Part1: แนวทางใหม่เพื่อเพิ่มศักยภาพการงอกใหม่ของเซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือดในผู้ป่วยโรคไตระยะสุดท้าย

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อtina.xiang@wecistanche.com

เชิงนามธรรม: การหมุนเวียนเซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือดจากไขกระดูก (EPCs) ที่มาจากไขกระดูกช่วยซ่อมแซมหลอดเลือดในอวัยวะต่าง ๆ รวมถึงไต แต่จะค่อยๆ ลดลงในระยะสุดท้ายโรคไตผู้ป่วย (ESKD) ซึ่งมีความสัมพันธ์กับผลลัพธ์ของโรคหัวใจและหลอดเลือดและการเสียชีวิตที่เกี่ยวข้อง ดังนั้นเราจึงพิจารณาว่าการเพิ่มผลการซ่อมแซมเนื้อเยื่อของเซลล์ mesenchymal stromal ที่ได้จากไขกระดูกของมนุษย์ (BM-MSCs) ที่มีผลทางหลอดเลือดของ recombinant human relaxin (RLX) อาจส่งเสริมการเพิ่มจำนวนและการทำงานของ EPC CD34 บวก EPC แยกได้จากเลือดของผู้ป่วยที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วย ESKD ที่เพาะเลี้ยงจนกระทั่งเกิด EPC ระยะสุดท้าย จากนั้นกระตุ้นด้วยสื่อสภาวะที่ได้มาจาก BM-MSC (CM; 25 เปอร์เซ็นต์ o), RLX (1 หรือ 10ng/mL) หรือทั้งสองอย่าง การรักษาแบบผสมผสาน ในขณะที่ RLX เพียงอย่างเดียวกระตุ้นการงอกของ EPC การสร้างหลอดเส้นเลือดฝอย และการรักษาบาดแผลในหลอดทดลอง มาตรการเหล่านี้ได้รับการปรับปรุงอย่างรวดเร็วและชัดเจนยิ่งขึ้นด้วยผลรวมของ CM และ RLX ที่ได้จาก BM-MSC ใน EPC ที่ได้จากทั้งผู้ป่วยที่มีสุขภาพดีและ ESKD การค้นพบนี้มีนัยสำคัญทางคลินิก โดยได้ระบุวิธีการรักษาแบบผสมผสานแบบใหม่ที่สามารถฟื้นฟูและเพิ่มจำนวน EPC และการทำงานในผู้ป่วย ESKD ได้

คีย์เวิร์ด: เซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือด; โรคไตระยะสุดท้าย; เซลล์ต้นกำเนิดจากไขกระดูกจากไขกระดูก ผ่อนคลาย; การรักษาบาดแผล; การสร้างเส้นเลือดใหม่; การฟื้นฟู

คลิกที่นี่เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับ cistanche สำหรับการขาย

1. บทนำ

โรคไตเรื้อรัง(CKD) เป็นปัญหาสุขภาพระดับโลก ซึ่งหมายถึงการลดลงของอัตราการกรองไต (GFR) น้อยกว่าหรือเท่ากับ 60 มล./นาที/1.73 ตร.ม. ซึ่งมักนำไปสู่โรคไตระยะสุดท้าย (ระยะที่ 5) (ESKD; GFR น้อยกว่าหรือเท่ากับ 15 มล./นาที/1.73 ม.2)[2] ลักษณะทางพยาธิวิทยาของ CKD รวมถึงการลีบของท่อที่เกี่ยวข้องกับการลดลงของเส้นเลือดฝอยในไตและ podocytes การทำลายเซลล์บุผนังหลอดเลือดของไตและการพัฒนาของพังผืดของไต[3,4]. เอ็นโดทีเลียมของไตบกพร่องในระหว่างกระบวนการเหล่านี้ นำไปสู่การสร้างเส้นเลือดใหม่บกพร่องและการทำงานของไต [5] กำลังติดตามไตเสียหาย, เซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือดจากไขกระดูก (EPCs) ที่ได้รับจากไขกระดูกถูกคัดเลือกไปยังบริเวณที่ได้รับบาดเจ็บเพื่ออำนวยความสะดวกในการซ่อมแซมเนื้อเยื่อ [6] EPC มีบทบาทสำคัญในการเจริญเติบโตและการเพิ่มจำนวนของเซลล์บุผนังหลอดเลือดในไต ความสมบูรณ์ของหลอดเลือด และการซ่อมแซมบุผนังหลอดเลือดที่เสียหาย อย่างไรก็ตาม จำนวน EPC ที่หมุนเวียนจะลดลงเรื่อย ๆ ในผู้ป่วย ESKD [7-9] ซึ่งสัมพันธ์กับผลลัพธ์ด้านหัวใจและหลอดเลือดที่ไม่พึงประสงค์ [9,10] และการตายในระยะยาว

มีรายงานว่าเซลล์สโตรมอลมีเซนไคมอล (MSC) ส่งเสริมการสร้างเส้นเลือดใหม่โดยการกระตุ้นการเขียนโปรแกรม EPC อย่างไรก็ตาม ในขณะที่ MSCs ได้รับการประเมินในการทดลองทางคลินิกต่างๆ [13] ความสามารถในการอำนวยความสะดวกในการงอกใหม่ของบุผนังหลอดเลือดไตยังไม่ได้รับการตรวจสอบ การศึกษาล่าสุดจากห้องปฏิบัติการของเราได้ระบุถึงศักยภาพในการรักษาที่เพิ่มขึ้นของการรวม MSCs ที่ได้จากไขกระดูกของมนุษย์กับสารต้านการเกิดพังผืด นั่นคือ recombinant human(gene-2)relaxin (serelaxin; RLX[14)) ในการเยียวยา ความเสียหายของไต,การอักเสบและพังผืดในรูปแบบพรีคลินิกของโรค ในขณะที่ RLX เพียงอย่างเดียวสามารถกระตุ้นการเพิ่มจำนวน EPC ที่ได้รับจากเลือดของมนุษย์และการผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) ในหลอดทดลอง และการสร้างหลอดเลือดในหนูทดลองในร่างกาย [18] ยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัดว่าผลกระทบร่วมกับ BM-MSC สามารถเร่งและ/หรือเพิ่มประสิทธิภาพ EPC- การสร้างเส้นเลือดใหม่ที่ได้รับและการรักษาบาดแผล การศึกษานี้จึงประเมินศักยภาพในการรักษาของการรวม RLX และ BM-MSC-derived condensed media (CM) กับการเพิ่มจำนวน EPC ที่ได้รับจากผู้ป่วย ESKD และการรักษาบาดแผลในหลอดทดลอง

2. วัสดุและวิธีการ

2.1.การแยก EPC และการเพาะเลี้ยงจากเลือดส่วนปลาย

เมื่อได้รับแบบฟอร์มยินยอมของผู้ป่วยที่ลงนามแล้ว จะมีการเก็บรวบรวมเลือดประมาณ {{0}} มล. จากกลุ่มควบคุมของผู้ชายที่มีสุขภาพดีจากบริการสภากาชาดออสเตรเลีย ในทางตรงกันข้าม เก็บเลือดสูงสุดเพียง 5 มล. ของผู้ป่วย ESKD เพศชายจากศูนย์การแพทย์ Monash เนื่องจากภาวะสุขภาพของพวกเขา ตัวอย่างเลือดทั้งหมดได้รับการประมวลผลภายใน 24 ชั่วโมงของเวลารวบรวม ตัวอย่างเลือดทั้งหมดถูกเจือจางด้วยสารละลายเกลือที่สมดุลของแฮงค์ 1 เท่า (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) จนถึงปริมาตรรวม 20 มล. จากนั้น เลือดจะถูกแบ่งชั้นอย่างระมัดระวังด้วย Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 15 มล. ลงในหลอด Falcon 50 มล. (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) และปั่นแยกที่ 400× g เป็นเวลา 40 นาทีที่อุณหภูมิห้องเพื่อแยกบัฟฟี่โค้ตออกจากส่วนประกอบอื่นโดยใช้วิธีการแยกเกรเดียนต์ของความหนาแน่นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [19,20] หลังจากการแยกทางเกรเดียนต์ ชั้นบนที่มีพลาสมาและเกล็ดเลือดถูกกำจัดออกโดยการสอดปิเปตทางซีรั่มอย่างระมัดระวัง โดยปล่อยให้บัฟฟี่โค้ตที่มีเซลล์โมโนนิวเคลียร์จากเลือดส่วนปลาย (PBMC) ไม่ถูกรบกวน ซึ่งประกอบด้วยเซลล์ต้นกำเนิดบุผนังหลอดเลือด (EPC) เม็ดถูกแขวนลอยใหม่ใน Endothelial Cell Growth Media (EGM) 2 มล.-2 Microvascular (MV)Bullet Kit (ผลิตภัณฑ์ #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 5 เปอร์เซ็นต์ (FBS), ไฮโดรคอร์ติโซน 0.04 เปอร์เซ็นต์, ปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์ของมนุษย์ 0.4 เปอร์เซ็นต์ (hFGF) และ 0.1 เปอร์เซ็นต์ของปัจจัยการเจริญเติบโตบุผนังหลอดเลือด (VEGF), R3-ปัจจัยการเจริญเติบโตคล้ายอินซูลิน (IGF) )-1, กรดแอสคอร์บิก, ปัจจัยการเจริญของผิวหนังชั้นนอกของมนุษย์(hEGF) และเจนตามิซินซัลเฟต/แอมโฟเทอริซิน(GA-1000) ต่อ EPC ที่แยกจากการเพาะเลี้ยง เซลล์ถูกนับโดยใช้ CountessM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ก่อนที่พวกมันจะถูกเพาะลงบนจาน/ขวดเพาะเชื้อที่เคลือบด้วยไฟโบรเนกติน

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 เซลล์/โคโลนี) โดยใช้การสอบวิเคราะห์หน่วยสร้างโคโลนี (CFU)

2.2. การเตรียมสื่อปรับสภาพ (CM) จากการเพาะเลี้ยง BM-MSC

เนื่องจากการเพิ่ม BM-MSC เข้ากับวัฒนธรรม EPC จะทำให้อุปกรณ์ปลายทางที่เกี่ยวข้องกับ EPC ถูกวัดได้ประนีประนอม จึงตัดสินใจว่าจะเป็นการดีกว่าที่จะวิเคราะห์ผลกระทบของ CM ที่ได้มาจาก BM-MSC ต่อฟังก์ชัน EPC ตามที่เคยใช้สำหรับการวิเคราะห์ ของอุปกรณ์ปลายทางอื่นๆ [19] โดยสังเขป BM-MSC นั้นเติบโตในสื่อ Alpha-Minimum Essential ( -MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, ออสเตรเลีย) เสริมด้วยซีรัมของทารกในครรภ์ 16 เปอร์เซ็นต์ (FBS) และ 1 เปอร์เซ็นต์ 200 mM แอล-กลูตามีน และเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเซลล์ถึงจุดบรรจบกัน ~80 เปอร์เซ็นต์ BM-MSCs ถูกเพาะเลี้ยงย่อยเพิ่มเติมและชุบลงในจานหลุม 12-หลุมที่ความหนาแน่น ~0.5×10 องศาต่อหลุม และคงไว้ในการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24-48 ชั่วโมง เพื่อให้แน่ใจว่าสิ่งที่แนบมากับเซลล์ เพื่อเตรียมสื่อที่ปรับสภาพแล้ว (CM) จาก BM-MSC ช่วงเวลาสั้นๆ เซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วย 1 มล. ของ 1× HBSS ที่อุ่นล่วงหน้า ตามขั้นตอนการล้าง 500 ไมโครลิตรของซีรั่มและสารตั้งต้นของเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ปราศจากปัจจัยการเจริญเติบโต (EBM; Product #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA)ถูกเติมลงในเซลล์และคงสภาพในการเพาะเลี้ยงที่ 5 เปอร์เซ็นต์ CO, 37 องศาเป็นเวลาอีก 24 ชั่วโมง เมื่อสิ้นสุดระยะฟักตัว CM จะถูกรวบรวมและหมุนเหวี่ยงที่ 400×g เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อขจัดเศษเซลล์ใดๆ CM ใน 500 ไมโครลิตร aliquots ถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาจนกว่าจะใช้ในอนาคต

2.3. การทดสอบการทำงาน

2.3.1. การรักษา EPCs ปลายที่เพาะเลี้ยง

เมื่อเก็บเกี่ยว EPC ระยะสุดท้ายแล้ว การทดสอบเชิงฟังก์ชันก็ถูกดำเนินการ การทดลองทั้งหมดดำเนินการในข้อ 3-6 การทดสอบเชิงฟังก์ชันถูกดำเนินการเพื่อตรวจสอบผลกระทบของ (i)25 เปอร์เซ็นต์ BM-MSC สื่อที่ถูกปรับสภาพ (CM 25 เปอร์เซ็นต์)[20];(ii)1 [RLX-1] หรือ 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX(แสดงถึงระดับการหมุนเวียนของ H2 relaxin ที่พบในสตรีมีครรภ์ [21]); หรือ (i) ผลรวมของ CM 25 เปอร์เซ็นต์และ 1 หรือ 10 ng/mL RLX; (iv) 20 เปอร์เซ็นต์ FBS ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวกต่อศักยภาพในการเพิ่มจำนวนและการสร้างหลอด (สร้างเส้นเลือดใหม่) ของ EPC ระยะสุดท้ายที่ได้มาจากผู้ป่วยกลุ่มควบคุม . เปรียบเทียบกลุ่มการรักษากับเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา

2.3.2.การทดสอบความมีชีวิตและการเพิ่มจำนวน

ความมีชีวิตและศักยภาพในการงอกขยายของ EPC ระยะสุดท้ายถูกกำหนดหาโดยใช้ {{0}}(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT)การทดสอบตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia) โดยสังเขป ~5×103 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะในเพลต 96-หลุม (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia) ต่อจากนั้น เซลล์ได้รับการบำบัดด้วย CM-MSC ที่ได้มาจาก BM, RLX(10 ng/ มล.) หรือการรวมกันของ CM และ RLXat 1 หรือ 10ng/mL เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เมื่อสิ้นสุดระยะฟักตัว เติมน้ำยาการติดฉลาก MTT 10 ไมโครลิตร (0.5 มก./มล., Sigma-Aldrich, เมลเบิร์น, VIC, ออสเตรเลีย) และบ่มที่ 37 องศา Cand 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ต่อไปอีก 4 ชั่วโมง เซลล์ถูกละลายโดยการเพิ่ม 100 ไมโครลิตรของสารละลายการละลาย (ซิกมา-อัลดริช, เมลเบิร์น, VIC ออสเตรเลีย) และศักยภาพในการเพิ่มจำนวนของ EPC ระยะสุดท้ายถูกกำหนดโดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงของแต่ละตัวอย่างที่ 590 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลท reader (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Australia) และวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ SoftMax Pro สำหรับ Windows OS (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA) แต่ละกลุ่มการรักษาถูกดำเนินการและวิเคราะห์ในหกซ้ำ

2.3.3. การทดสอบการก่อตัวของหลอด

ผลของการรักษาต่างๆ เพื่อส่งเสริมศักยภาพการสร้างเส้นเลือดใหม่ของ EPCs ระยะสุดท้าย โดยใช้การทดสอบการก่อตัวของหลอดถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบ μ-angiogenesis (Abidi, Fitchburg, WI, USA) โดยสังเขป 10 ไมโครลิตรของปัจจัยการเจริญเติบโตที่ลด (GFR) Matrigel (ผลิตภัณฑ์ #356231, Corning, Tewksbury, MA, USA) ถูกเติมลงในบ่อน้ำชั้นในของ μ-Slide ของชุดทดสอบการสร้างเส้นเลือดใหม่ (Abidi, Fitchburg, WI, USA ). วัฒนธรรมที่ไหลมารวมกันของ EPC ระยะสุดท้ายถูกเพาะลงบนเซลล์ที่เคลือบและบำบัดด้วย CM ที่ได้มาจาก BM-MSC, RLX(10 ng/mL) หรือการรวมกันของ CM และ RLX ที่ 10 ng/mL ปริมาตรรวม 50 ไมโครลิตรของสารแขวนลอยของเซลล์ที่มี~1 ×104 เซลล์ถูกนำไปใช้กับแต่ละหลุม รูปภาพถูกจับทันทีและติดป้ายกำกับว่าเป็นจุดเวลา 0-ชั่วโมง ความสามารถของเซลล์ภายใต้การรักษาต่างๆ เพื่อ

สังเกตพบหลอดรูปแบบและภาพถูกจับที่ 2-24 ชั่วโมงการเพาะหลังเซลล์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง จำนวนหลอด ความยาวของท่อ และจำนวนจุดแตกแขนงถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ

2.3.4.การทดสอบการรักษาบาดแผล

ผลของการรักษาแบบต่างๆ ต่อศักยภาพในการฟื้นฟูของ EPC ระยะสุดท้ายถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบการรักษาบาดแผล เพื่อทำการทดสอบ ~ 1 × 10 เซลล์ถูกระงับในตัวกลางการเจริญเติบโต 50 ไมโครลิตรและเพาะลงในซิลิโคน 2 หลุมในจานขนาด 35 มม. สำหรับการทดสอบการรักษาบาดแผล (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA) แผลเทียมภายในจานถูกสร้างขึ้นโดยค่อยๆ เอาซิลิโคนบ่อออกโดยใช้แหนบที่ปลอดเชื้อ (ระยะห่างของช่องว่าง=500±100μm) เติม EGM 50 เปอร์เซ็นต์ 2 มล. จำนวน 2 มล.-2 ในจานด้วยการเพิ่มสารต่างๆ การรักษารวมถึง CM-MSC ที่ได้รับ CM, RLX(10 ng/mL) หรือการรวมกันของ CM และ RLX ที่ 1 หรือ 10ng/mL ประเมินจำนวนเซลล์ที่ย้ายเพื่อปิดแผลโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง เซลล์ที่ถูกย้ายถูกจับที่ 0-24 ชั่วโมงหลังการบำบัด เปอร์เซ็นต์ของพื้นที่ปิดช่องว่างถูกกำหนดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Image]

2.3.5.การวิเคราะห์รูปภาพ

การวิเคราะห์ภาพทั้งหมดสำหรับการทดสอบการทำงานดำเนินการโดยใช้ ImageJ สำหรับ MacOS (เวอร์ชัน 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) สำหรับศักยภาพในการก่อตัวหลอดของ EPC ระยะสุดท้าย รูปภาพถูกวิเคราะห์โดยใช้ปลั๊กอินการทดสอบการสร้างเส้นเลือด และบันทึกพารามิเตอร์ที่แตกต่างกันสี่ตัวรวมถึงความยาวทั้งหมด จำนวนตาข่าย จำนวนจุดเชื่อมต่อ และจำนวนกิ่ง สำหรับการทดสอบการหายของบาดแผลนั้น วิเคราะห์พื้นที่ปิดแผลโดยทำเครื่องหมายบริเวณที่ปราศจากเซลล์ด้วยตนเองในแต่ละจุดเวลา การวัดทั้งหมดดำเนินการอย่างน้อย 3 ครั้งเพื่อควบคุมการแปรผัน

2.3.6. อิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

การกำหนดตำแหน่งโปรตีนของ Relaxin Family Peptide Receptor 1 (RXFP1; ตัวรับ RLX cognate) ใน EPCs ที่เพาะเลี้ยงในช่วงปลายที่ได้รับการเพาะเลี้ยงถูกกำหนดโดยใช้การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ ประการแรก ~1× 1{{20}} องศาเซลล์ที่เติบโตบนฝาครอบกระจกขนาด 13 มม. (เคลือบด้วยโพลี-ดี-ไลซีน) ในจานหลุม 12-หลุมถูกตรึงใน PFA 4 เปอร์เซ็นต์สำหรับ 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ตายตัวถูกบล็อกสำหรับการจับโปรตีนที่ไม่เฉพาะเจาะจงโดยใช้ 1 เปอร์เซ็นต์ของโบวีนในเลือดอัลบูมิน (BSA) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เมื่อสิ้นสุดระยะฟักตัว เซลล์ถูกล้างใน PBS เป็นเวลา 5 นาที (3 ครั้ง) และบ่มด้วยโพลีโคลนัล RXFP1 แอนติบอดีของกระต่าย (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim ประเทศเยอรมนี )ใน 0.01 เปอร์เซ็นต์ BSA ค้างคืนที่ 4 องศา เซลล์ถูกล้างด้วย PBS และบ่มด้วยแอนติบอดีรองแพะ-ต้านกระต่าย Alexa-fluor 594 (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia) ใน 0.01 เปอร์เซ็นต์ BSA เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ทำการย้อมทับด้วยนิวเคลียร์โดยเติม DAPI 40 ไมโครลิตรในตัวกลางสำหรับติดตั้ง Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) และปิดฝา โปรตีน RXFP1 ที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันถูกแสดงภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงที่กำลังขยาย ×40 (Olympus BX51) และภาพถูกรวมเข้าด้วยกันโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ

2.4. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SEM และการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) ใช้วิธี ANOVA เพื่อเปรียบเทียบผลของการรักษาต่างๆ ต่อศักยภาพในการเพิ่มจำนวน (MTT assay) และศักยภาพการสร้างเส้นเลือดใหม่ (การทดสอบการสร้างหลอด) ของ EPC ระยะสุดท้าย ตามด้วยการทดสอบภายหลังของ Tukey เพื่อให้สามารถเปรียบเทียบได้หลายแบบระหว่างกลุ่มการรักษา การวัดซ้ำแบบสองทาง-ANOVA ถูกใช้เพื่อเปรียบเทียบผลของการรักษาต่างๆ ต่อการปิดแผลโดย EPC ระยะสุดท้ายเมื่อเวลาผ่านไป ตามด้วยการทดสอบหลังเฉพาะกิจของ Tukey เพื่อเปรียบเทียบแต่ละกลุ่มการรักษา ค่า p ที่น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ