การคัดกรองไฟโตเคมิคอลและกิจกรรมเอสโตรเจนของ Glycosides ทั้งหมดของ Cistanche Deserticola

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

เชิงนามธรรม

ตลอดหลายทศวรรษที่ผ่านมา มีความพยายามที่จะยกระดับคุณภาพชีวิตมนุษย์อย่างต่อเนื่อง โรควัยหมดประจำเดือนเป็นปัญหาร้ายแรงต่อสุขภาพของผู้หญิง การรักษาด้วยฮอร์โมนเป็นหัวใจหลักในการรักษาภาวะนี้ อย่างไรก็ตาม การรักษานี้อาจนำไปสู่การละเมิดฮอร์โมนเอสโตรเจน ซึ่งนำไปสู่อาการไม่พึงประสงค์และผลข้างเคียง ด้วยเหตุนี้ การรักษาด้วยฮอร์โมนจึงไม่ประสบผลสำเร็จในการรักษาโรคในวัยหมดประจำเดือนCistanche deserticolaเป็นสมุนไพรโทนิคคลาสสิกในการแพทย์แผนจีน มันแสดงกิจกรรมเอสโตรเจนที่สำคัญ สารออกฤทธิ์หลักของสมุนไพรนี้คือไกลโคไซด์ ในการทดลองก่อนหน้านี้ มีการระบุปัจจัยสำคัญสามประการที่ส่งผลต่อผลผลิตของไกลโคไซด์ทั้งหมด ผลผลิตของแอกทิโอไซด์ และกิจกรรมของเอสโตรเจน ได้แก่ ความเข้มข้นของตัวชะ pH และปริมาตรของตัวชะ ในการทดลองนี้ กระบวนการทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสมที่สุดถูกกำหนดโดยใช้วิธีการพื้นผิวที่ตอบสนองต่อการออกแบบคอมโพสิตส่วนกลางเพื่อให้ได้ไกลโคไซด์จากสมุนไพรนี้ พบว่าความเข้มข้นของสารชะ (เอทานอล) ที่ 85 เปอร์เซ็นต์และปริมาตร 25 BV ที่ pH 11 เหมาะสมที่สุด สารประกอบออกฤทธิ์ยี่สิบเอ็ดชนิดถูกระบุโดยการทดสอบแมสสเปกโตรเมทรีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง/ควอดรูโพล Time-of-flight Mass spectrometry การศึกษานี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าสำหรับการวิจัยเชิงลึกเพิ่มเติมเพื่อประเมินกิจกรรมเอสโตรเจนของไกลโคไซด์ทั้งหมดของCistanche deserticola.

คำสำคัญ: การออกแบบคอมโพสิตกลาง; Cistanche Deserticola รวมไกลโคไซด์; LC/Q-TOF-MS; เทคโนโลยีการทำให้บริสุทธิ์ การทดสอบการเจริญเติบโตของมดลูก

บทนำ

Cistanche deserticolaเป็นสมุนไพรโทนิคคลาสสิกที่รับประทานได้ มันถูกกล่าวถึงครั้งแรกในสมุนไพรคลาสสิกของ Shen Nong และเกณฑ์ในระดับสูงสุด เป็นสมุนไพรที่อบอุ่นและหวาน มีสรรพคุณทางยามากมาย เช่น การบำรุงตับและไต การเสริมสร้างกล้ามเนื้อและกระดูก และการปรับปรุงภูมิคุ้มกันควบคู่ไปกับกิจกรรมต่อต้านริ้วรอยและต่อต้านเนื้องอก [1-4] สารประกอบธรรมชาติบางชนิดได้รับการแยกและระบุได้จากสารสกัดจากสมุนไพรนี้ สารประกอบหลักคือ ฟีนิลทานอยด์ ไกลโคไซด์ ลิกนานอยด์ อิริดอยด์ โพลีแซคคาไรด์ และอัลคาลอยด์ [5-8]

ยาที่ได้จากพืชสมุนไพรมีสารออกฤทธิ์หลายชนิดซึ่งมีหน้าที่หลักในการรักษา ประสิทธิภาพของยาตัวเดียวกันที่ได้รับจากแหล่งพืชต่างๆ อาจแตกต่างกันไปเนื่องจากความแตกต่างในประเภทและปริมาณของสารประกอบออกฤทธิ์ที่มีอยู่ในยา ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องระบุและหาปริมาณสารประกอบออกฤทธิ์ทั้งหมดที่มีอยู่ในยาที่ได้จากพืชสมุนไพร เช่นเดียวกับ C. deserticola วิธีการพื้นผิวการตอบสนองเป็นวิธีทดลองเพื่อตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ระหว่างปัจจัยต่างๆ พร้อมกัน [9-10] สามารถใช้สำหรับการปรับพารามิเตอร์การสกัดให้เหมาะสมที่สุดสำหรับไฟโตฟาร์มาซูติคอลและการประมาณค่าเชิงปริมาณของสารประกอบออกฤทธิ์ในยา การออกแบบคอมโพสิตกลาง (CCD) เป็นหนึ่งในการออกแบบทดลองที่มีประโยชน์ในวิธีการตอบสนองพื้นผิว เมื่อเทียบกับการออกแบบมุมฉากและแบบสม่ำเสมอ CCD มีความแม่นยำสูงกว่าและสามารถคาดการณ์ได้ดีกว่า [11]

กลุ่มอาการวัยหมดประจำเดือนสามารถลดคุณภาพชีวิตในสตรีได้อย่างมาก โดยปกติสโตรเจนจะใช้รักษาอาการนี้ อย่างไรก็ตาม, การใช้เอสโตรเจนในระยะยาวอาจนำไปสู่การล่วงละเมิด, จึงก่อให้เกิดอาการไม่พึงประสงค์ต่างๆและผลข้างเคียง. ดังนั้นจึงมีความจำเป็นที่จะต้องเลือกการรักษาทางเลือก โดยเฉพาะอย่างยิ่งยาสมุนไพรที่มีเอสโตรเจนเป็นสารออกฤทธิ์สำหรับการรักษาโรควัยหมดประจำเดือน [12-13]

ในการทดลองเบื้องต้น โครงสร้างของสารประกอบธรรมชาติต่างๆ ที่ได้จาก C. deserticola ถูกระบุโดยใช้แมสสเปกโตรเมทรี (MS) [14] ได้รับการยืนยันแล้วว่าไกลโคไซด์เป็นสารประกอบออกฤทธิ์หลักที่มีการออกฤทธิ์ของเอสโตรเจนที่มีนัยสำคัญ [14-15] ในการพัฒนาสารออกฤทธิ์เอสโตรเจนที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพในยาใหม่ จำเป็นต้องมีการตรวจสอบเชิงลึกเกี่ยวกับ TGCD หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ ในการศึกษานี้ ครั้งแรกที่ใช้ CCD เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทำให้บริสุทธิ์ของไกลโคไซด์ทั้งหมดของ C. deserticola (TGCD) ต่อจากนั้น การทดสอบการเจริญเติบโตของมดลูกถูกใช้เพื่อประเมินกิจกรรมของฮอร์โมนเอสโตรเจนของไกลโคไซด์เดียวกัน โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง/แมสสเปกโตรเมตรี time-of-flight (HPLC/Q-TOF-MS) ที่มีประสิทธิภาพสูงถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพของสารประกอบของ TGCD หลังจากการทำให้บริสุทธิ์ กระบวนการนี้ถูกนำไปใช้เพื่อแสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการมีอยู่ของสารประกอบออกฤทธิ์ต่างๆ ที่มีการออกฤทธิ์ของเอสโตรเจนใน TGCD สิ่งนี้สามารถเป็นพื้นฐานสำหรับการใช้ทางคลินิกในกลุ่มอาการวัยหมดประจำเดือนแทนที่ฮอร์โมนเอสโตรเจนพร้อมกัน

ขั้นตอนการทดลอง

เครื่องมือ

ระบบ Agilent 1290 HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), Agilent 6530 series quadrupole time-of-flight LC/MS (Q-TOF) ระบบ (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) และ Chemical HPLC{ {5}}เวิร์กสเตชัน D ถูกใช้เป็นเครื่องมือโครมาโตกราฟีสำหรับการประมวลผลข้อมูล ใช้น้ำบริสุทธิ์พิเศษ Milli-Q สำหรับการศึกษาทั้งหมด เครื่องชั่งวิเคราะห์ทางอิเล็กทรอนิกส์ AR1140 (Ohaus International Ltd.); เครื่องอ่านไมโครเพลท 680 (Bio-Rad Corporation); และเครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง 64R (Beckman Coulter Allegra) ใช้สำหรับการเตรียมตัวอย่าง

ยาและสารเคมี

C. deserticola ถูกซื้อจากตลาดยาและระบุโดย Prof. Zhang Delian (Harbin University of Commerce, China) ซื้อไดเอทิลสติลเบสทรอลมาตรฐาน (บริสุทธิ์ 99 เปอร์เซ็นต์ ล็อตที่ 60518) จาก Dr. Ehrenstorfer (ประเทศเยอรมนี) มาตรฐานอื่นๆ ของแอกทิโอไซด์ (111530-200505) และอิชินาโคไซด์ (111670-200503) ได้มาจากสถาบันแห่งชาติเพื่อการควบคุมผลิตภัณฑ์ยาและชีวภาพ ปักกิ่ง ประเทศจีน ความบริสุทธิ์ของแต่ละมาตรฐานคือ > 98 เปอร์เซ็นต์ ซื้ออะซิโตไนไตรล์ (ACN) เมทานอล และกรดฟอร์มิก (เกรด MS) จาก Thermo Scientific Pierce (ร็อกฟอร์ด รัฐอิลลินอยส์ สหรัฐอเมริกา) ได้รับน้ำบริสุทธิ์พิเศษจาก Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (หางโจว ประเทศจีน) รีเอเจนต์ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดทั้งหมดมีระดับการวิเคราะห์

การเตรียมไกลโคไซด์ทั้งหมดของสารละลายการทำให้บริสุทธิ์ C. deserticola

หลังจากการแช่ในเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ผงที่ยังไม่ผ่านกระบวนการของ C. deserticola (100 ก.) ถูกสกัดด้วยเอทานอล 75 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) 800 มล. ที่ 80 องศา เป็นเวลา 150 นาทีภายใต้การไหลย้อน จากนั้นจึงกรองผ่านตัวกรองแบบสองชั้นและต่อมาสกัดด้วยเอธานอล 75 เปอร์เซ็นต์ 800 มล. สองครั้งเป็นเวลาเพิ่มเติม 150 นาที ต่อจากนั้น กรองถูกผสมและทำให้เข้มข้นในสุญญากาศที่ 45 องศา สารสกัดได้มาจากการกำจัดตัวทำละลาย น้ำกลั่นจำนวนหนึ่งถูกเติมลงในสารสกัดเพื่อให้ได้ความเข้มข้น 0.5 ก./มล. ซึ่งใช้เพื่อคัดกรองกระบวนการทำให้บริสุทธิ์

สำหรับการดูดซับโดยใช้เรซินแมโครพอรัส AB-8 ค่า pH ของสารละลายตัวอย่างทดสอบถูกปรับเป็น 11 ขั้นแรก ใช้น้ำกลั่น 2 BV เพื่อชะล้างสิ่งเจือปนออกไป จากนั้น ชะที่ความเข้มข้น 25 BV เอทานอล 85 เปอร์เซ็นต์ ถูกชะและเก็บรวบรวม ในที่สุด สารชะบริสุทธิ์ที่รวบรวมได้ก็ถูกรวมเข้าด้วยกัน น้ำกลั่นจำนวนหนึ่งถูกเติมลงในสารสกัดเพื่อให้ได้ความเข้มข้น 1.5 ก./มล. ซึ่งใช้สำหรับการบริหารในกระเพาะอาหาร สำหรับกลุ่มควบคุมเชิงบวก สารละลายไดเอทิลสติลเบสทรอล (20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) ถูกเตรียมด้วยผงไดเอทิลสติลเบสทรอล

ตามอัตราส่วนของการทำให้บริสุทธิ์ ({{0}}.6) สารสกัดจำนวนหนึ่ง (เทียบเท่ากับ C. deserticola 1 กรัม) ถูกถ่ายโอนไปยังขวดปริมาตร 10 มล. ละลายในสารละลายเมทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ (v/v) ในอ่างอัลตราโซนิกเป็นเวลา 5 นาที และเจือจางเป็น 10 มล. สารละลายทางยาได้มาจากการกรองส่วนลอยเหนือตะกอนผ่านเมมเบรนกรอง 0.45 ไมโครเมตร แอกทิโอไซด์และอิชินาโคไซด์ (แต่ละ 1 มก.) ถูกผสมและละลายอย่างสมบูรณ์ในสารละลายเมทานอล 50 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) 10 มล. สุดท้าย สารละลายมาตรฐานถูกกรองผ่านตัวกรองมิลลิพอร์ 0.45 ไมโครเมตรก่อนทำการวิเคราะห์

เงื่อนไข LC-MS

การแยกสารด้วยโครมาโตกราฟีดำเนินการในระบบ HPLC (Agilent 129{{10}}) ที่ติดตั้งระบบนำส่งตัวทำละลายควอเทอร์นารี สูญญากาศ degasifier และเครื่องตรวจจับอาร์เรย์โฟโตไดโอด การวิเคราะห์ด้วย MS/MS ถูกดำเนินการในเครื่องมือ Agilent-1290 HPLC/6530 ระบบ Q-TOF-MS ที่ถูกติดตั้งด้วยแหล่งกำเนิดอิออไนเซชันของอิเล็กโตรสเปรย์ในโหมดไอออนบวกและลบ คอลัมน์ Waters Symmetry shield RP C18 (4.6 × 250 มม., 5 µm) (Waters Corporation, Milford, MA, USA) ใช้สำหรับการแยก เฟสเคลื่อนที่ประกอบรวมด้วยสารละลายในน้ำกรดฟอร์มิก 0.2 เปอร์เซ็นต์ (v/v) (A) และ ACN (B) และมันถูกสูบที่อัตราการไหล 0.5 มล./นาที ปริมาตรการฉีดของแต่ละตัวอย่างคือ 10 ไมโครลิตร โปรแกรมการชะเกรเดียนต์เป็นดังนี้: 5−23 เปอร์เซ็นต์ B เป็นเวลา 0−35 นาที, 23-25 ​​เปอร์เซ็นต์ B เป็นเวลา 35−65 นาที และ 25−5 เปอร์เซ็นต์ B เป็นเวลา 65−70 นาที อุณหภูมิคอลัมน์ถูกคงไว้ที่ 30 องศา โครมาโตแกรมถูกเฝ้าติดตามและบันทึกที่ 330 นาโนเมตร ความดันแก๊สการทำให้เป็นละอองถูกตั้งไว้ที่ 30 Psi และแรงดันของเส้นเลือดฝอยคือ 3.5 kV อัตราการไหลของก๊าซแห้งเท่ากับ 8 ลิตร/นาที ที่อุณหภูมิ 30 องศา อุณหภูมิของก๊าซฝักถูกตั้งไว้ที่ 400 องศาที่อัตราการไหล 12 ลิตร/นาที พลังงานการชนถูกกำหนดไว้ที่ 10–20 eV สำหรับการสแกนพลังงานต่ำและ 30–50 eV สำหรับการสแกนพลังงานสูง ข้อมูลแมสสเปกตรัมถูกบันทึกภายในช่วงการสแกน 50–1000 Da ในโหมดการสแกนไอออนบวกและลบ ในการศึกษานี้ การเปรียบเทียบที่รวดเร็วและมีประสิทธิภาพระหว่าง TGCD กับมาตรฐานได้ดำเนินการภายใต้สภาวะ LC-MS เดียวกัน

การทดสอบการเจริญเติบโตของมดลูก

ดำเนินการอย่างเคร่งครัดตามคำแนะนำของแนวทางการดูแลและการใช้สัตว์ทดลองของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ ขั้นตอนการทดลองทั้งหมดได้รับการตรวจสอบและอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยพาณิชย์ฮาร์บิน ประเทศจีน

หนูคุนหมิงเพศเมียที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ (อายุคลอดประมาณ 21 วัน หย่านม) น้ำหนัก 12 ± 2 กรัม ถูกซื้อจากศูนย์สัตว์ทดลองในห้องปฏิบัติการฐานอุตสาหกรรมชีวภาพแห่งชาติฉางชุน (ฉางชุน ประเทศจีน) หนูถูกเลี้ยงไว้ในห้องที่มีการควบคุมอุณหภูมิ (22 ± 2 องศา) โดยมีอาหารและน้ำโดยอิสระ การทดลองกับสัตว์เริ่มต้นขึ้นหลังจากปรับตัวให้ชินกับสภาพแวดล้อมได้ห้าวัน หนูอดอาหารค้างคืนโดยเติมน้ำก่อนการให้สารละลายทดสอบในกระเพาะ

หนูถูกสุ่มแบ่งเป็น 22 กลุ่ม โดยแต่ละกลุ่มมีสัตว์ 10 ตัว พวกเขาได้รับยาทดลองที่มีปริมาตรเท่ากันวันละสองครั้ง (เช้าและเย็น) เป็นเวลาสี่วันดังนี้:

กลุ่มที่ 1: ไกลโคไซด์ทั้งหมดในกระเพาะอาหารของ C. deserticola purification solution (20 มล./กก.), (ปริมาตรของสารละลาย/ น้ำหนักของหนูเมาส์),

กลุ่ม II: น้ำกลั่นในกระเพาะอาหาร (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) และ

กลุ่มที่ III: ไดเอทิลสติลเบสทรอลในกระเพาะอาหาร (20 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) (กลุ่มควบคุมที่ให้ผลบวก)

ในวันที่ห้า หนูทั้งหมดถูกสังเวย มดลูกจะถูกลบออกทันทีและชั่งน้ำหนักและคำนวณค่าสัมประสิทธิ์ของมดลูก

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดสอบ t-test แบบคู่สองด้านถูกใช้เพื่อระบุความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติในพารามิเตอร์ต่างๆ ในกลุ่มการทดลองต่างๆ การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์สถิติ SPSS (SPSS สำหรับ Windows v21.0, SPSS Inc. สหรัฐอเมริกา) ความแตกต่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับความเชื่อมั่น 95 เปอร์เซ็นต์ (p <>

ผลลัพธ์และการอภิปราย

ความเป็นเส้นตรงและความสัมพันธ์ของผลผลิตแอกทิโอไซด์และไกลโคไซด์ทั้งหมด

สมการถดถอยเชิงเส้นของผลผลิตแอกทีโอไซด์คือ y {{0}}x – 14.75 (โดยที่ x คือความเข้มข้นของแอกทิโอไซด์ และ y คือพื้นที่พีคที่สอดคล้องกัน) โดยมีสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของ r=1 ในช่วงความเข้มข้นของ 0.12−{{10}}.72 มก./มล. สิ่งนี้บ่งชี้ถึงกราฟการปรับเทียบเชิงเส้น สมการถดถอยเชิงเส้นของผลผลิตไกลโคไซด์ทั้งหมดคือ y=26.074x บวก 0.0866 (โดยที่ x คือความเข้มข้นของไกลโคไซด์ทั้งหมด และ y คือพื้นที่พีคที่สอดคล้องกัน) โดยมีสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของ r { {12}}.9982 ในช่วงความเข้มข้น 0.013−0.065 มก./มล. สิ่งนี้ยังระบุเส้นโค้งการสอบเทียบเชิงเส้นด้วย

การตรวจสอบตามระเบียบวิธี

ความแม่นยำ ความสามารถในการทำซ้ำ ความเสถียร และการนำตัวอย่างกลับมาใช้ใหม่ได้ในการศึกษาวิจัยตามระเบียบวิธีวิจัย ในการทดลองความแม่นยำ ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (RSD) ของแอกทีโอไซด์และไกลโคไซด์ทั้งหมดเท่ากับ 1.43 เปอร์เซ็นต์และ 005 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ในการทดลองความสามารถในการทำซ้ำ RSD ของแอคทีโอไซด์และไกลโคไซด์ทั้งหมดคือ 0.10 เปอร์เซ็นต์และ 1.44 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ในการทดลองความคงตัว 24 ชั่วโมง RSD ของแอกทิโอไซด์และไกลโคไซด์ทั้งหมดเท่ากับ 0.14 เปอร์เซ็นต์ และ 0.90 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ในการทดลองการกู้คืน การกู้คืนของ acteoside เท่ากับ 100.50 เปอร์เซ็นต์ โดยมี RSD 2.08 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่การกู้คืนของ glycosides ทั้งหมดคือ 99.12 เปอร์เซ็นต์ โดยมี RSD ที่ 1.65 เปอร์เซ็นต์ ค่า RSD ทั้งหมดน้อยกว่า 3 เปอร์เซ็นต์ ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงความแม่นยำและการทำซ้ำที่ดี นอกจากนี้ ตัวอย่างมีความคงตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ผลลัพธ์ของการกู้คืนยังอยู่ในช่วงที่อนุญาต (95−105 เปอร์เซ็นต์ ) ดังนั้น วิธีนี้สามารถใช้สำหรับการกำหนดแอคทีโอไซด์และผลผลิตรวมของไกลโคไซด์หลังจากการทำให้บริสุทธิ์

การตรวจสอบปัจจัยเดียวของ TGCD

การทำให้ TGCD บริสุทธิ์โดยใช้เรซินที่มีรูพรุนอาจได้รับผลกระทบจากหลายปัจจัย เช่น ชนิดของเรซิน ปัจจัยการดูดซับแบบสถิต (เวลาการดูดซับ ความเข้มข้นของการรั่วไหล และ pH ของสารละลายตัวอย่าง) และสภาวะการชะ (ความเร็วการไหล ปริมาตร และความเข้มข้น) โดยใช้ความสามารถในการดูดซับและอัตราการคายดูดซับและการชะของ TGCD เป็นดัชนี กำหนดเงื่อนไขการทดลองตามผลของการทดลองปัจจัยเดียว โดยใช้เรซินดูดซับแมโครพรุนชนิด AB-8 สภาวะที่เหมาะสมที่สุดต่อไปนี้ถูกกำหนดหา: 0.5 มก./มล. สารละลายตัวอย่าง, pH ที่ 10, เวลาดูดซับแบบคงที่ 8 ชั่วโมง, 2 BV น้ำกลั่นสำหรับล้างสิ่งสกปรก เอทานอล 20 BV 80 เปอร์เซ็นต์เป็นสารชะ และความเร็วการไหล 0.5 BV/นาที ผลลัพธ์เฉพาะแสดงไว้ในรูปที่ 1-7

CCD สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของเทคโนโลยีการทำให้บริสุทธิ์ TGCD

จากผลการตรวจสอบปัจจัยเดียว ปัจจัยสามประการที่มีอิทธิพลอย่างมีนัยสำคัญต่อวิธีการทำให้บริสุทธิ์ถูกเลือกเป็นดัชนี ได้แก่ pH ของสารละลายตัวอย่าง (x1) ความเข้มข้นของสารชะ (x2) และปริมาตรของตัวชะ (x3) ตามหลักการ CCD แต่ละปัจจัยมีห้าระดับ ระดับสูงสุดและต่ำสุดของปัจจัยต่าง ๆ เหล่านี้ถูกกำหนดตามผลการทดลองเบื้องต้น ระดับปัจจัยแสดงในตารางที่ 1 และผลการทดลองแสดงในตารางที่ 2

ผลผลิตของไกลโคไซด์และแอกทิโอไซด์ทั้งหมดถูกกำหนดหาเพื่อทำให้วิธีการทำให้บริสุทธิ์เหมาะสมที่สุดสำหรับ TGCD ประการแรก ผลผลิตของไกลโคไซด์และแอกทิโอไซด์ทั้งหมดถูกกำหนดเป็นเกณฑ์เชิงตัวเลขของความพึงปรารถนา (d) ระหว่าง {{0}}}-1 จากนั้นจึงคำนวณความพึงปรารถนาโดยรวม (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n โดยที่ n คือหมายเลขดัชนี] SPSS21.{{10}} ซอฟต์แวร์และซอฟต์แวร์ผู้เชี่ยวชาญด้านการออกแบบถูกใช้สำหรับการถดถอยเชิงเส้นพหุคูณและการปรับทวินามของตัวแปรอิสระและ OD โดยพิจารณาว่า p < 0.05="" ได้รับการพิจารณา="" มาตรฐานที่มีนัยสำคัญทางสถิติของสมการ="" สมการที่มีค่า="" r="" มากกว่า="" (ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์หลายค่า)="" ถูกเลือกเป็นแบบอย่างที่เหมาะสมที่สุด="" สมการเชิงเส้นหลายตัวแปรแสดงเป็น="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" บวก="" 0.034x2="" บวก="" 0.012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" หน้า="0.004)" สมการทวินามคือ="" y="–" 21.92173="" –="" 0.74079x1="" บวก="" 0.62914x2="" บวก="" 0.041161x3="" บวก="" 0.014972x1x2="" บวก="" 2.06050*10-4x1x3="" บวก="" 1.05698="" ×="" 10-3x2x3="" -="" 0.029589x{="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)" จากสมการข้างต้นจะเห็นได้ว่าค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของสมการถดถอยเชิงเส้นหลายตัวแปรมีค่าต่ำกว่า="" ความสัมพันธ์ระหว่างตัวแปรอิสระและตัวแปรตามนั้นต่ำมาก="">

แต่ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของสมการทวินามมีค่าสูงและส่งผลให้มีความเหมาะสม ดังนั้นจึงเลือกแบบจำลองทวินาม จากการวิเคราะห์ที่ครอบคลุมของรูปร่างพื้นผิวและแผนที่รูปร่างรวมกับข้อมูลการทดลอง (ค่า OD ใกล้ {0}}.6) ได้ช่วงที่เหมาะสมที่สุดของวิธีการทำให้บริสุทธิ์ จากรูปที่ 8 จะเห็นได้ว่าค่า OD สูงสุดถูกสร้างขึ้นเมื่อ pH ของสารละลายตัวอย่าง (A) อยู่ในช่วง 9-10 และความเข้มข้นของตัวชะ (B) อยู่ในช่วง 79−85 เปอร์เซ็นต์ . รูปที่ 9 แสดงให้เห็นว่าได้ค่า OD สูงสุดเมื่อค่า pH ของสารละลายตัวอย่าง (A) อยู่ในช่วง 9-10 และปริมาตรของตัวชะ (C) อยู่ในช่วง 20-25 BV รูปที่ 10 แสดงว่าได้รับค่า OD สูงสุดเมื่อความเข้มข้นของตัวชะ (B) อยู่ในช่วง 80−85 เปอร์เซ็นต์ และปริมาตรของตัวชะ (C) อยู่ในช่วง 20-25 BV จากการวิเคราะห์ข้อมูลเหล่านี้อย่างครอบคลุม ค่า pH ของสารละลายตัวอย่าง ความเข้มข้นของตัวชะ และปริมาตรของตัวชะถูกกำหนดให้อยู่ในช่วง 9-10, 80−85 เปอร์เซ็นต์ และ 20-25 BV ตามลำดับ จากสมการทวินามหลายตัวแปรสำหรับผลลัพธ์อนุพันธ์ของอนุพันธ์และรูปแบบที่เหมาะสมที่สุด พบว่าวิธีการทำให้บริสุทธิ์ TGCD ที่ดีที่สุดอยู่ที่ความเข้มข้นของตัวชะ (เอทานอล) 85 เปอร์เซ็นต์ และปริมาตร 25 BV ที่ pH 11 ค่า OD ที่สอดคล้องกันคือ 0.8332 และผลผลิตของไกลโคไซด์ทั้งหมดเท่ากับ 73.0339 เปอร์เซ็นต์ การแสดงผลด้วยสายตาจากตัวเลข 8-10 ระบุวิธีที่ดีที่สุดที่จะเป็นวิธีการที่มีการพิจารณาปฏิสัมพันธ์ระหว่างสองปัจจัย แม้ว่าวิธีที่ดีที่สุดที่อนุมานจากสูตรจะรับรู้ถึงวิธีการที่มีปฏิสัมพันธ์ระหว่างปัจจัยทั้งสาม ผลลัพธ์ทั้งสองต่างกันและวิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสมที่สุดถือว่ามีความเข้มข้นของตัวชะ (เอทานอล) อยู่ที่ 85 เปอร์เซ็นต์ และปริมาตร 25 BV ที่ pH 11

การวัดการเจริญเติบโตของมดลูก

ค่าสัมประสิทธิ์มดลูกของแต่ละกลุ่มแสดงในตารางที่ 3 เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ ผลลัพธ์ของกลุ่มอื่นมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ พบว่า TGCD ได้มาจากวิธีการทำให้บริสุทธิ์ 20 วิธีที่แตกต่างกันทั้งหมดทำปฏิกิริยากับเอสโตรเจน

การทดลองยืนยัน

ผลที่ครอบคลุมของ CCD และการทดสอบการเจริญเติบโตของมดลูกแสดงให้เห็นว่าวิธีการทำให้บริสุทธิ์ที่เหมาะสมที่สุดได้รับการพิจารณาว่ามีความเข้มข้นของสารชะ (เอทานอล) ที่ร้อยละ 85 และปริมาตร 25 BV ที่ pH 11 ในระหว่าง

กระบวนการตรวจสอบ ผลผลิตเฉลี่ยของไกลโคไซด์ทั้งหมดเท่ากับ 70.9150 เปอร์เซ็นต์ ส่วนเบี่ยงเบนเฉลี่ยระหว่างค่าที่คาดการณ์และค่าจริงคือ 2.1180 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้นจึงสามารถแนะนำได้ว่าความสามารถในการคาดการณ์และความน่าเชื่อถือในการทดลองของแบบจำลองนี้เป็นสิ่งที่ดี

การระบุ TGCD หลังการทำให้บริสุทธิ์

ตามเวลาเก็บรักษาและข้อมูล MS สันนิษฐานว่ามีองค์ประกอบทางธรรมชาติ 21 ชนิด ได้แก่ campneoside 1, 2′-acetylacteoside, cistanoside A, cistanoside B, syringalide A 3'- - L-rhamnopyranoside, tubuloside A, tubuloside B, salidroside, cistanoside G, กรด teniposide, decaffeoylacteoside, 8-epiloganic acid, echinacoside, cistanoside F, cistantubuloside B1, isoacteoside, acteoside, cis-acteoside, kankanoside E, osmanthuside B และ cistanoside, MS / ระยะเวลาการเก็บรักษา ข้อมูล MS สูตรและสารประกอบที่คาดเดาถูกแสดงไว้ในตารางที่ 4

Q-TOF-MS เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการระบุโครงสร้างของส่วนประกอบโมเลกุลที่ซับซ้อนของยาและอาหาร เนื่องจากสามารถให้องค์ประกอบธาตุที่เป็นไปได้ผ่านมวลโมเลกุลที่แน่นอนและลักษณะโครงสร้างของเศษไอออน เพื่อสร้างคุณลักษณะเชิงโครงสร้างที่เป็นระบบ ข้อมูล Q-TOF-MS, MS, การค้นหาฐานข้อมูล และเอกสารอ้างอิงที่ตีพิมพ์ถูกนำมาใช้เพื่อระบุตัวตน สูตรโมเลกุลของส่วนประกอบเป้าหมายแต่ละอย่างถูกอนุมานจากไอออนต้นกำเนิด และมันถูกจับคู่กับสารประกอบที่รู้จัก สูตรนี้สามารถกำหนดเพิ่มเติมได้จากแฟรกเมนต์ไอออนที่เกี่ยวข้อง ตัวอย่างเช่น พีค 5 แสดงไอออนที่ลดโปรตอนอย่างเด่นที่ m/z 654 (C30H38O16) ซึ่งเหมือนกันกับองค์ประกอบธาตุของแคมป์นีโอไซด์ 1 การสูญเสีย caffeoyl เกิดขึ้นจากแฟรกเมนต์ไอออนที่ m/z 493 และการสูญเสียของ rha moiety ถูกก่อรูปจากแฟรกเมนต์ไอออนที่ m/z 347

บทสรุป

โดยใช้เทคโนโลยี LC-Q-TOF-MS วิธีการวิเคราะห์เชิงคุณภาพที่ง่ายและมีประสิทธิภาพสำหรับ TGCD ได้รับการพัฒนาและตรวจสอบอย่างสมบูรณ์ ข้อมูลการตรวจสอบความถูกต้องสำหรับการคัดกรองและการระบุสารประกอบธรรมชาติจาก TGCD เป็นที่น่าพอใจ สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพ 21 ชนิดจาก TGCD ถูกคาดการณ์ดังนี้: salidroside, cistanoside G, geniposidic acid, decaffeoylacteoside, campneoside 1, 8-epiloganic acid, 2'-acetylacteoside, cistanoside A, cistanoside B, syringalide A3′{{{ }}L-rhamnopyranoside, echinacoside, cistanoside F, cistantubuloside B1, isoacteoside, acteoside, tubuloside A, cis-acteoside, kankanoside E, osmanthuside B, cistanoside C และ tubuloside B. การแสดงลักษณะโครงสร้างของสารประกอบเหล่านี้สำหรับการทดลอง การควบคุมคุณภาพและการประยุกต์ใช้ทางคลินิกต่อไปเนื่องจากกิจกรรมของฮอร์โมนเอสโตรเจน นี้สามารถเสนอทางเลือกการรักษาที่แปลกใหม่และปรับปรุงสำหรับการรักษาโรควัยหมดประจำเดือน ดังนั้นจึงหลีกเลี่ยงผลข้างเคียงและอาการไม่พึงประสงค์จากการรักษาด้วยฮอร์โมนเอสโตรเจน

ตัวย่อ

TGCDCistanche deserticolaไกลโคไซด์ทั้งหมด LC/Q-TOF-MS โครมาโตกราฟีของเหลว/แมสสเปกโตรเมตรีเวลาของเที่ยวบินควอดรูโพล

วิธีการพื้นผิวการตอบสนอง RSM

การออกแบบคอมโพสิตกลาง CCD

MS แมสสเปกโตรเมตรี HPLC/Q-TOF-MS โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง/แมสสเปกโตรเมตรีเวลาบินสี่เท่า

ACN อะซิโตไนไตรล์

ปริมาณเตียง BV

OD ความปรารถนาโดยรวม

LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry

Q-TOF-MS quadrupole time-of-flight แมสสเปกโตรเมตรี

ยาจีนแผนโบราณ TCM

ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ RSD

รับทราบ

โครงการนี้ได้รับการสนับสนุนโดยมูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งชาติของจีน (หมายเลข 81073015) มูลนิธิวิทยาศาสตร์ธรรมชาติแห่งมณฑลเฮยหลงเจียง (ZD2017014) แผนฝึกอบรมผู้มีความสามารถด้านนวัตกรรมรุ่นใหม่ของวิทยาลัยในมณฑลเฮยหลงเจียง (UNPYSCT- 2017209) ผู้เขียนขอประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์เกี่ยวกับการตีพิมพ์บทความนี้

ขัดผลประโยชน์

ผู้เขียนระบุว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์

อ้างอิง

[1] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Phenylethanoid glycosides ที่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบจากลำต้นของ Cistanche deserticola ที่เพาะเลี้ยงในทะเลทราย Tarim, Fitoterapia, 2013, 89, {{4} }.

[2] Guo Y. , Cao L. , Zhao Q. , Zhang L. , Chen J. , Liu B. , Zhao B. , ลักษณะเบื้องต้น, สารต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ป้องกันตับของโพลีแซคคาไรด์จาก Cistanche deserticola, วารสารนานาชาติของโมเลกุลขนาดใหญ่ทางชีวภาพ , 2016, 293, 678-685.

[3] Nan ZD, Zhao MB, Zeng KW, Tian SH, Wang WN, Jiang Y., Tu PF, iridoids ต้านการอักเสบจากลำต้นของ Cistanche deserticola ที่เพาะเลี้ยงในทะเลทรายทาริม, วารสารยาธรรมชาติของจีน, 2016, 14, 61-65.

[4] Peng F. , Chen J. , Wang X. , Xu C. , Liu T. , Xu R. , การเปลี่ยนแปลงระดับของ Phenylethanoid Glycosides, กิจกรรมต้านอนุมูลอิสระและลักษณะคุณภาพอื่น ๆ ใน Cistanche Deserticola Slice โดยกระบวนการอบไอน้ำ, เคมี และ Pharmaceutical Bulletin (โตเกียว), 2016, 64, 1024-1030

[5] Wang T. , Zhang X. , Xie W. , Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": บทวิจารณ์, The American Journal of Chinese Medicine, 2012, 40, 1123-1141

[6] Song Y. , Song Q. , Li J. , Zhang N. , Zhao Y. , Liu X. , Jiang Y. , Tu P. , กลยุทธ์แบบบูรณาการเพื่อสร้างความแตกต่างในเชิงปริมาณระหว่างดอกคาโมไมล์ระหว่างCistanche deserticolaและ C. tubulosa โดยใช้ liquid chromatography-hybrid triple quadrupole linear ion trap mass spectrometry ที่มีประสิทธิภาพสูง, Journal of Chromatography A, 2016, 1429, 238-247

[7] Li Y. , Peng Y. , Wang M. , Zhou G. , Zhang Y. , Li X. , การคัดกรองอย่างรวดเร็วและการระบุความแตกต่างระหว่างเมแทบอไลต์ของCistanche deserticolaและสารสกัดจากน้ำ C. tubulosa ในหนูโดยการวิเคราะห์การรู้จำรูปแบบรวม UPLC-Q-TOF-MS, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 131, 364-372

[8] Li WL, Sun XM, Song H. , Ding JX, Bai J. , Chen Q. , HPLC/Q-TOF-MS-Based Identification ขององค์ประกอบที่ดูดซับและเมตาโบไลต์ของพวกมันในหนูเซรั่มและปัสสาวะหลังการบริหารช่องปากของ Cistanche Deserticola Extract, วารสารวิทยาศาสตร์การอาหาร, 2015, 80, H2079-2087.

[9] Almasi A. , Dargahi A. , Mohamadi M. , Biglari H. , Amirian F. , Raei M. , การกำจัด Penicillin G. โดยการรวมกันของ sonolysis และ Photocatalytic (sano-photocatalytic) จากสารละลายในน้ำ: การปรับกระบวนการให้เหมาะสมที่สุด โดยใช้ RSM (วิธีการตอบสนองพื้นผิว), Electron Physician, 2016, 8,

[10] 2878-2887. Hou W. , Zhang W. , Chen G. , Luo Y. , การเพิ่มประสิทธิภาพของเงื่อนไขการสกัดสำหรับกิจกรรมฟีนอลสูงสุด, ฟลาโวนอยด์และสารต้านอนุมูลอิสระจากข้อมูลใบประดับ Melaleuca โดยใช้วิธีการตอบสนองพื้นผิว, PloS One, 2016, 11,

[11] e0162139. Pooralhossini J., Ghaedi M., Zanjanchi MA, Asfaram A., ทางเลือกของการสกัดด้วยอัลตราซาวนด์ร่วมกับ spectrophotometric สำหรับการกำหนดกรดแกลลิกอย่างรวดเร็วในตัวอย่างน้ำ: การออกแบบคอมโพสิตกลางสำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของตัวแปรกระบวนการ Ultrasonics Sonochemistry, 2017, 34 , 692- 699.

[12] Han L. , Boakye-Yiadom M. , Liu E. , Zhang Y. , Li W. , Song X. , Fu F. , Gao X. , ลักษณะโครงสร้างและการระบุ phenylethanoid glycosides จากCistanches deserticola YC Maโดย UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochemical Analysis, 2012, 23, 668-676

[13] Lu D. , Zhang J. , Yang Z. , Liu H. , Li S. , Wu B. , Ma Z. , การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ Cistanches Herba โดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงควบคู่ไปกับการตรวจจับอาร์เรย์ไดโอดและ ความละเอียดของมวลสารรวมกับวิธีเคมี วารสารวิทยาศาสตร์การแยก, 2013, 36, 1945-1952.

[14] Li WL, Chen Q. , Yang B. , Gao S. , Zhang JJ, การคัดกรองสารสกัดที่มีประสิทธิภาพของ phyto-estrogenic และปริมาณของCistanche deserticola, ยาสมุนไพรจีน, 2013, 5, 292-296.

[15] Li YP, Huang FR, Dong J. , Xiao C. , Xian RY, Ma ZG, Zhao J. , การระบุอย่างรวดเร็วของ Cistanche ผ่านเทคโนโลยีการถ่ายภาพสเปกตรัมเรืองแสงรวมกับการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักและความแตกต่างของชาวประมง Guang Pu Xue Yu Guang ผู่เฟินซี 2015, 35, 689-694.