็นเบาหวาน ดังนั้นจึงจำกัดการก่อตัวของผลิตภัณฑ์โปรตีนออกซิเดชันขั้นสูงในขนาดยา ลักษณะที่ขึ้นต่อกันและทำให้การทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเป็นปกติ (ซูเปอร์ออกไซด์ dismutase, กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส, กลูตาไธโอนรีดักเตส) ในไมโตคอนเดรียของหัวใจโดยไม่ขึ้นกับขนาดยาที่ใช้ นอกจากนี้ Q ในทั้งสองขนาดยังป้องกันการพัฒนาของความเครียดออกซิเดชันในหนู T2DMคาร์ดิโอไมโอไซต์โดยลดกิจกรรมของ NADPH oxidase และ xanthine oxidase

บทสรุป. ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่า Q ทั้งในขนาด 10 มก./กก. และ 50 มก./กก. สามารถป้องกันการพัฒนาของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในคาร์ดิโอไมโอไซต์ในหนูที่เป็นเบาหวานได้ ข้อมูลปัจจุบันระบุว่าการใช้ Q อาจช่วยบรรเทาความเสี่ยงโรคหัวใจและหลอดเลือดในผู้ป่วย T2DM

คีย์เวิร์ด: เควอซิทิน, เบาหวานชนิดที่ 2, คาร์ดิโอไมโอไซต์, ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน

โรคเบาหวานmellitus (DM) เป็นหนึ่งในภาวะฉุกเฉินด้านสุขภาพระดับโลกที่เติบโตเร็วที่สุดแห่งศตวรรษที่ 21* จากข้อมูลของสหพันธ์เบาหวานนานาชาติ ระบุว่า 463 ล้านคนทั่วโลกป่วยเป็นโรคเบาหวานในปี 2019 และคาดว่าจำนวนนี้จะสูงถึง 700 ล้านคนภายในปี 2045 DM มีความเกี่ยวข้องกับภาวะหัวใจและหลอดเลือดที่หลากหลาย ซึ่งรวมแล้วเพิ่มความเสี่ยงต่อการเสียชีวิตจากโรคหัวใจและหลอดเลือดได้ถึง 132 เปอร์เซ็นต์ในผู้ป่วยเบาหวานเมื่อเทียบกับบุคคลที่ไม่มี DM (IDF Diabetes Atlas 2019)

DM เป็นที่ทราบกันดีว่าทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเฉพาะในโครงสร้างของกล้ามเนื้อหัวใจและการทำงานที่ไม่ขึ้นกับโรคหลอดเลือดหัวใจหรือความดันโลหิตสูงมักถูกกำหนดให้เป็นโรคหัวใจและหลอดเลือด (DCM) DCM แสดงออกโดยความผิดปกติของ diastolic ตามด้วยความผิดปกติในการทำงานของ systolic ซึ่งอาจนำไปสู่ภาวะหัวใจล้มเหลว (หลิว et al.2014). เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่าความผิดปกติของการเผาผลาญใน cardiomyocytes ที่ DCM (ยั่วยวน การอักเสบ การตายของเซลล์ พังผืด) มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการพัฒนาของความเครียดออกซิเดชัน(Kayama et al.2015)

ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) รวมถึงซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน ไฮดรอกซิลเรดิคัล และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เป็นโมเลกุลสัญญาณที่สำคัญที่มีบทบาทสำคัญในทั้งสรีรวิทยาของหัวใจและโรค แหล่งที่มาของไซโตโซลิกทั้งสอง รวมทั้ง NADPH oxidases (NOX), xanthine oxidase(XO), cyclooxygenases และ cytochrome P450 enzymes และแหล่งที่มาของ mitochondrial เช่น ระบบทางเดินหายใจและ monoamine oxidases มีส่วนทำให้เกิดแหล่ง ROS ภายในเซลล์ ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา การส่งสัญญาณ ROS ของหัวใจจะควบคุมการพัฒนาของหัวใจและการเจริญเติบโตของหัวใจและหลอดเลือด การจัดการแคลเซียมในหัวใจ อย่างไรก็ตาม สภาพทางพยาธิสภาพของการผลิต ROS ที่ไม่ได้รับการควบคุมทำให้ระดับ ROS สูงขึ้น ซึ่งอาจส่งผลให้ความเครียดออกซิเดชันผ่านการทำลายออกซิเดชันของดีเอ็นเอ โปรตีน และไขมัน ตลอดจนความผิดปกติของไมโตคอนเดรียและการตายของเซลล์ (Peoples et al. 2019) อันที่จริง การผลิต ROS ที่ผิดปกติและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีส่วนเกี่ยวข้องกับโรคหัวใจจำนวนมาก รวมถึงโรคกล้ามเนื้อหัวใจตายจากเบาหวาน (Ritchie and Abel 2020)

การผลิต ROS ที่มากเกินไปโดยไมโตคอนเดรียสามารถส่งผลโดยตรงต่อการทำงานของกล้ามเนื้อหัวใจตายโดยการดัดแปลงออกซิเดชันของเอนไซม์และช่องไอออนที่มีส่วนร่วมในการควบคุมของวงจรกระตุ้น-ผ่อนคลาย (Brown and Griendling 2015; Bai et al. 2016) นอกจากนี้ ROS กระตุ้นการเพิ่มจำนวนของเซลล์คาร์ดิโอไมโอไซต์และกระตุ้นไฟโบรบลาสต์และเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน ซึ่งนำไปสู่การเจริญเติบโตมากเกินไปและการเปลี่ยนแปลงของกล้ามเนื้อหัวใจซึ่งส่งผลให้เกิดภาวะหัวใจล้มเหลว (DOria et al.2020) ดังนั้นจึงแนะนำว่าการดำเนินการทางเภสัชวิทยาที่มุ่งลดการผลิต ROS ที่มากเกินไปอาจมีประสิทธิภาพในการป้องกันและแก้ไขภาวะแทรกซ้อนของโรคหัวใจและหลอดเลือดจากเบาหวาน

ปัจจุบันได้มีการกำหนดแล้วว่าการบริโภคโพลีฟีนอลจากธรรมชาติโดยเฉพาะอย่างยิ่งฟลาโวนอยด์สามารถลดความเสี่ยงของโรคเบาหวานและโรคหลอดเลือดหัวใจและกลไกการป้องกันอาจไม่เพียงขึ้นอยู่กับสารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ต้านการอักเสบของฟลาโวนอยด์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงสารฟลาโวนอยด์ด้วย คุณสมบัติที่ส่งผลต่อระดับน้ำตาลในเลือด การใช้กลูโคส และการหลั่งอินซูลิน (Ghorbaniet al.2019; Lutz et al.2019)

เควอซิทิน(Q;3,5,7,34-pentahydroxy flavon)เป็นฟลาโวนอยด์ที่มีมากที่สุดในอาหารของมนุษย์ มีการทำงานทางชีวภาพที่หลากหลายของ Q รวมถึงผลกระทบต่อเส้นทางที่เกี่ยวข้องกับการอักเสบ เบาหวาน และโรคหลอดเลือดหัวใจ (Zahedi et al. 2013) งานวิจัยหลายชิ้นได้แสดงให้เห็นกลไกของฤทธิ์ต้านเบาหวานของ Q รวมถึง

ลิพิดเปอร์ออกซิเดชันที่ลดลง กิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ (เช่น superoxide dismutase, SOD; glutathione peroxidase, GPX; catalase, CAT) ลดการดูดซึมกลูโคสในลำไส้เนื่องจากการหยุดทำงานของตัวขนส่ง GLUT2 และอื่นๆ (Shi et al.2019; Salehi et al.2020) ผล cardioprotective ของ Q ต่อความแตกต่างคาร์ดิโอไมโอไซต์เนื่องจากการปิดใช้งานของโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจนและเส้นทางการส่งสัญญาณของโปรตีนไคเนสบีก็แสดงให้เห็นเช่นกัน (Daubney et al.2015)

การวิจัยในอนาคตที่มุ่งทำความเข้าใจกลไกการทำงานของหัวใจและหลอดเลือดในผู้ป่วยเบาหวานอาจส่งผลต่อการปรับปรุงการดูแลผู้ป่วยโรคเบาหวาน

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาผลของเควอซิทินต่อสถานะรีดอกซ์ของคาร์ดิโอไมโอไซต์ในหนูที่เป็นเบาหวานชนิดที่ 2 (T2DM)

วัสดุและวิธีการ

เคมีภัณฑ์. สารเคมีทั้งหมดที่ใช้มีคุณภาพเกรดรีเอเจนต์เชิงวิเคราะห์และซื้อจาก Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO, USA) Quercetin ให้บริการโดย PJSCSICBorshchahivskiy Chemical-Pharmaceutical Plant (Kyiv, Ukraine) และมีสารออกฤทธิ์อย่างน้อย 96.5 เปอร์เซ็นต์

การออกแบบทดลอง. การศึกษาปัจจุบันได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมทางชีวภาพของ "สถาบัน V. Dani-levsky สำหรับปัญหาพยาธิวิทยาต่อมไร้ท่อของสถาบันวิทยาศาสตร์การแพทย์แห่งชาติของประเทศยูเครน" (คาร์คิฟ, ยูเครน) และดำเนินการตามอนุสัญญายุโรปว่าด้วยการคุ้มครองสัตว์มีกระดูกสันหลัง ใช้สำหรับการทดลองและวัตถุประสงค์ทางวิทยาศาสตร์อื่น ๆ (Strasbourg, 1986)

ทำการทดลองกับหนู Wistar เพศผู้ 32 ตัว (12-สัปดาห์, 200-230 g น้ำหนักตัว, bw) ซึ่งถูกเลี้ยงในกรงลูกแก้ว (3 ตัวต่อกรง) ที่อุณหภูมิ 22±1 องศา C ในรอบแสง/ความมืดคงที่ 12-ชั่วโมง

แบบจำลองสัตว์ของ T2DM ที่เหนี่ยวนำโดยอาหารแคลอรี่สูงรวมกับการฉีดสเตรปโตโซโตซินขนาดต่ำหลายครั้งถูกนำมาใช้ แบบจำลองนี้ให้การพัฒนาคุณสมบัติหลักสองประการของ T2DM: อาหารที่มีแคลอรี่สูงทำให้เกิดการดื้อต่ออินซูลิน และ STZ ในขนาดต่ำทำให้เกิดการด้อยค่าของการหลั่งอินซูลินเล็กน้อย ดังนั้น แบบจำลองนี้จึงเลียนแบบประวัติธรรมชาติของเหตุการณ์โรค (ตั้งแต่การดื้อต่ออินซูลินไปจนถึงความผิดปกติของเซลล์) ตลอดจนลักษณะการเผาผลาญของ T2DM ของมนุษย์ (Skovso 2014)

หนูควบคุมที่ไม่บุบสลาย (n=8) ถูกเลี้ยงด้วยอาหารมาตรฐานเป็นเวลา 14 สัปดาห์ หนูทดลอง (n=24) ได้รับอาหารแคลอรีสูงซึ่งประกอบด้วยน้ำมันหมู 15 เปอร์เซ็นต์ ซูโครส 25 เปอร์เซ็นต์ เกลือน้ำดี 1 เปอร์เซ็นต์ และอาหารมาตรฐาน 59 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 14 สัปดาห์ สัตว์เหล่านี้สามารถเข้าถึงน้ำได้ฟรี ในสี่สัปดาห์ หนูทดลองถูกฉีดเข้าช่องท้อง(.p.ฉีดด้วย STZ(25 มก./กก. bw) สัปดาห์ละครั้งเป็นเวลาสองสัปดาห์(Lin et al. 2010) หนูควบคุมได้รับสารบัฟเฟอร์ซิเตรตตามแบบแผนเดียวกันเจ็ดวันหลังจาก การฉีด STZ ครั้งสุดท้าย วัดระดับน้ำตาลกลูโคสในสัตว์ทั้งหมด และหนูทดลองถูกแบ่งออกเป็นสามกลุ่ม: หนูเบาหวานที่ไม่ได้รับการรักษา (เบาหวาน n=8) และหนูเบาหวานที่รักษาด้วยยาฉินในขนาด 10 มก./กก. bw (เบาหวาน บวก Q10,n=8)หรือ 50 มก./กก. bw (เบาหวาน บวก Q50, n=8) วันละครั้งโดยทางสายเลือดเป็นเวลา 8 สัปดาห์หลังจากการชักนำให้เกิดโรคเบาหวาน .

สัตว์ถูกสังเวยตามระเบียบของคณะกรรมการจริยธรรม

การวัดสภาวะสมดุลของกลูโคส. การทดสอบความทนทานต่ออินซูลินในช่องท้อง (IPITT) ดำเนินการในหนูที่อดอาหารข้ามคืน เริ่มแรกความเข้มข้นของกลูโคสในเลือดถูกวัดที่สภาวะที่เป็นเบส ({{0}} นาที) จากนั้นให้สัตว์ได้รับ ani หน้า การฉีดอินซูลิน 0.25 U/kg bw(Actrapid, Novo Nordisk, Agsvaerd, Denmark)ตามด้วยการฉีดน้ำตาลกลูโคสทางไอพี (2 g/kg)(Bowe et al.2014) ต่อจากนั้น วัดระดับน้ำตาลในเลือดส่วนหางโดยใช้เครื่องวิเคราะห์กลูโคส Eksan-G (Analita Firm Joint Stock Company Ltd., Vilnius, Republic of Lithuania) ที่ 15, 30,60,90 และ 120 นาทีหลังจากโหลดกลูโคส

การแยกตัวของไมโตคอนเดรีย. ไมโทคอนเดรียถูกแยกออกโดยวิธีทั่วไป หัวใจหนูที่เพิ่งตัดออกใหม่ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในอาหารที่มี {{0}}.18 M KCl, 10 mM EDTA, 0.5 เปอร์เซ็นต์ของโปรตีนในเลือดของอัลบูมิน (BSA), 10mM HEPES, pH7.4 โฮโมจิเนตถูกล้างออกจากเศษซากและ นิวเคลียสโดยการหมุนเหวี่ยงสองครั้งที่ 500 กรัม (10 นาทีที่ 4 องศา ) ไมโทคอนเดรียถูกอัดเป็นเม็ดจากส่วนลอยเหนือตะกอนที่ 10000 กรัม (15 นาทีที่ 4 องศา ) และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การแยก

เศษส่วนส่วนลอยเหนือตะกอนของไมโทคอนเดรียถูกนำมาใช้สำหรับการกำหนดกิจกรรม XO และ NOX เพื่อกำจัด EDTA และอัลบูมิน เม็ดไมโตคอนเดรียถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10000g(15 นาที,4 องศา ) และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับล้างที่มี 0.18 M KCl และ 10mM HEPES(pH7.4) สองครั้ง (DiLisa et al.1994) .

สเปกโตรโฟโตเมตรี. เครื่องวัดสเปกโตรโฟโตเมตรีทั้งหมดดำเนินการโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV-VIS แบบลำแสงคู่ Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)

การวัดผลิตภัณฑ์โปรตีนออกซิเดชันขั้นสูง (AOPP) การกำหนดระดับ AOPP ดำเนินการโดยวิธีแก้ไขของ Witko-Sarsat และเพื่อนร่วมงาน (Sagor et al.2015) ไมโตคอนเดรียของหัวใจ (0.โปรตีน 2 มก.) ถูกบำบัดด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton-X100 และเจือจางในสารละลาย PBS(pH7.4) KI (1.16 โมลาร์) ถูกเติมลงในอาหารสำหรับการทดสอบ ตามด้วย 2 นาทีต่อมา โดยการเติมกรดอะซิติกน้ำแข็ง การดูดกลืนแสงของของผสมปฏิกิริยาถูกอ่านทันทีที่ 340 นาโนเมตรเทียบกับช่องว่าง ความเข้มข้นของ AOPP ถูกแสดงออกเป็นโปรตีนคลอรามีน T/mg ที่เทียบเท่านาโนโมล

การวัดกิจกรรมของเอนไซม์. กิจกรรม NOX ได้รับการตรวจสอบเป็นการผลิต O2 ที่ขึ้นกับ NADPH โดยเศษส่วนเหนือตะกอนของไมโตคอนเดรียภายหลังโดยใช้การลดเฟอร์ริซิโตโครมซีที่ยับยั้ง SOD ได้ (Li et al. 2002) สัดส่วนหลังไมโตคอนเดรียของหัวใจโฮโมจีเนต (โปรตีน 1 มก.) ถูกเสริมด้วย 10 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl (pH7.8), 500μMcytochrome c, 100μM NADPH ถูกบ่มที่ 37 องศา C เป็นเวลา 30 นาทีโดยมีหรือไม่มี SOD 200 U/มล การลดไซโตโครมถูกวัดโดยการดูดกลืนการอ่านที่ 550 นาโนเมตร (8=21 mM-1 ซม.-)

กิจกรรม XO ถูกทดสอบในสารละลาย PBS ที่สมดุลในอากาศ (pH7.4) ซึ่งประกอบด้วยเศษส่วนหลังไมโตคอนเดรียของฮาร์โมจิเนตของหัวใจ (โปรตีน 1 มก.) ที่ 37 องศาหลังจากการเติมแซนไทน์ (ความเข้มข้นสุดท้าย 360μM) โดยการวัดการผลิตกรดยูริกจากการเปลี่ยนแปลง ในการดูดกลืนแสงที่ 295nm (e=9500M-'cm-') (Lee et al.2014)

กิจกรรม Mn-SOD ในสารแขวนลอยยลถูกตรวจพบโดยการยับยั้งการลดไนโตรบลู เตตตราโซเลียม (NBT) ที่เกิดจากระบบแซนไทน์-XO เป็นตัวกำเนิด O2 และในที่สุดก็หาค่าการดูดกลืนแสงที่ 560 นาโนเมตร ของผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วยไมโตคอนเดรียหัวใจ (0.0โปรตีน 2 มก.),0.05 โมลาร์คาร์บอเนตบัฟเฟอร์(pH10.2),0.1 มิลลิโมลาร์ EDTA,0.1 มิลลิโมลาร์ แซนไทน์,25μM NBT,1 mU/มล. XO. ผลลัพธ์ถูกแสดงออกในหน่วยใดๆ (au) ของแอคติวิตี SOD ต่อมิลลิกรัมของโปรตีน หนึ่ง aumeans ปริมาณเอนไซม์ที่ก่อให้เกิดการยับยั้ง 50 เปอร์เซ็นต์ของอัตราการลด NBT (Wang et al. 2018)

กิจกรรมของกลูตาไธโอนรีดักเตส (GR) ถูกวัดโดยการติดตามการออกซิเดชันของ NADPH ที่ 340 นาโนเมตรในปฏิกิริยารีดักชันกลูตาไธโอนออกซิไดซ์ (GSSG) ในการทำปฏิกิริยา ไมโทคอนเดรียจากหัวใจ (โปรตีน 0.1 มก.) ถูกบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 37 องศาในบัฟเฟอร์สำหรับทดสอบที่มี Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์ (pH7.4), 0.25 mM EDTA, 10 μM FAD, 3 mM GSSG และ 0.1 mM NADPH(Raza และ John 2004)

การประมาณการของกิจกรรม GPX จัดทำขึ้นโดยพิจารณาจากความสามารถของเอนไซม์ในการเร่งการย่อยสลายของ tertbutyl hydroperoxide โดยใช้กลูตาไธโอนที่ลดลง (GSH) เป็นสารตั้งต้น ของผสมปฏิกิริยา(pH7.0) มีไมโตคอนเดรียหัวใจ (0.โปรตีน 1 มก.), 0.56mM NADPH,1.0 U/ml GR,7.5 mM โซเดียม เอไซด์, 5 มิลลิโมลาร์ GSH, 5 มิลลิโมลาร์ EDTA และบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.05 โมลาร์ เติร์ต-บิวทิล ไฮโดรเปอร์ออกไซด์ (23 มิลลิโมลาร์) ถูกเติมเพื่อเริ่มต้นปฏิกิริยา อัตราการก่อตัวของ GSSG ถูกกำหนดโดยปฏิกิริยา GR จากการลดลงของการดูดกลืนแสงของโพรบที่ 340 นาโนเมตร (Antunes et al.2002)

การวัดปริมาณโปรตีนในตัวอย่าง. โปรตีนไมโตคอนเดรียถูกกำหนดโดยวิธีโลว์รีดัดแปลงโดยมิลเลอร์ โดยมีบีเอสเอเป็นมาตรฐาน (Lowry et al.1951; Miller 1959)

การวิเคราะห์ทางสถิติ. ข้อมูลแสดงเป็นค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) การทดสอบ Shapiro-Wilk ใช้เพื่อทดสอบความปกติของการกระจายข้อมูล สำหรับการเปรียบเทียบข้อมูลหลายรายการที่มีการแจกแจงแบบปกติ ได้ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวแบบพาราเมตริก (ANOVA) และใช้วิธี Student-Newman-Keuls เพื่อทดสอบความแตกต่างของค่าเฉลี่ย ค่ามีนัยสำคัญทางสถิติที่ p<>

ผลลัพธ์

เราพบว่าระดับน้ำตาลกลูโคสพื้นฐานในหนูที่ได้รับอาหารแคลอรี่สูงและฉีดด้วย STZ นั้นสูงกว่าในกลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1) นอกจากนี้ พื้นที่ใต้เส้นโค้งระดับน้ำตาลในเลือด (AUC) ที่ได้รับระหว่าง IPITT นั้นเกือบ ในสัตว์ที่เป็นโรคเบาหวานมีขนาดใหญ่ขึ้นสามเท่าเมื่อเทียบกับสัตว์ควบคุม(ตารางที่ 1, รูปที่ 1) ข้อมูลเหล่านี้ยืนยันการพัฒนาของการขาดอินซูลินสัมพัทธ์และการดื้อต่ออินซูลินในหนูทดลอง

การบริหารให้ Q ไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อภาวะน้ำตาลในเลือดสูงพื้นฐานของสัตว์ที่เป็นเบาหวาน อย่างไรก็ตาม Q ส่งผลต่อความไวของอินซูลินในหนูที่มี T2DM ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา โดยลด IPITT AUC ลง 27 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มทดลองที่ได้รับยา 10 มก./กก. และ 41% ในกลุ่มที่ได้รับ Q 50 มก./กก. เปรียบเทียบ ให้กับสัตว์รับรถ (ตารางที่ 1 รูปที่ 1)

ระดับ AOPP ในไมโตคอนเดรียหัวใจของหนูทดลองเพิ่มขึ้นร้อยละ 66 ยืนยันการพัฒนาของความเครียดออกซิเดชันใน T2DM (รูปที่ 2) การบริหารส่งผลให้การสะสม AOPP ในหัวใจของสัตว์ที่เป็นเบาหวานลดลงในปริมาณของยา ในกลุ่มทดลองที่ได้รับ Q 50 มก./กก. ความเข้มข้นของ AOPP ลดลงจนถึงระดับของกลุ่มควบคุม ซึ่งบ่งชี้ถึงคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระของ Q (รูปที่ 2)

ดังที่แสดงในรูปที่ 3 ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในไมโตคอนเดรียหัวใจของหนูที่มี T2DM นั้นมาพร้อมกับกิจกรรมที่เหนี่ยวนำของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ -Mn-SOD, GPO และ GR การบริหารให้ Q ในทั้งสองขนาดทำให้กิจกรรมของเอนไซม์ต่อต้านอนุมูลอิสระที่ศึกษาในสัตว์ที่เป็นโรคเบาหวานเป็นปกติจนถึงระดับของกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3)

พบว่า T2DM สัมพันธ์กับกิจกรรม NOX และ XO ที่เพิ่มขึ้น 65 เปอร์เซ็นต์และ 52 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งเป็นแหล่ง O2 หลักของเซลล์ในเซลล์หัวใจ 2 แห่ง ตามลำดับ ในส่วนหลังไมโตคอนเดรียของหัวใจที่ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของหนูทดลอง (รูปที่ 4) การใช้ Q นำไปสู่การทำให้กิจกรรม NOX และ XO เป็นปกติในหัวใจของสัตว์ที่เป็นโรคเบาหวานโดยไม่ขึ้นกับขนาดยา (รูปที่ 4)

การอภิปราย

ในปัจจุบัน ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่กำหนดว่าเป็นการเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องของอนุมูลอิสระอันเนื่องมาจากความไม่สมดุลในการผลิตและการใช้ประโยชน์ของพวกมัน ถือเป็นกลไกสากลที่ผสมผสานวิถีการก่อโรคต่างๆ ของภาวะแทรกซ้อนทางหลอดเลือดและหัวใจจากเบาหวาน (Huynh et al.2014)

ความเครียดที่เกิดจากออกซิเดชันที่เกิดจากน้ำตาลในเลือดสูงมีบทบาทสำคัญในการทำให้เกิดโรคของ T2DM (Shah and Brownlee 2016) ลักษณะทางพยาธิวิทยาหลักของ T2DM คือการหลั่งอินซูลินที่ลดลงและลดความไวต่อฮอร์โมนในเนื้อเยื่อส่วนปลาย ในขั้นตอนแรกของการศึกษา การดื้อต่ออินซูลินถูกจำลองในหนูโดยใช้อาหารที่มีแคลอรีสูง ในช่วงสี่สัปดาห์ หนูที่ได้รับอาหารแคลอรีสูงคือ หน้า ฉีดด้วย STZtoผลิตอินซูลินที่สัมพันธ์กัน ระดับน้ำตาลในเลือดพื้นฐานที่เพิ่มขึ้นและ AUC ที่เพิ่มขึ้นใน IPITT บ่งชี้ถึงพัฒนาการของการขาดอินซูลินและการดื้อต่ออินซูลินในสัตว์จำลอง

การบริหาร Q ไม่ส่งผลต่อระดับน้ำตาลในเลือดสูงพื้นฐานของหนูที่เป็นเบาหวาน แต่ความไวของอินซูลินดีขึ้นในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ผลลัพธ์สอดคล้องกับข้อมูลจากการศึกษาอื่น ๆ เกี่ยวกับความสามารถของ Q ในการลดความต้านทานต่ออินซูลิน (Shi et al. 2019) Q เพิ่มการใช้กลูโคสในเนื้อเยื่อรอบข้างและลดการผลิตกลูโคสในตับ มีรายงานว่าฟลาโวนอยด์กระตุ้นกลไกที่ไม่ขึ้นกับอินซูลินซึ่งเกี่ยวข้องกับไคเนสโปรตีนที่ขึ้นกับ AMP ซึ่งกระตุ้นการเคลื่อนย้ายกลูโคส GLUT4 เข้าไปในเยื่อหุ้มพลาสมาในกล้ามเนื้อโครงร่างและลดระดับเอนไซม์กลูโคเนเจเนซิสที่สำคัญในตับ (ฟอสโฟอีนอล-ไพรูเวต คาร์บอกซิไคเนสและกลูโคส) 6}}ฟอสฟาเตส)(Eid and Haddad 2017). การปรับปรุงความไวของอินซูลินโดย Q อาจเนื่องมาจากความสามารถในการเพิ่มการแสดงออกของ adiponectin ในเนื้อเยื่อไขมันสีขาวโดยไม่ขึ้นกับการแสดงออกของตัวรับที่กระตุ้นด้วย peroxisome proliferator (Wein et al. 2010)

ฤทธิ์ต้านเบาหวานของ Q ยังสามารถรับรู้ได้โดยการลดการดูดซึมกลูโคสในลำไส้ผ่านการหยุดการทำงานของตัวขนส่งกลูโคส GLUT2 (Gaueret al.2018) และการยับยั้งการทำงานของลำไส้ -glucosidases (Pereira et al. 2011) นอกจากนี้ Q ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถยับยั้งเอนไซม์ 1l -hydroxysteroid dehydrogenase-1 ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาโรคอ้วนและ T2DM โดยส่งผลต่อการทำงานของฮอร์โมนกลูโคคอร์ติคอยด์ในตับ เนื้อเยื่อไขมัน และตับอ่อน -เซลล์ (Torres-Piedra et al.2010).

สันนิษฐานว่าทั้งการพัฒนาและความก้าวหน้าของภาวะแทรกซ้อนจากเบาหวานเกิดจากการผลิต ROS ที่เพิ่มขึ้น (Kayama et al. 2015) ใน cardiomyocytes ROS เกิดจากการขนส่งอิเล็กตรอนในไมโตคอนเดรีย (ETC), NOX และ XO (Tsutsui) et al.2011) เป็นที่ถกเถียงกันอยู่ว่าไมโทคอนเดรียเป็นปัจจัยหลักที่ทำให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันต่อ T2DM (ชาห์และบราวน์ลี 2016) การพัฒนาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในไมโตคอนเดรียจะมาพร้อมกับการหยุดชะงักของวิถีการส่งสัญญาณที่ไวต่อปฏิกิริยารีดอกซ์ ฟอสโฟรีเลชันและการผลิตเอทีพีที่ลดลง ความเสียหายของดีเอ็นเอของไมโตคอนเดรีย และผลที่ตามมาก็คือ การผลิต ROS เพิ่มขึ้นอีก เป็นผลให้น้ำตกที่ทำให้เกิดโรคของเหตุการณ์ระดับโมเลกุลซึ่งขยายตัวเองนำไปสู่การเปิดตัวเส้นทางการส่งสัญญาณ proapoptotic และการตายของเซลล์ เมื่อพิจารณาถึงความสำคัญของไมโตคอนเดรียในการเผาผลาญของเซลล์ ความผิดปกติของพวกมันอาจนำไปสู่โรคต่างๆ รวมถึงโรคหัวใจและหลอดเลือด ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียเกิดขึ้นในผู้ป่วยโรคหลอดเลือดหัวใจ คาร์ดิโอไมโอแพที หัวใจล้มเหลว โรคหลอดเลือดสมอง และ T2DM (Bai et al.2016)

ในการศึกษาของเรา การพัฒนาของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในไมโตคอนเดรียหัวใจของหนูเบาหวานนั้นแสดงให้เห็นได้จากการสะสมของ AOPP ความเข้มข้นของ AOPP เป็นเครื่องหมายที่ค่อนข้างใหม่ของความเครียดออกซิเดชัน ซึ่งสะท้อนถึงสถานะรีดอกซ์โดยรวมของโปรตีนในเซลล์และเนื้อเยื่อ มีรายงานว่า AOPP เพิ่มขึ้นในผู้ป่วยที่มี DM, โรคหัวใจและหลอดเลือด, ความดันโลหิตสูง, หลอดเลือด (Conti et al.2019) และระดับมีความสัมพันธ์กับการดื้อต่ออินซูลินและการปรากฏตัวของภาวะแทรกซ้อนจากโรคเบาหวานอย่างรุนแรง (Gradinaru et al. 2013; Taylor et al. 2558). การปรับเปลี่ยนโปรตีนออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญในการพัฒนาความผิดปกติของกล้ามเนื้อหัวใจตายจากเบาหวาน การเปลี่ยนแปลงรีดอกซ์ของโครงสร้างโปรตีนอาจส่งผลให้เกิดการแยกตัวของหน่วยย่อยเร่งปฏิกิริยาของเอ็นไซม์ การคลี่ออก การรวมกลุ่ม หรือการกระจายตัวของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการหดตัว การกระตุ้น-ข้อต่อการหดตัว การพับของโปรตีน การป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ เมแทบอลิซึม และการจัดการ Ca2* ในหัวใจของผู้ป่วยเบาหวาน (วาร์กา et al. 2015). นอกจากนี้ยังพบว่า AOPP กระตุ้นการส่งสัญญาณ proapoptotic ใน cardiomyocytes ซึ่งนำไปสู่การพัฒนาของ DCM (Zhang et al.2016)

ในสัตว์ที่บำบัดด้วย Q ในขนาด 10 มก./กก. พบว่า AOPP ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในไมโตคอนเดรียของหัวใจ ในขณะที่ขนาดยา Q 50 มก./กก. ทำให้เครื่องหมายนี้เป็นปกติอย่างสมบูรณ์เมื่อเปรียบเทียบกับหนูที่ได้รับกระสายยา

ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ Q ในไมโตคอนเดรียอาจรวมถึงกลไกหลักหลายประการ สารฟลาโวนอยด์มีความสามารถในการกำจัด ROS เนื่องจากการกำหนดค่าไฮดรอกซิลของบีริงในโครงสร้าง (Kumar และ Pandey 2013) การกำจัดโดยตรงของ O ที่สร้างขึ้นในไมโตคอนเดรียคอมเพล็กซ์ II ของ ETC ในไมโตคอนเดรียหัวใจของหนูที่แยกได้แสดงให้เห็นสำหรับ Q (Dudy-lina et al. 2019) นอกจากนี้ ฟลาโวนอยด์ยังสามารถลดการก่อตัวของ ROS ในไมโตคอนเดรียผ่านการยับยั้งคอมเพล็กซ์ I และ III ของ ETC การยับยั้ง Q ของกิจกรรม complex I ลด H2O2 อย่างมีนัยสำคัญ การผลิตในไมโตคอนเดรียหัวใจของหนูที่แยกได้ (Lagoa et al.2011) นอกจากนี้ พบว่าการลดลงของการสร้าง ROS ของไมโตคอนเดรียโดยฟลาโวนอยด์สัมพันธ์กับคุณสมบัติการคลายตัวบางส่วน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในไมโตคอนเดรียของหัวใจ (Bernatoniene et al.2014) นอกจากนี้ สารฟลาโวนอยด์ยังแสดงให้เห็นว่าสามารถกระตุ้นการสร้างชีวภาพของไมโตคอนเดรียผ่านการเหนี่ยวนำของตัวกระตุ้นร่วมการถอดรหัส PGC-la และตัวควบคุมต้นน้ำ SIRT1 หลังนำไปสู่การกระตุ้นชุดของปัจจัยการถอดรหัส (NRF1, NRF2 และเอสโตรเจนที่เกี่ยวข้องกับ-a) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการควบคุมการเผาผลาญพลังงานและการรักษาสภาวะสมดุลในไมโตคอนเดรีย (Kicinska และ Jarmuszkiewicz 2020)

จากการทดลองของเรา การเพิ่มขึ้นของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในไมโตคอนเดรียหัวใจของหนูเบาหวานนั้นมาพร้อมกับการกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ Mn-SOD, GPO และ GR เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่ากลไกสำคัญในการป้องกันเซลล์จากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันคือการกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณที่ขึ้นกับ Keapl/Nrf-2- ซึ่งควบคุมการแสดงออกของยีนที่มีผลิตภัณฑ์โปรตีนเกี่ยวข้องกับการล้างพิษและการกำจัด สารออกซิไดซ์ที่เกิดปฏิกิริยา (Nguyen et al. 2009). ในเรื่องนี้ การเหนี่ยวนำที่สังเกตได้ของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในหัวใจของสัตว์ทดลองคือการดำเนินการตอบรับเชิงลบที่มุ่งรักษาสภาวะสมดุลของรีดอกซ์

การบริหารให้ Q ในทั้งสองขนาดทำให้กิจกรรมของ Mn-SOD, GPO และ GR ในไมโตคอนเดรียหัวใจของสัตว์ทดลองลดลง จนถึงค่าที่ไม่แตกต่างทางสถิติจากกลุ่มควบคุม แม้ว่า Q จะกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ข้างต้น (Shi et al.2019) ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าผลของสารต้านอนุมูลอิสระของ Q ใน cardiomyocytes ใน T2DM นั้นรับรู้ได้มากขึ้นด้วยความสามารถในการป้องกันการผลิตมากเกินไปของ ROS และผลที่ตามมาของการพัฒนา ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียมากกว่าการกระตุ้นระบบป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระ ก่อนหน้านี้ แสดงให้เห็นว่าการใช้ Q ช่วยเพิ่มความสามารถในการออกซิเดชันของไมโตคอนเดรีย และกิจกรรมของเอนไซม์บางตัวของวัฏจักรเครบส์ในหัวใจของหนูด้วย T2DM(Gorbenko et al.2019)

ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น ไมโทคอนเดรียเป็นสาเหตุหลัก แต่ไม่ใช่แหล่งเดียวของ ROS ในคาร์ดิโอไมโอไซต์ ปัจจัยสำคัญอันดับสองในการพัฒนาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในหัวใจของผู้ป่วยเบาหวานคือ NOX โดย NOX2 และ NOX4 เป็นไอโซฟอร์มของกล้ามเนื้อหัวใจหลัก หน้าที่หลักของ NOX คือการสร้าง ROS NOX2 ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นในพลาสมาเมมเบรนและมีส่วนร่วมในการส่งสัญญาณรีดอกซ์ภายในเซลล์ของตัวรับแองจิโอเทนซิน II และอื่นๆ ในขณะที่ NOX4 มีสัญญาณการแปลตำแหน่งไมโตคอนเดรียโดยเฉพาะและแสดงกิจกรรมที่เป็นส่วนประกอบ (Cave et al. 2005) มีการแสดงให้เห็นแล้วว่าการฟักตัวของ cardiomyocytes ของหนูที่มีโปรตีน glycated ในระยะแรกกระตุ้นการผลิต ROS ผ่านการกระตุ้น NOX2 ที่ขึ้นกับโปรตีนไคเนส C (PKC) ของ NOX2 (Zhang et al. 2006) นอกจากนี้ พบว่าหัวใจโตมากเกินไป พังผืด และการตายของเซลล์มีความสัมพันธ์กับ NOX2 ที่เพิ่มขึ้นในหัวใจของหนูที่มี DM ชนิดที่ 1 และ 2 (Ritchie et al.2007; Huynh et al.2013) แหล่งที่มาเพิ่มเติมของ ROS ใน cardiomyocytes คือ XO ซึ่งกระตุ้นการเกิดออกซิเดชันของ hypoxanthine และ xanthine ให้เป็นกรดยูริกโดยใช้ O เป็นตัวรับอิเล็กตรอนและผลิต O และ H2O2 ในกระบวนการ ถึงแม้ว่าการมีส่วนร่วมของปฏิกิริยา XO ต่อการพัฒนาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในโรคเบาหวานยังไม่ได้รับการศึกษาเพียงพอ สารยับยั้ง XO แสดงให้เห็นว่าช่วยปรับปรุงความผิดปกติของระบบหัวใจและหลอดเลือดในรูปแบบของภาวะหัวใจล้มเหลวที่เกิดจากการเว้นจังหวะ (Amado et al. 2005) ในการศึกษาของเรา T2DM ทำให้กิจกรรม NOX และ XO เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหัวใจของหนูทดลอง ในเวลาเดียวกัน การบริหาร Q อย่างอิสระจากขนาดปกติของกิจกรรมของเอนไซม์ จนถึงปัจจุบัน การศึกษาหลายชิ้นได้แสดงความสามารถของ Q ในการยับยั้งการทำงานของ NOX โดยลดการแสดงออกของหน่วยย่อยและป้องกันการกระตุ้นผ่านสิ่งเร้านอกเซลล์ กลไกที่สองสามารถรับรู้ได้โดยการลดฟอสโฟรีเลชั่นของหน่วยย่อยควบคุม p47phox เนื่องจากผลการยับยั้งของฟลาโวนอยด์ต่อ PKC (Redondo et al.2012; Jimenez et al. 2015) นอกจากนี้ O และเมแทบอไลต์ของมันเป็นที่รู้จักกันในการยับยั้งกิจกรรมของ XO ในลักษณะที่เลือก โดยสร้างโครงสร้างสามวงแหวนคอนจูเกตที่มีไซต์แอคทีฟและปฏิกิริยาพันธะไฮโดรเจนจำเพาะกับสิ่งตกค้างที่เกี่ยวข้องกับตัวเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ (Taka-Hama et al. 201l; Cao และคณะ2014).

โดยสรุป การศึกษาของเราพบว่า Q ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาช่วยลดการเกิดออกซิเดชันของอนุมูลอิสระในไมโตคอนเดรียของกล้ามเนื้อหัวใจในหนูที่มี T2DM ซึ่งจำกัดการสร้าง AOPP นอกจากนี้ Q ในขนาด 10 มก./กก. และ 50 มก./กก. ยังป้องกันการพัฒนาของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในหัวใจของหนูที่เป็นเบาหวานซึ่งลดกิจกรรม NOX และ XO ข้อมูลที่ได้รับบ่งชี้ว่าการใช้ Q อาจช่วยบรรเทาความเสี่ยงโรคหัวใจและหลอดเลือดใน T2DM