ความหมายที่คาดการณ์ของการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโรคไต Myeloid 8 ในผู้ป่วยที่เป็นโรคไตที่เกี่ยวข้องกับโรคอ้วนหรือเบาหวานชนิดที่ 2

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

ทาคาชิเกะ คุวาบาระ¹, คิโยชิ โมริ1,^2*, มาซาโตะ คาซาฮาระ^1,3, ฮิเดกิ โยโคอิ¹, ฮิโรทากะ อิมามากิ¹,อากิระ อิชิอิ¹, เคนอิจิ โคกะ¹, อากิระ สุกาวาระ⁴, ชินจิ ยาสึโนะ³, เคนจิ อุเอชิมะ³, ทาคาชิ โมริคาวะ⁵,โยชิโอะ โคนิชิ⁵, มาซาฮิโตะ อิมานิชิ⁵, อากิระ นิชิยามะ⁶, คาซึวะ นากาโอะ^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Department of Medicine and Clinical Science, Kyoto University Graduate School of Medicine, เกียวโต, ประเทศญี่ปุ่น,

²ศูนย์นวัตกรรมการแพทย์ มหาวิทยาลัยเกียวโต บัณฑิตวิทยาลัยแพทยศาสตร์ เมืองเกียวโต ประเทศญี่ปุ่น

³Department of EBM Research, Institute for Advancement of Clinical and Translational Science, Kyoto University Hospital, Kyoto, ญี่ปุ่น,

⁴แผนกโรคไต โรงพยาบาลกาชาดโอซาก้า โอซาก้า ประเทศญี่ปุ่น

5 Division of Nephrology and Hypertension, Osaka City General Hospital, โอซาก้า, ประเทศญี่ปุ่น,

6 Department of Pharmacology, Kagawa University Medical School, Kagawa, Japan

เชิงนามธรรม

หลักการและวัตถุประสงค์: เราได้รายงานว่าตัวรับค่าโทร 4 (TLR4) และลิแกนด์ภายในตัวตัวใดตัวหนึ่ง ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับมัยอีลอยด์ 8 (MRP8 หรือ S100A8) มีบทบาทสำคัญในการลุกลามของโรคไตจากเบาหวานในหนูทดลอง จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อประเมินความสำคัญของไตการแสดงออกของ MRP8 ในผู้ป่วยที่มีความอ้วน- หรือเบาหวานชนิดที่ 2โรคไต. วิธีการ: ในอาสาสมัครที่เป็นโรคเบาหวาน โรคอ้วน หรือกลุ่มควบคุม MRP8 mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนในตัวอย่างชิ้นเนื้อไตถูกกำหนดโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์และอิมมูโนฮิสโตเคมี (n=28 และ 65 ตามลำดับ) และความสัมพันธ์กับการตรวจวัดพื้นฐาน และวิเคราะห์พารามิเตอร์พยากรณ์โรค ผลของ MRP8 ต่อการแสดงออกของยีนที่ทำให้เกิดการอักเสบถูกตรวจสอบโดยใช้มาโครฟาจ ผลลัพธ์:ไตระดับการแสดงออกของยีนและโปรตีน MRP8 สูงขึ้นในกลุ่มโรคอ้วนหรือเบาหวานเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในบรรดาอาสาสมัครทั้งหมด โดยการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นแบบไม่แปรผัน MRP ของไต8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกและ MRP ของ tubulointerstitial MRP8- ที่การตรวจวัดพื้นฐานมีความสัมพันธ์กันไม่เพียงแต่กับปัจจัยเสี่ยงต่างๆ ที่ทราบกันดีสำหรับโรคไตจากโรคเบาหวานเท่านั้น (เช่น เช่น ความดันโลหิตซิสโตลิก โปรตีนในปัสสาวะ และครีเอตินีนในซีรัม) แต่ยังรวมถึงโรคไตและพังผืดในหลอดเลือด ปัจจัยอิสระที่ทำนายระดับโปรตีนในปัสสาวะในอีกหนึ่งปีต่อมาได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์หลายตัวแปร และรวมถึง MRP ของไต8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวก (b=0.59, P,0.001), โปรตีนในปัสสาวะ (b=0.37, P=0.002) และความดันโลหิตซิสโตลิก (b=0.21, P=0.04) ที่การตรวจวัดพื้นฐาน หลังจากปรับสำหรับความเสี่ยงที่ทราบ ปัจจัย. การแสดงออกของโปรตีน MRP8 ถูกสังเกตพบในซีดี68-มาโครฟาจที่เป็นบวกและหลอดแตก ในมาโครฟาจของหนูเมาส์ที่เพาะเลี้ยง การแสดงออกของโปรโตไคน์ที่เกิดจากการอักเสบของโปรตีน MRP8 ยังกระตุ้นการเหนี่ยวนำอัตโนมัติของ MRP8 ในลักษณะที่ขึ้นกับ TLR4-

สรุป: การแสดงออกของ Glomerular MRP8 ดูเหมือนจะเกี่ยวข้องกับการลุกลามของโปรตีนในปัสสาวะในผู้ป่วยโรคอ้วนหรือเบาหวานชนิดที่ 2 ซึ่งอาจเกิดจากการเปลี่ยนแปลงการอักเสบในมาโครฟาจผ่านการส่งสัญญาณ TLR4

ผลของ cistanche: การรักษาโรคไต

บทนำ

การอักเสบเรื้อรังมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของโรคเบาหวานหรือความอ้วนและโรคหลอดเลือดหัวใจตีบ [1] การมีส่วนร่วมของตัวรับภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติและแกนด์ภายในในกระบวนการของการอักเสบเรื้อรังมีความเกี่ยวข้อง โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับมัยอีลอยด์ 8 (MRP8 หรือที่เรียกว่า S100A8 หรือ calgranulin A) เดิมถูกระบุว่าเป็นโปรตีนที่จับกับแคลเซียมในไซโตพลาสซึมในนิวโทรฟิลและโมโนไซต์ [2] และได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางว่าเป็นลิแกนด์ภายในที่มีศักยภาพสำหรับตัวรับค่าโทร 4 (TLR4 ) ในโรคต่างๆ ได้แก่ ภาวะช็อกจากการติดเชื้อ ความผิดปกติของหลอดเลือดและภูมิต้านทานผิดปกติ [3,4,5] เราเพิ่งเสนอว่าการส่งสัญญาณ MRP8/TLR4 มีบทบาทสำคัญในการลุกลามของภาวะไขมันในเลือดสูงที่เกิดจากภาวะไตจากเบาหวาน [6] มาโครฟาจไตและเซลล์ท่อดักจับเป็นแหล่งสำคัญของ MRP8 ในแบบจำลองหนูเมาส์ของโรคไตจากเบาหวาน[6] และพังผืดในไต [7] ตามลำดับ ระดับ MRP8 ในพลาสมา ซึ่งมักจะสร้างสารเชิงซ้อนเฮเทอโรไดเมอร์ที่มีคู่จับ MRP14 ในกระแสเลือด จะเพิ่มขึ้นในคนอ้วน [8,9] อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีรายงานการตรวจสอบการแสดงออกของไตของ MRP8 ในผู้ป่วยโรคอ้วนหรือพิมพ์2เบาหวานและสัมพันธ์กับการพยากรณ์โรคของไต

จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการกำหนด mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ MRP8 ในไตของผู้ป่วยโรคเบาหวานชาวญี่ปุ่น (DN)ความอ้วนglomerulopathy ที่เกี่ยวข้อง (ORG) อาการไตวายน้อยที่สุด (MCNS) หรือความผิดปกติของไตเล็กน้อย (MGA) ซึ่งทั้งหมดได้รับการวินิจฉัยโดยการตรวจชิ้นเนื้อของไต และเพื่อประเมินว่าการแสดงออกของ MRP8 ของไตสามารถทำนายผลลัพธ์ของไตได้หรือไม่

Cistanche สามารถปรับปรุงการทำงานของไต

วัสดุและวิธีการ

คำชี้แจงจริยธรรม

การศึกษาในมนุษย์ดำเนินการตามหลักการที่ระบุไว้ในปฏิญญาเฮลซิงกิ และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมด้านการวิจัยมนุษย์ของมหาวิทยาลัยเกียวโตGraduate School of Medicine และ Osaka City General Hospital ตามลำดับ ผู้เข้าร่วมทั้งหมดให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร โปรโตคอลการศึกษาสัตว์ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการวิจัยสัตว์แห่งบัณฑิตวิทยาลัยแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยเกียวโต (หมายเลขใบอนุญาต: Med Kyo 13318) การผ่าตัดสัตว์ทั้งหมดดำเนินการภายใต้การระงับความรู้สึกโซเดียม pentobarbital และพยายามทั้งหมดเพื่อลดความทุกข์ทรมาน

วิชาเรียน

ผู้ป่วยโปรตีนกับความอ้วนหรือโรคเบาหวานประเภท 2 ที่ได้รับการตรวจชิ้นเนื้อไตในการศึกษาครั้งนี้ ไม่รวมผู้ป่วยที่เป็นโรคติดเชื้อ โรคมะเร็ง โรคตับ หรือโรคคอลลาเจน โปรตีนในปัสสาวะถูกกำหนดให้เป็นโปรตีนในปัสสาวะมากกว่า 0.5 ก./กรัม creatinine หรืออัลบูมินในปัสสาวะมากกว่า 300 มก./กรัม creatinine ในการวัดอย่างน้อยสองครั้งติดต่อกันโรคอ้วนถูกกำหนดให้เป็นดัชนีมวลกาย (BMI) มากกว่า 250 (kg/m²). เบาหวานชนิดที่ 2 ได้รับการวินิจฉัยตามเกณฑ์ขององค์การอนามัยโลก การวัดทางชีวเคมีในการรับการตรวจชิ้นเนื้อไตถูกใช้เป็นลักษณะพื้นฐานสำหรับการวิเคราะห์แบบภาคตัดขวาง อัตราการกรองไตโดยประมาณ (eGFR) คำนวณโดยใช้สมการทำนายแบบง่ายที่เสนอโดยสมาคมโรคไตแห่งญี่ปุ่น: eGFR (มล./นาที/1.73 ม.²)=1946 [อายุ (ปี)]20.287 6 [serum creatinine (mg perdl)]21.094 60.739 (สำหรับสตรี) ซึ่งเป็นการดัดแปลง MDRD ในพื้นที่ที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว [ 10]. วัดความเข้มข้นของครีเอตินีนในซีรัมโดยใช้วิธีเอนไซม์

สำหรับอิมมูโนฮิสโตเคมี ผู้ป่วยชาวญี่ปุ่น 65 รายที่ได้รับการตรวจชิ้นเนื้อไตที่ภาควิชาแพทยศาสตร์และคลินิก โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยเกียวโตระหว่างปี 2543 ถึง พ.ศ. 2554 ได้รับการวิเคราะห์ การวินิจฉัยการตรวจชิ้นเนื้อของผู้ป่วยทุกรายในช่วงเวลานี้แสดงไว้ในตารางที่ S1 ในไฟล์ S1 อาสาสมัครที่ตรวจสอบในงานนี้ ได้แก่ DN (n=19), ORG (n=10) และกลุ่มควบคุมที่ไม่เป็นโรคอ้วนและไม่เป็นเบาหวานที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็น MGA (n=19) หรือ MCNS (n=17) บางกรณีในหมวดหมู่เหล่านี้ไม่ได้รับการยกเว้นเนื่องจากตัวอย่างที่เหลือมีน้อยกว่า 10 glomeruli คำจำกัดความของ DN ประกอบด้วย (1) ระยะเวลามากกว่า 5 ปีหลังจากเริ่มเป็นเบาหวาน (2) การมีอยู่ของ micro- หรือ macro-albuminuria (3) การเปลี่ยนแปลงทางเนื้อเยื่อวิทยาที่เข้ากันได้กับ DN เช่น glomerular basement membrane thickening, mesangial expansion, nodular เส้นโลหิตตีบ (ก้อน Kimmelstiel-Wilson) และ / หรือหลอดเลือดแดง hyalinosis และ (4) การยกเว้นสาเหตุอื่นสำหรับความผิดปกติของไต [11] ORG ถูกกำหนดทางสัณฐานวิทยาเป็น glomerulosclerosis เฉพาะส่วนโฟกัสและ/หรือ glomerulomegaly ในอาสาสมัครที่มีทั้งความอ้วนและโปรตีนในปัสสาวะซึ่งมีคำจำกัดความอธิบายไว้ข้างต้น [12,13]

สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของ mRNA ไม่รวมตัวอย่างคุณภาพต่ำ ซึ่งระดับ ribosomal RNA (rRNA) 18S นั้นต่ำกว่าขีดจำกัดความไวในการตรวจจับโดย RT-PCR แบบเรียลไทม์ กลุ่มตัวอย่างที่ลงทะเบียนประกอบด้วยผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 จำนวน 22 รายที่ได้รับการตรวจชิ้นเนื้อไตที่โรงพยาบาล Osaka City General Hospital ระหว่างปี พ.ศ. 2543 ถึง พ.ศ. 2553 และผู้ป่วยที่ไม่เป็นเบาหวาน 6 รายที่ได้รับการตรวจชิ้นเนื้อที่ได้รับการพิสูจน์แล้ว

ตารางที่ 1 และ 2 สรุปลักษณะทางคลินิกพื้นฐานของผู้ป่วยที่ได้รับการตรวจด้วยอิมมูโนฮิสโตเคมีหรือการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนตามลำดับ สำหรับกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง ตัวอย่างเนื้อเยื่อได้รับการประมวลผลตามขั้นตอนมาตรฐาน ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลิน-อีโอซิน, กรดคาลิก-ชิฟฟ์, เมธามีน ซิลเวอร์ ที่เป็นกรดของธาตุหรือแมซสัน ไตรโครม(รูปที่ S1) อัตราส่วนของจำนวนโกลเมอรูไลกับเส้นโลหิตตีบทั่วโลกระหว่างจำนวนโกลเมอรูไลทั้งหมดและพื้นที่สัมพัทธ์ของพังผืดในท่อไตได้รับการประเมินอย่างอิสระโดยนักพยาธิวิทยาสองคนที่ไม่ทราบข้อมูลการวินิจฉัยและข้อมูลทางคลินิก

ผลของ cistanche: การรักษาโรคไต

ความหมายของผลลัพธ์ของไต

ตัวบ่งชี้การพยากรณ์โรคสองตัวต่อไปนี้ได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นและการวิเคราะห์การถดถอยโลจิสติกตามลำดับ: (1) ขอบเขตของโปรตีนในปัสสาวะที่วัดที่หนึ่งปีหลังการตรวจชิ้นเนื้อ และ (2) เหตุการณ์ของไตที่กำหนดเป็นการเพิ่มขึ้นของ creatinine ในซีรัมต่อปี .50 เปอร์เซ็นต์ จากการตรวจวัดพื้นฐานหรือการเริ่มต้นของการฟอกไตเรื้อรัง

อิมมูโนฮิสโตเคมี

อิมมูโนฮิสโตเคมีของ MRP8 และ CD68 ดำเนินการโดยใช้ไตส่วน (ความหนา 4 มม.) แก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์บัฟเฟอร์ 4 เปอร์เซ็นต์ หลังจากการดึงแอนติเจนโดยบัฟเฟอร์ซิเตรต ส่วนของไตถูกบ่มด้วยเซรั่มแพะ 10 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วย MRP8 ที่ต่อต้านมนุษย์ของหนูเมาส์ (1:100; BMA biomedicals, Augst, Switzerland)[14] หรือแอนติบอดีต่อต้าน CD68 ของมนุษย์ในหนูเมาส์ (1:50) ; DAKO, Ely, UK) ตามลำดับ แอนติบอดีปฐมภูมิถูกแสดงภาพด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตของฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสและ 3,3-ไดอะมิโนเบนซิดีน เตตระไฮโดรคลอไรด์ (Dako USA, Carpinteria, CA) นิวเคลียสถูกย้อมด้วยฮีมาทอกซิลิน MRP8-เซลล์บวกถูกนับในโกลเมอรูไลมากกว่า 10 ตัว และ MRP8-พื้นที่บวกใน tubulointerstitium ถูกวัดในเชิงปริมาณเพื่อให้ได้ค่าเฉลี่ยสำหรับแต่ละวิชาโดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorph 7.5 (อุปกรณ์โมเลกุล Downingtown, PA, USA ). Colocalization ของ CD68- และ MRP8- เซลล์บวกถูกประเมินด้วยส่วนอนุกรม ไม่มีสัญญาณ MRP8 หรือ CD68 ในกลุ่มควบคุมเชิงลบที่ย้อมโดยไม่มีแอนติบอดีที่หนึ่ง (รูปที่ S2) การบ่มล่วงหน้าของแอนติบอดีต้าน MRP8 ที่มีโปรตีน MRP8 ของมนุษย์ลูกผสมเกิน 20 โมลาร์ (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ที่ 4uC ในชั่วข้ามคืน การย้อมสีลดลงอย่างเห็นได้ชัด ถ้าไม่สมบูรณ์ สนับสนุนความจำเพาะเพิ่มเติมของแอนติบอดีต่อไป (รูปที่ S3) .

Cistanche รักษาไต

การประเมินการแสดงออกของ mRNA

แช่แข็งไตส่วนต่างๆ ถูกแยกออกเป็นเนื้อเยื่อโกลเมอรูลีและนอโกลเมอรูลัสโดยใช้เลเซอร์ดักจับไมโครดิสเซชัน (LM200; โอลิมปัส โตเกียว ญี่ปุ่น) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [15] RNA ทั้งหมดถูกสกัดด้วย RNeasy mini kit (Qiagen, Tokyo, Japan) ระดับการแสดงออกของ mRNA ถูกกำหนดโดย PCR แบบเรียลไทม์ของ TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [16,17] ระดับการแสดงออกของยีนทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยระดับ 18S rRNA (การควบคุมภายใน) ดูตาราง S2 ในไฟล์ S1 สำหรับลำดับไพรเมอร์และโพรบ ตรวจพบ Eukaryotic 18S rRNA ด้วย PreDeveloped TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystems)

ตารางที่ 1. ลักษณะทางคลินิกพื้นฐานของผู้ป่วยที่ตรวจชิ้นเนื้อไตที่ได้รับการวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีน MRP8 โดยอิมมูโนฮิสโตเคมี

MGA: ความผิดปกติของไตเล็กน้อย, MCNS: โรคไตเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด, ORG:ความอ้วนglomerulopathy ที่เกี่ยวข้อง, DN: โรคไตจากเบาหวาน, BMI: ดัชนีมวลกาย, BUN: ยูเรียไนโตรเจนในเลือด, CRP: โปรตีน C-reactive ข้อมูลหมายถึง 6 SD *เปรียบเทียบความแตกต่างโดยรวมระหว่างกลุ่ม MGA, MCNS, ORG และ DN โดย ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

การรักษาด้วย MRP8 ของแมคโครฟาจ

มาโครฟาจที่ได้มาจากไขกระดูกถูกสร้างขึ้นจากหนูเมาส์แบบ wild-type หรือ TLR4 knockout (KO) [18] บนพื้นหลังทางพันธุกรรม C57BL/6J (Oriental BioService, Kyoto, Japan) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [6] โดยสังเขป หลังจากการสลายของเซลล์เม็ดเลือดแดง เซลล์ไขกระดูกถูกแขวนลอยใหม่ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีซีรัมของทารกในครรภ์ 20 เปอร์เซ็นต์และปัจจัยกระตุ้นมาโครฟาจ-โคโลนีของมนุษย์ลูกผสม 50 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) และเพาะเลี้ยงที่ 37uC ในบรรยากาศ CO2 5 เปอร์เซ็นต์ ในวันที่ 7 มาโครฟาจถูกบ่มด้วย MRP8 ของหนูเมาส์ลูกผสม (Abnova, ไทเป, ไต้หวัน) หรือยานพาหนะเป็นเวลา 4 ชั่วโมง Polymyxin B (25 มก./มล., NacalaiTesque, Kyoto, Japan) ถูกเติมในแต่ละหลุมเพื่อลดการปนเปื้อนของเอนโดทอกซินตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [3,19] ตรวจพบ Noendotoxin ที่ความเข้มข้นใดๆ ของ MRP8 ที่ทดสอบภายหลังการฟักไข่ด้วย polymyxin B 25 มก./มล. โดย ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA) RNA ทั้งหมดจากเซลล์ถูกสกัดด้วย RNeasy MiniKit และระดับการแสดงออกของ mRNA ของ interleukin-1 beta (IL-1b), tumor necrosis factor-alpha (TNFa) และ MRP8 ถูกกำหนดโดย TaqMan แบบเรียลไทม์ RT-PCR. ระดับการแสดงออกของยีนทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยระดับ GAPDH ของสัตว์ฟันแทะ (การควบคุมภายใน, รีเอเจนต์การทดสอบ TaqMan Assay ที่พัฒนาแล้ว) ลำดับไพรเมอร์และโพรบสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์แสดงอยู่ในตาราง S2 ในไฟล์ S1

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย 6 SD หรือหมายถึงช่วงความเชื่อมั่น 695 เปอร์เซ็นต์ (CI) ตามความเหมาะสม สำหรับการเปรียบเทียบระหว่างสี่กลุ่ม จะใช้ ANOVA แบบทางเดียวหรือสองทางกับการวิเคราะห์หลังการวิเคราะห์ของ Bonferroni และเปรียบเทียบตัวแปรเชิงหมวดหมู่โดยใช้การทดสอบ x2 การทดสอบ t แบบ unpaired ของนักเรียนถูกนำมาใช้เพื่อเปรียบเทียบระหว่างสองกลุ่มตามความเหมาะสม ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์สเปียร์แมนถูกประเมินเพื่อกำหนดความสัมพันธ์ระหว่างสองตัวแปร เพื่อตรวจสอบผลของค่าความแปรปรวนร่วมพื้นฐานที่กำหนดขอบเขตของการแสดงออกของ MRP8 ไตหรือ tubulointerstitial หรือระดับโปรตีนในปัสสาวะหนึ่งปีหลังจากทำการวิเคราะห์ biopsy, univariate และ multivariate linear regression การวิเคราะห์การถดถอยโลจิสติกใช้ในการวิเคราะห์ตัวแปรอธิบายทำนายการเกิดเหตุการณ์ไต ข้อมูลทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ StatView 5.{9}} (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA) ค่า P,0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

ผลของ cistanche: การรักษาโรคไต

ผลลัพธ์

เราเปรียบเทียบระดับการแสดงออกของโปรตีน MRP8 ในไตในกลุ่ม DN, ORG และกลุ่มที่ไม่เป็นโรคอ้วน กลุ่มควบคุมที่ไม่เป็นเบาหวาน (MGA และ CNS) การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีพบว่าทั้ง MRP ของไต8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวก (รูปที่ 1A) และ MRP ของเนื้อเยื่อตับ8-ที่เป็นบวก (รูปที่ 1B) ใน DN มีขนาดใหญ่กว่าในกลุ่มอื่นๆ อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งรวมถึง MGA, MCNS, และ ORG (ป<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

ตารางที่ 2. ลักษณะทางคลินิกพื้นฐานของผู้ป่วยที่ตรวจชิ้นเนื้อไตที่ได้รับการวิเคราะห์การแสดงออกของ MRP8 mRNA ด้วย RT-PCR แบบเรียลไทม์

ความสัมพันธ์ระหว่างไตสัญญาณ MRP8 และพารามิเตอร์ทางคลินิกที่การตรวจวัดพื้นฐานในช่วงเวลาของการตรวจชิ้นเนื้อไตถูกวิเคราะห์แบบภาคตัดขวาง (ตารางที่ 3) โดยการวิเคราะห์แบบไม่แปรผัน การแสดงออกของโปรตีน MRP8 ของไตและ/หรือ tubulointerstitial มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับอายุ ความดันโลหิตซิสโตลิกและไดแอสโตลิก โปรตีนในปัสสาวะ ระดับครีเอตินีนในเลือด BUN และ HDL โคเลสเตอรอล eGFR และขอบเขตของโกลเมอรูลอสเคลอโรซิสและพังผืดในหลอดเลือด พารามิเตอร์เหล่านี้ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมโดยการวิเคราะห์หลายตัวแปรหลังจากไม่รวมความดันโลหิต diastolic, eGFR และ BUN เนื่องจากความสอดคล้องกัน เปอร์เซ็นต์ของการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial มีความสัมพันธ์อย่างอิสระกับสัญญาณ glomerularMRP8 (b=0.62, ปรับ P=0.02) และสัญญาณ tubulointerstitialMRP8 (b=0.85, ปรับ P ,0.001) ตามลำดับ นอกจากนี้ สัญญาณ MRP8 ของ tubulointerstitial ยังมีความสัมพันธ์อย่างอิสระกับโปรตีนในปัสสาวะที่ตรวจวัดพื้นฐาน (b=0.20, ปรับ P=0.01) การวิเคราะห์พล็อตแบบกระจัดกระจายระหว่างสัญญาณ MRP8 ในโกลเมอรูไลหรือทูบูโลอินเทอร์สตีเทียม และพารามิเตอร์ทางคลินิกบ่งชี้ว่า MCNSgroup มี รูปแบบการกระจายที่แตกต่างจากกลุ่มอื่น โดยเฉพาะโปรตีนในปัสสาวะและระดับ LDL โคเลสเตอรอลในซีรัม (รูปที่ S5A–D, S6A–D) การยกเว้นกลุ่ม MCNS ปรับปรุงความสัมพันธ์ระหว่างสัญญาณ MRP8 กับโปรตีนในปัสสาวะหรือระดับ LDL-โคเลสเตอรอลในซีรัม (รูปที่ S5E–F, S6E–F) ดังนั้นเราจึงทำการวิเคราะห์ย่อยโดยไม่รวมผู้ป่วย MCNS และพบว่าโปรตีนในปัสสาวะเป็นปัจจัยอิสระที่สัมพันธ์กับสัญญาณไต MRP8 โดยการวิเคราะห์หลายตัวแปร (ตารางที่ 4; b=0.36, ปรับ P=0.03 ).

ต่อไป เราทำการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นหรือการวิเคราะห์การถดถอยโลจิสติกเพื่อระบุปัจจัยอธิบายที่ทำนายผลลัพธ์ของไตซึ่งเป็นระดับของโปรตีนในปัสสาวะในอีกหนึ่งปีต่อมาและเหตุการณ์ของไตภายในหนึ่งปี เนื่องจากมีความสัมพันธ์ที่ดีระหว่างสัญญาณ MRP8 ของไตและ tubulointerstitial (รูปที่ S7; R=0.67,P,0001) พารามิเตอร์เหล่านี้จึงถูกลงทะเบียนในการวิเคราะห์เพิ่มเติม . เราประเมินความสัมพันธ์ระหว่างพารามิเตอร์พื้นฐานและโปรตีนในปัสสาวะที่ 1 ปีหลังจากการตรวจชิ้นเนื้อไตโดยการวิเคราะห์การถดถอยพหุคูณ ตามที่แสดงในตารางที่ 5 สัญญาณ MRP8 ของไต (b=0.59, ปรับ P, 0.001) เป็นปัจจัยทำนายสำหรับระดับโปรตีนในปัสสาวะในอีกหนึ่งปีต่อมา เช่นเดียวกับความดันโลหิตซิสโตลิกที่เส้นพื้นฐาน (b {{13} }.21, ปรับ P=0.04) และโปรตีนในปัสสาวะที่เส้นพื้นฐาน (b=0.37, P ที่ปรับแล้ว=0.002) ถูก พารามิเตอร์เหล่านี้ไม่ขึ้นกับปัจจัยเสี่ยงอื่นๆ เกี่ยวกับโรคไตจากเบาหวาน ซึ่งรวมถึงความผิดปกติของไต (serum creatinine) และขอบเขตของ global sclerosis และ tubulointerstitial fibrosis [11,21–24] ในทางกลับกัน สัญญาณ MRP8 ของ tubulointerstitial (b=0.34, ปรับ P=0.09) ไม่ใช่ปัจจัยทำนายอิสระสำหรับระดับโปรตีนในปัสสาวะในอีกหนึ่งปีต่อมา เหตุการณ์เกี่ยวกับไตเกิดขึ้นในผู้ป่วย 7 ราย (6 ใน DN และ 1 ในกรณี ORG) ภายในหนึ่งปีหลังจากการตรวจชิ้นเนื้อไต จากการวิเคราะห์แบบ univariate ไม่เพียงแต่ขอบเขตของ glomerulosclerosis และ tubulointerstitial fibrosis และสัญญาณ MRP8 ของไตและไตเท่านั้น แต่ยังรวมถึงความดันโลหิต ความผิดปกติของไต และระดับโปรตีนในปัสสาวะที่การตรวจวัดพื้นฐานเป็นปัจจัยคาดการณ์ที่สำคัญสำหรับการเกิดเหตุการณ์เกี่ยวกับไต อย่างไรก็ตาม โดยการวิเคราะห์หลายตัวแปร โควาเรียของพวกมันถูกยกเลิกโดยกันและกัน (ตาราง S3 ในไฟล์ S1) มีแนวโน้มว่าจะมีความสัมพันธ์สูงระหว่างพารามิเตอร์เหล่านี้

สุดท้าย เราได้ตรวจสอบศักยภาพของ MRP8 ในฐานะลิแกนด์ภายในตัวสำหรับ TLR4 โดยใช้มาโครฟาจที่เพาะเลี้ยง ในมาโครฟาจที่ได้มาจากไขกระดูกจากหนูป่า การควบคุมที่เพิ่มขึ้นจากโปรตีน MRP8 ของยีนไซโตไคน์ที่มีการอักเสบ เช่น IL-1b และTNFa และยังกระตุ้นการเหนี่ยวนำอัตโนมัติของ MRP8 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาระหว่าง 1{{ 15}}–1000 นาโนกรัม/มล. ผลกระทบเหล่านี้ของ MRP8 ถูกระงับประมาณสองในสามในมาโครฟาจที่ได้จากหนูเมาส์ TLR4 KO (P,0.01) (รูปที่ 3)

รูปที่ 1 การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีและ mRNA สำหรับ MRP8 inไตตัวอย่างการตรวจชิ้นเนื้อ การหาปริมาณของ MRP ของไต{{0}}จำนวนเซลล์ที่เป็นบวก (A) และ MRP ของ tubulointerstitial8-พื้นที่บวก (B) การแสดงออกของ mRNA ของ MRP8 ในเศษส่วนของไตและส่วนที่ไม่ใช่ไต (C) บาร์เปิด: การควบคุมที่ไม่อ้วนและไม่เป็นเบาหวาน ได้แก่ MGA หรือ MCNS แถบปิด: ORG หรือ DN (A–C) รูปภาพตัวแทนของกลุ่ม MGA, MCNS, ORG และ DN (D–G) MGA: ความผิดปกติของไตเล็กน้อย, MCNS: โรคไตที่เปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด, ORG: โรคไตที่เกี่ยวข้องกับโรคอ้วน, DN: โรคไตจากเบาหวาน *ป,0.01.ดอย:10.1371/journal.pone.0088942.g001

การอภิปราย

การศึกษาในปัจจุบันได้แสดงให้เห็นว่า MRP8 แสดงออกอย่างมากมายใน glomeruli และ tubulointerstitium ของผู้ป่วยที่มี DNAs เมื่อเปรียบเทียบกับ ORG และกลุ่มควบคุมที่ไม่เป็นโรคอ้วนและไม่เป็นเบาหวาน (MGAand MCNS) นอกจากนี้ ในวิชา ORG ระดับการแสดงออกของ MRP8 มีแนวโน้มที่จะสูงกว่าวิชา MGA หรือ MCNS ในการศึกษาภาคตัดขวางพื้นฐานซึ่งรวมถึงทุกวิชา โดยการวิเคราะห์การถดถอยเชิงเส้นแบบไม่แปรผัน, MRP ของไต8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกและ MRP ของ tubulointerstitial8-พื้นที่บวกมีความสัมพันธ์กันไม่เพียงแต่กับปัจจัยเสี่ยงต่างๆ ที่ทราบแล้วสำหรับ โรคไตจากเบาหวาน (เช่น ความดันโลหิตซิสโตลิก, โปรตีนในปัสสาวะ, และครีเอตินินในซีรัม) แต่ยังรวมถึงระดับของภาวะเกล็ดเลือดต่ำและพังผืดในหลอดเลือด จากการวิเคราะห์หลายตัวแปร tubulointerstitial MRP8-บริเวณที่เป็นบวกมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับโปรตีนในปัสสาวะและการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial Glomerular MRP8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial ในการวิเคราะห์ปฐมภูมิ และกับโปรตีนในปัสสาวะในการวิเคราะห์ย่อยโดยไม่รวมกลุ่ม MCNS อิมมูโนฮิสโตเคมีบ่งชี้ว่า MRP8 ถูกแสดงออก อย่างน้อยก็บางส่วนโดย CD68( บวก ) ซึ่งแสดงออกมาโครฟาจและหลอดแกร็น การค้นพบนี้ทำให้เกิดความเป็นไปได้ว่าไตสัญญาณ MRP8 ใน glomeruli หรือ tubulointerstitium อาจทำหน้าที่เป็นเครื่องหมายใหม่ของโรคไตจากโรคเบาหวาน

รูปที่ 2 การแปลการแสดงออกของโปรตีน CD68 และ MRP8 ในส่วนต่อเนื่องของกรณีโรคไตจากเบาหวาน การแสดงออกของ CD68(A, B) และการแสดงออกของ MRP8 (C, D) ในตัวอย่างไตที่จับคู่ (A และ C, หรือ B และ D) ลูกศรระบุการ colocalization ของสัญญาณ CD68 และ MRP8.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

ในการศึกษาพยากรณ์โรค การวิเคราะห์หลายตัวแปรเปิดเผยว่าระดับโปรตีนในปัสสาวะที่หนึ่งปีหลังจากการตรวจชิ้นเนื้อไตมีความเกี่ยวข้องอย่างอิสระกับ MRP ของไต8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวก โปรตีนในปัสสาวะ และความดันโลหิตซิสโตลิกที่การตรวจวัดพื้นฐาน ข้อสังเกต การแสดงออกของ MRP8 ของไตแสดงความสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นที่สุดกับโปรตีนในปัสสาวะในอีกหนึ่งปีต่อมา (b= 0.87) ซึ่งแข็งแกร่งกว่าโปรตีนในปัสสาวะที่ตรวจวัดพื้นฐาน (b=0.78) โดยการวิเคราะห์แบบไม่แปรผัน ส่วนหนึ่งเป็นเพราะการแสดงออกของ MRP8 ของไตไม่ได้เพิ่มขึ้นอย่างมากในรูปแบบของโปรตีนในปัสสาวะที่ 'ไม่เป็นพิษเป็นภัย' เช่นที่พบในผู้ป่วย MCNS ซึ่งมีระดับโปรตีนในปัสสาวะสูงมากในการวินิจฉัยโดยการตรวจชิ้นเนื้อไต แต่มักจะได้รับการแก้ไขภายในหนึ่งปีหลังจากเริ่มการรักษาด้วยภูมิคุ้มกัน การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกของ MRP8 ของไตอาจมีลักษณะการทำนายที่ไม่ซ้ำใครในฐานะตัวบ่งชี้โรค ซึ่งไม่สามารถแทนที่ด้วยโปรตีนในปัสสาวะที่เส้นพื้นฐานหรือการวิเคราะห์ทางพยาธิวิทยาเป็นประจำเพื่อประเมินภาวะโรคหลอดเลือดตีบทั่วโลกและการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial ยิ่งกว่านั้น เราคาดการณ์ว่านิพจน์ MRP8 ของไตไม่ใช่เครื่องหมายธรรมดาหรือผู้ยืนดู แต่เป็นผู้เล่นที่กระฉับกระเฉงในการบาดเจ็บของไตตามที่กล่าวไว้ด้านล่าง

สัมประสิทธิ์การกำหนด (R2) ที่คำนวณด้วยพารามิเตอร์อธิบายที่ลงทะเบียนในการวิเคราะห์การถดถอยพหุคูณคือ 0.52* และ 0.74# ตามลำดับ y, ปี; ความดันโลหิต, ความดันโลหิต; gCr, g creatinine; T-chol, คอเลสเตอรอลรวม; HDL-Chol, HDL คอเลสเตอรอล; LDL-chol, LDL คอเลสเตอรอล; GS, glomerulosclerosis; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

ตารางที่ 4. การวิเคราะห์ย่อยของความสัมพันธ์ระหว่างพารามิเตอร์ทางคลินิกพื้นฐานและสัญญาณ MRP8 หลังจากการยกเว้นกลุ่ม MCNS

ตารางที่ 5. การวิเคราะห์การถดถอยพหุคูณเพื่อระบุปัจจัยที่ทำนายระดับโปรตีนในปัสสาวะ 1 ปีหลังการตรวจชิ้นเนื้อไต

รูปที่ 3 ผลของ MRP8 ต่อมาโครฟาจที่ได้มาจากไขกระดูก มาโครฟาจที่ได้มาจากไขกระดูก (BMDM) ถูกกระตุ้นด้วย MRP8 ของหนูเมาส์ลูกผสมเป็นเวลา 4 ชั่วโมง แถบข้อผิดพลาดระบุ CI 95 เปอร์เซ็นต์ และการวิเคราะห์ทางสถิติถูกดำเนินการด้วยค่าที่แปลงบันทึก การวิเคราะห์ความแปรปรวนสองทางเปิดเผยผลกระทบที่มีนัยสำคัญของจีโนไทป์ ความเข้มข้นของ MRP8 และปฏิกิริยาต่อการแสดงออกของยีนทั้ง 3 ตัว (P,0001 สำหรับการเปรียบเทียบทั้งหมด) น=4 WT ชนิดไวด์; KO, น็อคเอาท์; IL-1b, อินเตอร์ลิวกิน 1 เบต้า; TNFa ปัจจัยเนื้อร้ายเนื้องอก-อัลฟา *P,0.01 ในระดับความเข้มข้นต่างกัน, #P,0.01 ในกลุ่ม genotypes.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

ในความพยายามอีกครั้งของการศึกษาตามยาว การวิเคราะห์การถดถอยโลจิสติกล้มเหลวในการค้นหาตัวทำนายอิสระสำหรับการเกิดเหตุการณ์ไตภายในหนึ่งปี เราคาดการณ์ว่าส่วนหนึ่งเป็นเพราะการแสดงออกของ MRP8 ของ tubulointerstitial และการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial เป็นตัวทำนายที่มีศักยภาพสองตัวสำหรับเหตุการณ์ของไตในการวิเคราะห์แบบไม่แปรผัน แต่ความสำคัญของพวกมันถูกยกเลิกโดยกันและกันในการวิเคราะห์หลายตัวแปร พารามิเตอร์ทั้งสองนี้แสดงความสัมพันธ์ที่ชัดเจน (R=0.68, P,0.001) (รูปที่ S8) ซึ่งบ่งชี้ว่าพารามิเตอร์ทั้งสองนี้อาจเทียบเท่ากับการทำนายเหตุการณ์ของไต อันที่จริง การแสดงออกของ MRP8 คั่นระหว่างหน้าแสดงรูปแบบที่ค่อนข้างคล้ายกันกับการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้าซึ่งประเมินโดยการย้อมสี Masson trichrome ปริมาณของ MRP8 คั่นระหว่างหน้าส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับสัญญาณเชิงบวกในหลอด atrophic มากกว่าสัญญาณในมาโครฟาจ ซึ่งมีลักษณะแตกต่างจากของไต MRP8 ในการแจกแจงเครื่องหมายวรรคตอน นอกจากนี้ ขนาดตัวอย่างที่เล็ก ระยะเวลาการสังเกตสั้น และอาสาสมัครเพียงไม่กี่คนที่พัฒนาเหตุการณ์เกี่ยวกับไตอาจลดกำลังในการตรวจจับ เนื่องจากการแสดงออกของ MRP8 ในเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อมีบทบาทสำคัญในการลุกลามของการอักเสบของเนื้อเยื่อตับในแบบจำลองเมาส์ของการเกิดพังผืดในไต[7] การวิเคราะห์เพิ่มเติมจะต้องชี้แจงบทบาทของ MRP8 ของ tubulointerstitial ใน DN

ตามการศึกษาก่อนหน้านี้ของเรา [6], MRP8 mRNA ได้รับการควบคุมอย่างเด่นชัดในส่วนของไตของอาสาสมัคร DN ของมนุษย์เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่มี MGA ในทางกลับกัน การแสดงออกของโปรตีน MRP8 ไม่เพียงสังเกตพบในโกลเมอรูลัสเท่านั้น แต่ยังสังเกตพบในทูบูโลอินเทอร์สติเทียมด้วย ในเรื่องนี้ ควรสังเกตว่า MRP8staining มีสองรูปแบบที่แตกต่างกันใน tubulointerstitium ของ DN หนึ่งคือการย้อมสีที่เข้มข้นและโฟกัสในท่อที่ตีบอย่างรุนแรง อีกวิธีหนึ่งคือการย้อมสีอ่อนๆ กระจายไปตามขอบแปรงของท่อใกล้เคียง ซึ่งพบใน ORG และ MCNS ด้วย สัญญาณหลังน่าจะเป็นตัวแทนของโปรตีน MRP8 ที่ได้มาจากเลือดและถูกดูดกลับโดยหลอดใกล้เคียง ซึ่งไม่ควรมาพร้อมกับการแสดงออกของ MRP8 mRNA ที่เพิ่มขึ้น เกี่ยวกับโปรตีนอื่นที่ไม่ใช่ MRP8 เราและคนอื่นๆ ได้รายงานปรากฏการณ์ที่คล้ายคลึงกันของการตรวจหาโปรตีนอิมมูโนรีแอกทีฟในท่อใกล้เคียงที่เกิดจากการดูดซึมซ้ำแต่ไม่ได้เกิดจากการสังเคราะห์ของไต [25,26] ในทางกลับกัน เนื่องจากการย้อมสี MRP8 เพียงเล็กน้อยยังคงอยู่ในการทดสอบการดูดซึมแอนติบอดี โดยเฉพาะอย่างยิ่งในรอยโรคไตและรอยโรคพังผืดที่มีแผลเป็นรุนแรงรอบ ๆ ท่อแกร็น การมีอยู่ของสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงจึงไม่สามารถลบล้างได้อย่างสมบูรณ์ (รูปที่ S3)

สัญญาณ Glomerular MRP8 ส่วนใหญ่แสดงรูปแบบเครื่องหมายวรรคตอนในอาสาสมัคร DN (รูปที่ 1, รูปที่ S4) เนื่องจากทั้ง CD68 และ MRP8 ตรวจพบโดยโมโนโคลนอลแอนติบอดีของหนูเมาส์ การแปลตำแหน่งของโมเลกุลเหล่านี้จึงถูกประเมินโดยส่วนต่อเนื่อง ไม่ใช่โดยการสร้างภูมิคุ้มกันสองครั้ง รูปแบบการย้อมสีของ MRP8 เข้ากันได้กับผู้ที่อยู่ในความผิดปกติของไตอักเสบอื่น ๆ รวมถึง IgAnephritis [27], membranoproliferative glomerulonephritis [14] และ glomerulonephritis ที่เกี่ยวข้องกับ ANCA [20] ซึ่งแนะนำว่ามาโครฟาจเป็นแหล่งสำคัญของ MRP8 ตามที่เรารายงาน โมเดลหนู [6] นอกจากนี้ นิวโทรฟิลยังถือเป็นอีกแหล่งหนึ่งของ MRP8 ที่มีผลต่อภาวะแทรกซ้อนของหลอดเลือด [28] ขณะนี้ เรากำลังตรวจสอบกลไกระดับโมเลกุลว่าเหตุใด MRP8 จึงได้รับการควบคุมอย่างเด่นชัดในเซลล์ myeloid-lineage ที่แทรกซึมเข้าสู่โกลเมอรูไล การศึกษาในหลอดทดลองเปิดเผยว่า MRP8 กระตุ้นการแสดงออกของไซโตไคน์ที่มีการอักเสบและยังกระตุ้นการแสดงออกของ MRP8 เองในมาโครฟาจในลักษณะที่ขึ้นกับ TLR4- นอกจากนี้ MRP8-เซลล์บวกไม่มีอยู่ในรอยโรคเส้นโลหิตตีบเป็นก้อนกลม ซึ่งบ่งชี้ว่า MRP8 ของไตอาจสะท้อนความเสียหายของไตอย่างต่อเนื่อง [20] ที่สำคัญ การศึกษาในมนุษย์ขนาดใหญ่ที่สุดรายงานว่าการแสดงออกของยีน MRP8 ในเซลล์โมโนนิวเคลียร์ในเลือดของผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 1 นั้นเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในผู้ที่มีภาวะแทรกซ้อนจากโรคเบาหวานรวมถึงโรคไต [29]

เนื่องจากการยับยั้งระบบ renin-angiotensin (RAS) เป็นตัวกำหนดสำคัญของผลลัพธ์ของไต เราจึงตรวจสอบผลกระทบของ RASblockade ต่อไตนิพจน์ MRP8 เราพบว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของ MRP8 mRNA ของไตระหว่างผู้ป่วย DN ที่รักษาโดยมีหรือไม่มีการปิดกั้น RAS (รูปที่ S9) อาจเป็นเพราะกรณีที่รับการรักษาด้วย RAS blockade มักจะมีความดันโลหิตสูงและโปรตีนในปัสสาวะรุนแรงกว่ากรณีที่ไม่มี RAS blockade

ในคนและหนูที่เป็นโรคอ้วน MRP8/14complex ในพลาสมาที่เพิ่มขึ้นอาจสะท้อนถึงระดับของความอ้วนและมีต้นกำเนิดจาก adipocytes เช่นเดียวกับ leukocytes [8,9] เคส ORG ของเรามีรอยเปื้อนเล็กน้อยของ MRP8 ในท่อใกล้เคียง ซึ่งบ่งชี้ว่าระดับ MRP8 ในพลาสมาเพิ่มขึ้น ในทางตรงกันข้าม ไม่มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญระหว่างการแสดงออกของ MRP8 ของ tubulointerstitial และดัชนีมวลกาย (รูปที่ S6G) ดังนั้น นิพจน์ MRP8 ท้องถิ่นในไตอาจทำหน้าที่เป็นเครื่องหมายสำหรับการบาดเจ็บของไตได้ดีกว่าสำหรับความอ้วน[8,9].

Cistanche สำหรับการปรับปรุงความผิดปกติของไต

การศึกษาของเรามีข้อ จำกัด หลายประการ. จำนวนกลุ่มตัวอย่างแต่ละกลุ่มที่ศึกษามีน้อย อาสาสมัครที่ไม่เหมือนกันลงทะเบียนใน mRNA และการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี เนื่องจากเราวิเคราะห์เฉพาะผู้ป่วยที่ได้รับการตรวจชิ้นเนื้อไต องค์ประกอบของผู้ป่วยที่ตรวจสอบที่นี่อาจไม่สะท้อนถึงผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 2 ทั่วไปหรือในผู้ป่วยเรื้อรังทั่วไปไตวิชาโรค แม้ว่าอายุจะไม่ถูกเก็บไว้เป็นปัจจัยอิสระที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณ MRP8 ในข้อมูลของเรา (ตารางที่ 3) เป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วว่าความชรานั้นสัมพันธ์กับการอักเสบเรื้อรัง [30] ผลกระทบของอายุไม่สามารถละเลยได้อย่างสมบูรณ์ แม้ว่าสัญญาณ MRP8 ส่วนใหญ่จะหายไปในการทดสอบการดูดซึมแอนติบอดี แต่ก็มีสัญญาณเชิงบวกบางส่วนที่เหลืออยู่ ซึ่งอาจเกิดจากการจับที่ไม่จำเพาะของแอนติบอดีตัวแรก ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น การตรวจสอบการแสดงออกของ MRP8 ของไตโดยการตรวจชิ้นเนื้อไตช่วยให้เราเข้าใจพยาธิสรีรวิทยาและการพยากรณ์โรคของไตเรื้อรัง โดยเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับความอ้วนและโรคเบาหวาน แต่มีข้อเสียในการใช้ประจำและซ้ำในคลินิกผู้ป่วยนอก

โดยสรุป การศึกษาในปัจจุบันชี้ให้เห็นว่าการแสดงออกของ MRP8 ในไตสะท้อนถึงสถานะทางพยาธิวิทยาในปัจจุบันและทำนายผลลัพธ์ของไตในผู้ป่วยด้วยความอ้วนหรือเบาหวานชนิดที่ 2. อาจมีการตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อศึกษาระดับ MRP8 ของปัสสาวะในผู้ป่วยโรคอ้วนหรือเบาหวานในปริมาณมาก

ข้อมูลสนับสนุน

รูปที่ S1 ภาพถ่ายที่แสดงตัวอย่างซึ่งแสดงส่วนการตัดชิ้นเนื้อไตของผู้ป่วย DN ที่ย้อมด้วย (A) กรดชิฟฟ์เป็นระยะ (B) เมธามีนที่เป็นกรดเป็นระยะหรือ (C) แมสสันไตรโครม อัตราส่วนของจำนวนโกลเมอรูลีที่มีโกลเมอรูไลที่มีเส้นโลหิตตีบทั่วโลก (ลูกศร) ระหว่างโกลเมอรูไลทั้งหมดและพื้นที่สัมพัทธ์ของพังผืดในท่อไตอยู่ที่ 33 เปอร์เซ็นต์ และ 65 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ในผู้ป่วยรายนี้ (TIFF)

รูปที่ S2 อิมมูโนฮิสโตเคมีสำหรับโปรตีน MRP8 และ CD68 ในผู้ป่วย DN ภาพถ่ายในคอลัมน์ด้านขวาแสดงการทดลองกลุ่มควบคุมเชิงลบโดยไม่มีแอนติบอดีที่ 1 (ทีไอเอฟ)

รูปที่ S3 การทดสอบการดูดซึมแอนติบอดีสำหรับการย้อมสี MRP8.PBS: น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต, rhMRP8: recombinant humanMRP8.(TIF)

รูปที่ S4 ภาพถ่ายตัวแทนของนิพจน์ MRP8 ในกลุ่ม MGA, MCNS, ORG และ DN (TIF)

รูปที่ S5 ความสัมพันธ์ระหว่าง MRP ของไต8-จำนวนเซลล์ที่เป็นบวกและพารามิเตอร์ทางคลินิก ใช้ค่าที่แปลงบันทึกของสัญญาณ MRP8 วิเคราะห์ความสัมพันธ์โดยใช้ทั้ง 4 กลุ่ม (A–D, G) หรือ 3 กลุ่ม ยกเว้นกลุ่ม MCNS (E, F) วงกลมเปิด: ความผิดปกติของไตเล็กน้อย (MGA), วงกลมปิด: โรคไตเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด (MCNS), รูปสามเหลี่ยมเปิด:ความอ้วน-โรคไตที่เกี่ยวข้อง (ORG), สามเหลี่ยมปิด: โรคไตจากเบาหวาน (DN).(TIF)

รูปที่ S6 ความสัมพันธ์ระหว่าง MRP ของ tubulointerstitial8-พื้นที่บวกและพารามิเตอร์ทางคลินิก ใช้ค่าที่แปลงบันทึกของสัญญาณ MRP8 วิเคราะห์ความสัมพันธ์เหล่านี้โดยใช้ทั้ง 4 กลุ่ม (A–D, G) หรือ 3 กลุ่ม ยกเว้นกลุ่ม MCNS (E, F) (TIF)

รูปที่ S7 ความสัมพันธ์ระหว่างนิพจน์ MRP8 ของไตและ tubulointerstitial ใช้ค่าที่แปลงบันทึกของสัญญาณ MRP8 (TIF)

รูปที่ S8 ความสัมพันธ์ระหว่าง MRP ของ tubulointerstitial8-บริเวณที่เป็นบวกและการเกิดพังผืดของ tubulointerstitial ใช้ค่าที่แปลงบันทึกของสัญญาณ MRP8 (TIF)

รูปที่ S9 การแสดงออกของ mRNA ของไตของ MRP8 ในผู้ป่วย DN ที่มีหรือไม่มีการปิดกั้น renin-angiotensin NS: ไม่มีนัยสำคัญ n=15 (ใช่), 6 (ไม่ใช่) ในบรรดาผู้ป่วย 22 ราย DN ไม่มีข้อมูลเกี่ยวกับยาในผู้ป่วยรายเดียว (TIF)

ไฟล์ S1 รองรับตาราง

ตารางที่ S1 การวินิจฉัยทางพยาธิวิทยาของทุกกรณีที่ได้รับการตรวจชิ้นเนื้อไตที่ภาควิชาอายุรศาสตร์และวิทยาศาสตร์คลินิก โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยเกียวโตระหว่างปี 2543 ถึง พ.ศ. 2554 ตาราง S2 ลำดับไพรเมอร์และโพรบสำหรับ RT-PCR แบบเรียลไทม์ของ TaqMan ตาราง S3 การวิเคราะห์การถดถอยโลจิสติกสำหรับการเกิดเหตุการณ์ไตภายในหนึ่งปี (DOC)การตอบรับเราขอขอบคุณ S. Tanaka สำหรับคำแนะนำทางสถิติ Y. Ogawa, N.Igarashi และ C. Kimura สำหรับความช่วยเหลือด้านเทคนิค และ A. Yamamoto และ SOgino สำหรับความช่วยเหลือด้านเลขานุการ ผู้เขียนมีส่วนร่วมคิดและออกแบบการทดลอง: TK KM MK HY MI AN KNMM ทำการทดลอง: TK HI AI KK TM YK MI AN วิเคราะห์ข้อมูล: TK KM MK HY AS SY KU KN MM รีเอเจนต์/วัสดุ/เครื่องมือวิเคราะห์ที่มีส่วนร่วม: TK KM. เขียนบทความ: TK KMMM.

ผลของ cistanche: การรักษาโรคไต

อ้างอิง

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) โรคเบาหวานประเภท 2 เป็นโรคอักเสบ Nat Rev Immunol 11: 98–107

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, และคณะ (1987) โปรตีนที่จับกับแคลเซียมสองชนิดในการแทรกซึมมาโครฟาจของโรคข้ออักเสบรูมาตอยด์ ธรรมชาติ 330: 80–82

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C และอื่น ๆ (2007) Mrp8 และMrp14 เป็นตัวกระตุ้นภายในตัวของ Toll-like receptor 4 ซึ่งกระตุ้นให้เกิดการช็อกจากสารพิษที่เป็นพิษถึงตาย นัท เมด 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M, et al. (2009) โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับมัยอีลอยด์-8/14 มีความสำคัญต่อการตอบสนองทางชีวภาพต่อการบาดเจ็บของหลอดเลือด การไหลเวียน 120: 427–436

5. ผู้แพ้ K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V และอื่น ๆ (2010) ลิแกนด์ 4 ตัวที่เหมือนตัวรับค่าโทร Mrp8 และ Mrp14 มีความสำคัญอย่างยิ่งในการพัฒนา CD8 ที่ทำปฏิกิริยาอัตโนมัติร่วมกับทีเซลล์ นัท เมด 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H และอื่น ๆ (2012)อาการกำเริบของโรคไตจากเบาหวานโดยไขมันในเลือดสูงมีสื่อกลางโดย Toll-like receptor 4 ในหนูทดลอง เบาหวาน 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) เซลล์เยื่อบุผิวที่รวบรวมท่อไตควบคุมการอักเสบในความเสียหายของ tubulointerstitial ในหนู J Clin ลงทุน 121: 3425–3441

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T และอื่น ๆ (2012) ระดับการหมุนเวียนของ S100A8 / A9 complex (calprotectin) สูงในเพศชายชาวญี่ปุ่นที่มีความอ้วนในช่องท้องและการแสดงออกที่ผิดปกติของ S100A8 และ S100A9 ในเนื้อเยื่อไขมันของหนูอ้วน ชุมชน Biochem Biophys Res 419: 782–789

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP, และคณะ (2009) Calprotectin—เครื่องหมายใหม่ของความอ้วน. PLOS หนึ่ง 4: e7419

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, และคณะ (2009) แก้ไขสมการสำหรับ GFR โดยประมาณจาก serum creatinine ในญี่ปุ่น แอม เจไตDis53: 982–992.

11. ยอดรวม JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) โรคไตจากเบาหวาน: การวินิจฉัย การป้องกัน และการรักษา การดูแลผู้ป่วยโรคเบาหวาน 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)โรคอ้วนglomerulopathy ที่เกี่ยวข้อง: โรคระบาดที่เกิดขึ้นใหม่ไตInt 59: 1498–1509

13. Praga M, โมราเลส อี (2006)โรคอ้วนโปรตีนในปัสสาวะและความก้าวหน้าของภาวะไตวาย Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M, และคณะ (2005) การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ Myeloid 8 บนมาโครฟาจเป็นตัวบ่งชี้การพยากรณ์โรคที่มีประโยชน์สำหรับความผิดปกติของไตในเด็กที่มี MPGN ประเภท 1 Am JไตDis 45: 510–518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M และอื่น ๆ (2011) angiotensinogen ในปัสสาวะสะท้อนการทำงานของระบบ renin-angiotensin ในไตในผู้ป่วย IgA nephropathy การปลูกถ่าย Nephrol Dial 26: 170–177

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K, et al. (2012)ตัวรับเปปไทด์ Natriuretic guanylyl cyclase-A ปกป้อง podocytes จากการบาดเจ็บของไตที่เกิดจาก aldosterone เจ แอม ซ็อก เนโฟรล 23: 1198–1209

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T และอื่น ๆ (2008) การแสดงออกมากเกินไปของปัจจัยการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อเกี่ยวพันใน podocytes ทำให้โรคไตโรคเบาหวานแย่ลงในหนูไตInt 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T และอื่น ๆ (1999) คมตัด: Toll-like receptor 4 (TLR4) - หนูที่บกพร่องนั้นไม่ตอบสนองต่อ lipopolysaccharide: หลักฐานสำหรับ TLR4 ว่าเป็นผลิตภัณฑ์ยีน Lps เจ อิมมูนอล162: 3749–3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X และอื่น ๆ (2007) บทบาทของวิถีทางที่รับค่าโทร 4/NF-kappaB ในการเปลี่ยนแปลงการอักเสบที่เกิดจากกรดไขมันอิ่มตัวในปฏิกิริยาระหว่าง adipocytes และแมคโครฟาจ หลอดเลือดแดงอุดตัน Vasc Biol 27: 84–91

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N และอื่น ๆ (2013)การแสดงออกของเม็ดเลือดขาวและซีรั่ม S100A8/S100A9 สะท้อนถึงกิจกรรมของโรคในหลอดเลือดอักเสบที่เกี่ยวข้องกับ ANCA และไตอักเสบไตInt 83: 1150–1158

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) ปัจจัยเสี่ยงหลักสำหรับโรคไตในเบาหวานชนิดที่ 2 คือระดับคอเลสเตอรอลในพลาสมา ความดันโลหิตเฉลี่ย และน้ำตาลในเลือดสูง Arch Intern Med 158: 998–1004

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR และอื่น ๆ (2000) การเชื่อมโยงความดันโลหิตซิสโตลิกกับภาวะแทรกซ้อนของหลอดเลือดและหลอดเลือดขนาดเล็กของโรคเบาหวานประเภท 2 (UKPDS 36): การศึกษาเชิงสังเกตในอนาคต BMJ 321: 412–419

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) โรคไตของโรคเบาหวานประเภท-2 เจ รอง เนโฟร 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) ความสัมพันธ์ทางคลินิกและทางเนื้อเยื่อวิทยาของการลดลงของการทำงานของไตในผู้ป่วยเบาหวานที่มีโปรตีนในปัสสาวะ โรคเบาหวาน 43: 1046–1051

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A และอื่น ๆ (2012) Liverangiotensinogen เป็นแหล่งหลักของ angiotensin ของไต II เจ แอม ซ็อก เนฟรอล23: 1181–1189

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H และอื่น ๆ (2009)ระดับไลโปคาลินที่เกี่ยวข้องกับนิวโทรฟิลในปัสสาวะสะท้อนถึงความเสียหายต่อโกลเมอรูไล ท่อใกล้เคียง และไตส่วนปลายไตInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y และอื่น ๆ (2009) การสะสมของมาโครฟาจที่แสดงโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับมัยอีลอยด์ 8 ที่เกี่ยวข้องกับความก้าวหน้าของการเปลี่ยนแปลง sclerotic ในเด็กที่เป็นโรคไต IgA Tohoku J Exp Med 218: 49–55

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S และอื่น ๆ (2013)ภาวะน้ำตาลในเลือดสูงส่งเสริม myelopoiesis และลดความละเอียดของหลอดเลือด เซลล์ Metab 17: 695–708

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X และอื่น ๆ (2013) การแสดงออกของยีนที่ทำให้เกิดการอักเสบได้รับการควบคุมในเลือดรอบนอกของผู้ป่วยเบาหวานชนิดที่ 1 การดูแลผู้ป่วยเบาหวาน.

30. Longo VD, Finch CE (2003) เวชศาสตร์วิวัฒนาการ: จากระบบแบบจำลองแคระไปจนถึงอายุครบ 100 ปี? วิทยาศาสตร์ 299: 1342–1346

อ้างอิง: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) นัยสำคัญเชิงทำนายของไตการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับมัยอีลอยด์ 8 ในผู้ป่วยที่มีโรคอ้วน- หรือโรคไตที่เกี่ยวข้องกับโรคเบาหวานประเภท 2 PLOS ONE 9(2): e88942. ดอย:10.1371/journal.pone.0088942

บรรณาธิการ: Utpal Sen, University of Louisville, United States of America

รับ 11 กันยายน 2556; ยอมรับ 14 มกราคม 2014; เผยแพร่เมื่อ กุมภาพันธ์ 18, 2014

ลิขสิทธิ์: 2014 Kuwabara et al. นี่เป็นบทความแบบเปิดที่เผยแพร่ภายใต้เงื่อนไขของ Creative Commons Attribution License ซึ่งอนุญาตให้ใช้ แจกจ่าย และทำซ้ำได้ไม่จำกัดในสื่อใดๆ โดยต้องให้เครดิตผู้เขียนต้นฉบับและแหล่งที่มา

เงินทุน: งานนี้ได้รับการสนับสนุนส่วนหนึ่งโดย Grant-in-Aid for Diabetic Nephropathy and Nephrosclerosis Research จากกระทรวงสาธารณสุข แรงงาน และสวัสดิการแห่งประเทศญี่ปุ่น (to KM) ทุนวิจัยจากกระทรวงศึกษาธิการ วัฒนธรรม กีฬา วิทยาศาสตร์ของญี่ปุ่น และเทคโนโลยี (ถึง TK, KM และ MM) จาก Japan Foundation for Applied Enzymology (ถึง TK) และจากมูลนิธิวิจัยการสูบบุหรี่ (ถึง MM) ผู้ให้ทุนไม่มีบทบาทในการออกแบบการศึกษา การเก็บรวบรวมข้อมูล และการวิเคราะห์ การตัดสินใจเผยแพร่ หรือการเตรียมต้นฉบับ

ความสนใจที่แข่งขันได้: ผู้เขียนได้ประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

* อีเมล: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp