Pinocembrin Ameliorates ภาวะหัวใจล้มเหลวหลังเกิดภาวะหัวใจวายด้วยการเปิดใช้งานเส้นทางการส่งสัญญาณ Nrf2/HO-1 ตอนที่ 1

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม

พื้นหลัง:ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นปัจจัยสำคัญที่เกี่ยวข้องกับความก้าวหน้าของภาวะหัวใจล้มเหลว การศึกษาในปัจจุบันได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบว่า pinocembrin สามารถปรับปรุงภาวะหัวใจล้มเหลวหลังเกิดภาวะหัวใจล้มเหลว (PIHF) และกลไกพื้นฐานได้หรือไม่

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

วิธีการ:หนูถูกทำ ligation หลอดเลือดแดงด้านหน้าซ้ายเพื่อกระตุ้นกล้ามเนื้อหัวใจตายและต่อมาถูกเลี้ยงเป็นเวลา 6 สัปดาห์เพื่อทำให้เกิดภาวะหัวใจล้มเหลวเรื้อรัง จากนั้นจึงให้พินโนเซมบรินวันเว้นวันเป็นเวลา 2 สัปดาห์ ประเมินผลกระทบโดย echocardiography, western blot, การย้อมสีของ Masson, การตรวจทางชีวเคมี, อิมมูโนฮิสโตเคมีและการเรืองแสง ในหลอดทดลอง เรายังเพาะเลี้ยง H9c2 cardiomyocytes และ cardiac myofibroblasts เพื่อเป็นพยานถึงกลไกต่อไป

ผลลัพธ์:เราพบว่าการเสื่อมสภาพของการทำงานของหัวใจที่เกิดจาก PIHF ดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญโดยการบริหาร pinocembrin นอกจากนี้ การรักษาด้วยพิโนเซมบรินยังช่วยลดการสะสมของคอลลาเจนและเพิ่มตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของบุผนังหลอดเลือดที่หลอดเลือด 2 ในเขตชายแดนของกล้ามเนื้อหัวใจตายพร้อมกับการตายของเซลล์อะพอพโทซิสที่ลดทอน ซึ่งเกี่ยวข้องกับการบรรเทาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่พิสูจน์ได้จากการลดลงของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ในเนื้อเยื่อหัวใจ และมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) ในซีรัม และการเพิ่มขึ้นของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) สิ่งนี้มาพร้อมกับการปรับขึ้นของวิถีทางแฟคเตอร์อีรีทรอยด์ 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2)/ฮีม อ็อกซิเจน-1(H2O-1) การทดลองในหลอดทดลอง เราพบว่าสารยับยั้ง Nrf2 จำเพาะสามารถย้อนกลับผลที่เกิดจากพินโคเซมบรินได้อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งรวมถึงสารต้านอนุมูลอิสระ การต่อต้านการตายของเซลล์ การต้านการเกิดพังผืด และการสร้างหลอดเลือดใหม่ ซึ่งบ่งชี้ว่าการเยียวยา PIHF โดยพินโนเซมบรินนั้นอยู่ใน Nrf2/H2O-1 เพิ่มเติม ลักษณะที่ขึ้นกับเส้นทาง

Cistanche สามารถปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

บทสรุป:Pinocembrin ช่วยปรับปรุงการทำงานของหัวใจและการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นจาก PIHF โดย ROS scavenging และการกระตุ้นเส้นทาง Nrf2/HO-1 ซึ่งทำให้การสะสมของเส้นใยคอลลาเจนและการตายของเซลล์ลดลง และทำให้การสร้างเส้นเลือดใหม่สะดวกขึ้น

คำสำคัญ:Pinocembrin, หัวใจล้มเหลว, ความเครียดออกซิเดชัน, Nrf2/H2O-1

บทนำ

ภาวะหัวใจล้มเหลว (HF) ซึ่งมีลักษณะอาการทางคลินิกระยะสุดท้ายซึ่งเป็นผลมาจากความบกพร่องทางโครงสร้างและ/หรือการทำงานของหัวใจ ยังคงเป็นภาระด้านสุขภาพทั่วโลก โดยมีกล้ามเนื้อหัวใจตาย (MI) เป็นสาเหตุสำคัญ (Ziaeian และ Fonarow 2016; Galli และ ลอมบาร์ดี 2016; Rengo et al.2013). แม้จะมีความก้าวหน้าอย่างมากในการรักษาและในคุณภาพการดูแลใน HF แต่ก็มีความชุกประมาณ 37.7 ล้านคนทุกปีทั่วโลกพร้อมกับการตายร้อยละ 50 ที่ 5 ปีหลังจากการวินิจฉัยโรค HF (Go et al .2014). ภาวะที่กลืนไม่เข้าคายไม่ออกในปัจจุบันอาจอธิบายส่วนหนึ่งว่า HF หลังเกิดภาวะหัวใจวาย (PIHF) ประกอบด้วยกลไกทางพยาธิสรีรวิทยาที่หลากหลายซึ่งวิธีการรักษาในปัจจุบันไม่สามารถอ้างอิงได้อย่างสมบูรณ์

การศึกษาที่สะสมได้แสดงให้เห็นว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน (OS) มีส่วนเกี่ยวข้องอย่างมากกับความก้าวหน้าทางพยาธิวิทยาของ PIHF (Dubois-Deruy et al.2020; Ma et al. 2019; Bubb et al.2017; Habtemariam 2019) OS ซึ่งนำเสนอโดย การสะสมของอนุมูลอิสระ/ออกซิเจนปฏิกิริยา (ROS) ที่มากเกินไปที่มีไฮดรอกซิลเรดิคัล ซูเปอร์ออกไซด์ ไนตริกออกไซด์ ฯลฯ (Dubois-Deruy et al. 2020; Habtemariam 2019) ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าสามารถทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงออกซิเดชันหรือความเสียหายของไขมัน โปรตีนและดีเอ็นเอที่มีความผิดปกติของออร์แกเนลล์ การอักเสบ การตายของเซลล์ในเซลล์มัยโอไซต์และการเกิดพังผืดคั่นระหว่างหน้า (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; Hermida et al. 2018) โดยอาศัยผลเสียหลายประการของ ROS สารต้านอนุมูลอิสระจึงถูกนำมาพิจารณาในการบำบัดด้วย PIHF ซึ่งกลไกดังกล่าวประกอบด้วยการกำจัด ROS โดยตรงและ/หรือการกระตุ้นการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระที่มีกลูตาไธโอน ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD) คาตาเลส ฯลฯ ( Habtemar-iam 2019). อย่างไรก็ตาม น่าเสียดายที่การใช้สารต้านอนุมูลอิสระบางชนิด ทั้งวิตามินอี (Lee et al.2005) และ resveratrol (Made et al. 2015; Olesen et al. 2014) ไม่สามารถตอบสนองความพึงพอใจในการรักษาโรคหัวใจและหลอดเลือดได้ หลักฐานจากความล้มเหลวในการปรับปรุงการทำงานของหัวใจ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีสารต้านอนุมูลอิสระที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นในการบำบัดด้วย PIHF

Pinocembrin (Pino) ​​(โครงสร้างทางเคมีแสดงในรูปที่ 1A) เป็นสารประกอบฟลาโวนอยด์ตามธรรมชาติ ซึ่งสามารถสกัดได้จากน้ำผึ้ง โพลิส และพืชอื่นๆ อีกหลายชนิด (Lan et al.2015; Rasul et al.2013) นอกเหนือจาก การสังเคราะห์เทียม (Costa and Leitao 2011) มีฤทธิ์ต้านการอักเสบ ต้านแบคทีเรีย ต้านและต้านมะเร็ง (Rasul et al.2013; Ye et al.2019) พร้อมด้วยฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่เน้นย้ำ (Kim et al.2020; Sangweni et al .2020). ดังที่แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ โครงสร้างฟีนอลของ Pino ที่รับผิดชอบในการกำจัด ROS โดยตรง เช่นเดียวกับโครงสร้างทั้งฟีนอลและ nonphenolic ที่เสริมการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระให้เข้มข้นขึ้น (Habtemariam 2019) คำนึงถึงผลของสารต้านอนุมูลอิสระของ Pino โดยที่ Pino ได้รับการศึกษาและประยุกต์ใช้ในวงกว้าง ความหลากหลายของโรค เช่น โรคเกี่ยวกับระบบประสาท หลอดเลือด ความเป็นพิษของคาร์ดิโอไมโอไซต์ที่เกิดจาก doxorubicin (Sangweni et al. 2020; Sang et al.2012; Liu et al.2014) อย่างไรก็ตาม เนื่องจากสารต้านอนุมูลอิสระหลายชนิดสำหรับกล้ามเนื้อหัวใจตายและ HF นั้นใช้ไม่ได้หรือไม่เพียงพอที่จะเปลี่ยนเป็นการใช้ทางคลินิก ไม่ว่าผลของสารต้านอนุมูลอิสระของ Pino จะสามารถบรรลุผลในการรักษาด้วย PIHF ได้หรือไม่ก็ตาม งานวิจัยนี้จึงได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบว่าการบริหาร Pino สามารถให้ผลที่เป็นประโยชน์ต่อ PIHE ได้หรือไม่ โดยถือสัญญาว่าจะเป็นนวนิยาย หรือถ้าไม่เด่นแต่อย่างน้อยก็ให้การรักษาเสริม

วิธีการและวัสดุ

แบบจำลองสัตว์และโปรโตคอลการทดลอง

หนู Sprague-Dawley เพศผู้ 56 ตัว ซื้อมาจากศูนย์ทดลองสัตว์ของมหาวิทยาลัย China Three Gorges

ได้รับการเลี้ยงดูในการดูแลสัตว์ในโรงพยาบาลหวู่ฮั่น No.3 การทดลองทั้งหมดได้รับอนุญาตอย่างเป็นทางการและดำเนินการใน Hubei Key Laboratory of Cardiology ซึ่งเป็นไปตามคู่มือการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองที่ตีพิมพ์โดยสถาบันสุขภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา (NIH Publication No.82-23 ซึ่งแก้ไขในปี 1996)

หนูเริ่มแรกได้รับ ligation หลอดเลือดหัวใจตีบซ้ายด้านหน้า (LAD) หรือการผ่าตัดหลอก โดยสังเขป หนูถูกดมยาสลบโดยเพนโตบาร์บิทัล 3 เปอร์เซ็นต์ (2 มล./กก.; Sigma-Aldridge, St.Louis, USA, ในช่องท้อง) ตามมาด้วยการใส่ท่อช่วยหายใจและการช่วยหายใจ (ปริมาตรน้ำขึ้นน้ำลง: 5-10 มล. อัตรา: 70 ครั้ง/นาที) ต่อมาได้ทำการเปิดหัวใจและ LAD ถูกมัดด้วยไหมเย็บไนลอนแบบเส้นใยเดี่ยว 7-0 การเกิดขึ้นของความซีดของเอเพ็กซ์คอร์ดิสหรือส่วนสูงของส่วน ST บนตะกั่ว I ของคลื่นไฟฟ้าหัวใจบ่งชี้การเหนี่ยวนำของ MI การดำเนินการหลอกลวงได้ผ่านขั้นตอนที่เหมือนกัน ยกเว้น LAD ligation เพนิซิลลิน (200,000 IU) ถูกฉีดเข้ากล้ามวันละครั้งเป็นเวลาหนึ่งสัปดาห์หลังการผ่าตัด

Afterward, the rats were carefully raised for 6 weeks to produce PIHF. Rats were then randomly split into 4 groups:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 mg/kg, purity>98 เปอร์เซ็นต์ ; Sigma-Aldridge)หรือน้ำเกลือในปริมาณเท่ากันถูกฉีดเข้าเส้นเลือดดำทางหลอดเลือดดำหางวันเว้นวันเป็นเวลา 2 สัปดาห์ ปริมาณที่อ้างถึงการศึกษาก่อนหน้านี้ (Lan et al.2017) โปรโตคอลถูกแสดงไว้ในรูปที่ 1B

หนูทดลองควบคุมเชิงบวกมี 3 กลุ่ม ได้แก่ เสแสร้งบวกน้ำเกลือ (กลุ่มหลอก); LAD ligation บวกน้ำเกลือ (กลุ่ม HF); LAD ligation บวก enalapril (กลุ่ม HF บวก ACEI) หนูได้รับการผ่าตัดที่เกี่ยวข้อง ยกเว้นหนูที่ได้รับยา enalapril 20 มก./กก. ในกลุ่ม HF ร่วมกับ ACEI

การวัด Echocardiography

การทำงานของหัวใจได้รับการประเมินโดย echocardiography transthoracic โดยใช้ระบบภาพอัลตราซาวนด์ (Vevo 2100, Visual Sonics Inc., Toronto, Canada) ตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ในกลุ่มของเรา (Fo et al.2020) มิติภายในของหัวใจห้องล่างซ้ายที่ระยะ end-diastolic (LVIDd) และระยะ end-systolic (LVIDs), ปริมาตรหัวใจห้องล่างซ้าย end-systolic และ end-diastolic (LVESV และ LVEDV) ถูกบันทึกโดย echocardiograms โหมด M สองมิติเป็นเวลาอย่างน้อย 3 รอบต่อเนื่องสำหรับหนูแต่ละตัว ต่อมาคำนวณเศษส่วนของการดีดออกของกระเป๋าหน้าท้องด้านซ้าย (LVEF)และการตัดทอนเศษส่วน (FS) ซึ่งสะท้อนถึงฟังก์ชันซิสโตลิก

การเตรียมตัวอย่าง

หลังจากให้การทดสอบ Pino และ echocardiography หนูถูกทำให้หมดความรู้สึกอีกครั้ง เลือดดำมากกว่า 2 มล.ถูกจับจากหลอดเลือดดำส่วนหางไปเป็นกรดเอทิลีนไดอะมีนเตตระอะซิติก (EDTA) ที่มีหลอดเก็บเลือดสุญญากาศด้วยการหมุนเหวี่ยงต่อเนื่องที่ความเร็ว 3000 r/นาที เป็นเวลา 15 นาทีและที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ตามด้วยการแยกของ ซีรั่ม supernatant และการเก็บรักษาที่ -80 "C. จากนั้นหัวใจก็ถูกเก็บเกี่ยวโดยเร็ว ส่วนหนึ่งของเขตชายแดนที่เสียชีวิตของหัวใจแต่ละดวงถูกตัดออกและแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวสำหรับการวิเคราะห์ Western blot โดยที่เนื้อเยื่อหัวใจอื่น ๆ ได้รับการแก้ไขใน 4 เปอร์เซ็นต์พาราฟอร์มัลดีไฮด์นานกว่า 24 ชม.

การย้อมสีของ Masson

เราทำการย้อมของ Masson เพื่อตรวจหาการสะสมของคอลลาเจนในเขตชายแดนของกล้ามเนื้อหัวใจตาย โพรงที่มีพาราฟอร์มัลดีไฮด์ตายตัวถูกฝังโดยพาราฟินแล้วตัดเป็นส่วน 5-μm ส่วนต่างๆ ถูกย้อมด้วย Masson trichrome โดยที่คอลลาเจนถูกย้อมด้วยสีน้ำเงิน กล้ามเนื้อหัวใจเป็นสีชมพู และนิวเคลียสเป็นสีดำ สัดส่วนการสะสมคอลลาเจนคำนวณโดยซอฟต์แวร์ Image J (NIH, Bethesda, MD) ที่กำลังขยาย× 200

การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี

การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีดำเนินการเพื่อประเมินความหนาแน่นของตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตของเยื่อบุผนังหลอดเลือด 2 (VEGFR2) ซึ่งการควบคุมที่เพิ่มขึ้นส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดใหม่ที่เป็นประโยชน์และมีความสำคัญในการลดทอนของการเปลี่ยนแปลงรูปแบบใหม่ (Rengo et al. 2013) ส่วนของหัวใจห้องล่างถูกผลิตขึ้นเช่นเดียวกับที่ทำในการย้อมสี Masson ตามด้วยการทำให้ปราศจากพาราฟินและนำน้ำกลับมาใช้ใหม่ จากนั้นส่วนต่างๆ ได้รับการดึงข้อมูลแอนติ-เจนที่อาศัยความร้อนและถูกบำบัดด้วย H, O 3 เปอร์เซ็นต์ เพื่อป้องกันเปอร์ออกซิเดสที่เกิดภายใน ด้วยการฟักตัวของแอนติบอดี VEGFR2 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (Abcam, ab9530) เป็นเวลา 12 ชั่วโมงที่ 4 องศาที่บรรลุผล หลังจากนั้น ส่วนต่างๆ ถูกฟักโดยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก Horse-radish peroxidase (HRP) (1:200, Service, G1213) เป็นเวลา 50 นาทีที่ 37 องศา นอกจากนี้ 3,3'-ไดอะมิโนเบนซิดีนยังถูกใช้เพื่อสร้างการย้อมสีในเชิงบวกซึ่งก็คือ แสดงในสีน้ำตาลอ่อน สุดท้าย ความหนาแน่นของแสงเฉลี่ยของ VEGFR2 ได้รับการวิเคราะห์และคำนวณโดยซอฟต์แวร์ Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA)

การทดสอบการติดฉลากนิคเอนด์ที่อาศัยเทอร์มินอล-ดีออกซีนิวคลีโอทิดิลทรานส์เฟอเรส (TUNEL)

ภายหลังการตรวจ Apoptosis ด้วย TUNEL มวลพาราฟินที่ผลิตก่อนหน้านี้ที่ฝังเนื้อเยื่อของหัวใจห้องล่างถูกตัดเป็นชิ้นอื่นๆ สำหรับการทดสอบ TUNEL ตามด้วยการย้อมสี TUNEL ตามคำแนะนำของผู้ผลิตชุดทดสอบเชิงพาณิชย์ (โรช สวิตเซอร์แลนด์ 11684817910) โดยสังเขป ส่วนของหัวใจห้องล่างสัมผัสกับรีเอเจนต์ TUNEL โดยที่ TdT และ dUTP ถูกผสมด้วยสัดส่วน 1:9 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการฟักตัวของโปรตีเอส K และการแตกของเยื่อหุ้มเซลล์ ในที่สุด ภาพเรืองแสงถูกสังเกตที่ความยาวคลื่น 530 นาโนเมตร ซึ่งถูกกระตุ้นโดยความยาวคลื่นการปล่อย 450 นาโนเมตร (กำลังขยาย× 400) อัตราการตายของเซลล์ของเนื้อเยื่อกระเป๋าหน้าท้องในแต่ละกลุ่มได้รับการวิเคราะห์และคำนวณโดย Image Software

หยดตะวันตก

เราใช้ western blot เพื่ออธิบายกลไกพื้นฐานที่ Pino ปรับปรุง PIHF ขั้นตอนในการสกัดและเตรียมตัวอย่างโปรตีนคล้ายกับที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ในการศึกษาของเรา (Chen et al.2020a) เยื่อหุ้มถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีที่ต่อต้านนิวเคลียสแฟคเตอร์ erythroid 2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (Nrf2), heme oxygenase{{ 4}}(HO-1;1:2000, Abcam, ab189491),p53(1:1000,เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์,2524S), BCL-2 (1:1000, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์,2870P) ,bax (1:1000, Abcam, ab32503), แยก caspase-3(1:1000, เทคโนโลยีการส่งสัญญาณของเซลล์, 9664 T), คอลลาเจน I(1:1000, Affinity, AF7001), glyceraldehyde-3- ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (GAPDH, Service, GB12002) พร้อมการแสดงภาพที่ตามมาโดยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก HRP (บริการ, G1213 และ G1214) และรีเอเจนต์การตรวจจับเคมีลูมิเนสเซนซ์ ในที่สุด ภาพ blot ก็ถูกวิเคราะห์และวัดปริมาณโดยซอฟต์แวร์ Image J

การเพาะเลี้ยงและการกำจัดคาร์ดิโอมัยโอไซต์ H9c2 ในหลอดทดลอง คาร์ดิโอไมโอไซต์ H9c2 ที่ได้มาจากหัวใจของหนู ซึ่งซื้อมาจาก American Type Culture Collection (CRL-1446) ได้รับการเพาะเลี้ยงเพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมถึงผลกระทบที่กระทำโดย Pino ในหลอดทดลอง เซลล์คาร์ดิโอไมโอไซต์ H9c2 ได้รับการเพาะเลี้ยงในตัวกลางของ Eagle (DMEM) / F12 ดัดแปลงของ e Dulbecco ที่มีซีรัมวัวในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ (Sijiqing, หางโจว, จีน) ภายใต้อุณหภูมิ 37 องศาและบรรยากาศของอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์และ CO 5 เปอร์เซ็นต์ ถูกเพาะไปยังเพลต 6-หลุมหลังจากเติบโตเป็น 90 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้ สื่อในซีรัมที่มี isoprenaline(ISO) 25 uM ถูกแทนที่ด้วยอาหารปกติใน 3 หลุมเพื่อบ่มเซลล์เป็นเวลา 48 ชั่วโมงเพื่อเลียนแบบสถานะ HF ตั้งแต่ HF ยังมีลักษณะเฉพาะด้วยการใช้น้ำเสียงที่เห็นอกเห็นใจมากเกินไปและการกระตุ้นของตัวรับ -adrenergic ทำให้เกิด ROS (Velusamy et al.2020) จากนั้นเซลล์ถูกแบ่งออกเป็น 6 กลุ่ม:(i)กลุ่มควบคุม;(ii) สื่อควบคุมที่เติมด้วย Pino 25 μM เป็นเวลา 4 ชั่วโมง (กลุ่มควบคุมบวกกับกลุ่ม Pino); （i） ควบคุมสื่อที่ฟักร่วมกันโดย 25 μM Pino และ 5 μM ML385 เป็นเวลา 4 ชั่วโมง (ตัวยับยั้ง Nrf2; MCE, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา)(กลุ่มควบคุมบวก Pino plus ML385);(iv) กลุ่ม ISO; v. สื่อ ISO ที่มีระยะฟักตัว 4- ชม. โดย Pino 25 μM (กลุ่ม ISO plus Pino); vi. ISO บวก 25 μM กลุ่ม Pino บวก 5 μM ML385 ความเข้มข้นและเวลาฟักตัวของยาอ้างอิงถึงการศึกษาก่อนหน้าหรือคำแนะนำ (Jin et al.2015; Oliveira et al.2017)

การเพาะเลี้ยง myofibroblasts ของหัวใจในหนูแรกเกิดและการทดสอบการเพิ่มจำนวน

myofibroblasts หัวใจของหนูแรกเกิด (CMFs) ถูกเพาะเลี้ยงเพื่อตรวจสอบผลของ Pino ต่อการหลั่งคอลลาเจน CMF แยกจากกันโดยใช้หนูแรกเกิดที่อายุ 3 วัน โดยอ้างอิงถึงวิธีการที่แสดงให้เห็นก่อนหน้านี้ (Cui et al. 2021) หัวใจที่แยกออกมาและสับละเอียดถูกย่อยด้วยทริปซิน 0.125 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยค็อกเทลที่มีทริปซิน 0.25 เปอร์เซ็นต์ และคอลลาเจนเนส 0.08 เปอร์เซ็นต์ หลายครั้ง จากนั้นจึงหมุนเหวี่ยงและย้ายไปยังจานเพาะเชื้อ เซลล์จากสิ่งเหนือธรรมชาติ จากนั้นสื่อถูกแทนที่ด้วยสื่อในซีรัมที่คล้ายกับที่ใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงคาร์ดิโอไมโอไซต์ H9c2 หลังจากการยึดเกาะ 90 นาที CMFs ได้รับการกำจัดที่เหมือนกันกับใน H9c2 cardiomyocytes เรายังใช้ชุดตรวจนับเซลล์-8(CCK-8) การทดสอบ (โดจินโด ประเทศญี่ปุ่น) เพื่อตรวจหาการเพิ่มจำนวน CMF เมื่อถึงความหนาแน่น 1.5×10 องศาในแต่ละหลุม โดยใช้ประโยชน์จากเครื่องอ่านไมโครเพลทที่ ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร โดยที่ค่าที่สูงกว่าบ่งชี้ถึงกิจกรรมการเพิ่มจำนวนที่เพิ่มขึ้น

การตรวจจับ ROS

ความสามารถของ Pino ในการไล่ตาม ROS ถูกวัดโดย fluorescent probe dihydroethidium (DHE; Beyotime, Shanghai, China) DHL ซึ่งถูกละลายใน DMSO ถูกเจือจางเป็น 5 ไมโครโมลาร์สำหรับส่วนที่แช่แข็งหรือเติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อในซีรัมเพื่อเจือจางให้มีความเข้มข้นเท่ากันตามคำแนะนำ หัวใจที่ตรึงพาราฟอร์มัลดีไฮด์ถูกแช่แข็งตามด้วยการหั่นเป็นชิ้นๆ ถึง 4-μm ส่วนหรือคาร์ดิโอไมโอไซต์ H9c2 ถูกบ่มร่วมกับสารละลาย DHE เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศา ถ่ายภาพหลังจากนั้นด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงกลับหัว (IX70; โอลิมปัส โตเกียว ญี่ปุ่น) โดยสังเขป นิวเคลียสซึ่งเต็มไปด้วย DNA และ RNA ถูกย้อมด้วยสีแดงที่ชัดเจนเนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่างกรดนิวคลีอิกกับ DHE นอกจากนี้ ความเข้มแสงฟลูออเรสเซนต์ที่เข้มขึ้นบ่งชี้ว่ามีการสะสมของ ROS มากขึ้น

การตรวจทางชีวเคมี

การตรวจสอบทางชีวเคมีได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของ BNP, SOD และ malondialdehyde (MDA) ในซีรัมในซีรัมและ supernatant ระดับเซลล์ซึ่งระบุฟีโนไทป์ของ HF และการป้องกันสารออกซิแดนท์ตามลำดับ วัดความเข้มข้นโดยใช้ชุดทดสอบทางชีวเคมีที่สอดคล้องกันตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Jiancheng, Nanjing, China)

บทความนี้คัดลอกมาจาก Chen et al มอล เมด (2021) 27:100 https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7