ผลการป้องกันและกลไกของ Procyanidins ต่อโรคพาร์กินสันในร่างกายและในหลอดทดลอง ตอนที่ 1

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม:งานวิจัยนี้ประเมินกลไกระดับโมเลกุลของ procyanidins(PCs) ต่อ neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP) และ metabolite {{6 }}เมทิล-4-แบบจำลองฟีนิลไพริดิเนียม (MPP บวก ) ที่เหนี่ยวนำให้เกิดโรคพาร์กินสัน ในหลอดทดลอง เซลล์ PC12 ถูกบ่มด้วย PC หรือ deprenyl เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และจากนั้นสัมผัสกับ MPP 1.5 มิลลิโมลาร์บวกเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในร่างกาย ตัวอ่อนของ zebrafish (สายพันธุ์ AB) 3 วันหลังการปฏิสนธิ (pdf) ถูกบ่มด้วย deprenyl หรือ PC ใน 400 ไมโครโมลาร์ MPTP เป็นเวลา 4 วัน เมื่อเทียบกับ MPP*/MPTP เพียงอย่างเดียว พีซีสามารถปรับปรุงกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระได้อย่างมีนัยสำคัญ (เช่น กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GSH-Px), ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD), คาตาเลส (CAT)) และระดับออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) และมาลอนไดไฮด์ที่ลดลง (MDA) ). นอกจากนี้ พีซียังเพิ่มการสะสม Nrf2 ของนิวเคลียร์ในเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญ และเพิ่มการแสดงออกของ NQO1, HO-1, GCLM และ GCLC ในทั้งเซลล์ PC12 และม้าลายเมื่อเปรียบเทียบกับ MPP*/MPTP เพียงอย่างเดียว การศึกษาในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าพีซีมีผลในการป้องกันระบบประสาท กระตุ้นเส้นทางนิวเคลียสแฟกเตอร์-อีรีทรอยด์ 2-ที่เกี่ยวข้องกับแฟคเตอร์ 2 (Nrf2)/การตอบสนองของสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) และบรรเทาความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในโมเดล PD ที่เกิดจาก MPP plus / MPTP

คำสำคัญ:โปรไซยานิดิน; โรคพาร์กินสัน; เซลล์ PC12; ปลาม้าลาย; เส้นทาง Nrf2/ARE

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

1. บทนำ

โรคพาร์กินสัน (PD) เป็นกลุ่มอาการทางระบบประสาทที่ก้าวหน้าซึ่งเกิดจากการไม่มีเซลล์ประสาทโดปามีนใน substantia nigra อาการทางคลินิกของมันรวมถึงการชะลอการเคลื่อนไหว การสั่น ความตึง และความไม่มั่นคงของท่าทาง [1-6] วิธีการที่มีประสิทธิภาพในการป้องกันหรือย้อนกลับความเสื่อมของเส้นประสาทในผู้ป่วยโรค PD ยังไม่เป็นที่แน่ชัด ดังนั้นการค้นพบและพัฒนายาต้านพาร์กินโซเนียนชนิดใหม่จึงยังคงมีความสำคัญสูงสุดในการค้นหาการรักษา PD

แม้ว่าการเกิดโรคของ PD ยังไม่ชัดเจน แต่การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญในการสูญเสียเซลล์ประสาทโดปามีน [7,8] โดปามีนสามารถเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันแบบอัตโนมัติหรือด้วยเอนไซม์เพื่อนำไปสู่การผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) และโมเลกุลอิเล็กโทรฟิลลิกควิโนน [9] กระบวนการทั้งสองที่อาจรองรับความเปราะบางของเซลล์ประสาทโดปามีนต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและอิเล็กโตรฟิลลิก[10-12 ]. ดังนั้น วิธีที่เป็นไปได้ในการป้องกันหรือรักษา PD อาจเป็นการเสริมการรักษาด้วยสารต้านอนุมูลอิสระเพื่อกำจัด ROS ที่มากเกินไป อันที่จริง สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพตามธรรมชาตินั้นได้เปรียบตรงที่พวกมันมักจะปลอดภัยสำหรับผู้บริโภคและมีอาการข้างเคียงน้อยมาก (ถ้ามี) [13] ดังนั้นสารต้านอนุมูลอิสระจากทรัพยากรธรรมชาติอาจช่วยในการรักษา PD ได้

Cistanche สามารถปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

Procyanidins (PCs) เป็นสารประกอบฟีนอลิกตามธรรมชาติของฟลาโวนอยด์ รวมถึงโอลิโกเมอร์ของโมโนเมอร์คาเทชินและอีพิคาเทชิน [14] พีซีเป็นสารอาหารจากธรรมชาติและสารต้านอนุมูลอิสระที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่แรงกว่าวิตามินซีและอี [15] เส้นทาง Nrf2/ARE เป็นวิถีทางต้านอนุมูลอิสระที่สำคัญ Nrf2 ถูกปลดปล่อยจาก Keap1 โดย ROS หรือผ่านปฏิกิริยาอิเล็กโทรฟิลิก หลังจากนั้น สารประกอบจะจับกับองค์ประกอบตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) ในนิวเคลียสและเป็นสื่อกลางในการแสดงออกของเอนไซม์เปอร์ออกซิเรดอกซินและเอนไซม์ล้างพิษระยะที่ 2 (HO-1, GCLC, GCLM และ NQO-1) ซึ่ง ทำหน้าที่เป็นตัวเก็บขยะของ ROS และปกป้องเซลล์จากความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [16]

สมองของปลาม้าลายตัวอ่อนประกอบด้วยเซลล์ประสาท dopaminergic, noradrenergic และ adrenergic หลายกลุ่มในตำแหน่งที่คล้ายกับที่พบในสมองของผู้ใหญ่ [17-19] ภายใน 3 วันหลังการปฏิสนธิ(pdf) จะพบเซลล์ประสาทโดปามีนในช่องท้อง, พรีเทคตัม, โลคัส coeruleus, หลอดไฟรับกลิ่นและเรตินา [20] เมื่อเทียบกับหนูทดลอง โมเดล zebrafish สัมพันธ์กับระยะเวลาการทดลองที่สั้นกว่า ต้นทุนต่ำกว่า และลดความซับซ้อนในการจัดการยีน [21. เซลล์ pheochromocytoma ของหนู (เซลล์ PC12) มีความคล้ายคลึงกับเซลล์ประสาทในด้านสัณฐานวิทยา โครงสร้าง และการทำงาน [22] มีความสอดคล้องอย่างมากกับเซลล์ประสาทที่เพาะเลี้ยงขั้นต้นและมีข้อดีของการเพาะเลี้ยงที่ง่ายและเสถียร [23] มีการใช้เซลล์ PC12 อย่างกว้างขวางเพื่อเป็นแบบจำลองในการศึกษาเซลล์ประสาท [24-26]

นิวโรทอกซิน 1-เมทิล-4-ฟีนิล-1,2,3,6-เตตระไฮโดรไพริดีน (MPTP) แสดงให้เห็นว่าทำให้เกิดกลุ่มอาการในมนุษย์ที่คล้ายกับโรคพาร์กินสัน MPTP ทำให้เกิดการเสื่อมแบบเลือกของเซลล์ประสาทโดปามีนใน substantia nigra และผู้ป่วยแสดงอาการรวมทั้งอาการสั่น การไม่สามารถเคลื่อนไหวได้ และการเดินแบบสับเปลี่ยน [27].MPTP ถูกเผาผลาญเป็น 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP) ใน glial เซลล์ในสมอง หลังจากปล่อยจากเกลีย MPP plus จะถูกขนส่งไปยังเซลล์ประสาทโดปามีนผ่านตัวขนส่งโดปามีน (DAT) [28] และสะสมในไมโตคอนเดรีย ซึ่งเชื่อกันว่าจะทำให้เซลล์ตายโดยรบกวนการทำงานของเอนไซม์ระบบทางเดินหายใจและก่อให้เกิดความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน [29,30] . การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่าพีซีป้องกันกระบวนการชราของหนูเพศเมีย [31] และมีผลในการป้องกันเส้นประสาท [32,33] อย่างไรก็ตาม ไม่ว่าพีซีจะสามารถป้องกันหรือย้อนกลับการเสื่อมสภาพของเส้นประสาทใน PD โดยการควบคุมเส้นทาง Nrf2/ARE ได้หรือไม่นั้นยังคงไม่ชัดเจน การศึกษานี้ใช้เซลล์ PC12 ที่รักษาด้วย MPP [34,35] และปลาม้าลายที่บำบัดด้วย MPTP [36] เพื่อประเมินผลการป้องกันและกลไกที่เป็นไปได้ของพีซีในรูปแบบ PD

2. ผลลัพธ์

2.1.ผลกระทบของพีซีต่อ MPP plus -ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหนี่ยวนำโดย PC12 เซลล์

การฟักตัวของเซลล์ PC12 ถึง 1.5 mM MPP บวกเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ส่งผลให้เซลล์มีชีวิตที่ 58.88 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ la) การปรับสภาพเซลล์ด้วยพีซีป้องกันเซลล์ PC12 จากความเสียหายที่เกิดจาก MPP บวกด้วยการเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์ (รูปที่ 1b) ไม่มีความแตกต่างที่ชัดเจนในอัตราการรอดชีวิตของเซลล์ระหว่างกลุ่ม PCs 4ug/mL และกลุ่ม deprenyl 30 μM (กลุ่มควบคุมเชิงบวก) (รูปที่ 1b)

2.2. พีซีลด MPP บวก - ความเครียดที่เกิดจากออกซิเดชันและการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระที่เพิ่มขึ้น

ระดับ ROS และ malondialdehyde (MDA) บ่งบอกถึงความรุนแรงของความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน การเปิดเผยเซลล์ PC12 เป็น 1.5 mM MMP บวกเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพิ่มระดับ ROS และ MDA ซึ่งถูกยับยั้งโดยพีซีที่ 4ug/mL (รูปที่ 2a-c) เพื่อประเมินผลของพีซีต่อความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระของเซลล์ PC12 ที่ได้รับการบำบัดด้วย MPP บวกด้วยการวัดฤทธิ์ของกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GSH-Px), คาตาเลส (CAT) และซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) และสังเกตว่า MPP บวกการบำบัดยับยั้ง GSH-Px กิจกรรม , CAT และ SOD อย่างไรก็ตาม เอฟเฟกต์ MPP plus เหล่านี้ได้รับการช่วยเหลือจากการเปิดรับพีซีที่ 4 ug/mL (รูปที่ 2d-f)

2.3.ผลกระทบของพีซีบนเส้นทาง Nrf2/ARE ใน MPP plus -Induced PC12 Cells

การแสดงออกของปัจจัยนิวเคลียร์-อีริทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2(Nrf2) ได้รับการควบคุม และระดับของ Keap1 ลดลงหลังจากการรักษาด้วย PC (รูปที่ 3a-c) พีซี (4 ug/mL) อำนวยความสะดวกในการแปลนิวเคลียร์ของ Nrf2 ภายใต้สภาวะ MPP lesion (ภาพที่ 3d-f) นอกจากนี้ ข้อมูล Western blot แสดงให้เห็นการปรับเพิ่มขึ้นที่ชัดเจนในการแสดงออกของ heme oxygenase 1(H2O-1), quinone oxidoreductase 1(NQO1),glutamate-cysteine ​​ligase catalytic subunit(GCLC) และหน่วยย่อยตัวดัดแปลง glutamate-cysteine ​​ligase (GCLM) ) การแสดงออกหลังการบำบัดด้วย PC (4 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เปรียบเทียบกับการสัมผัส MPPt เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 3g-k)

2.4.Nf2/ARE การส่งสัญญาณเกี่ยวข้องกับผลกระทบต่อระบบประสาทและสารต้านอนุมูลอิสระโดย PCS

การล้มลงของ Nrf2 โดย siRNA ได้ยกเลิกการแสดงออกของ Nrf2 อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 4a,b) อันที่จริง การรักษาด้วย Nrf2 siRNA ได้ยกเลิกการกระทำในการป้องกันของพีซีต่อความเสียหายจากการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ MPP บวกกับความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งเห็นได้จากความมีชีวิตของเซลล์ที่ลดลงในกลุ่มที่ทรานส์เฟก Nrf2 siRNA (รูปที่ 4c) นอกจากนี้ ผลกระทบของพีซีต่อ MDA และ SOD ถูกย้อนกลับโดยการทำให้ล้มลงของ Nrf2 ภายใต้สภาวะการเกิดแผล MPP (รูปที่ 4d,e.

2.5.ผลกระทบของพีซีต่อการเคลื่อนที่ของ Zebrafish Laroae ต่อการรักษา MPTP

MPTP ลดระยะทางรวมของ zebrafish ว่าย การบำบัดด้วย PC (4,8 และ 16 ug/mL) ช่วยชีวิตการขาดดุลของรถจักรที่เหนี่ยวนำโดย MPTP และเพิ่มระยะทางโดยรวมที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่ม MPTP (รูปที่ 5a,b) นอกจากนี้ deprenyl ยังให้การป้องกันจากความเสียหายที่เกิดจาก MPTP และถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง PC (16 ug/mL) และ deprenyl (40 μM) เพียงอย่างเดียวไม่ส่งผลต่อพฤติกรรมการเคลื่อนที่ของตัวอ่อนของ zebrafish ปกติ

2.6.ผลกระทบของพีซีต่อการบาดเจ็บของเซลล์ประสาทโดปามีนที่เหนี่ยวนำโดย MPTP ในปลาม้าลาย

เอ็มบริโอของ Zebrafish ที่ฟักด้วย MPTP แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในความหนาแน่นของไทโรซีนไฮดรอกซีเลส (TH) (รูปที่ 6a,b) อย่างไรก็ตาม การบำบัดด้วยพีซีขนาด 16 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรได้ย้อนกลับการลดความหนาแน่นของเซลล์ THt อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6a,b)

Figure 2. PCs reduced MPP+-induced oxidative stress and increased antioxidant enzyme activity. (a) ROSlevels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured by imageJsoftware;(c)MDA levels;(d) GSH-Px activity;(e)CAT activity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons:ns, p>0.05;*,p<><0.01;,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Figure 3. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPP+-induced PC12 cells. (a)Protein levels of Nrf2 and Keep-1, as determined by Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Keap1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(d) protein expression levels of nuclear Nrf2 and cytoplasmic Nrf2, as determined by Western blotting; (e) nuclear Nrf2/LaminB protein relative expression (ratio to control); (f) cytoplasmic Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(g) protein levels of HO-1, NQO1, GCLCand GCLM, as determined by Western blotting;(h)HO-1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(i) NQO1/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(j) GCLC/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(k) GCLM/GAPDH protein relative expression (ratio to control). F and pvalues of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><0.01;the error="" bars="" are="">

Figure 4. Nrf2/ARE signaling is related to the neuroprotective and antioxidant effects mediated by PCs.(a) Knockout efficiency was detected by determination of Nrf2 protein expression using Western blotting;(b)Nrf2/GAPDH protein relative expression (ratio to control);(c) Cell viability;(d) MDA levels;(e) SODactivity. Find values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p >0.05;*,p<0.05;**,p><0.01;**,p><0.001; the="" error="" bars="" are="">

รูปที่ 5. ผลกระทบของพีซีต่อการเคลื่อนที่ของลูกน้ำม้าลายต่อการรักษาด้วย MPTP (ก) รูปแบบทั่วไปของร่องรอยการว่ายน้ำของตัวอ่อนของปลาม้าลายในแต่ละกลุ่ม (ข) ระยะทางรวมเฉลี่ยของตัวอ่อนของปลาม้าลายในแต่ละกลุ่ม ค่า F และ p ของการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวจะแสดงอยู่เหนือแผนภูมิ ผลการทดสอบ post hoc ของ Tukey ถูกนำเสนอสำหรับการเปรียบเทียบที่เลือก: **,p<0.001; the="" error="" bars="" are="">

บทความนี้คัดมา Molecules 2021, 26, 5558 https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules