การประเมินเชิงปริมาณของการแทรกซึมของการอักเสบในการตรวจชิ้นเนื้อไตปลูกถ่ายโดยใช้การขยายสัญญาณไทราไมด์แบบมัลติเพล็กซ์และการเรียนรู้เชิงลึก
Mar 25, 2022
ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com
Meyke Hermsen1Valery Volk2Jan Hinrich Brasen2et al
เชิงนามธรรม
การทำงานของการปลูกถ่ายไตล่าช้า (DGF) เป็นปัจจัยเสี่ยงที่แข็งแกร่งสำหรับการพัฒนาของพังผืดคั่นระหว่างหน้าและการลีบของท่อ (IFTA) ในการปลูกถ่ายไต การประเมินเชิงปริมาณของ inflammatory inflrates ในการตรวจชิ้นเนื้อไตของผู้ป่วย DGF สามารถเปิดเผยเครื่องหมายคาดการณ์สำหรับการพัฒนา IFTA ในการศึกษานี้ เรารวมการขยายสัญญาณไทราไมด์มัลติเพล็กซ์ (mTSA) และโครงข่ายประสาทเทียม (CNNs) เพื่อประเมินสภาพแวดล้อมจุลภาคในการตรวจชิ้นเนื้อไตของผู้ป่วย DGF (n=22) ที่ถ่ายที่ 6 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย ผู้ป่วยถูกแบ่งชั้นเพื่อการพัฒนา IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">
Cistanche Deserticola ป้องกันโรคไต คลิกที่นี่เพื่อรับตัวอย่าง
บทนำ
การทำงานของการปลูกถ่ายไตล่าช้า (DGF) หลังการปลูกถ่ายไตมีหลายปัจจัยและส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับลักษณะผู้บริจาคและเวลาขาดเลือด โดยทั่วไป DGF อธิบายว่าจำเป็นต้องฟอกไตภายใน 7 วันหลังการปลูกถ่าย และเป็นปัจจัยเสี่ยงที่แข็งแกร่งสำหรับการบาดเจ็บที่ไตเรื้อรัง [1–3] องค์ประกอบคลาสสิกของการบาดเจ็บที่ไตเรื้อรังคือการมีพังผืดคั่นระหว่างหน้าและลีบของท่อ (IFTA) อย่างไรก็ตาม ไม่ใช่ว่าผู้ป่วย DGF ทุกรายจะมีความคืบหน้าในการพัฒนา IFTA และความสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่าง DGF และ IFTA ก็ยังไม่ค่อยเข้าใจ นี่เป็นครั้งแรกเนื่องจากความล่าช้าระหว่างเหตุการณ์ที่อาจเป็นสาเหตุและการลดลงของการทำงาน และประการที่สองเนื่องจากผลกระทบที่ผันแปรและซับซ้อนของตัวกระตุ้นที่อาจเกิดขึ้น เช่น การปฏิเสธและผลข้างเคียงของยา [1, 4] มีการอธิบายการมีอยู่ทั่วไปของ inflamation และมาโครฟาจจำเพาะในการศึกษาจำนวนมากว่าเป็นตัวทำนายการสูญเสียการต่อกิ่ง [5–8] อย่างไรก็ตาม กระบวนการทางพยาธิวิทยาที่แฝงอยู่นั้นยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ และการบาดลึกในระดับสูงไม่ได้นำไปสู่การสูญเสียการต่อกิ่งในระยะยาวอย่างสม่ำเสมอ เป็นผลมาจากสิ่งเร้าจากสิ่งแวดล้อม มาโครฟาจได้รับหน้าที่พิเศษและโพลาไรซ์เป็นฟีโนไทป์ที่แตกต่างกัน การศึกษาจำนวนมากเสนอแนะว่าชนิดย่อยของมาโครฟาจจำเพาะ (มาโครฟาจที่ถูกกระตุ้นอีกทางหนึ่ง) เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงรูปแบบเนื้อเยื่อโดยการกระตุ้นการซ่อมแซมเนื้อเยื่อหรือการเกิดพังผืด โพลาไรเซชันไปสู่ฟีโนไทป์ของการเปลี่ยนแปลงเนื้อเยื่อ (บางครั้งโปรไฟโบรติก) เป็นที่ทราบกันดีว่าขึ้นอยู่กับสิ่งเร้าทางสิ่งแวดล้อมที่หลากหลาย ท่ามกลางสิ่งอื่นที่มีให้โดยไทป์ย่อยของ T-helper lymphocyte [9–11] การประเมินประชากรเซลล์ T-helper ในการต่อกิ่งในขณะที่ DGF เปิดเผย T-helper 1 ชนิดย่อยที่แพร่หลาย แต่ยังไม่มีการศึกษาความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ของการปลูกถ่ายอวัยวะหรือความก้าวหน้าของ IFTA จนถึงตอนนี้ [12] การประเมินที่ครอบคลุมของสภาวะแวดล้อมจุลภาคที่เจาะจงซึ่งเน้นไปที่มาโครฟาจและชุดย่อยของเซลล์ T-helper ในกลุ่มผู้ป่วยที่คัดเลือกมาอย่างดีอาจให้ข้อมูลเชิงลึกว่าทำไมผู้ป่วย DGF บางราย แต่ไม่ใช่ทุกรายที่พัฒนาไปสู่การพัฒนา IFTA
อย่างไรก็ตาม การตรวจสอบอย่างละเอียดของ infammatory infaltrates นั้นถูกขัดขวางโดยข้อจำกัด (ทางเทคนิค) หลายประการ อิมมูโนฮิสโตเคมีแบบดั้งเดิม (IHC) และเทคนิคอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์สนับสนุนการแสดงภาพเครื่องหมายเซลล์จำนวนจำกัดในส่วนเนื้อเยื่อเดียว ไม่จำเป็นต้องมีการแบ่งส่วนย่อยของชิ้นส่วนเนื้อเยื่อเล็กๆ ที่มีคุณค่า เช่น การตัดชิ้นเนื้อไตเป็นลำดับ และการตีความความสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ในส่วนต่างๆ นั้นทำได้ยาก นอกจากนี้ การประเมินเชิงปริมาณของการแทรกซึมของ inflammatory โดยการประมาณค่าด้วยสายตายังมาพร้อมกับระดับความแปรปรวนของผู้สังเกตการณ์ในระดับที่มีนัยสำคัญ [13] เทคนิคการประมวลผลภาพแบบดั้งเดิม เช่น การกำหนดจุดพิกเซล ลุ่มน้ำ และการแบ่งส่วนตามสัณฐานวิทยา อาศัยความรู้เดิมเกี่ยวกับการแสดงเซลล์ทางสัณฐานวิทยาและความเข้มของคราบเนื้อเยื่อตลอดทั้งชุดข้อมูล [14–16] ดังนั้น วิธีการเหล่านี้จึงมักขาดความคงทนต่อการเปลี่ยนแปลงของภาพทางชีววิทยาและทางเทคนิค และแปลเป็นชุดข้อมูลใหม่หรือข้อมูลภายนอกได้ไม่ดี การเพิ่มขึ้นของพยาธิวิทยาดิจิทัลได้เร่งการพัฒนาวิธีการทางเลือกสำหรับการประเมินภาพทั้งสไลด์ (WSI) [17, 18] แบบจำลองการเรียนรู้เชิงลึก โดยเฉพาะโครงข่ายประสาทเทียม (Convolutional Neural Network - CNN) ได้พิสูจน์แล้วว่าสามารถแบ่งส่วนและตรวจหาโครงสร้างทางชีววิทยาที่เกี่ยวข้องในสไลด์ทางจุลพยาธิวิทยาได้ [19] เทคนิคเหล่านี้มีศักยภาพที่จะเปลี่ยนจากการประมาณค่าภาพตามอัตวิสัยและการประมวลผลภาพแบบดั้งเดิมไปเป็นการตรวจจับเซลล์ที่แม่นยำ ตรงตามวัตถุประสงค์ และทำซ้ำได้
จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการพัฒนาวิธีการสำหรับการประเมินเชิงปริมาณเชิงวัตถุของเครื่องหมายเซลล์ที่มีการอักเสบหลายตัว โดยหลีกเลี่ยงความจำเป็นในการแบ่งส่วนสไลด์แบบอนุกรมอย่างครอบคลุม ในการดำเนินการดังกล่าว เราได้รวม IHC แบบมัลติเพล็กซ์ การสร้างภาพแบบหลายสเปกตรัม และแบบจำลองการเรียนรู้เชิงลึก เพื่อแสดงให้เห็นถึงความเกี่ยวข้องของเทคนิคเหล่านี้ เราศึกษาความสัมพันธ์ของสภาพแวดล้อมจุลภาคที่ติดเชื้อ ซึ่งวัดปริมาณโดยแบบจำลองการเรียนรู้เชิงลึก กับการพัฒนา IFTA ในการตรวจชิ้นเนื้อตรวจวินิจฉัยผู้ป่วย DGF
สารสกัดจาก cistanche รักษาโรคไต
วัสดุและวิธีการ
เพื่อประเมินสภาวะแวดล้อมจุลภาคในการตรวจชิ้นเนื้อไตของผู้ป่วย DGF เราทำ multiplex IHC ในการตรวจชิ้นเนื้อเพื่อเฝ้าระวังที่ 6 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย ผู้ป่วยถูกแบ่งชั้นเพื่อการพัฒนา IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">
ตัวอย่างเนื้อเยื่อ
เราใช้การตรวจชิ้นเนื้อแบบสอดส่องดูแลจากผู้รับการปลูกถ่ายไตที่ Hannover Medical School (ฮันโนเวอร์ ประเทศเยอรมนี) ซึ่งได้มาในบริบทของโครงการตรวจชิ้นเนื้อเพื่อเฝ้าระวังในอนาคต เกณฑ์การรวมคือ: การเกิด DGF (กำหนดเป็น<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">
การประเมิน IFTA
ขอบเขตของการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้า (ci) และการฝ่อของท่อ (ct) (IFTA) ที่ 6 สัปดาห์และ 6 เดือน แสดงออกโดยใช้ระบบการจัดระดับรอยโรคของแบมฟ์ [24] ได้มาจากรายงานพยาธิวิทยา เพื่อประเมินความสัมพันธ์ระหว่างการแทรกซึมของรังสีในระยะแรกและการพัฒนา IFTA โดยละเอียดยิ่งขึ้น สไลด์ที่ย้อมด้วย PAS ทั้งหมดจะถูกแปลงเป็นดิจิทัลสำหรับการตรวจสอบอีกครั้งโดยใช้เครื่องสแกนสไลด์ดิจิตอล Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, ฮังการี) ที่มี 20 เครื่อง × วัตถุที่ความละเอียด 0.24 μm/ พิกเซล PAS WSI ของจุดเวลาทั้งสอง (6 สัปดาห์และ 6 เดือน) ได้รับคะแนนสำหรับขอบเขตของ IFTA (เปอร์เซ็นต์ของพื้นที่ผิว โดยมีช่วงเวลา 10 เปอร์เซ็นต์) โดยนักพยาธิวิทยาโรคไตสามคน คะแนน IFTA เฉลี่ยของนักพยาธิวิทยาถูกใช้เป็นคะแนนสุดท้ายในการคำนวณการเปลี่ยนแปลงใน IFTA ระหว่าง 6 สัปดาห์ถึง 6 เดือนหลังการปลูกถ่าย ผู้ป่วยถูกแบ่งชั้นโดยคะแนน IFTA ที่เพิ่มขึ้นอย่างสมบูรณ์ที่ร้อยละ 10 หรือมากกว่า (n=13) และไม่มีหรือ<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">
นอกจากนี้ คะแนนรอยโรคของแบมฟ์ยังถูกเปรียบเทียบระหว่างจุดเวลาโดยใช้การทดสอบอันดับที่ลงนามโดย Wilcoxon สิ่งนี้เผยให้เห็นความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างการตรวจชิ้นเนื้อเป็นเวลา 6 สัปดาห์และ 6 เดือนสำหรับหมวดหมู่ Banff ti (p=0.017), ci (p=0.004) และ ct (p=0}.011) .
การย้อมสี TSA แบบมัลติเพล็กซ์
เราดำเนินการ IHC แบบมัลติเพล็กซ์โดยใช้ mTSA เพื่อแสดงภาพเครื่องหมายของเซลล์หลายตัวในการตรวจชิ้นเนื้อ 6 สัปดาห์ หลังจากการฟักไข่ด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิและทุติยภูมิ เนื้อเยื่อได้รับการบำบัดด้วยไทราไมด์ที่ติดฉลากฟลูออเรสเซนต์ เปอร์ออกซิเดสหัวไชเท้าจากแอนติบอดีทุติยภูมิกระตุ้นการก่อตัวของอนุมูลอิสระของไทราไมด์ อนุมูลไทราไมด์จับกับไทโรซีนตกค้างบนแอนติเจนอย่างโควาเลนต์ การจับอย่างถาวรนี้อนุญาตให้เอาสารเชิงซ้อนของแอนติบอดีปฐมภูมิ-ทุติยภูมิออกด้วยความร้อนในขณะที่คงสภาพการสะสมของไทราไมด์ที่เป็นฟลูออเรสเซนต์ไว้ [25] สิ่งนี้ทำให้เกิดการฟักไข่อย่างต่อเนื่องตามมาด้วยแอนติบอดีเพิ่มเติมจากสปีชีส์เดียวกันที่ต้านกับแอนติเจนเป้าหมาย
mTSA ถูกดำเนินการบนสไลด์สองครั้งติดต่อกันจากการตรวจชิ้นเนื้อสำหรับการเฝ้าระวัง 6 สัปดาห์ เราพัฒนาแผง mTSA สองแผงเพื่อประเมินการอักเสบแทรกซ้อนและขอบเขตของเส้นเลือดฝอยในช่องท้องในกลุ่มผู้ป่วยของเรา แผงที่ 1 มีแอนติบอดีต้าน CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 และ CD34 แผง II ถูกใช้เพื่อตรวจสอบเซลล์ T-helper และโพลาไรเซชันของมาโครฟาจโดยใช้แอนติบอดีต้าน CD4, Tbet, GATA3, CD68 และ CD163 ข้อมูลจำเพาะของแอนติบอดี การเจือจาง และลำดับของการย้อมสีแสดงไว้ในตารางเสริมที่ 1 สไลด์ทั้งหมดถูกกำจัดพาราฟินในไซลีน อบแห้งในเอธานอล 95 เปอร์เซ็นต์ ล้างในน้ำประปา และต้มเพื่อดึงเอพิโทปใน 10x เจือจางไตรสโบเรต-EDTA (TBE 10x) , 0658, VWR Life Sciences, US) บัฟเฟอร์ หลังจากเย็นตัวลง สไลด์ถูกล้างด้วยสารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกซิเดส 3 เปอร์เซ็นต์สำหรับการปิดกั้นเปอร์ออกซิเดสภายในและล้างด้วยบัฟเฟอร์บัฟเฟอร์ทริสบัฟเฟอร์ด้วย 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 (822184, Merck KGaA, เยอรมนี) (TBS-T) การปิดกั้นโปรตีนถูกดำเนินการโดยใช้ TBS-T กับ 1 เปอร์เซ็นต์ของโบวีนซีรัมอัลบูมิน (BSA) (mTSA ขั้นตอนที่ 1) แอนติบอดีปฐมภูมิถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หรือข้ามคืนที่สี่องศาเซลเซียส (mTSA ขั้นตอนที่ 2) หลังจากการล้างใน TBS-T สไลด์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกต HRP (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, The Netherlands) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (mTSA ขั้นตอนที่ 3) ถัดไป TSA ถูกดำเนินการโดยใช้ Opal TSA fluorophores จาก Opal 7-color Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, US) (mTSA ขั้นตอนที่ 4) (fluorophores และแอนติบอดีที่เกี่ยวข้องของพวกมันแสดงอยู่ในตารางเสริม 1) สารเชิงซ้อนของแอนติบอดี-TSA ถูกกำจัดออกด้วยรอบการเดือดในบัฟเฟอร์ TBE (mTSA ขั้นตอนที่ 5) ทำซ้ำ mTSA ขั้นตอนที่ 1-5 จนกว่าสไลด์จะถูกย้อมด้วยแอนติบอดีทั้งหมดจากแผงที่เกี่ยวข้อง สไลด์ถูกปกคลุมด้วย fluoromount-G ด้วย DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, US)
herba cistanche
การตรวจสอบความถูกต้อง TSA แบบมัลติเพล็กซ์
รอบการเดือดซ้ำๆ อาจส่งผลต่อความสัมพันธ์ของอีพิโทปเป้าหมาย แอนติบอดีบางตัวแสดงรูปแบบการย้อมสีที่อ่อนแอกว่าหลังจากที่เนื้อเยื่อถูกต้มหลายครั้ง แอนติบอดีอื่นๆ ต้องการรอบการเดือดมากขึ้นเพื่อให้ได้ความเข้มข้นของการย้อมสีที่เหมาะสมที่สุด และบางชนิดจะไม่ได้รับผลกระทบเลย เราประเมินผลกระทบนี้สำหรับแอนติบอดีทั้งหมดโดยใช้โครโมจีนิก IHC บนเนื้อเยื่อต่อมทอนซิลควบคุม FFPE สำหรับแอนติบอดีที่ทดสอบทุกตัว (n=9) หกส่วนถูกตัด (หนา 4 ไมโครเมตร) สไลด์ทั้งหมดถูกกำจัดพาราฟินในไซลีน อบแห้งในเอธานอล 95 เปอร์เซ็นต์ ล้างในน้ำประปา และต้มเพื่อดึงอีพิโทปใน TBE เจือจาง 10 เท่า (รอบการเดือดที่ 1) หลังจากเย็นตัวลง หนึ่งสไลด์ต่อแอนติบอดีที่ทดสอบแล้วจะถูกเก็บไว้ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) สไลด์ที่เหลือต้มอีกครั้ง รอบนี้ทำซ้ำห้าครั้ง ต่อมาล้างสไลด์ทั้งหมดด้วยสารละลายไฮโดรเจนเปอร์ออกซิเดส 3 เปอร์เซ็นต์ แล้วล้างด้วย PBS แอนติบอดีปฐมภูมิ (ตารางเสริม 1) ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการฟักตัว สไลด์ถูกล้างใน PBS สไลด์ที่ย้อมด้วยแอนติบอดีต้าน CD68, ทิเบต และ GATA3 จำเป็นต้องมีการฟักเพิ่มเติมด้วยการบล็อกหลังแอนติบอดี (PAB) เป็นเวลา 15 นาที (การบล็อก VWRKDPVB, Immunologic, เนเธอร์แลนด์) หลังจากการฟักไข่ สไลด์ถูกล้างใน PBS และบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตด้วย HRP (ตามหลัง PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, เนเธอร์แลนด์ สำหรับคนอื่น ๆ ดูตารางเสริมของแอนติบอดีทุติยภูมิที่ 1) การแสดงภาพดำเนินการโดยใช้ 3,3′- diaminobenzidine (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, The Netherlands) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นในรูปที่ 1 เพิ่มเติม จากผลลัพธ์เหล่านี้ เรากำหนดลำดับแอนติบอดีที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทดลอง mTSA ตามที่แสดงไว้ในตารางเสริม 1
หาก epitopes ที่น่าสนใจมีการแปลร่วมกัน เงินฝาก tyramide อาจรบกวนซึ่งกันและกัน เพื่อทดสอบการยับยั้ง steric เราใช้สไลด์เนื้อเยื่อควบคุมต่อมทอนซิลและย้อมสีเหล่านี้ด้วยแผง mTSA ของเรา การแสดงออกของแอนติบอดีใน mTSA ถูกนำมาเปรียบเทียบกับการแสดงออกในสไลด์สีเดียว ซึ่งผ่านรอบการเดือดจำนวนเท่ากัน เราไม่ได้สังเกตความแตกต่างในรูปแบบการย้อมสีระหว่างสไลด์ที่ย้อมเดี่ยวและสีมัลติเพล็กซ์ (ตัวอย่างที่รวมจากแผง I, รูปที่ 2 และ 3) เพิ่มเติม แอนติบอดีหลักทั้งหมดใน mTSA ถูกใช้ในการเจือจางแบบเดียวกับที่ใช้สำหรับโครโมเจก IHC ความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ถูกปรับให้เหมาะสมโดยการปรับการเจือจางของสารละลาย TSA
การถ่ายภาพ TSA แบบมัลติเพล็กซ์
การถ่ายภาพหลายสเปกตรัมดำเนินการโดยใช้ Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, US) โดยมีวัตถุประสงค์ 20x ที่ความละเอียด 0.49 μm ต่อพิกเซล และใช้ DAPI, FITC, CY3, Texas Red และ Cy5 สเปกตรัมลูกบาศก์ ระบบ Vectra ช่วยให้สามารถเลือกพื้นที่ได้ด้วยตนเองสำหรับการรับคลื่นความถี่หลายสเปกตรัม ซึ่งระบบจะแบ่งส่วนย่อยออกเป็นไทล์ (รูปที่ 1.1) ในภายหลัง สเปกตรัมของการเรืองแสงอัตโนมัติและ Opal TSA fluorophores ทั้งหมดได้รับการบันทึกล่วงหน้าใน "ห้องสมุด" สเปกตรัมโดยใช้ Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6 (Akoya Biosciences สหรัฐอเมริกา). ไลบรารีสเปกตรัมเปิดใช้งานการสลายไทล์มัลติเพล็กซ์เป็นไทล์เดี่ยวหลายอันที่แสดงถึงการมีส่วนร่วมของแต่ละ fluorophore ("unmixing") สิ่งนี้ส่งผลให้ไทล์โมโนโครม หลายแชนเนล แต่ละแชนเนลสอดคล้องกับ fluorophore เดียว และด้วยเหตุนี้ แอนติบอดี (รูปที่ 1.2)
การแปลงเป็น IHC . ความสว่างประดิษฐ์
ตามพิกัดที่เก็บไว้ ไทล์ถูกต่อเข้าด้วยกันเพื่อสร้าง WSI แบบหลายช่องสัญญาณโดยใช้สคริปต์หลามที่กำหนดเอง (รูปที่ 1.3) แชนเนลที่เป็นตัวแทนของสัญญาณ DAPI (IDAPI) และแชนเนลที่เป็นตัวแทนของแอนติบอดีตัวใดตัวหนึ่ง (IIHC) ถูกแปลงเป็นการย้อม hematoxylin เทียมและการย้อมสี DAB ตามลำดับ (รูปที่ 1.4 และ 1.5) ตามโครมาติกฮีมาทอกซิลินและ DAB Cx ที่รู้จัก พิกัด Cy หลังจากการแปลงฮิว-อิ่มตัว-ความหนาแน่น (HSD) ได้เวกเตอร์รอยเปื้อนในการศึกษาก่อนหน้านี้ [26, 27] เวกเตอร์รอยเปื้อนเหล่านี้ถูกใช้ในการคำนวณค่าสีแดง-เขียว-น้ำเงินสำหรับ IHC ด้านความสว่างเทียม (รูปที่ 1.5) ดังนี้:
ด้วย CR จะดูดซับแสงของสีย้อมในส่วนสีแดงของสเปกตรัม ค่าสำหรับ B และ G ถูกคำนวณในลักษณะเดียวกัน
การวิเคราะห์ภาพ
ภูมิภาคที่น่าสนใจ (ROI)
ภูมิภาคที่น่าสนใจ (ROI) ได้รับการใส่คำอธิบายประกอบสำหรับทุกกรณีในกลุ่มประชากรตามรุ่นโดยใช้ซอฟต์แวร์แพลตฟอร์มการวิเคราะห์สไลด์อัตโนมัติ (ASAP; เวอร์ชัน 1.9 ซึ่งพร้อมใช้งานเป็นซอฟต์แวร์โอเพนซอร์สบน GitHub) ROI เหล่านี้ประกอบด้วยเยื่อหุ้มสมอง tubulointerstitium ซึ่งไม่รวมแคปซูล glomeruli และหลอดเลือดแดง เนื่องจาก inflammation ในบริเวณ subcapsular ของไตถือว่าไม่เฉพาะเจาะจงในพยาธิวิทยาของการปลูกถ่าย การตรวจชิ้นเนื้อในการศึกษานี้จึงถูกวิเคราะห์เบื้องต้นโดยไม่รวมบริเวณ subcapsular (กำหนดเป็น 400 µm ใต้แคปซูล) ประการที่สอง เราวิเคราะห์ซ้ำรวมถึงบริเวณ subcapsular ตัวอย่างภาพของ ROI จะรวมอยู่ในรูปที่ 4 เพิ่มเติม
การตรวจหาลิมโฟไซต์ CNN I
อิมเมจ IHC ความสว่างประดิษฐ์ที่แสดงการย้อมสี CD3, CD4, CD8 และ CD20 ถูกวิเคราะห์โดยใช้ CNN ที่มีอยู่ด้วยสถาปัตยกรรม U-Net [22, 28] เครือข่ายนี้ได้รับการออกแบบมาโดยเฉพาะสำหรับการตรวจหาเครื่องหมายลิมโฟไซต์ของไซโตพลาสมาใน IHC ประสิทธิภาพของ CNN สามารถแสดงได้อย่างแม่นยำ การเรียกคืน และคะแนน F1- โดยที่:
CNN มีความแม่นยำถึง {{0}}.76, การเรียกคืนของ 0.79 และคะแนน F1-เท่ากับ 0.78 ในชุดทดสอบ ที่ใช้ในกระดาษต้นฉบับซึ่งประกอบด้วย IHC WSI แบบดั้งเดิม การตรวจหาเซลล์บวกแต่ละเซลล์จำเป็นต้องมีการกำหนดเอาต์พุตของ CNN ตามด้วยการประมวลผลภายหลัง เนื่องจากการย้อมสี CD3 ในแผง mTSA นั้นแข็งแกร่งกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับ CD4, CD8 และ CD20 เกณฑ์การตรวจจับวัตถุที่ต่ำกว่าจึงถูกใช้สำหรับสามส่วนหลัง (0.4) และเกณฑ์การตรวจจับวัตถุดั้งเดิมสำหรับ CD3 (0.7) เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ CNN เกี่ยวกับ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ในการศึกษานี้ ใช้ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ 4 ตัว (CD8 และ CD20 จากผู้ป่วยสองราย) เป็นชุดทดสอบในการศึกษานี้ คำอธิบายประกอบแบบจุด (n=1115) ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ ASAP หลังจากใช้เครือข่ายแล้ว คะแนนความแม่นยำ การเรียกคืน และ F1- จะถูกคำนวณเพื่อประเมินประสิทธิภาพของ CNN การตรวจพบถือเป็นผลบวกที่แท้จริง หากพบว่าภายใน 4 ไมโครเมตร (เส้นผ่านศูนย์กลางของลิมโฟไซต์เฉลี่ย) จากคำอธิบายประกอบความจริงภาคพื้นดิน เมื่อพบการตรวจจับสองครั้งภายในช่วง 4 µm เฉพาะการตรวจจับที่ใกล้เคียงที่สุดกับคำอธิบายประกอบเท่านั้นที่ถือว่าเป็นผลบวกที่แท้จริง ต่อจากนั้น การตรวจจับลิมโฟไซต์ CNN I ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ IHC WSI ความสว่างเทียมทั้งหมดที่แทนเครื่องหมายลิมโฟไซต์ของไซโตพลาสมา (CD3, CD4, CD8 และ CD20)
การตรวจหาลิมโฟไซต์ CNN II
การวิเคราะห์ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ที่มีรูปแบบการย้อมสีนิวเคลียร์ (ดังที่นำเสนอโดยช่อง T-bet และ GATA3) ที่เป็นตัวแทนของ DAPI และ CD4 ถูกเลือกให้รวมกันเป็น WSI (4) หนึ่งรายการ สเตนเวคเตอร์ที่ได้มาในการศึกษาก่อนหน้านี้ถูกใช้เพื่อทำให้สีของสัญญาณ DAPI เป็นสีน้ำเงิน (ฮีมาทอกซิลิน) และสีน้ำตาลสัญญาณ CD4 (DAB) ทำให้เกิดสีเทียม IHC WSI (5)
จำเป็นต้องมีการฝึกอบรม การตรวจสอบ และการทดสอบซีเอ็นเอ็นใหม่ เพื่อจุดประสงค์นี้ ไต ต่อมทอนซิล และเนื้อเยื่อควบคุม FFPE ของไตเก้าสไลด์ถูกตัดออก สไลด์เหล่านี้ถูกย้อมด้วย IHC ด้วยสารต่อต้านทิเบต (โคลน 4B1{{10}}, 14-5825-82, วิทยาศาสตร์เทอร์โมฟิชเชอร์, สหรัฐอเมริกา) และสารต้าน GATA3 (โคลน L50-823, CM -405B, Biocare Medical, เนเธอร์แลนด์) แอนติบอดี สไลด์ถูกแปลงเป็นดิจิทัลโดยใช้เครื่องสแกนสไลด์ดิจิตอล Pannoramic 250 Flash II ที่ความละเอียด 0.12 ไมโครเมตร/พิกเซล ผู้สังเกตการณ์สองคนสร้างคำอธิบายประกอบจุด 5726 ในภูมิภาคต่างๆ โดยใช้ซอฟต์แวร์ ASAP คำอธิบายประกอบจากสไลด์ทั้งห้าถูกใช้สำหรับการฝึกสถาปัตยกรรม U-Net CNN โดยใช้แพตช์ 256 × 256 พิกเซลที่มีขนาดพิกเซล 0.49 μm/ พิกเซล WSI สองตัวถูกใช้เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของ CNN และสำหรับกำหนดเกณฑ์การตรวจจับวัตถุ (0.4) ประสิทธิภาพของ CNN ใน IHC WSI แบบดั้งเดิมได้รับการประเมินในชุดการทดสอบที่ระงับของ IHC WSI สองชุด ประสิทธิภาพของ CNN เกี่ยวกับ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ได้รับการประเมินในชุดการทดสอบรองที่ประกอบด้วย IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ 4 แบบ (ทิเบตและ GATA3 จากผู้ป่วยสองราย) พร้อมหมายเหตุประกอบ 1082 จุด ความแม่นยำ การเรียกคืน และคะแนน F1- คำนวณเพื่อประเมินประสิทธิภาพของชุดการทดสอบทั้งสองชุด การตรวจจับถือเป็นผลบวกที่แท้จริง หากพบว่าภายใน 4 µm จากหมายเหตุประกอบความจริงพื้นๆ เมื่อพบการตรวจจับสองครั้งภายในช่วง 4 µm เฉพาะการตรวจจับที่ใกล้เคียงที่สุดกับคำอธิบายประกอบเท่านั้นที่ถือว่าเป็นผลบวกที่แท้จริง ต่อจากนั้น การตรวจจับลิมโฟไซต์ CNN II ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ IHC WSI ด้านสว่างเทียมทั้งหมดที่แทนเครื่องหมายนิวเคลียร์ (ลิมโฟไซต์) (ทิเบตและ GATA3)
การตรวจจับมาโครฟาจ CNN
ตรงกันข้ามกับการตรวจหาลิมโฟไซต์ การระบุแมคโครฟาจแต่ละตัวไม่ชัดเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในฉากคลัสเตอร์ สามารถคาดหวังระดับความแปรปรวนของผู้สังเกตการณ์ที่มีนัยสำคัญได้ ดังนั้น จึงมีการใช้กรณีและคำอธิบายประกอบของมนุษย์จำนวนมากขึ้นในการฝึก CNN ที่สามโดยเฉพาะสำหรับการตรวจหา CD68 plus และ CD163 plus macrophages รวบรวมสไลด์ที่ย้อมด้วย IHC (n=111) จากเนื้อเยื่อไตดั้งเดิมและการปลูกถ่าย การย้อมสี IHC ถูกดำเนินการโดยใช้แอนติ-CD68 (โคลน PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Denmark หรือโคลน KP1, M0876, Dako, เดนมาร์ก) หรือแอนติ-CD163 (โคลน MRQ แอนติบอดี -26 หรือ 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) สไลด์ IHC ถูกแปลงเป็นดิจิทัลโดยใช้เครื่องสแกนสไลด์ดิจิทัลแบบพาโนรามา 250 Flash II หรือ Aperio AT2 Slide Scanner (Leica Biosystems, Wetzlar เยอรมนี) ที่ความละเอียด 0.24 หรือ 0 .25 μm/พิกเซล ตามลำดับ ผู้สังเกตการณ์สี่คนสร้างหมายเหตุประกอบจุด 37,709 จุดใน ROI หลายรายการใน WSI โดยใช้โปรโตคอลสำหรับหมายเหตุประกอบมาโครฟาจ ซึ่งตกลงกันไว้หลังจากการทดลองนำร่องครั้งแรก คำอธิบายประกอบจาก 101 สไลด์ถูกใช้สำหรับการฝึกอบรมสถาปัตยกรรม YoloV2 CNN [29] Yolo เหมาะอย่างยิ่งสำหรับงานที่มุ่งเป้าไปที่งานการตรวจจับ เครือข่ายประกอบด้วยเลเยอร์ที่บิดเบี้ยวเจ็ดชั้น ได้รับการฝึกบนแพทช์ 256 × 256 พิกเซลที่สกัดที่ความละเอียด 0.98 ไมโครเมตร/พิกเซลพร้อมกรอบล้อมรอบ 21 ไมโครเมตร (ตามขนาดมาโครฟาจเฉลี่ย) ใช้ WSI สิบรายการเพื่อตรวจสอบความถูกต้องของ CNN และสำหรับกำหนดเกณฑ์การตรวจจับวัตถุ (0.45) และพารามิเตอร์การปราบปรามที่ไม่สูงสุด (0.05) ประสิทธิภาพของ CNN ใน IHC WSI แบบดั้งเดิมได้รับการประเมินในชุดการทดสอบที่ระงับไว้ 10 IHC WSI ประสิทธิภาพของ CNN เกี่ยวกับ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ได้รับการประเมินในชุดการทดสอบรองที่ประกอบด้วย IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์สี่ชุด (CD68 และ CD163 จากผู้ป่วยสองราย) ที่มีหมายเหตุประกอบ 1033 จุด คะแนนความแม่นยำ การเรียกคืน และ F1 ถูกคำนวณเพื่อประเมินประสิทธิภาพของชุดการทดสอบทั้งสองชุด การตรวจจับถือเป็นผลบวกที่แท้จริง หากพบว่าภายใน 21 µm (เส้นผ่านศูนย์กลางของมาโครฟาจเฉลี่ย) จากหมายเหตุประกอบความจริงภาคพื้นดิน เมื่อพบการตรวจจับเพิ่มเติมภายในช่วง 21µm เฉพาะการตรวจจับที่ใกล้เคียงที่สุดกับคำอธิบายประกอบเท่านั้นที่ถือว่าเป็นผลบวกที่แท้จริง ต่อจากนั้น การตรวจจับมาโครฟาจ CNN ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ IHC WSI ของช่องแสงประดิษฐ์ทั้งหมดที่แสดงเครื่องหมายมาโครฟาจ (CD68 และ CD163)
ซิสแทนเช่ ทูโบโลซ่า เทสโทสเตอโรน
บวกสองเท่า
ค่าความเป็นบวกของเซลล์สำหรับเครื่องหมายสองตัว (ค่าบวกสองเท่า) ได้รับการประเมินโดยการกำหนดจำนวนพิกเซลระหว่างการตรวจจับเซลล์ในช่องต่างๆ หากระยะห่างระหว่างการตรวจหาลิมโฟไซต์สองครั้งเท่ากับ<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">
หมายเลขเซลล์ถูกคำนวณภายใน ROI และความหนาแน่นของเซลล์ขึ้นอยู่กับจำนวนเซลล์และพื้นที่ของ ROI ที่ทำหมายเหตุประกอบไว้
ความสัมพันธ์เชิงพื้นที่
การตรวจหาเซลล์อัตโนมัติใน WSI ช่วยให้สามารถตรวจสอบความสัมพันธ์เชิงพื้นที่ระหว่างเซลล์ได้ ระยะทางที่สั้นที่สุดเฉลี่ยถูกกำหนด (ในพื้นที่ยกเว้นบริเวณ subcapsular) สำหรับเซลล์ CD68 plus และ CD3 plus , CD3 plus CD8 plus และ CD20 plus เซลล์ใน WSI ของแผง I สำหรับทั้งสองกลุ่มผู้ป่วย และระหว่าง CD163 plus เซลล์และ CD4 plus , CD4 plus Tbet plus , และ CD4 plus GATA3 plus ใน WSI สำหรับกลุ่มผู้ป่วยทั้งสองกลุ่ม
ขอบเขตของเส้นเลือดฝอย Per
เพื่อประเมินขอบเขตของเส้นเลือดฝอยในช่องท้อง WSI แบบไม่ผสมซึ่งเป็นตัวแทนของช่อง CD34 ถูกวิเคราะห์ในฟิจิ (ImageJ เวอร์ชัน 2.00 สหรัฐอเมริกา มาโครและปลั๊กอิน: "เปิดและทำซ้ำ", "โดยเร็ว" ROI Reader") [30]. พิกเซลที่เป็นบวกถูกกำหนดผ่านเกณฑ์อัตโนมัติและต่อมาแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของจำนวนพิกเซลทั้งหมดภายใน ROI
การวิเคราะห์ทางสถิติ
ความหนาแน่นของประชากรเซลล์ต่อไปนี้คำนวณในการตรวจชิ้นเนื้อ 6 สัปดาห์: T-lymphocytes (CD3 plus ), cytotoxic T-lymphocytes (CD3 plus CD8 plus ), B-lymphocytes (CD20 plus ), macrophages (CD68 plus , แผง I และ II), มาโครฟาจแบบโพลาไรซ์ (CD68 plus CD163 plus , CD163 plus ), T-helper 1 lymphocytes (CD4 plus Tbet plus ) และ T-helper 2 lymphocytes (CD4 plus GATA3 plus ) ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของสเปียร์แมนคำนวณเพื่อประเมินว่ามีความสัมพันธ์ระหว่างความหนาแน่นของลิมโฟไซต์ของ T-helper 1 และ T-helper 2 หรือไม่ (CD4 บวก Tbet plus , CD4 บวก GATA3 บวก ) และความหนาแน่นของมาโครฟาจแบบโพลาไรซ์ (CD68 บวก CD163 บวก หรือ CD163 บวก) เราสังเกตสัญญาณ CD68 (fluorophore 540 nm) ใน IHC เทียม CD4 (ฟลูออโรฟอร์ 520 นาโนเมตร) ของแผง I ดังนั้น เราจึงรายงานความหนาแน่นของเซลล์เพิ่มเติมสำหรับเซลล์ CD3 บวก CD8− ในการประเมินความแตกต่างระหว่างกลุ่มผู้ป่วยที่มีผลลัพธ์ IFTA ต่างกัน เรารายงานค่ามัธยฐาน ค่าต่ำสุด และค่าความหนาแน่นของเซลล์สูงสุดต่อกลุ่ม ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในความหนาแน่นของเซลล์และขอบเขตของเส้นเลือดฝอยในช่องท้อง (กำหนดเป็นเปอร์เซ็นต์พิกเซลบวกของ CD34-) ระหว่างกลุ่มได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ U ของ Mann–Whitney สำหรับตัวอย่างอิสระ ไม่ว่าผู้ป่วยที่มีผลลัพธ์ IFTA ต่างกันแสดง CD3 บวก CD8−/CD3 บวก CD8 บวกอัตราส่วนเซลล์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ ถูกประเมินโดยใช้ t-test สำหรับตัวอย่างอิสระ ความแตกต่างระหว่างกลุ่มผู้ป่วยในความสัมพันธ์เชิงพื้นที่ของเซลล์ CD68 plus และ CD163 plus กับเซลล์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ ได้รับการประเมินสำหรับความสำคัญโดยใช้การทดสอบ U ของ Mann–Whitney สำหรับตัวอย่างอิสระ
ผลลัพธ์
การตรวจหาเซลล์บวก IHC ตาม CNN
เพื่อที่จะนำ CNN ที่มีอยู่มาใช้ ซึ่งเดิมพัฒนาขึ้นสำหรับกล้องจุลทรรศน์ที่มีความสว่างสูง ภาพ mTSA fluorescence จะถูกแปลงเป็นภาพที่มีความสว่างเทียม ตัวอย่างของบริเวณที่ย้อมด้วย mTSA ที่มีภาพ IHC ความสว่างประดิษฐ์ที่สอดคล้องกันจะรวมอยู่ในรูปที่ 2 ตัวอย่างของ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ที่แสดงไว้ในรูปที่ 4 WSI แบบหลายความละเอียดสามารถเปิดและดูได้ในการดูสไลด์ดิจิทัล ซอฟต์แวร์ เช่น ASAP และ Aperio ImageScope [v12.4.3.5008] ตามที่แสดงในรูปที่ 2 IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์เหมาะสำหรับการวิเคราะห์อัตโนมัติโดย CNN ที่เดิมพัฒนาขึ้นสำหรับ IHC WSI แบบดั้งเดิม
CNN สามตัวถูกใช้สำหรับการประเมินเชิงปริมาณของเซลล์ที่มีการอักเสบในชิ้นเนื้อปลูกถ่ายที่ย้อมด้วย mTSA เป็นเวลา 6 สัปดาห์: สำหรับการตรวจจับลิมโฟไซต์ด้วยการย้อมด้วยไซโตพลาสซึม (CNN I) และการย้อมสีนิวเคลียร์ (CNN II) IHC และสำหรับการตรวจจับมาโครฟาจ ตารางที่ 2 แสดงประสิทธิภาพของ CNN (ความแม่นยำ การเรียกคืน และคะแนน F1-) สำหรับชุดการดึงออกของทั้ง IHC WSI ที่ย้อมด้วย DAB และ IHC WSI ความสว่างประดิษฐ์ โดยทั่วไป ประสิทธิภาพของ CNN นั้นดีเท่ากับหรือดีกว่า CNN พื้นฐานที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ด้วยคะแนน F1- เท่ากับ 0.78) ซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีประสิทธิภาพเทียบเท่ากับผู้สังเกตการณ์ด้วยตนเองที่มีประสบการณ์ [22] . ในขณะที่การตรวจจับลิมโฟไซต์ CNN II มีประสิทธิภาพลดลงบ้างในภาพที่สว่างเสมือนเมื่อเปรียบเทียบกับภาพ DAB จริง (ซึ่ง CNN ได้รับการฝึกฝน) ตรงกันข้ามกับ CNN สำหรับการตรวจจับมาโครฟาจ
ตัวอย่างของการประเมินเชิงบวกโดยอัตโนมัติที่ประสบความสำเร็จจะรวมอยู่ในรูปที่ 3
ความสัมพันธ์ของเซลล์ประเภทต่างๆ
ความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งที่สุดถูกสังเกตพบระหว่าง CD4 บวก GATA3 บวกความหนาแน่นของเซลล์และ CD163 บวกกับความหนาแน่นของเซลล์ (ค่าสัมประสิทธิ์ของสเปียร์แมน 0.75, p < 0.001)="" ใน="" การตรวจชิ้นเนื้อ="" 6="" สัปดาห์="" (รูปที่="" 5a="" เสริม)="" ความสัมพันธ์นี้อ่อนแอกว่าระหว่าง="" cd4="" บวก="" tbet="" บวกความหนาแน่นของเซลล์และ="" cd163="" บวกความหนาแน่นของเซลล์="" (ค่าสัมประสิทธิ์ของสเปียร์แมน="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (รูปที่="" 5b="" เสริม)="" .="" เมื่อจำกัดจำนวนเซลล์เป็นมาโครฟาจบวกสองเท่า="" (cd68="" บวก="" cd163="" บวก="" )="" ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของสเปียร์แมนเท่ากับ="" 0.65="" (p="">< 0.01)="" กับ="" cd4="" บวก="" gata3="" บวกเซลล์="" และ="" 0.66="" (p="">< 0.01)="" กับ="" cd4="" บวก="" tbet="" บวกเซลล์="" (รูปที่="" 5c,="" d)="" เพิ่มเติม="" การรวมบริเวณ="" subcapsular="">
เปรียบเทียบ inflammatory infiltrates ระหว่างผู้ป่วยที่เข้าสู่ IFTA เทียบกับ non-IFTA
ผู้ป่วยที่เข้าสู่ IFTA ที่ 6 เดือนแสดง CD163 บวกกับความหนาแน่นของเซลล์ที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการตรวจชิ้นเนื้อที่ใช้เวลา 6 สัปดาห์หลังการปลูกถ่าย (มัธยฐาน 505 เซลล์/มม. 2) เทียบกับผู้ป่วยที่ไม่เจริญไปสู่ IFTA (มัธยฐาน 370 เซลล์/มิลลิเมตร2; p=0 .043) (ตารางที่ 3). การรวมบริเวณ subcapsular ส่งผลให้ผลกระทบนี้ลดลงเล็กน้อย (p=0.051) CD68 และ CD4 ถูกใช้ในทั้งสองแผง สไลด์ที่ย้อมด้วยแผง mTSA ฉันแสดงค่าบวกของ CD68 มากกว่าสไลด์ที่ย้อมด้วยแผง mTSA II ความหนาแน่นของเซลล์ CD4 นั้นสูงกว่าในแผง mTSA II เมื่อเทียบกับแผง mTSA I (ตารางที่ 3)
ขอบเขตของเส้นเลือดฝอยในช่องท้องมีความคล้ายคลึงกันในการตรวจชิ้นเนื้อของผู้ป่วย DGF 6 สัปดาห์ที่มีผลลัพธ์ IFTA ต่างกัน (ตารางที่ 3) ทั้งเมื่อไม่รวม (p=0.74) และรวมถึง (p=0.90) บริเวณ subcapsular จาก/ในการวิเคราะห์
การประเมินอัตราส่วน CD3 บวก CD8−/CD3 บวก CD8 บวกเซลล์ พบอัตราส่วนที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผู้ป่วยที่มี<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">
ระยะทางที่สั้นที่สุดเฉลี่ยจากเซลล์ CD68 plus ถึง CD3 plus , CD3 plus CD8 plus , และ CD20 plus cells (แผง I) และจากเซลล์ CD163 plus ถึง CD4 plus , CD4 บวก Tbet plus , และ CD4 บวก GATA3 plus เซลล์ (แผง II) ได้ ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มผู้ป่วย ผลลัพธ์จะแสดงในรูปที่ 4
สารสกัดจาก cistanche: ปรับปรุงการทำงานของไตและความแข็งแรงของร่างกาย
การอภิปราย
ในการศึกษานี้ เราได้พัฒนาวิธีการหาปริมาณที่แม่นยำและเป็นกลางของเซลล์ inflammatory แทรกซึมในการตัดชิ้นเนื้อของผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไตด้วย DGF ที่หลีกเลี่ยงการตัดชิ้นเนื้อไตแบบต่อเนื่องอย่างกว้างขวาง เพื่อจุดประสงค์นี้ เรารวมมัลติเพล็กซ์ IHC, การขยายสัญญาณไทราไมด์, การถ่ายภาพหลายสเปกตรัม และการหาปริมาณโดย CNN เราเป็นคนแรกที่แปลงข้อมูล multispectral แบบเรียงต่อกันเป็นภาพ chromogenic เทียมเพียงภาพเดียวต่อเครื่องหมายเซลล์ อำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์ WSI และการประยุกต์ใช้ CNN ที่ออกแบบมาสำหรับ IHC ที่ให้ความสว่าง เราออกแบบ CNN ใหม่สองชุดสำหรับการตรวจหาลิมโฟไซต์และมาโครฟาจที่ย้อมด้วยนิวเคลียร์ และแสดงให้เห็นถึงความสามารถทั่วไปของ CNN ที่พัฒนาบน IHC WSI แบบดั้งเดิมไปจนถึง IHC WSI ความสว่างเทียม การบังคับใช้วิธีการของเราแสดงให้เห็นโดยใช้ผลลัพธ์เชิงปริมาณที่ได้รับจาก CNNs เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของสภาวะแวดล้อมจุลภาคอักเสบในการตรวจชิ้นเนื้อผู้ป่วย DGF 6 สัปดาห์ที่มีการพัฒนา IFTA 6 เดือนหลังการปลูกถ่าย
เราใช้ชุดย้อมสีแบบแมนนวลที่มีจำหน่ายทั่วไปสำหรับ IHC แบบมัลติเพล็กซ์เพื่อแสดงภาพเซลล์ภูมิคุ้มกันและเส้นเลือดฝอยในช่องท้องในการตรวจชิ้นเนื้อเพื่อเฝ้าระวังที่ได้รับหลังการปลูกถ่าย 6 สัปดาห์ ขั้นตอนการย้อมแบบมัลติเพล็กซ์ประกอบด้วยขั้นตอนการล้าง การฟักไข่ และการเดือดของเนื้อเยื่อหลายครั้ง และเกี่ยวข้องกับสารละลายรีเอเจนต์หลายอย่าง การตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการอย่างละเอียดและการควบคุมคุณภาพจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง และแนะนำให้ใช้แอนติบอดีจำเพาะที่ให้ความเข้มของการย้อมสีที่สม่ำเสมอ แม้จะมีขั้นตอนการตรวจสอบความถูกต้อง แต่รูปแบบการย้อมสีที่เหมือนมาโครฟาจก็ถูกพบในช่อง CD4 ของสไลด์จากแผง mTSA I และ II รอบการย้อมสี CD4 และ CD68 ไม่ได้ดำเนินการอย่างติดต่อกัน ดังนั้นปรากฏการณ์นี้จึงไม่ได้เกิดจากการลอกที่ไม่สมบูรณ์ของแอนติบอดี CD68 (ตารางเสริมที่ 1) แม้ว่าจะมีการอธิบายการเกิดขึ้นของ macrophage dual-positive ที่เกิดขึ้นได้ยากกับ CD4 [31] แต่คำอธิบายที่น่าเชื่อถือกว่านั้นอยู่ในบริเวณใกล้เคียงของสเปกตรัมการแผ่รังสีของ fluorophores ที่ใช้สำหรับการสร้างภาพ CD4 (520 nm) และ CD68 (540 nm) โดยลูกบาศก์ฟิลเตอร์ FITC ของกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ซึ่งอาจทำให้ "เลือดออก" ของสัญญาณ CD68 ที่แรงในแชนเนล CD4 สัญญาณนี้ส่วนใหญ่ไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ในแผง I เนื่องจากมีเพียง CD4 บวกกับเซลล์ที่เป็นบวกสองเท่ากับ CD3 เท่านั้นที่ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์เซลล์ T-helper ทั่วไป อย่างไรก็ตาม เราตัดสินใจประเมินเซลล์ T-helper ทั่วไปโดยอ้อมด้วย โดยใช้ CD3 บวก CD8− แทน ในแผง II มีการใช้ CD4 ร่วมกับทิเบตและ GATA3 แต่เพียงผู้เดียว ซึ่งจำกัดความเสี่ยงในการใช้การตรวจจับที่ผิดพลาด
พบค่าบวก CD68 ที่ต่ำกว่าในแผง II เมื่อเทียบกับแผง I เราตั้งสมมติฐานว่านี่เป็นผลมาจากการยับยั้ง steric โดยการสะสม tyramide ที่เป็นของ CD163 ("เอฟเฟกต์ร่ม") [32] เราสังเกตพบ CD163-เซลล์ที่เป็นบวกในกลุ่มที่ศึกษาอย่างมีนัยสำคัญมากกว่าในเนื้อเยื่อต่อมทอนซิลที่ใช้ในการตรวจหาการยับยั้ง steric ซึ่งอาจอธิบายได้ว่าทำไมจึงไม่พบผลกระทบนี้ในระหว่างการตรวจสอบ
Multiplex IHC ถูกรวมเข้ากับการถ่ายภาพหลายสเปกตรัมเพื่อตรวจสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกในการศึกษาด้านเนื้องอกวิทยาหลายครั้ง และเมื่อเร็วๆ นี้สำหรับการวิเคราะห์การปฏิเสธการปลูกถ่ายไต [33–35] ในการดึงการมีส่วนร่วมของมาร์กเกอร์ทั้งหมดในสไลด์ mTSA ส่วนต่างๆ จะถูกถ่ายภาพด้วยระบบ Vectra หรือกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ที่คล้ายกันด้วยการตั้งค่ามัลติสเปกตรัม หลังจากบันทึกภาพภาพรวมที่มีกำลังขยายต่ำ ระบบ Vectra จะแบ่งเนื้อเยื่อออกเป็นแผ่นๆ และสแกนแผ่นกระเบื้องโดยอัตโนมัติด้วยสเปกตรัมหลายสเปกตรัม ส่งผลให้ไทล์รูปภาพที่มีสเปกตรัมร่วมหลายรายการ เนื่องจากสเปกตรัมของ fluorophores เดียวเป็นที่รู้จักจาก "library" สเปกตรัมที่บันทึกไว้ล่วงหน้า จึงเป็นไปได้ที่จะแยกชิ้นส่วนมัลติเพล็กซ์ออกเป็นไทล์เดี่ยวหลายอันที่แสดงถึงการมีส่วนร่วมของแต่ละ fluorophore ("unmixing") ในการศึกษาส่วนใหญ่ ภาพที่ยังไม่ได้ผสมจะถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์เชิงพาณิชย์ ในหลายกรณี โปรแกรมเหล่านี้ไม่สนับสนุนการวิเคราะห์ WSI มีความยากลำบากในการวิเคราะห์เซลล์แบบคลัสเตอร์ และมักไม่ยืดหยุ่นต่อสิ่งประดิษฐ์และรูปแบบการย้อมสี การแปลงไทล์ที่ไม่ผสมเป็น IHC WSI ที่ให้ความสว่างเทียม ทำให้เราสามารถประยุกต์ใช้ CNN ที่มีอยู่ซึ่งออกแบบมาโดยเฉพาะสำหรับการตรวจจับลิมโฟไซต์ใน IHC [22] (เรียกว่าการตรวจจับลิมโฟไซต์ CNN I) เครือข่ายนี้สามารถตรวจจับเซลล์ลิมโฟไซต์แต่ละชนิดและแบบคลัสเตอร์ได้อย่างแม่นยำสูง ขณะเดียวกันก็ยืดหยุ่นต่อการย้อมสีพื้นหลังได้ (รูปที่ 2, CD3) นอกจากนี้ เราฝึกอบรม CNN ใหม่สองแห่งสำหรับการตรวจหาเซลล์ที่มีรูปแบบการย้อมสีด้วยนิวเคลียร์ (ทิเบต, GATA3) (การตรวจจับลิมโฟไซต์ CNN II) และสำหรับการตรวจหามาโครฟาจ มาโครฟาจนั้นยากต่อการตรวจจับเนื่องจากรูปแบบการย้อมสีที่กระจัดกระจาย ดังนั้น CNN การตรวจจับมาโครฟาจจึงได้รับการฝึกอบรมโดยใช้คำอธิบายประกอบของผู้เชี่ยวชาญสี่คนที่แตกต่างกัน ก่อนทำคำอธิบายประกอบ มีการวางแผนการประชุมหลายครั้งโดยมีการอภิปรายและประเมินเกณฑ์สำหรับการทำหมายเหตุประกอบมาโครฟาจ สิ่งนี้ส่งผลให้เครือข่ายสามารถตรวจจับมาโครฟาจในรูปแบบที่ทำซ้ำได้ในขณะที่แข็งแกร่งสำหรับการย้อมสีที่ไม่เฉพาะเจาะจง (ตารางที่ 2 รูปที่ 2 และรูปที่ 6) เพิ่มเติม สำหรับความรู้ของเรา นี่เป็นอัลกอริธึมแรกสำหรับการตรวจจับมาโครฟาจในส่วนทางจุลพยาธิวิทยาที่สแกน เราทดสอบประสิทธิภาพของเครือข่ายทั้งสามในชุดทดสอบที่ประกอบด้วย IHC WSI แบบดั้งเดิม (คล้ายกับที่ใช้ระหว่างการฝึก) และชุดทดสอบรองที่ประกอบด้วย IHC WSI ระดับความสว่างเทียม ซึ่งสร้างขึ้นจากภาพที่บันทึกด้วยสเปกตรัมหลายสเปกตรัม CNN ทั้งหมดแสดงประสิทธิภาพที่ดีมากในชุดการทดสอบหลักและคะแนน F1- ที่คล้ายกันในชุดการทดสอบรอง เมตริกประสิทธิภาพของการตรวจหาลิมโฟไซต์ CNN I คำนวณจากเนื้อเยื่อปกติ สิ่งประดิษฐ์ และกลุ่มเซลล์ IHC ความสว่างประดิษฐ์ของชุดทดสอบที่สองไม่มีสิ่งประดิษฐ์ของเนื้อเยื่อและกลุ่มเซลล์จำนวนน้อยลง นี้สามารถอธิบายประสิทธิภาพโดยรวมที่ดีขึ้นของเครือข่ายนี้ในชุดทดสอบที่สอง CNN การตรวจจับมาโครฟาจได้รับการฝึกอบรมและทดสอบกับคำอธิบายประกอบจากตัวบันทึกย่อที่ต่างกันสี่ตัว แม้ว่าจะมีการอภิปรายถึงเกณฑ์คำอธิบายประกอบเป็นพิเศษ แต่ยังคงสังเกตเห็นรูปแบบต่างๆ ของคำอธิบายประกอบ ความไวของ CNN จึงน่าจะอยู่ตรงกลางของรูปแบบคำอธิบายประกอบสุดขั้ว คำอธิบายประกอบสำหรับชุดการทดสอบที่สองสร้างขึ้นโดยผู้ทำหมายเหตุประกอบหนึ่งราย ซึ่งดูเหมือนว่าจะตรงกับความไวของ CNN
การใช้ CNN ที่อธิบายไว้ช่วยให้เราตรวจสอบ infammatory infaltrate ด้วยความแม่นยำที่ไม่เคยมีมาก่อนในชุดการตรวจชิ้นเนื้อสำหรับการเฝ้าระวังในระยะเริ่มต้นที่คัดเลือกมาอย่างเข้มงวดของผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายด้วย DGF อย่างเข้มงวด
น่าเสียดายที่ต้องแยกตัวอย่างหลายตัวอย่างออกจากการวิเคราะห์ ส่วนใหญ่เกิดจากเนื้อเยื่อตกค้างไม่เพียงพอหลังการตรวจวินิจฉัย แม้จะมีขนาดที่จำกัดของชุดข้อมูล แต่เราพบว่า CD163 บวกกับความหนาแน่นของเซลล์สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการตรวจชิ้นเนื้อของผู้ป่วย DGF ที่พัฒนาไปสู่การพัฒนา IFTA ซึ่งสอดคล้องกับบทบาทที่อาจเป็นไปได้ในการขยายพันธุ์ของเซลล์เหล่านี้ [11] แม้ว่าแนวโน้มที่สังเกตพบจะสอดคล้องกับข้อมูลที่เผยแพร่ เราไม่สามารถยืนยันผลที่เป็นอันตรายของการมีอยู่ในช่วงต้นของ CD68 บวกกับมาโครฟาจที่รายงานก่อนหน้านี้สำหรับกลุ่มผู้ป่วยปลูกถ่ายไตอื่นๆ [7, 36, 37] เราพบความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างความหนาแน่นของเซลล์ CD4 บวก GATA3 plus และเซลล์ CD163 plus ซึ่งอาจยืนยันการมีส่วนร่วมของ T-helper 2 ลิมโฟไซต์ต่อสภาพแวดล้อมระดับจุลภาค แม้ว่าจะไม่มีการค้นพบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพแบบคาดการณ์ล่วงหน้าสำหรับการพัฒนา IFTA ในผู้ป่วย DGF ในการศึกษานี้ แต่เราประสบความสำเร็จในการพัฒนาวิธีการสำหรับการประเมินที่ถูกต้อง ทำซ้ำได้ และปรับขนาดได้ของ inflammatory infiltrate ในเนื้อเยื่อเบาบาง เช่น การตัดชิ้นเนื้อที่ปลูกถ่าย วิธีการเหล่านี้มีประโยชน์สำหรับการศึกษาเชิงปริมาณในอนาคตเกี่ยวกับการอักเสบในเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อ
เพื่อบรรเทาความเมื่อยล้าของต่อมหมวกไตด้วย cistanche คลิกที่นี่เพื่อดูรายละเอียดเพิ่มเติม
ความพร้อมใช้งานของข้อมูล
คำขอความร่วมมือเกี่ยวกับการใช้ข้อมูลที่นำเสนอในการศึกษานี้สามารถระบุถึงผู้เขียนที่เกี่ยวข้อง (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) หรือ FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de)
รับทราบ
เราขอขอบคุณ Mark Gorris และ Kiek Verrijp สำหรับคำแนะนำเกี่ยวกับการย้อมสีและการถ่ายภาพ mTSA, Merijn van Erp สำหรับการพัฒนาฟังก์ชัน ImageJ แบบกำหนดเอง และ Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg และ Martijn Otten สำหรับการสร้างความจริงพื้นฐานสำหรับเครือข่ายการตรวจจับมาโครฟาจ นอกจากนี้ เราขอขอบคุณ Irina Scheffner สำหรับความช่วยเหลือของเธอในการรวบรวมข้อมูลทางคลินิก
ผลงานของผู้เขียนMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH และ JAWML
ได้ออกแบบการศึกษา วัสดุของผู้ป่วยและข้อมูลทางคลินิกถูกรวบรวมและจัดให้มีโดย JS, WG และ FF FF ประสานงานความพยายามที่ดำเนินการที่ MHH JHB, EJS และ JK ทำคะแนนสไลด์ PAS สำหรับเปอร์เซ็นต์ IFTA MH ทำการย้อมสี mTSA การตรวจสอบความถูกต้องของแผง I และ II และการสร้างภาพและการผสมแผง I. VV ที่ถ่ายภาพและแผงที่ไม่ผสม II DJG ได้พัฒนาวิธีการแปลงไทล์ mTSA เป็น WSI ความสว่างประดิษฐ์ MH ดำเนินการแปลง ZS-C พัฒนา CNN สำหรับการตรวจหาลิมโฟไซต์และเขียนสคริปต์สำหรับการหาปริมาณลิมโฟไซต์ JL พัฒนา CNN สำหรับการตรวจหามาโครฟาจและเขียนสคริปต์สำหรับการหาปริมาณมาโครฟาจ MH ดำเนินการหาปริมาณเซลล์และเส้นเลือดฝอย NSS คำนวณระยะทางของเซลล์ MH, BS, LBH และ JAWML วิเคราะห์ข้อมูล MH จัดทำภาพประกอบและร่างกระดาษ ต้นฉบับฉบับสุดท้ายได้รับการแก้ไขและอนุมัติโดยผู้เขียนทั้งหมด
เงินทุนงานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยความคิดริเริ่ม ERACoSysMed (โครงการ SysMIFTA) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของโครงการ Horizon 2020 Framework ของสหภาพยุโรปที่เสนอโดย ZonMw (หมายเลข 9003035004) โดยได้รับทุนสนับสนุนจากกระทรวงวิจัยและการศึกษาของเยอรมนี (BMBF) เลขที่ . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) และ FKZ01ZX1608A (SYSIMIT) JAWML ได้รับค่าที่ปรึกษาจากฟิลิปส์ (เนเธอร์แลนด์) และเงินช่วยเหลือจาก
ContextVision, Philips (เนเธอร์แลนด์) และ Sectra (สวีเดน) นอกงานที่ส่ง JK ได้รับการสนับสนุนทางการเงินจาก Dutch Kidney Foundation (โครงการ DEEPGRAFT, Grant No. 17OKG23)
การปฏิบัติตามมาตรฐานทางจริยธรรม
ผลประโยชน์ทับซ้อนผู้เขียนประกาศไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน
การอนุมัติจริยธรรมและการยินยอมให้เข้าร่วมการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการด้วยความยินยอมของผู้ป่วยที่ได้รับแจ้งและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรม (หมายเลข 2765) ของ Hannover Medical School
หมายเหตุของผู้จัดพิมพ์Springer Nature ยังคงเป็นกลางเกี่ยวกับการอ้างสิทธิ์ในเขตอำนาจศาลในแผนที่ที่เผยแพร่และความเกี่ยวข้องกับสถาบัน
เปิดการเข้าถึงบทความนี้ได้รับอนุญาตภายใต้ Creative Commons Attribution 40 International License ซึ่งอนุญาตให้ใช้ แบ่งปัน ดัดแปลง แจกจ่าย และทำซ้ำในสื่อหรือรูปแบบใดๆ ตราบใดที่คุณให้เครดิตที่เหมาะสมกับผู้เขียนต้นฉบับ ) และแหล่งที่มา ระบุลิงก์ไปยังใบอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ และระบุว่ามีการเปลี่ยนแปลงหรือไม่ รูปภาพหรือเนื้อหาของบุคคลที่สามในบทความนี้รวมอยู่ในใบอนุญาต Creative Commons ของบทความ เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่นในเครดิตของเนื้อหา หากเนื้อหาไม่รวมอยู่ในใบอนุญาตครีเอทีฟคอมมอนส์ของบทความ และการใช้งานตามวัตถุประสงค์ของคุณไม่ได้รับอนุญาตตามข้อบังคับทางกฎหมายหรือเกินกว่าการใช้งานที่ได้รับอนุญาต คุณจะต้องได้รับอนุญาตโดยตรงจากผู้ถือลิขสิทธิ์
อ้างอิง
1. Siedlecki A, Irish W, เบรนแนน ดี.ซี. ฟังก์ชั่นการรับสินบนล่าช้าในการปลูกถ่ายไต Am J การปลูกถ่าย 2011;11:2279–96.
2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. ปัจจัยเสี่ยงของการสูญเสียการรับสินบนในระยะยาวในผู้รับการปลูกถ่ายไตที่มีความผิดปกติของ allograft เรื้อรัง Exp คลินิกปลูกถ่าย. 2010;8:277–82.
3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR ความสัมพันธ์ระหว่างการทำงานของกราฟต์ที่ล่าช้ากับการปลูกถ่าย allograft กับการอยู่รอดของผู้ป่วย: การทบทวนอย่างเป็นระบบและการวิเคราะห์เมตา การปลูกถ่าย Nephrol Dial 2552;24:1039–47.
4. Schröppel B, Legendre C. การทำงานของการปลูกถ่ายไตล่าช้า: จากกลไกสู่การแปล ไตอินเตอร์ 2014;86:251–8.
5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, และคณะ การให้คะแนนการทำลายล้างทั้งหมดนั้นเหนือกว่าคะแนนการทำลายล้างของแบมฟ์ในปัจจุบันในการทำนายผลลัพธ์และระดับของการรบกวนของโมเลกุลในการปลูกถ่ายไต Am J การปลูกถ่าย 2009;9:1859–67.
6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall
นพ. การทำนายการลดลงของการทำงานของไต allograft จากการตรวจชิ้นเนื้อในระยะเริ่มแรก Am J การปลูกถ่าย 2005;5:2464–72.
7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, และคณะ บทบาทของแมคโครฟาจในการพัฒนาการเกิดพังผืดของไตของมนุษย์ในปีแรกหลังการปลูกถ่าย Am J การปลูกถ่าย 2014;14:2126–36.
8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M และอื่น ๆ แมคโครฟาจที่กระตุ้นอีกทางเลือกหนึ่งในการเกิดโรคของการบาดเจ็บ allograft ไตเรื้อรัง เพเดียท เนโฟรล. 2015;30:1007– 17.
9. Biswas SK, Mantovani A. Macrophage ปั้นพลาสติกและปฏิสัมพันธ์กับกลุ่มย่อยของลิมโฟไซต์: มะเร็งเป็นกระบวนทัศน์ นัท อิมมูนอล. 2010;11:889–96.
10. Anders HJ, Ryu M. Renal microenvironments และ macrophage phenotypes เป็นตัวกำหนดความก้าวหน้าหรือความละเอียดของการอักเสบของไตและการเกิดพังผืด ไตอินเตอร์ 2011;80:915–25.
11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages ในการปลูกถ่ายอวัยวะ พรมแดนอิมมูนอล 2020;11:582939.
12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, และคณะ ชุดย่อยของเซลล์ T helper 1, 2 และ 17 ในผู้ป่วยปลูกถ่ายไตที่มีการทำงานของการรับสินบนล่าช้า ทรานสป อินเตอร์ 2011;24:233–42.
13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, และคณะ การให้คะแนนของลิมโฟไซต์ที่แทรกแซงเนื้องอก: จากการประมาณค่าด้วยสายตาไปจนถึงการเรียนรู้ของเครื่อง สัมมนามะเร็ง Biol. 2018;52:151–7.
14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. วิธีการตามการวิเคราะห์ภาพสำหรับการหาปริมาณของพารามิเตอร์ดัชนีความเสียหายของ allograft เรื้อรัง แอมป์ 2549;114:440–8.
15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, และคณะ การใช้อัลกอริธึมลุ่มน้ำกับการแบ่งส่วนนิวเคลียสแบบคลัสเตอร์ ไซโตเมทรี 1997;28:289–97.
16. ลาย YK, ขัดสน PL. ธรณีประตูแบบวงกลมที่มีประสิทธิภาพ IEEE Trans Med Imaging 2014;23:992– 1001.
17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, และคณะ แบบสำรวจการเรียนรู้เชิงลึกในการวิเคราะห์ภาพทางการแพทย์ Med ภาพก้น. 2017;42:60–88.
18. Madabhushi A, Lee G. การวิเคราะห์ภาพและการเรียนรู้ของเครื่องในพยาธิวิทยาดิจิทัล: ความท้าทายและโอกาส Med ภาพก้น. 2016;33:170–5.
19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. การประเมินการวินิจฉัยของอัลกอริธึมการเรียนรู้เชิงลึกสำหรับการตรวจหาการแพร่กระจายของต่อมน้ำเหลืองในสตรีที่เป็นมะเร็งเต้านม จามา. 2017;318:2199–210.
20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. การประเมินทางจุลพยาธิวิทยาตามการเรียนรู้เชิงลึกของเนื้อเยื่อไต เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 2019;30:1968–79.