โพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์ Ulva Sp. เศษส่วนจากการสกัดด้วยเอนไซม์ช่วยปรับการเผาผลาญ 2

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

3. อภิปราย

ขอบเขตหลักของเราคือการประเมินกิจกรรมทางชีววิทยาที่เป็นไปได้ของเศษส่วนโพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์จาก Ulon sp. ได้มาจากกระบวนการ Enzyme-Assisted Extraction (EAE) ที่เป็นนวัตกรรมใหม่ ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าช่วยเพิ่มผลผลิตของคุณในการสกัด [5] และให้การเสริมคุณค่าเศษส่วนที่สำคัญใน ulvans เมื่อเทียบกับการยุ่ย [36] ต่อการเผาผลาญของไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ใน วัฒนธรรม.

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

เน้นที่การแสดงออกของส่วนประกอบเมทริกซ์นอกเซลล์ผิว (ECM) ที่เกี่ยวข้องกับวิถีอะนาโบลิก (โดยเฉพาะคอลลาเจนประเภท I และ Ⅲ, GAGs และ TIMP-1) และในวิถีทางแคแทบอลิซึม (MMP-1) ในระดับโปรตีโอมิกและทรานสคริปโทมิก ในงานนี้ เราคิดว่าเนื่องจากองค์ประกอบที่สูงในคาร์โบไฮเดรตและกรดยูริกของเศษส่วน กิจกรรมที่เกี่ยวข้องกับองค์ประกอบ ulvan (poly- และ oligosaccharide) อย่างไรก็ตาม ผู้เขียนไม่ควรละเลย polysaccharide ulvans จาก Uloa sp. ผนังเซลล์เชื่อมโยงอย่างใกล้ชิดกับโปรตีน ซึ่งเป็นที่ทราบกันดีว่าส่งเสริมการสร้างคอลลาเจนโดยรวมในหลอดทดลองและการผลิตกรดไฮยาลูโรนิกในไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ [39] ดังนั้น ผู้เขียนแนะนำว่ากิจกรรมเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องกับการทำงานร่วมกันระหว่าง ulvans และโปรตีน แม้ว่าจะเน้นไปที่ ulvans ในต้นฉบับนี้ 3.1.การกระทำของเศษส่วนโพลีและโอลิโกแซ็กคาไรด์ Uloa จาก EAE ต่อการเผาผลาญของไฟโบรบลาสต์ ECM

การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่าเศษส่วนจาก Uloa sp.สารสกัดจาก Cistanche ป้องกันรังสี(ulvans ดิบและ ulvans ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ) มีความสามารถในการมอดูเลตการงอกขยายของไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์ปกติ [36-38] ผลลัพธ์ของเราระบุว่าทั้งเศษส่วนโพลีและโอลิโกแซ็กคาไรด์จาก EAE ทำให้เกิดกิจกรรมการเผาผลาญไฟโบรบลาสต์เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (มากถึงร้อยละ 68) ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันข้อมูลที่ตีพิมพ์เบื้องต้นก่อนหน้านี้ของผู้เขียน [36] และงานก่อนหน้าเกี่ยวกับสารสกัด Uloa pertusa ที่ไฮโดรไลซ์ที่ 250 ug/mL ซึ่งทำให้เกิดการแพร่กระจายของไฟโบรบลาสต์ก่อนและหลังวัยอย่างมีนัยสำคัญ [38] กิจกรรมการเผาผลาญที่เพิ่มขึ้นไม่ได้มาพร้อมกับผลความเป็นพิษต่อเซลล์ของเศษส่วน (ประเมินโดยการทดสอบ LDH) ซึ่งหมายความว่าผลการออกฤทธิ์ทางชีวภาพของเศษส่วนโพลี- และโอลิโกแซ็กคาไรด์ Uloa จาก EAE จะไม่ลำเอียงโดยผลที่เป็นพิษต่อเซลล์ในช่วงของความเข้มข้นที่ทดสอบ ผลลัพธ์ของเราเป็นไปตามการศึกษาก่อนหน้านี้ที่เน้นว่า ulvans เป็นสารประกอบที่ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ประเภทต่างๆ (สายเซลล์มาโครฟาจ เซลล์ในลำไส้ ไฟโบรบลาสต์ เซลล์จากหนูเมาส์ และเซลล์ Vero)[13,14,4]

cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

ดังที่กล่าวไว้ในบทนำ คอลลาเจนชนิด Iand III และ GAGs มีปฏิสัมพันธ์ร่วมกันเพื่อสร้างเครือข่ายระดับโมเลกุลสำหรับการประกอบ ECM ในผิวหนังชั้นหนังแท้ ดังนั้นในการศึกษานี้ การสังเคราะห์โปรตีนและการแสดงออกระดับ mRNA ของส่วนประกอบหลักของ ECM ของผิวหนัง (คอลลาเจนชนิดที่ 1 และ Ⅲ และ GAG ทั้งที่มีซัลเฟตและไม่มีซัลเฟต) ได้รับการตรวจสอบเมื่อมี poly- และ oligosaccharide Ullon sp เศษส่วนจาก EAE นอกจากนี้ MMP-1 ซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการสลายตัวของคอลลาเจนชนิดที่ 1 (วิถีแคแทบอลิซึมของ ECM) และตัวยับยั้งเนื้อเยื่อ TIMP-1 ที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมยังถูกประเมินที่ระดับโปรตีนและ mRNA

ผลการวิจัยพบว่าทั้งเศษส่วนโพลีและโอลิโกแซ็กคาไรด์ Ulva จาก EAE ช่วยเพิ่มการสังเคราะห์คอลลาเจนทั้งหมดที่ 1000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (สูงสุดบวก 2 เปอร์เซ็นต์ประเมินด้วยการทดสอบ Red sirius และผลลัพธ์ที่มีนัยสำคัญ ยกเว้น DEP-AD PP-UE) ผลลัพธ์เหล่านี้แตกต่างจากการศึกษาก่อนหน้านี้ที่รถตู้แบบหยาบและ ulvans ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการสังเคราะห์คอลลาเจนทั้งหมด [37] อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราเป็นไปตามงานก่อนหน้านี้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการเตรียมพอลิแซ็กคาไรด์ที่อุดมด้วย L-rhamnose (ROP) จากเชื้อ Klebsiella pneumonia กระตุ้นการสังเคราะห์คอลลาเจน[45] อันที่จริง ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์มีตำแหน่งเลกตินที่สามารถรับรู้ -L-rhamnose [46] ด้วยวิธีนี้ ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์สามารถรับรู้ rhamnose moiety ของเศษส่วน ulvan และส่งเสริมการสังเคราะห์คอลลาเจน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การสังเคราะห์คอลลาเจนประเภทที่ 1 เพิ่มขึ้นสำหรับเศษส่วนทั้งหมดใน ELISA (มีนัยสำคัญสำหรับ UE และ DS-UE) และในการทดสอบ Western blot (NS) ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับวรรณกรรมก่อนหน้าเกี่ยวกับสารสกัด Ulva pertusa ที่ไฮโดรไลซ์ [38] และกาแลคโตฟูแคนส์ที่สลายโพลีเมอไรเซชัน (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">ซิสแทนเช เฮอร์บาอันที่จริงในการศึกษาของเรา ulvans ที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำไม่มีผลต่อการผลิต GAG (รวมถึงกรดไฮยาลูโรนิก GAG ที่ไม่มีซัลเฟต)

เนื่องจากการเสื่อมสภาพของผิวมีลักษณะที่ไม่สมดุลของส่วนประกอบ ECM (ลดระดับคอลลาเจนประเภท I และ II และ GAG) เศษส่วนโพลีและโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ได้จาก Uloa sp. หลังการรักษา EAE เป็นที่สนใจในกลยุทธ์การต่อต้านริ้วรอย เนื่องจากกระตุ้นคอลลาเจนประเภท I และ III และการสังเคราะห์ GAG

อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเรายังเน้นย้ำถึงการเพิ่มขึ้นของ MP-1 การสังเคราะห์ กิจกรรม และการแสดงออกของยีน เมื่อมีเศษส่วนที่ได้จากโพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์ Uloa EAE การเพิ่มขึ้นของระดับ MMP-1 mRNA มีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของการสังเคราะห์ MMP-1 เมื่อมีเศษส่วนของ EAE ที่ได้มาจาก Ulon และมีนัยสำคัญสำหรับเศษส่วนโพลีแซ็กคาไรด์ (UE และ DS-UE) การเพิ่มขึ้นของ MMP การสังเคราะห์เอนไซม์ -1 ยังเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของกิจกรรม MMP-1 ที่ไม่มีนัยสำคัญเมื่อมีเศษส่วน ผลลัพธ์ของเราแตกต่างจากวรรณกรรมก่อนหน้านี้เนื่องจากสารสกัด Uloa pertusa ที่ไฮโดรไลซ์ยับยั้งการแสดงออกและการหลั่งของ MMP-1 ในไฟโบรบลาสต์ที่ชราภาพ [38] หรือโพลีแซคคาไรด์ที่มีฟิวโคส (ชื่อฟูคอยแดน) ยับยั้งการแสดงออกของ MMP ที่เกิดจาก UVB-1 ในไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ [50] อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราเป็นไปตามการศึกษาของ FRioux et al (2013) เนื่องจากกาแลคโตฟูแคนแบบหยาบ (638-1529 kDa) เพิ่ม MMP ของการเร่งปฏิกิริยาทั้งหมด (รวมถึง MMP-1) ของไฟโบรบลาสต์ที่บำบัดเป็นเวลา 6 วัน[47] ข้อมูลของเราเกี่ยวกับการเพิ่มระดับ MMP ก็สอดคล้องกับงานของ Andres et al (2006) เนื่องจาก RROPs (การเตรียมโอลิโกและโพลิแซ็กคาไรด์ที่อุดมด้วย rhamnose จากโรคปอดบวม Klebsiella และสายพันธุ์ K. planticola) ควบคุมการแสดงออกของ MMP-9 [45]การสังเคราะห์ MMP ที่ปรับปรุงแล้ว-1 มักจะส่งผลให้ ECM ลดลง ปริมาณส่วนประกอบ เช่น คอลลาเจนชนิดที่ 1 เนื่องจากกิจกรรมการย่อยสลาย MMP-1 แต่สิ่งนี้ไม่ได้ชี้ให้เห็นในการศึกษาของเรา เนื่องจากมีคอลลาเจนชนิดที่ 1 เพิ่มขึ้น นอกจากนี้ เศษส่วนที่ได้มาจาก Uloa EAE ไม่มีผลกระทบ (NS เพิ่มขึ้นหรือลดลง) ต่อระดับการแสดงออกของ mRNA และการผลิตโปรตีนของ TIMP-1 ซึ่งเป็นตัวยับยั้งเนื้อเยื่อของ MP-1 (ยกเว้น DEP-HD PP- UE ที่มีโปรตีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญp<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2.บทบาทของ Ulvan Abundance องค์ประกอบของซัลเฟตและน้ำหนักโมเลกุลในการปรับ ECM Fibroblast

ลักษณะโครงสร้างของ ulvans ที่ครอบคลุมระดับของซัลเฟต รูปแบบซัลเฟต องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์ การเชื่อมโยงไกลโคซิดิก ระดับของการแตกแขนง และน้ำหนักโมเลกุลเป็นที่ทราบกันว่าส่งผลกระทบต่อกิจกรรมทางชีวภาพ [10,1,37,40,44,51 ].

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าน้ำหนักโมเลกุลของสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ เช่น พอลิแซ็กคาไรด์หรือโปรตีน ดูเหมือนจะเป็นปัจจัยสำคัญสำหรับผลกระทบต่อการเพิ่มจำนวนของเซลล์ไฟโบรบลาสต์และการปรับ ECM [37,39,47] ในการศึกษาของเรา เศษส่วนพอลิแซ็กคาไรด์ UE และ DS-UE ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง (Mw > 670 kDa) ช่วยเพิ่มการงอกของไฟโบรบลาสต์ แม้ว่าเศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

ผู้เขียนชี้ให้เห็นว่าการออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่ดีขึ้นในการสังเคราะห์ GAGs นั้นมาจากเศษส่วนน้ำหนักโมเลกุลสูงของซัลเฟตพอลิแซ็กคาไรด์ที่อุดมไปด้วย ulvans ดิบ สิ่งนี้อาจเกี่ยวข้องกับองค์ประกอบที่แท้จริงของ ulvans ในซัลเฟตและน้ำหนักโมเลกุลของมัน เนื่องจาก oligosaccharide Ulva sp. เศษส่วนซึ่งปราศจากซัลเฟตบางส่วนไม่มีความสามารถในการกระตุ้นการสังเคราะห์ GAGการเจริญเติบโตขององคชาต cistancheการศึกษาอื่นเกี่ยวกับ Ulku sp. แสดงให้เห็นถึงความสำคัญของระดับซัลเฟต ulvan ต่อกิจกรรมทางชีวภาพตั้งแต่เศษ Alvan ที่มีซัลเฟตทางเคมี ปริมาณซัลเฟตเป็นสองเท่าจากพอลิแซ็กคาไรด์พื้นเมือง ฤทธิ์ต้านการแข็งตัวของเลือดที่เพิ่มขึ้นอย่างมาก [10] นอกจากนี้ DS-UE ยังเพิ่มการปรับ ECM เพิ่มเติมเกี่ยวกับ GAGs รวมและประเภท I และ Ⅲ คอลลาเจน การสังเคราะห์เมื่อเทียบกับ UE ฤทธิ์ทางชีวภาพที่ดีกว่านี้สามารถเชื่อมโยงกับความอุดมสมบูรณ์ของ ulvans ที่สูงขึ้นและเนื้อหาของกลุ่มซัลเฟตที่มากขึ้นในส่วนที่ถูกฟอกเมื่อเปรียบเทียบกับเศษส่วนอื่นๆ

ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าโพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์ Uloa sp. เศษส่วนแสดงกิจกรรมการเผาผลาญที่แตกต่างกัน ซึ่งอาจเกิดจากความอุดมสมบูรณ์ของ ulvan ระดับการเป็นซัลเฟตและโครงสร้างทางเคมี งานนี้ยังเน้นกิจกรรมที่ดีกว่าสำหรับรถตู้น้ำหนักโมเลกุลสูงที่แสดงกลุ่มซัลเฟต ข้อเท็จจริงที่ว่าเศษพอลิแซ็กคาไรด์ที่อุดมไปด้วย ulvans ดิบ (กล่าวคือ ไม่มีการดีโพลีเมอร์) มีผลกระทบมากที่สุดต่อการเผาผลาญของไฟโบรบลาสต์ ECM นั้นเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาที่กำลังจะเกิดขึ้นและการใช้งานที่มีศักยภาพในอนาคตในการดูแลผิวหนัง-เครื่องสำอาง เนื่องจากการประมวลผลเพียงเล็กน้อยช่วยลดต้นทุนและเวลาในการผลิต

4. วัสดุและวิธีการ

4.1.วัสดุแมคโครอัลกัล

สาหร่ายสีเขียว Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae) ได้มาจากชายหาดน้ำขึ้นน้ำลง Landrezac (47 องศา 30 องศา 17.9" ​​N องศา 2 องศา 42 องศา 37.1" O) ในเมืองซาร์โซ (บริตตานี ประเทศฝรั่งเศส) เมื่อวันที่ 28 พฤษภาคม พ.ศ. 2561 ในช่วงบ่ายที่น้ำลง วัสดุถูกล้างด้วยน้ำประปา บดให้มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 3 มม. แช่แข็งที่-25 องศา แห้งเยือกแข็ง (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz ประเทศเยอรมนี) และเก็บไว้ที่ห้อง อุณหภูมิในที่มืด

4.2.การผลิตและการกำหนดลักษณะเศษส่วนโพลีและโอลิโกแซ็กคาไรด์

ในงานก่อนหน้านี้โดย Fourniere et al. (2019) การผลิตเศษส่วนโพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์โดยละเอียดจากการสกัดด้วยเอนไซม์ช่วย (EAE) ถูกอธิบายไว้ (ดูรูปที่ 9 และตารางที่ 3) [36]

เพื่อสรุปโดยสังเขป เอ็นโดโปรตีเอส Protamex[(Novozymes, Bagverd, Denmark) ถูกใช้ที่ร้อยละ 6 (w/dw) บน Uloa sp. แห้ง สาหร่ายทะเล ทำการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 50 องศา จากนั้น สารสกัดที่เป็นน้ำได้รับการตกตะกอนด้วยเอธานอล (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, France) ที่ 4 องศาเป็นเวลา 244 ชั่วโมง เพื่อให้ได้ส่วนที่อุดมไปด้วย ulvans ดิบ (UE)

จากนั้น เศษส่วน DS-UE ถูกผลิตขึ้นหลังจากการฟอกไตของส่วนที่อุดมไปด้วยอีแวนส์ดิบ (10 มก./มล.) เป็นเวลา 7 วันที่ 4 องศา (ตัด 12-14 kDa, เมมเบรนฟอกไต Spectra/Por94, ห้องปฏิบัติการสเปกตรัม, ฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์ ,อิลเคียร์ช,ฝรั่งเศส).

ขั้นตอนดีพอลิเมอไรเซชันสองขั้นตอน (ดีพอลิเมอไรเซชันแบบรุนแรงโดย H-OZ และดีพอลิเมอไรเซชันเรซินแลกเปลี่ยนไอออน) ถูกดำเนินการบนสารละลายตกตะกอนที่มีเอธานอลจากเศษส่วนที่อุดมด้วย ulvans ที่ยังไม่ผ่านกระบวนการใดๆ (25 มก./มล.)สำหรับการทำดีพอลิเมอไรเซชันแบบรุนแรง ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (8 เปอร์เซ็นต์, v/v , Fisher Scientific, Illkirch, France) ผสมกับสารละลายเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 50 องศา และผลิตภัณฑ์ได้รับการฟอกไต 48 ชั่วโมงที่ 4 องศา (ตัด 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, ฝรั่งเศส) สำหรับการดีพอลิเมอไรเซชันที่เป็นกรด เรซิน Amberlite" FPC23H(เทียบเท่า 10mL, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France)ถูกผสมลงในสารละลายเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 80 องศา และผลิตภัณฑ์ถูกทำให้เป็นกลางด้วย NaOH (0.1 และ 1 M) ก่อนดำเนินการ 48 ชั่วโมง การฟอกไตที่ 4 องศา (ตัด 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, France)ประโยชน์ของซัลซ่า cistancheขั้นตอนทั้งสองนี้นำไปสู่เศษส่วนโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่เรียกว่า DEP-HD PP-UE และ DEP-AD PP-UE สำหรับ H2OZ และขั้นตอนเรซินที่เป็นกรดตามลำดับ

เศษส่วนทั้งหมดถูกทำให้แห้งโดยแช่แข็ง (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, เยอรมนี) และเก็บไว้ที่ 4 องศาก่อนทำการวิเคราะห์ การแสดงคุณลักษณะของเศษส่วนเหล่านี้: การกระจายน้ำหนักโมเลกุลพอลิแซ็กคาไรด์โดยโครมาโตกราฟีการแยกขนาดแรงดันสูง (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), องค์ประกอบทางชีวเคมี, องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์โดยโครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุลบที่มีประสิทธิภาพสูงพร้อมพัลซิ่งแอมเพอโรเมตริก การตรวจจับ (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, France) และเวลาการแตกตัวเป็นไอออนด้วยเลเซอร์ช่วยเมทริกซ์ของเที่ยวบินแมสสเปกโตรเมตรี (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA สหรัฐอเมริกา) ยังได้ดำเนินการในการศึกษาก่อนหน้านี้ [36]

4.3.วัฒนธรรมเซลล์

ตัวอย่างไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังของมนุษย์จัดทำโดย "Laboratoire Interactions Ep-iteliums Neurones" (LIEN,EA 4685), Brest ประเทศฝรั่งเศส ตัวอย่างผิวหนังของมนุษย์ได้มาจากการตรวจชิ้นเนื้อของผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีซึ่งได้รับการผ่าตัดช่องท้อง การศึกษาดำเนินการตามปฏิญญาเฮลซิงกิ และผู้ป่วยทุกรายลงนามในแบบฟอร์มข้อตกลงความยินยอมที่ได้รับการบอกกล่าว การรวบรวมตัวอย่างเป็นไปตามข้อตกลงท้องถิ่น ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) และอ้างอิงภายใต้ DC 2016-2833

ไฟโบรบลาสต์ที่ผิวหนังมนุษย์ปกติ (NHDF) เพาะเลี้ยงในตัวกลางอินทรีดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM, Lonza, Basel, Switzerland) ด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v) เซรั่มวัวในครรภ์ (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France ) สารละลายยาปฏิชีวนะ 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) (Penicillin, Streptomycin 10,000 U/mL, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France) และยาต้านเชื้อรา 1 เปอร์เซ็นต์ (v/v) (Fungizone, amphotericin B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France) ในตู้ฟักที่อุณหภูมิควบคุมด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ที่ 37 องศา (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold ประเทศเยอรมนี) เซลล์ได้รับการเพาะเลี้ยงย่อยโดยทริปซิไนเซชัน (0.05 เปอร์เซ็นต์) และสารละลาย EDTA (เอทิลีนไดเอมีนเตตระอะซิติก) ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France) หลังจากถึงจุดบรรจบกัน การทดลองทั้งหมดดำเนินการระหว่างข้อที่ 3 และ 8

เซลล์ถูกเพาะลงบนไมโครเพลท 96-หลุมที่ความหนาแน่น 400 เซลล์/หลุมสำหรับการสอบวิเคราะห์ WST-1 และ LDH (แลคเตท ดีไฮโดรจีเนส) บนเพลต 12-หลุม ที่ความหนาแน่น 5{{8 }} เซลล์/หลุมสำหรับเรดซิเรียสและการย้อมสีอัลเซียนสีน้ำเงินและการสอบวิเคราะห์ RT-qPCR และบนเพลต 6-หลุมที่ความหนาแน่น 200,000 เซลล์/หลุมสำหรับการสอบวิเคราะห์ ELISA และ Western blot

ในการทดลองทั้งหมด หลังจากไปถึงจุดบรรจบกัน 80 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ถูกบ่มใน DMEM โดยมี FBS 2 เปอร์เซ็นต์ในกรณีที่ไม่มีอยู่หรือมีอยู่ของเศษส่วนโพลี- และโอลิโกแซ็กคาไรด์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงที่ 50 และ 1000 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

4.4.WST-1 การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์

WST-1 ในหลอดทดลอง การสอบวิเคราะห์มีพื้นฐานอยู่บนการแปลงของเกลือเตตตราโซเลียม WST-1 (4-[3-(4-โลโดฟีนิล){{5 }}(4-ไนโตรฟีนิล)-2H-5-เตตระโซลิโอ]-1,3-เบนซีนไดซัลโฟเนต) ไปเป็นฟอร์มาซาน (สีย้อมสีส้ม) โดยไมโทคอนเดรียลดีไฮโดรจีเนสระดับเซลล์ การเปลี่ยนสีเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความมีชีวิตและการเพิ่มจำนวนของเซลล์ในวัฒนธรรม

หลังจากการบ่ม 48 ชั่วโมง สื่อจะถูกลบออกและ 100uL ของ WST-1 reagent (WST-1 cell proliferation kit, Roche Diagnostics, Meylan, France; การเจือจาง 1:40 ใน DMEM ที่มี 2 เปอร์เซ็นต์ FBS) เพิ่มในแต่ละบ่อ หลังจากการฟักตัว 45 นาทีที่ 37 องศาด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ การดูดกลืนแสงถูกวัดที่ 450 เทียบกับ 630 nm ด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) 4.5.LDH การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์

การสอบวิเคราะห์ความเป็นพิษต่อเซลล์ของ LDH อิงตามการวัดของแลคเตทดีไฮโดรจีเนส (LDH) ซึ่งเป็นเอนไซม์ไซโตซอลที่เสถียรซึ่งถูกปลดปล่อยออกมาเมื่อมีการสลายเซลล์ LDH ที่ปล่อยออกมาใน supernatants ของวัฒนธรรมวัดโดยการแปลงเกลือ tetrazolium (iodonitrotetrazolium violet) เป็นผลิตภัณฑ์ฟอร์มาซานสีแดงcistanche tubulosa ปริมาณ redditปริมาณฟอร์มาซานสีแดงที่วัดได้นั้นแปรผันตามจำนวนเซลล์ที่ถูกสลาย

การทดสอบ LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) ดำเนินการตามคำแนะนำของซัพพลายเออร์ การควบคุมเชิงบวก (การปลดปล่อยสูงสุดของ LDH) ถูกดำเนินการโดยการเพิ่ม 10 uL ของสารละลาย lysis 10×(Triton X-100 ที่ 0.8 เปอร์เซ็นต์ ) เป็นเวลา 45 นาทีก่อนที่จะเติมสารทำปฏิกิริยา CytoTox969 หลังจากการฟักไข่ 50 ไมโครลิตรของส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลท 96-หลุมใหม่ (ที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อ) จากนั้น 50 ไมโครลิตรของรีเอเจนต์ CytoTox96 ดีกรีถูกเติม ไมโครเพลทถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องในที่มืด จากนั้น ปฏิกิริยาหยุดลงโดยเติม "สารละลายหยุด" 50 ไมโครลิตร การปลดปล่อย LDH ถูกวัดโดยการหาปริมาณการดูดกลืนแสงด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลทที่ 490 นาโนเมตร (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)

4.6.Alcian Blue Staining สำหรับ Glycosaminoglycans Quantification

การย้อมสีอัลเซียนบลูเป็นวิธีการย้อมสีที่ช่วยให้สามารถหาปริมาณของไกลโคซามิโนไกลแคน (GAGs) ได้สองประเภท ได้แก่ ซัลเฟต (เฮปารานซัลเฟต เคราตันซัลเฟต คอนดรอยตินซัลเฟต และเดอร์มาตันซัลเฟต) และกรดไฮยาลูโรนิกที่ไม่เป็นกรด สารละลายสีน้ำเงิน Alcian ที่ pH 1 สีที่มีซัลเฟต GAGs ในขณะที่สารละลายที่ pH2.5 สี GAG ที่ไม่มีซัลเฟต

ที่ส่วนท้ายของการฟักไข่ อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกลบออก และเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance) จากนั้น ล้างเซลล์เป็นเวลา 5 นาทีด้วย 0.1N HCl(pH1, Fisher Scientific, Illkirch, France) หรือด้วยกรดอะซิติก 3M (pH2.5, Fisher Scientific, Illkirch, France) เพื่อลด pH และ เผยให้เห็นกลีโคซามิโนไกลแคนที่มีซัลเฟตและไม่มีซัลเฟต ตามลำดับ จากนั้น เซลล์ถูกย้อมด้วย Alcian Blue 1 เปอร์เซ็นต์(8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) ในสารละลาย HC10.1N (pH1) หรือในสารละลายกรดอะซิติก 3 เปอร์เซ็นต์ (pH2.5) เป็นเวลา 30 นาที ล้างเซลล์สองครั้งด้วยน้ำประปาเป็นเวลา 5 นาที ทำให้แห้งภายใต้ประทุน และล้างด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น สีย้อมที่ถูกผูกไว้ถูกละลายด้วยสารละลาย Guanidine hydrochloride 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) เป็นเวลา 5 นาทีภายใต้การกวนที่อุณหภูมิห้อง สารละลายสีถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลทใหม่ 96-หลุม และอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 นาโนเมตร (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)

4.7.การย้อมสีแดงซิเรียสสำหรับปริมาณคอลลาเจนทั้งหมด

ขั้นตอนการย้อมสี Red Sirius ช่วยให้สามารถวัดปริมาณคอลลาเจนทั้งหมดได้ Picrosirius red ซึ่งเป็นสีย้อมประจุลบเชิงเส้นแรงสูงที่ประกอบด้วยกลุ่มซัลโฟเนต 6 กลุ่ม เชื่อมโยงกับเส้นใยคอลลาเจนของประจุบวก

หลังจากการฟักไข่ อาหารเลี้ยงเชื้อจะถูกลบออก และเซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS 1X(Fisher Scientific, Illkirch, France) จากนั้น สารละลาย Bouin 1 มล. Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) ถูกเติมในแต่ละหลุม และเซลล์ถูกย้อมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างเซลล์สองครั้งด้วยน้ำกลั่นและทำให้แห้งภายใต้ประทุน เซลล์ถูกย้อมด้วยสารละลายซิเรียสแดง 1 มล. (ซิเรียสเรด 80 ในสารละลายกรดพิกริกอิ่มตัวที่เป็นน้ำ, ซิกมา-อัลดริช,เซนต์ เควนติน ฟอลลาเวียร์, ฝรั่งเศส) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากการย้อมสี สารละลายถูกกำจัดออก และเซลล์ถูกล้างอย่างต่อเนื่องด้วยน้ำกลั่นและ HC10.01N เพื่อขจัดสีย้อมที่ไม่ถูกจับ สีย้อมที่ถูกผูกไว้ถูกละลายด้วย NaOH0.1N เป็นเวลา 30 นาที สารละลายสีถูกถ่ายโอนไปยังไมโครเพลทใหม่ 96-หลุม และอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 550 นาโนเมตร (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) 4.8.คอลลาเจนชนิดที่ 1 และ MMP-1 ELISAs

หลังจากการฟักไข่ เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, France) ไฟโบรบลาสต์ถูกสลายในบัฟเฟอร์ RIPA (การทดสอบการตกตะกอนด้วยคลื่นวิทยุ) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, ฝรั่งเศส) เสริมด้วยค็อกเทลตัวยับยั้งโปรตีเอส (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier ประเทศฝรั่งเศส) ที่ 4 องศาเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เซลล์ถูกขูด และตัวอย่างถูกวอร์เท็กซ์เป็นเวลา 30 นาทีและหมุนเหวี่ยง (12,00xg เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 องศา ) ส่วนลอยเหนือตะกอนที่มีโปรตีนภายในเซลล์ถูกรวบรวมและเก็บไว้ที่ -80 องศาจนกระทั่งวิเคราะห์หาโปรตีนและการวิเคราะห์ Western blot ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดย Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) โดยใช้ Bovine Serum Albumin (BSA) เป็นมาตรฐาน

ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูกรวบรวมและหมุนเหวี่ยงเพื่อขจัดเศษเซลล์ (200× g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 องศา ) และเก็บไว้ที่ -80 องศาจนกระทั่งทำการวิเคราะห์

การวัดคอลลาเจน Type I และ MMP-1 ได้รับการประเมินในอาหารเลี้ยงเชื้อด้วย Abcam kits (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit และ ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต . วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรด้วยเครื่องอ่านไมโครเพลท (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) ผลลัพธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานด้วยความเข้มข้นของโปรตีนของเซลล์ที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ 4.9.Western Blotการสกัดตัวอย่างโปรตีนได้อธิบายไว้ในส่วนที่ 4.8 ก่อนหน้านี้ ตัวอย่างโปรตีนที่มีบัฟเฟอร์ Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette,France) ถูกต้ม 5 นาทีที่ 95 องศาแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 16000×g เป็นเวลา 1 นาที ปริมาณโปรตีนที่เท่ากัน (10 ug) ถูกบรรจุลงในหลุม 7.5 เปอร์เซ็นต์ หรือ 4-15 เปอร์เซ็นต์ TGX Stain-Free gel (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) พร้อมด้วย Precision Plus Protein "Unstained Protein" มาตรฐาน (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) เจลทำงานที่ 200 V เป็นเวลา 30 นาที (PowerPac"Basic with Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) การถ่ายโอนโปรตีนจากเจลไปยังเมมเบรนขนาดเล็ก PVDF (โพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์) (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) ดำเนินการด้วยระบบ Trans-Blot Turbo Transfer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette ประเทศฝรั่งเศส ) เมมเบรนถูกบล็อกด้วย BSA Gigma-Aldrich 3 เปอร์เซ็นต์, Saint Quentin Fallavier, France) หรือนมแห้งไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ใน TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและ ล้างด้วย TBST เมมเบรนถูกตรวจสอบด้วยคอลลาเจนชนิดที่ 1 (Novotec, Reuver, The Netherlands), type III collagen (Novotec, Reuver, The Netherlands), MMP-1 (EnoGene, New York, NY, USA) หรือ TIMP{{43 }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) แอนติบอดี; จากนั้น ล้างด้วย TBST หลาย ๆ ครั้ง และฟักเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีต่อเปอร์ออกซิเดสรอง (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK) จากนั้นจึงให้พื้นผิวที่ชัดเจนของ Western ECL (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) นำไปใช้กับเมมเบรนเป็นเวลา 5 นาทีและดำเนินการเปิดเผยโดยใช้ ChemiDoc XRS บวกกับ Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) ระดับโปรตีนถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageLab v6.01.1

4.10.Zymography

Zymography ถูกดำเนินการเพื่อวิเคราะห์รูปแบบแอคทีฟของ collagenase MMP-1 ตาม Inanc และคณะ (2017) วิธีการดัดแปลง [52]

เจล SDS-PAGE (โพลีอะคริลาไมด์ 1 0 เปอร์เซ็นต์, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, ฝรั่งเศส) ถูกโคพอลิเมอไรเซชันกับ 1 มก./มล. ของคอลลาเจนชนิดที่ 1 หางหนู Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, France) โปรตีน ตัวอย่าง (5 ไมโครกรัม) ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่างที่ไม่รีดิวซ์ (62.5 mM Tris HCl pH 6.8,20 เปอร์เซ็นต์กลีเซอรอล, 4 เปอร์เซ็นต์ SDS, 0.01 เปอร์เซ็นต์โบรโมฟีนอลสีน้ำเงิน), หมุนเหวี่ยง 1 นาทีที่ 4 องศา บรรจุลงในหลุม ของเจล พร้อมด้วยโปรตีนพรีซิชั่น พลัส" All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) แล้วนำไปอิเล็กโทรโฟเรสที่ 110 V ที่ 4 องศาเป็นเวลา 2 ชั่วโมง เจลถูกล้างสองครั้งใน 2.5 เปอร์เซ็นต์ Triton X{{26 }} (v/v) ครั้งละ 15 นาที เพื่อกำจัด SDS จากนั้นจึงนำเจลไปบ่มใน Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette,France) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 องศา หลังจากการฟักตัว , เจลถูกย้อมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงด้วยสารละลาย Coomassie Blue R-250 0.5 เปอร์เซ็นต์ (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) (w/v) จากนั้นจึงชะล้างด้วยเมทานอล 40 เปอร์เซ็นต์ และกรดอะซิติกน้ำแข็ง 10 เปอร์เซ็นต์ วิธีการแก้ (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) ตรวจพบกิจกรรม MMP-1 เป็นแถบใสตัดกับพื้นหลังเจลสี Coomassie Blue การหาปริมาณดำเนินการกับ ChemiDoc XRS บวกกับ Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, ฝรั่งเศส) ด้วยซอฟต์แวร์ Image Lab เวอร์ชัน 6.01.1 (Bio-Rad) 4.11.การแยกอาร์เอ็นเอและเรียลไทม์ RT-PCR

หลังจากการบ่ม 48 ชั่วโมง RNA ทั้งหมดถูกสกัดด้วย TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) และคลอโรฟอร์ม (Acros Organics,Fisher Scientific, Illkirch, France) ตกตะกอนด้วย isopropanol (Fisher Scientific, Illkirch, France) ล้างด้วยเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์ , ทำให้แห้งภายใต้ประทุนก่อนที่จะแขวนลอยใหม่ในน้ำที่ผ่านการบำบัดด้วย DEPC (ไดเอทิลไพโรคาร์บอเนต) (Fisher Scientific, Iilkirch, France) ปริมาณ RNA และระดับความบริสุทธิ์ (ระหว่าง 1.8 ถึง 2 0) ถูกประเมินด้วยการวัดค่าการดูดกลืนแสงบนเครื่องอ่านไมโครเพลท (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, ฟินแลนด์) ที่ 260 และ 280 นาโนเมตรโดยใช้ Drop TM Plate (Thermo Fisher วิทยาศาสตร์, วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา).

RNA ทั้งหมดหนึ่งไมโครกรัมได้รับการรักษาด้วย DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) เป็นเวลา 5 นาทีที่ 25 องศาเพื่อขจัดสิ่งปนเปื้อน DNA เอนไซม์ถูกปิดใช้งานเป็นเวลา 5 นาที ที่ 75 องศา

การถอดรหัสย้อนกลับดำเนินการบน RNA ทั้งหมด 1 ไมโครกรัม ซึ่งก่อนหน้านี้ได้รับการรักษาด้วย DNase I โดยใช้ iScript Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, ฝรั่งเศส) ขั้นตอนที่ตามมาสำหรับการสังเคราะห์ cDNa คือ 5 นาทีที่ 25 องศา ,20 นาที ที่ 46 องศา , และ 1 นาที ที่ 95 องศา .

การควบคุมที่ไม่ใช่แม่แบบรวมอยู่ในการทดลอง PCR qPCR ถูกดำเนินการในเพลต 96-หลุมสำหรับปริมาตรรวม 20 ไมโครลิตรที่มี 1 uL ของตัวอย่าง cDNA เจือจาง 1∶15 จาก RT,1 ไมโครลิตรของไพรเมอร์ (ดูตารางที่ 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette ประเทศฝรั่งเศส) 10 ไมโครลิตรของ iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, ฝรั่งเศส) และน้ำที่ปราศจากนิวคลีเอส 8μL สภาวะการขยายคือ 2 นาทีที่ 95 องศา ตามด้วย 40 รอบของ 5s ที่ 95 องศาและ 30s ที่ 60 องศา และสิ้นสุดที่ 5s ที่ 95 องศาและ 5s ที่ 65 องศา ก่อนโปรโตคอลสำหรับเส้นโค้งการหลอมเหลว: เพิ่มขึ้น 0.5 องศาจาก 65 องศาเป็น 95 องศา . การทดลอง PCR ดำเนินการบนระบบ CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, France) และรวบรวมผลลัพธ์จากซอฟต์แวร์ Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, France) ปริมาณ mRNA ถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น RPL13A mRNA และการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนสัมพัทธ์คำนวณโดยใช้วิธี 2-AACt

4.12. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ค่าทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ยของ n การทดลอง ± ความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (SE)

การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ Addinsoft (2020) การประเมินการแจกแจงแบบปกติของข้อมูลประเมินโดยใช้การทดสอบของชาปิโร-วิลค์ ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มตัวอย่างทดลองได้รับการวิเคราะห์โดย Student's-t-test (อิสระ สองด้าน) เมื่อมีการแจกแจงแบบปกติ และโดยการทดสอบของ Mann-Whitney เมื่อการแจกแจงแบบปกติถูกปฏิเสธ ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมตามการทดสอบทางสถิติจะแสดงด้วยเครื่องหมายดอกจัน(*p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. สรุปผลการวิจัย

งานนี้แสดงให้เห็นว่าเศษส่วนโพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่อุดมไปด้วย ulvans ฟื้นตัวหลังจากเทคโนโลยีใหม่ที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อม EAE จากสาหร่ายสีเขียว Uloa sp. มีอิทธิพลต่อการแพร่กระจายของไฟโบรบลาสต์ การสังเคราะห์โปรตีน ECM การต่ออายุเมทริกซ์ และการปรับรูปแบบใหม่ ศักยภาพในการใช้กลยุทธ์ในการต่อต้านริ้วรอยแห่งวัยเครื่องสำอางอาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากการเสื่อมสภาพของผิวเกิดจากการสังเคราะห์คอลลาเจนลดลง ดังนั้นการต่ออายุเมทริกซ์ผิวจึงเป็นประโยชน์ในบริบทนี้ ดังนั้น ulvans จาก Ulva sp. เศษส่วนที่ได้รับหลังจาก EAE มีฤทธิ์ทางชีวภาพในการเผาผลาญไฟโบรบลาสต์ของผิวหนังมนุษย์ ผู้เขียนแนะนำว่ากิจกรรมนี้เป็นหน้าที่ของความอุดมสมบูรณ์ของ ulvan องค์ประกอบของซัลเฟต และน้ำหนักโมเลกุลของเศษส่วน ผู้เขียนคาดการณ์ว่าโมเลกุลที่อุดมด้วย rhamnose ที่มีซัลเฟตเหล่านี้สอดคล้องกับโมเลกุลการส่งสัญญาณซึ่งเป็นที่รู้จักโดยไซต์เลคตินของไฟโบรบลาสต์เมมเบรนและต่อมากระตุ้นกิจกรรมการเผาผลาญของพวกมันที่มุมมองทั้ง anabolic และ catabolic อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อประเมินกลไกระดับโมเลกุลที่กระตุ้นโดยโพลี-และโอลิโกแซ็กคาไรด์ Ulou sp. เศษส่วนในระดับปัจจัยการถอดรหัส ความสามารถในการแทรกซึมของ ulvans ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงและต่ำในผิวหนัง 3 มิติหรือแบบจำลอง ex- vivo skin explant และยืนยันผลลัพธ์เหล่านี้ของการปรับ ECM ด้วยเศษส่วนที่ได้จาก Uloa EAE ในแบบจำลองเหล่านี้สำหรับเป้าหมายการต่อต้านวัย

บทความนี้คัดมาจาก ม.ค. 2521, 19, 156 https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs