ส่วนที่ II.: บทบาทของไฟโบรบลาสต์ไตปฐมภูมิของมนุษย์ใน TGF-β1-ไกล่เกลี่ยพังผืด-อุปกรณ์เลียนแบบ

ติดต่อ : ออเดรย์ Hu Whatsapp / hp : 0086 13880143964 อีเมล์ :audrey.hu@wecistanche.com

ส่วนที่ II.: บทบาทของไฟโบรบลาสต์ไตปฐมภูมิของมนุษย์ใน TGF-β1-ไกล่เกลี่ยพังผืด-อุปกรณ์เลียนแบบ

ซองฮเยฮวัง, ยุนมีลี &

นามธรรม

พังผืดของไตเป็นโรคไตเรื้อรังที่ก้าวหน้าซึ่งในที่สุดนําไปสู่ภาวะไตวายระยะสุดท้าย แม้จะมีแนวทางการต่อสู้หลายวิธีพังผืดของไตแบบจําลองการทดลองเพื่อประเมินยาที่มีอยู่ในปัจจุบันไม่เหมาะ เราพัฒนาแบบจําลอง b-mimicking โดยใช้อุปกรณ์เพาะเลี้ยงร่วมสามมิติ (3D) ที่ออกแบบให้มีชั้นคั่นระหว่างหน้าของ tubule สามชั้นแยกกัน ได้แก่ ชั้นเยื่อบุผิว fibroblastic และ endothelial เราแนะนําเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของไตของมนุษย์ (HK-2), เซลล์บุผนังหลอดเลือดหลอดเลือดดําสะดือของมนุษย์และไฟโบรบลาสต์ไตที่ได้จากผู้ป่วยและประเมินผลของtปัจจัยการเจริญเติบโต ransforming β(ทีจีเอฟ-β) และทีจีเอฟ-βการรักษาสารยับยั้งเกี่ยวกับเรื่องนี้เกี่ยวกับไตพังผืดแบบ การแสดงออกของพังผืดเครื่องหมายอัลฟาเรียบกล้ามเนื้อแอคตินเมื่อTGF-β1การรักษาได้รับการเสริมในเซลล์ HK-2 ที่เพาะเลี้ยงด้วยชั้นเดียวในรูปแบบโรค 3 มิติ ในช่องหลอดเลือดของเกี่ยวกับไตพังผืดแบบจําลองความหนาแน่นของเรือเพิ่มขึ้นและลดลงในทีจีเอฟ-β-กลุ่มที่ได้รับการรักษาและทีจีเอฟ-β- กลุ่มบําบัดยับยั้งตามลําดับ มัลติเพล็กซ์ ELISA โดยใช้สิ่งเหนือธรรมชาติในทีจีเอฟ-β- แบบจําลอง 3 มิติที่กระตุ้นแสดงให้เห็นว่าระดับไซโตไคน์โปรอักเสบและปัจจัยการเจริญเติบโตรวมถึงเบต้า interleukin-1, ปัจจัยเนื้อร้ายเนื้องอก - อัลฟา, ปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐานและTGF-β1,TGF-β2และTGF-β3เพิ่มขึ้นซึ่งเลียนแบบสภาพแวดล้อมขนาดเล็ก fibrotic ของไตของมนุษย์ การศึกษานี้อาจเปิดใช้งานการสร้างมนุษย์เกี่ยวกับไตพังผืด- เลียนแบบโมเดลอุปกรณ์นอกเหนือจากการทดลองวัฒนธรรมแบบดั้งเดิม

คําสําคัญ: ไฟโบรบลาสต์ไต; พังผืด; TGF-β1

ประโยชน์ต่อสุขภาพ cistanche tubolosa: การรักษาโรคไตเรื้อรัง

คลิกที่นี่เพื่อดูส่วนที่ 1

3. การสนทนา

TGF-β1มีบทบาทสําคัญในการสะสมเมทริกซ์ในการเกิดพังผืดของไตและยับยั้งการแพร่กระจายในเซลล์ส่วนใหญ่รวมถึงเซลล์เยื่อบุผิวและเยื่อบุผนังหลอดเลือดของไตรวมถึงเซลล์เยื่อบุผิวแบบท่อ【1】 อย่างไรก็ตาม TGF-ß1 ทําให้เกิดการแพร่กระจายในไฟโบรบลาสต์ไตของมนุษย์ผ่านการเหนี่ยวนําปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐาน (FGF-2) [8]

ในการศึกษาปัจจุบันเราได้จัดตั้งพังผืด- เลียนแบบอุปกรณ์โดยใช้ส่วนประกอบของเซลล์ที่สําคัญสามประการ ได้แก่ ไฟโบรบลาสต์ไตปฐมภูมิของมนุษย์เซลล์เยื่อบุผิวท่อไตและเซลล์บุผนังหลอดเลือดของมนุษย์และประเมินว่าเป็นเกี่ยวกับไตพังผืดแบบจําลองขึ้นอยู่กับTGF-β1สิ่งกระตุ้น เพื่อสร้างเกี่ยวกับไตพังผืด-on-a-chip เราได้สร้างระบบการเพาะเลี้ยง 3 มิติแบบใหม่ที่ออกแบบด้วยเนื้อเยื่อสามส่วนแยกกัน โดยมีเป้าหมายเพื่อเอาชนะอุปสรรคที่เกี่ยวข้องกับการสร้างแบบจําลองโรคไต การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าTGF-β1กระตุ้นการตอบสนองของเซลล์รวมถึงการเปลี่ยนแปลงเยื่อบุผิวท่อ - mesenchymal (EMT) ของเซลล์เยื่อบุผิวการเปลี่ยนแปลง microvascular ของเซลล์บุผนังหลอดเลือดและการเปลี่ยนแปลงไซโตไคน์ในไฟโบรบลาสต์ของไต นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่แนะนํา aพังผืด- อุปกรณ์เลียนแบบที่ประกอบด้วยไฟโบรบลาสต์ปฐมภูมิที่ได้จากไตของมนุษย์และไฟโบรบลาสต์กระตุ้นที่แยกได้จากผู้ป่วยที่มีTGF-β1ซึ่งเป็นตัวเหนี่ยวนําที่รู้จักของการตอบสนอง fibrotic โดยทั่วไปใช้เป็นมาตรฐานในการเลียนแบบพังผืดในการเพาะเลี้ยงเซลล์ [9] ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าTGF-β1- เซลล์เยื่อบุผิวที่ได้รับการรักษาจะถูกแปลงเป็นฟีโนไทป์ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์ mesenchymal เมื่อไรTGF-β1มีการบริหารงานให้กับไฟโบรบลาสต์ไซโตไคน์ต่าง ๆ จะถูกเปลี่ยนแปลงเพื่อสะท้อนถึงการเหนี่ยวนํากระบวนการไฟโบรติก เป็นที่ชัดเจนว่าในเกี่ยวกับไตพังผืดแบบจําลองไฟโบรบลาสต์เป็นกําลังหลักที่อยู่เบื้องหลังการพัฒนาระบบวัฒนธรรมที่จัดตั้งขึ้นผ่านการกระตุ้น TGF

Davis et al รายงานว่าการเพาะเลี้ยง 3 มิติของเซลล์บุผนังหลอดเลือดนั้นเพียงพอสําหรับเซลล์ที่จะบุกรุกและสร้างเครือข่ายลูเมนและท่อตามสิ่งมีชีวิตที่สมบูรณ์ในร่างกาย [10,11] หลายกลุ่มรายงานว่าแบบจําลองการเพาะเลี้ยง 3 มิติแสดงระดับความเป็นพิษต่อไตสูงกว่าแบบจําลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ 2 มิติ [12] นอกจากนี้ การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับพิษต่อไตและการอักเสบยังสูงกว่าแบบจําลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ 3 มิติของไตอย่างมีนัยสําคัญมากกว่าในวัฒนธรรม 2 มิติทั่วไป[13]

ในการศึกษาครั้งนี้สื่อวัฒนธรรมของมนุษย์เกี่ยวกับไตพังผืด-on-a-chip มีไซโตไคน์ในระดับที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับใน 2Dculture กลุ่มของเราแสดงให้เห็นว่าไฟโบรบลาสต์ที่ได้จากผู้ป่วยสามารถสร้างเนื้อเยื่อไตพื้นเมืองรวมถึงชั้นเซลล์บุผนังหลอดเลือดและเยื่อบุผิวผ่านที่แนะนําของเราพังผืด- รุ่นบนชิป ดังนั้นการค้นพบเหล่านี้บ่งชี้ว่าเกี่ยวกับไตพังผืดแบบจําลอง -on-a-chip จําลองสภาพแวดล้อมทางจุลฟิสิกส์ของไตมนุษย์ได้อย่างแม่นยํา นอกจากนี้เนื่องจากไฟโบรบลาสต์ที่เพาะเลี้ยงในชิปนั้นมาจากผู้ป่วยแบบจําลองผู้ป่วยอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องทางคลินิกจึงสามารถหาได้ง่ายและชัดเจนในลักษณะที่ปลอดภัย ดังนั้นมนุษย์เกี่ยวกับไตพังผืดระบบแบบจําลอง -on-a-chip ช่วยให้สามารถพัฒนายาเฉพาะบุคคลด้วยการวัดการทํางานของเยื่อบุผิวและเยื่อบุผนังหลอดเลือดที่ละเอียดอ่อน ในการทดลองของเราพังผืดและการสร้างเส้นเลือดใหม่ลดลงในทีจีเอฟ-βกลุ่มที่ได้รับการบําบัดด้วยสารยับยั้ง สารยับยั้ง TGF-β เป็นศัตรูตามธรรมชาติของ TGF-β ซึ่งแสดงให้เห็นโดยใช้แบบจําลองโรคไตต่างๆ ดูเหมือนว่าเป็นไปได้ที่จะทําการทดลองเพื่อยืนยันประสิทธิภาพของการรักษาในรูปแบบโรคโดยใช้ตัวแทนการรักษาเช่นสารยับยั้ง TGF-β นี้ ดังนั้นชิปนี้จึงเป็นวิธีการในการพัฒนารูปแบบที่ดีขึ้นของพังผืดในไตเพื่อวัดสัณฐานวิทยาและการทํางานของเซลล์และอาจเป็นประโยชน์ในการประเมินความเป็นพิษต่อไตสําหรับยา

ทีจีเอฟ-βเป็นปัจจัยหลักในโรคไตต่างๆ [14] และมีบทบาทในการสร้างเส้นเลือดใหม่ [15] ผลของ angiogenic ของ TGF-β มีความซับซ้อนมากและสามารถมีฤทธิ์กระตุ้นหรือ antiangiogenic ขึ้นอยู่กับการตั้งค่าและปัจจัยด้านกฎระเบียบต่างๆ [16] ปัจจัยการเจริญเติบโตของ Angiogenic เช่น VEGF และ FGF-2induce angiogenesis ในร่างกายดูเหมือนจะมีบทบาทสําคัญในการปรับการสร้างเส้นเลือดใหม่ในร่างกาย [17-20] หลักฐานบางอย่างบ่งชี้ว่าปัจจัยทั้งสองนี้สามารถทํางานร่วมกันเพื่อส่งเสริมเหตุการณ์ทางสัณฐานวิทยาของเซลล์บุผนังหลอดเลือด [21,22] เราได้ให้หลักฐานว่าการแสดงออกของ VEGF mRNA และการหลั่งโปรตีน FGF-2 ได้รับการยกระดับอย่างมีนัยสําคัญโดย TGF-β1 ในชิป 3 มิติเมื่อเทียบกับวัฒนธรรม 2 มิติ

ข้อ จํากัด ของเราพังผืดแบบจําลองอาจเป็นได้ว่าพวกเขาถูกสร้างขึ้นในระยะเวลาอันสั้น 24 ชั่วโมง TGF-beta มีคุณสมบัติโปรไฟโบรติกและต้านการอักเสบภายในต้นพังผืดกระบวนการไม่ได้อยู่ในกระบวนการเรื้อรัง ตามอัตภาพทีจีเอฟ-βมีการใช้เป็นหลักในไซโตไคน์ที่เกิดจากพังผืดรุ่น อย่างไรก็ตามเนื่องจากไซโตไคน์เพียงตัวเดียวไม่สามารถแสดงในร่างกายได้พังผืดแบบจําลองการเหนี่ยวนําโดยใช้สารผู้สมัครเพิ่มเติมหลายอย่างเช่นทีจีเอฟ-βและมีการเสนอ BMP7 อย่างไรก็ตามไซโตไคน์สองหรือสามตัวยังไม่เพียงพอที่จะทําซ้ําในร่างกาย เราใช้ทีจีเอฟ-βเป็นจุดเริ่มต้น อย่างไรก็ตาม เราพยายามใช้สภาพแวดล้อมขนาดเล็กในร่างกายบนชิปโดยทําให้เกิดพายุไซโตไคน์ที่หลากหลายมากขึ้น ไฟโบรบลาสต์ซึ่งเป็นส่วนประกอบสําคัญของเซลล์พังผืดได้รับการแนะนําและการกระตุ้นรองของไซโตไคน์ที่หลากหลายมากขึ้น (IL-1β, TNF-α, b-FGF,TGF-β1,ทีจีเอฟ-β2และทีจีเอฟ-β3) ถูกเหนี่ยวนําให้เกิดในไฟโบรบลาสต์ที่กระตุ้นด้วยทีจีเอฟ-β. ดังนั้นสภาพแวดล้อมที่คล้ายกับพังผืดในร่างกายมนุษย์ถูกทําซ้ํา

สารสกัดจาก cistanche deserticola: การรักษาโรคไต

4. วัสดุและวิธีการ

4.1.การเพาะเลี้ยงเซลล์

ไฟโบรบลาสต์ไต (KFs) ถูกแยกออกจากการตรวจชิ้นเนื้อของส่วนเนื้อเยื่อปกติของผู้ป่วยมะเร็งเซลล์ไตที่มีอัตราการกรองไตโดยประมาณ (eGFR) >60 มล. / นาที / 1.73 m2 หลังจากที่ผู้ป่วยได้ให้ความยินยอมในการตรวจชิ้นเนื้อครั้งที่สองเพื่อการวิจัย KFs ถูกเพาะเลี้ยงในสื่อการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์ (FGM-2, Lonza, Switzerland) และข้อความ 3 ถึง 4 ถูกใช้สําหรับการทดลอง ไฟโบรบลาสต์ไตถูกคัดลอกมาจากวัฒนธรรมเป็นเวลา 1-2 สัปดาห์จนกระทั่งเซลล์ก่อตัวเป็นชั้นเดียว เพื่อกําจัดเซลล์เยื่อบุผิวที่ปนเปื้อนวัฒนธรรมไฟโบรบลาสต์ได้รับการคัดเลือกโดยใช้ลูกปัดป้องกันไฟโบรบลาสต์แม่เหล็ก (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA, USA) หลังจากข้อความแรก เซลล์ถูกแยกออกโดยใช้กรดทริปซิน-เอทิลีนไดอามีนเตตตราอะซิติก 0.05% (EDTA) (เวลจีน, คยองซาน, เกาหลี) บ่มด้วยลูกปัดต่อต้านไฟโบรบลาสต์ และแยกออกจากกันโดยใช้คอลัมน์แม่เหล็ก และรวบรวมการไหลผ่าน ไฟโบรบลาสต์หลักบริสุทธิ์มีลักษณะการวิเคราะห์การคัดแยกเซลล์ที่เปิดใช้งานฟลูออเรสเซนส์ (FACS) โดยใช้แอนติบอดีต่อต้านไฟโบรบลาสต์ PE-conjugated การเรียงลําดับเซลล์ที่เปิดใช้งานด้วยแม่เหล็กอย่างอ่อนโยน (MACS)Dissociator ใช้สําหรับการขุดเนื้อเยื่อไตอย่างอ่อนโยน เครื่องแยกแม่เหล็ก Octo MACSTM พร้อมคอลัมน์ MACS LS (พร้อมลูกสูบ) ที่ใช้สําหรับการทําให้บริสุทธิ์ของเซลล์ที่ติดฉลากไมโครบีดซื้อจาก Miltenyi Biotec Inc. (ออเบิร์น แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) หลอดอ่อนโยน MACS C (Miltenyi Biotec Inc., ออเบิร์น, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ถูกนํามาใช้สําหรับสับไตสําหรับการแยกเซลล์. MACS Smart Strainers (70 um) ได้รับจาก Miltenyi Biotec Inc. (ออเบิร์น แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) บัฟเฟอร์คอลัมน์ถูกใช้เพื่อล้างคอลัมน์และเติมเม็ดเซลล์ บัฟเฟอร์ถูกเตรียมเป็นสารละลายที่มีอัลบูมินซีรั่มวัว 0.5 % (BSA) กับ EDTA 2 mM ในน้ําเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) (pH7.4) และซื้อจาก Miltenyi Biotec Inc. (ออเบิร์น แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) เซลล์บุผนังหลอดเลือดหลอดเลือดที่แสดงถึงโปรตีนจากมนุษย์ที่แสดงถึงโปรตีนฟลูออเรสเซนต์สีเขียว (GFP-HUVECs, Lonza, Switzerland) ได้รับการเพาะเลี้ยงใน Endothelial Growth Medium (EGM-2, Lonza, Switzerland) และมีการใช้เซลล์ในทางเดิน 3 ถึง 4 เซลล์ท่อใกล้เคียงของมนุษย์ (เซลล์ไตของมนุษย์ -2 (HK-2) ได้มาจากคอลเลกชันวัฒนธรรมประเภทอเมริกัน (ATCC) สายเซลล์ปลูกในสื่อของ Eagle's (DMEM) ที่มีกลูโคสสูงของ Dulbecco เสริมด้วยเซรั่มวัวในครรภ์ 10% (FBS), เพนิซิลลิน (100 U/mL) และสเตรปโตมัยซิน (100 ไมโครกรัม/มล.) รีเอเจนต์ถูกซื้อจาก Gibco (Rockville, MD, USA) เซลล์ทั้งหมดถูกถอดออกโดยใช้ Trypsin-EDTA 0.05% และเก็บรักษาไว้ในตู้อบที่มีความชื้นที่ 37 °Cและ 5% CO2 KFs ถูกแขวนลอยอีกครั้งใน FGM-2 ที่ความเข้มข้นของเซลล์ 4×10° เซลล์/มล. เซลล์เยื่อบุผิวท่อไตของมนุษย์ (HK-2) ถูกระงับอีกครั้งที่ความเข้มข้น 2×10° เซลล์/มล. ใน DMEM ที่มีกลูโคสสูง GFP-HUVECs ถูก resuspended ที่ความเข้มข้น 2×10° เซลล์/มล. ใน EGM-2

4.2.รีเอเจนต์

เมทริกซ์ประกอบด้วยเจลไฟบรินรวมถึงไฟบริโนเจนที่มีจําหน่ายทั่วไปจากพลาสมาวัวอะโพรตินินจากปอดวัวและทรอมบินจากพลาสมาวัว วัสดุสามชนิดดังกล่าวถูกซื้อจากซิกม่า (เซนต์หลุยส์, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) ไฟบริโนเจนละลายใน l×PBS ในอ่างน้ํา (37 °C) เป็นเวลา 30 นาทีที่ความเข้มข้น 10 มก./มล. ทรอมบินและอะโปรตินินละลายในน้ําปราศจากไอออนที่ความเข้มข้น 50 หน่วย/มล. และ 4 TIU/มล. สารละลายทั้งสามถูกฆ่าเชื้อโดยการกรองผ่านตัวกรอง 0.22 μm มนุษย์รีคอมบิแนนท์TGF-β1ได้มาจาก PeproTech EC Ltd. (ลอนดอน สหราชอาณาจักร) สารยับยั้งเฉพาะของตัวรับ TGF-beta kinase, SB431542 ถูกซื้อจาก Tocris Cookson, Inc. (เอลลิสวิลล์, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา)

4.3. รูปแบบเซลล์ในอุปกรณ์

ก่อนที่จะเพาะเมล็ดเซลล์เพื่ออํานวยความสะดวกในการยึดเกาะอย่างแน่นหนาอุปกรณ์นี้ได้รับการรักษาเป็นเวลา 1 นาทีในเครื่องพลาสมา (Femto Science Inc. , Suwon, Korea) ด้วยกําลัง 70 W, 50 Hz. การชอบน้ําที่พื้นผิวที่เกิดจากการรักษาด้วยพลาสมาและช่วยอํานวยความสะดวกในการเกิดลวดลายเจลและการโหลดสื่อ เพื่อหลีกเลี่ยงการเปลี่ยนแปลงในการชอบน้ําการทดลองได้ดําเนินการภายใน 30 นาทีหลังการรักษาด้วยพลาสมา รูปแบบเซลล์ที่แตกต่างกันภายในอุปกรณ์สามารถทําได้ในรูปแบบที่ปรับแต่งได้สูง สิ่งสําคัญคือต้องกําหนดองค์ประกอบและความเข้มข้นของเซลล์ประเภทต่างๆที่จะมีลวดลายไว้ล่วงหน้า สําหรับสารแขวนลอยไฮโดรเจลเซลลูลาร์ สารแขวนลอยของเซลล์ 37.5 μL และอะลิควอตที่แยกจากกันที่ 12.5 μL ของสารละลายไฟบริโนเจน 10 มก. / มล. (250 μL ของสารละลายไฟบริโนเจน 10 มก. / มล. 10 มล. ที่มี 40 ไมโครลิตรของ 4 TIU / mL aprotinin) ถูกเตรียมให้ผสมทันทีก่อนโหลด ทันทีก่อนที่จะโหลดสารแขวนลอยของเซลล์ 37.5 μL ถูกผสมกับไฟบริโนเจน 12.5 μL 10 มก. / มล. จนเป็นเนื้อเดียวกัน ไฮโดรเจล 50uL ผสมกับหยดลิ่มเลือดอุดตัน 1 uL (0.5 หน่วย / มล.) ทันทีหลังจากผสมลิ่มเลือดอุดตันที่มีสารแขวนลอยไฟบรินของ GFP-HUVECs (ความเข้มข้นของเซลล์ 2×10' เซลล์ / มล.) ถูกฉีดเข้าไปในขอบด้านนอกของช่องด้านนอก (รูปที่ 3 เจล A) เรารอ 3 นาทีเพื่อให้การเชื่อมโยงข้ามไฟบริโนเจนเสร็จสมบูรณ์ ทันทีหลังจากผสมลิ่มบินที่มีสารแขวนลอยไฟบรินของ KFs (ความเข้มข้นของเซลล์ 4×10 ° เซลล์ / มล.) ถูกวางไว้ที่แต่ละด้านของพื้นอ่างเก็บน้ําต่อหลุม (รูปที่ 3 เจล C) ระบบกันสะเทือนของเพลี้ยห้อยของเพลี้ยไฟนี้ได้รับอนุญาตให้เชื่อมขวางที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 นาที เซลล์แขวนลอยของเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้เคียงของไตของมนุษย์ 10 μL (HK-2) ถูกฉีดเข้าไปในพอร์ตการฉีดของช่องด้านใน (รูปที่ 3, เจล B) ในการติด HK-2 เข้ากับผนังของเจลไฟบรินในช่อง GFP-HUVECs อุปกรณ์ถูกหมุน 90 องศาและวางไว้ใน CO 5% ซึ่งเป็นตู้อบเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 °C HK-2 ปักหลักและสร้างแผ่นเซลล์ที่ด้านข้างของเจลไฟบริน

หลังจากติด HK-2 อุปกรณ์ก็เต็มไปด้วย EGM-2 อุปกรณ์ถูกบ่มเป็นเวลา 3 วันที่ 37 ° C ในศูนย์บ่มเพาะ CO 5% สื่อถูกเปลี่ยนโดยมีหรือไม่มี 5ng / มลTGF-β1และด้วย5ng/มล.TGF-β1และ 10 อืมTGF-β1สารยับยั้งหลังจากสามวันของการฟักตัว (รูปที่ 3)

cistanche คืออะไร

4.4. ไอมูโนไซโตฟลูออเรสเซนซ์

เนื้อเยื่อที่เพาะเลี้ยงร่วมในอุปกรณ์ได้รับการแก้ไขด้วยสารละลายพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% (w / v) (Biosesang, Seongnam, Korea) ใน PBS (Welgene, Gyeongsan, Korea) เป็นเวลา 20 นาทีตามด้วยการซึมผ่านด้วยการแช่ 20 นาทีใน 0.15% Triton X-100 (Sigma, St.Louis, MO, USA) ตัวอย่างที่ได้รับการปฏิบัติแล้วกับ 3% BSA (Sigma, USA) สําหรับ 1 ชั่วโมง เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีที่ซื้อจาก Abcam แอนติบอดีหลักคือการต่อต้านไซโตเคราติน 8 และต่อต้าน o-SMA ทิ้งไว้ 2 วันที่อุณหภูมิห้อง (RT) Alexa Fluor 647 คอนจูเกตลาต่อต้านกระต่าย IgG (H + L) ถูกใช้เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิ การติดฉลากดีเอ็นเอดําเนินการด้วยการเจือจาง 1:250 ของ Hoechst33342 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ RT ภาพถูกรวบรวมโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล Zeiss LSM 710 ความเข้มของการเรืองแสงเฉลี่ย (MFI) วัดโดยใช้ ImageJ และเครื่องวิเคราะห์ความเข้มของการเรืองแสง

4.5. การวิเคราะห์มัลติเพล็กซ์ของไซโตไคน์

MSD V-Plex Cytokine และ Angiogenesis Panel 1 ชุดมนุษย์ (Rockville, MD, USA) ถูกใช้เพื่อวัดความเข้มข้นของ interleukin-1 beta (IL-1ß) และความเข้มข้นของปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐาน (b-FGF) ในตัวอย่างเดียวตามคําแนะนําของผู้ผลิต ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการประเมินระดับโปรตีนทั้งหมดของ IL-1β และ b-FGF ปริมาณ (เป็น pg/mL) ถูกวัดจากเส้นโค้งมาตรฐานของการวัดแต่ละครั้ง

4.6. มัลติเพล็กซ์บีดอิมมูโนแอสเซย์

ความเข้มข้นของไซโตไคน์ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ระบบอิมมูโนแอสเซย์ลูกปัดมัลติเพล็กซ์ (Procarta Cytokine Assay Kit; Cytokine Assay Kit) Affymetrix, Inc., ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) โดยใช้เทคโนโลยีหลายเพล็กซ์ (xMAP; Luminex, Austin, TX, USA) ตามคําแนะนําของผู้ผลิต ข้อมูลได้มาโดยใช้เวิร์กสเตชันที่เข้ากันได้กับ Luminex และซอฟต์แวร์ผู้จัดการ (เวิร์กสเตชัน Bio-Plex และซอฟต์แวร์เวอร์ชัน 6.0; 6.0) Bio-Rad, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ตามคําแนะนําของผู้ผลิต มนุษย์ TGF-β1, TGF-β2 และ TGF-β3 ที่เกี่ยวข้องกับพังผืดกระบวนการถูกวิเคราะห์พร้อมกันในตัวอย่างเจือจาง ไอโซฟอร์มของทีจีเอฟ-βถูกตรวจพบโดยใช้ระบบ Bio-Plex 200 และ Bio-Plex ProTM Human ที่มีจําหน่ายทั่วไปทีจีเอฟ-βการทดสอบ (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, Inc); ขึ้นอยู่กับข้อมูลที่ได้รับจากผู้ผลิต ชุดทดสอบมัลติเพล็กซ์สามารถวัดไซโตไคน์หลายตัวจากซูเปอร์แนนต์เชิงปริมาณโดยมีขีด จํากัด การตรวจจับที่ต่ํากว่า 1 pg / mL ต่อไซโตไคน์ ตัวอย่างแต่ละตัวอย่างถูกเรียกใช้เป็นการวัดเดียวสําหรับปริมาณที่จํากัดของอภินันทยศาสตร์ที่เก็บรวบรวม

4.7.PCR แบบเรียลไทม์

การสกัด RNA ดําเนินการโดยใช้ TRIzol Reagent (เทคโนโลยีชีวิต Invitrogen, Carlsbad, CA, สหรัฐอเมริกา) มาสเตอร์มิกซ์และชุดการสังเคราะห์ cDNA แบบย้อนกลับตัวช่วยย้อนกลับถูกใช้สําหรับการถอดความย้อนกลับของ RNA.qPCR ทั้งหมดดําเนินการโดยใช้ระบบชีวภาพประยุกต์TM PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (เทอร์โมฟิชเชอร์วิทยาศาสตร์, Inc.) ไพรเมอร์เฉพาะถูกจัดทําขึ้นโดย Bioneer (แทจอน, เกาหลี) และใช้ในการทดลองนี้ดังนี้ ลําดับไพรเมอร์สรุปไว้ในตารางที่ 1

ไมโครลิตรสิบตัวของ PowerUp SYBR Green Master Mix, cDNA 4 μL และไพรเมอร์แต่ละตัว 2 pmol ใช้สําหรับ PCR แบบเรียลไทม์ในปริมาตรสุดท้าย 20 μL ปฏิกิริยานี้ดําเนินการที่ 95 °Cเป็นเวลา 1 วินาทีและ 60 ° C เป็นเวลา 20 วินาทีเป็นเวลา 45 รอบหลังจากการสูญเสียสภาพที่ 95 ° C เป็นเวลา 20 วินาที PCR ดําเนินการซ้ําหรือสามเท่าสําหรับแต่ละตัวอย่าง ระดับ cDNA ถูกกําหนดโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานของเกณฑ์รอบ ข้อมูลทั้งหมดสําหรับแต่ละ cDNA อยู่ภายในเส้นโค้งมาตรฐานที่สอดคล้องกัน ข้อมูลที่ได้รับจะถูกทําให้เป็นมาตรฐานเป็น β-actin cDNA

4.8 การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลเชิงปริมาณจะถูกนําเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ±SD หรือ SE ของการทดลองอิสระอย่างน้อยสามรายการ การวิเคราะห์ทางสถิติดําเนินการโดยใช้การทดสอบ t-test ของนักเรียนสองด้าน เราพิจารณาความแตกต่างอย่างมีนัยสําคัญที่ระดับความเชื่อมั่น 95% หรือสูงกว่าเท่านั้น (p<>

5. ข้อสรุป

โดยสรุปโปรโตคอลในการศึกษานี้เปิดใช้งานการสร้างมนุษย์เกี่ยวกับไตพังผืด- เลียนแบบอุปกรณ์เป็นแบบจําลองและแสดงเอฟเฟกต์ต่าง ๆ ที่ไม่สามารถทําได้ในการทดลองวัฒนธรรม 2 มิติ เราเชื่อว่ากลยุทธ์การประเมินที่เสนอในการศึกษาครั้งนี้จะนําไปสู่ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับรายละเอียดพังผืดกลไกที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยาในระหว่างโรคไต. พังผืดไต 3 มิติที่พัฒนาขึ้นสามารถใช้เป็นแบบจําลองในหลอดทดลองที่มีศักยภาพซึ่งจะทําให้เราเข้าใกล้การสร้างแบบจําลองไตบนชิปที่ได้รับการปรับปรุง

cistanche phelypaes: การรักษาโรคไต

อ้าง อิง

1. ชายแดน, W.; Noble, N. การเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโตในเนื้อเยื่อพังผืด.N. Engl. J. Med.1994, 331,1286-1292.

2. วัง, W.; หวง, X.R.; หลี่, A.G.; หลิว, F; หลี่,เจ.; ตวง, แอล.ดี.; วัง, X.J.; Lan, H.Y.กลไกการส่งสัญญาณของ TGF-betal ในการป้องกันการอักเสบของไต: บทบาทของ Smad. I. Am. Soc. Nephrol.2005, 16, 1371-1383. [ครอสรีฟ]

3. หลิว, วาย.เกี่ยวกับไตพังผืด: ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการเกิดโรคและการรักษา ไต Int.2006,69,213-217. [ครอสรีฟ] [ผับเมด]

4. แอนดีส, D.; Craig, W.A. เภสัชจลนศาสตร์แบบจําลองสัตว์และเภสัชพลศาสตร์: การทบทวนที่สําคัญ. Int. J.Antimicrob.Agents 2002, 19,261-268. [ครอสรีฟ]

5. คิม, เอส.; ทาคายามะ, S.Organ-on-a-chip และไต ไต Res. คลิน. Pract.2015, 34, 165-169. [ครอสรีฟ] [ผับเมด]

6. จาง, เค.เจ.; เมห์ร, เอ.พี. แฮมิลตัน, G.A.; แมคพาร์ทลิน, แอลเอ; ชุง, เอส.; ซู, เค.วาย; Ingber, D.E.Human ไตท่อใกล้เคียงบนชิปสําหรับการขนส่งยาเสพติดและการประเมินความเป็นพิษต่อไต จํานวนเต็ม ไบโอล. 2013,5,1119-1129. [ครอสรีฟ[ผับเมดล์

7. เรียดดอน, S. 'ออร์แกนออนชิป' กลายเป็นกระแสหลัก ธรรมชาติ 2015, 523, 266 [ครอสรีฟ]

8. สตรัทซ์, F; ซีสเบิร์ก, M; เรนซีเฮาเซน, A.; Raschke, B.; เบ็คเกอร์, V; คูเทน, C.V.; มูลเลอร์, G.A.TGF-β1ก่อให้เกิดการแพร่กระจายในไฟโบรบลาสต์ไตของมนุษย์ผ่านการเหนี่ยวนําปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐาน (FGF-2) ไต Int. 2001, 59, 579-592 [ครอสรีฟ] [ผับเมด]

9. ซานอตติ, เอส.; บรากาโต, C.; ซัคเชลลา, A.; แม็กกี้, แอล.; มันเตกาซซา, อาร์.; โมแรนดี, แอล.; Mora, M.Anti-fibrotic ผลของ pirfenidone ในกล้ามเนื้อที่ได้รับไฟโบรบลาสต์จากผู้ป่วยโรคกล้ามเนื้อเสื่อม Duchenne ชีวิตวิทย์. 2559, 145,127-136. [ครอสรีฟ]

10. เดวิส, GE.:คามาริลโล. C, W. อัลฟา 2 เบต้า 1 กลไก pinocytic ขึ้นอยู่กับ integrin ที่เกี่ยวข้องกับการก่อตัวของแวคิวโอลภายในเซลล์และการรวมตัวกันควบคุมลูเมนเส้นเลือดฝอยและการก่อตัวของท่อในเมทริกซ์คอลลาเจนสามมิติ Exp. Cell Res. 1996, 224, 39-51. [ครอสรีฟ]

11. เบย์เลส, เค.เจ.; เดวิส, จี. Cdc42 และ Race GTPases จําเป็นสําหรับการสร้างลูเมนเส้นเลือดฝอยในเมทริกซ์นอกเซลล์สามมิติ เจเซลล์วิทย์. 2002,115,1123-1136. [ครอสรีฟ [ผับเมด]

12. เดสโรเชอร์ส, ที.เอ็ม.; ซูเตอร์, แอล.; รอ ธ, A.; Kaplan, D.L. Bioengineered เนื้อเยื่อไตของมนุษย์ 3 มิติซึ่งเป็นแพลตฟอร์มสําหรับการพิจารณาความเป็นพิษต่อไต PLoS ONE 2013, 8, e59219 [ครอสรีฟ]

13. แอสทาชกินา, A.I.; แมนน์, B.K; เพรสทวิช, G.D.; Grainger, D.W. เปรียบเทียบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของพิษต่อไตที่ทํานายได้ในไต 3-D การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์หลักและเส้นเซลล์อมตะ วัสดุชีวภาพ 2012, 33, 4712-4721 [ครอสรีฟ] [ผับเมด]

14. Meng, X.M.; นิโคลิค-แพเทอร์สัน, ดี.เจ.; Lan, H.Y. TGF-beta: ตัวควบคุมหลักของพังผืด. Nat.Rev.Nephrol.2016,12, 325-338. [ครอสรีฟ]

15. ปาร์ดาลี, อี.; กูมัน, เอ็ม.เจ.; สิบ Dijke,P. การส่งสัญญาณโดยสมาชิกของครอบครัว TGF-beta ในสัณฐานของหลอดเลือดและโรค แนวโน้มเซลล์ Biol.2010, 20, 556-567 [ครอสรีฟ] [ผับเมด]

16. คูนา, เอสแอล; Pietras, K. ALK1 เป็นเป้าหมายที่เกิดขึ้นใหม่สําหรับการรักษาด้วยยาต้านมะเร็ง เลือด 2011,117,6999-7006 [ครอสรีฟ]

17.คลัคส์บรุน, ม.;D' Amore, P.A. Regulators of angiogenesis. อันนู. Rev. Physiol.1991,53, 217-239. [ครอสรีฟ]

18. โฟล์คแมน, เจ.; ชิง, Y.Angiogenesis. J.Biol. Chem.1992, 267,10931-10934. [ครอสรีฟ]

19. Shweiki, D. Itin, A.Soffer, D.Keshet,. ปัจจัยการเจริญเติบโตของเยื่อบุผนังหลอดเลือดที่เกิดจากการขาดออกซิเจนอาจเป็นสื่อกลางในการสร้างเส้นเลือดใหม่ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน ธรรมชาติ 1992, 359, 843-848 [ครอสรีฟ]

20. คิม, เคเจ; หลี่, บี.; วิเนอร์, เจ.; อาร์มานินี, M; กิลเลตต์, N.; ฟิลลิปส์, เอชเอส; Ferrera, N. การยับยั้งการสร้างเส้นเลือดใหม่ที่เกิดจากปัจจัยการเจริญเติบโตของเยื่อบุผนังหลอดเลือดที่เหนี่ยวนําให้เกิดการยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้องอกในร่างกาย ธรรมชาติ 1993, 362, 841-844 [ครอสรีฟ]

21. พริกไทย, MS; เฟอร์รารา, N.; ออร์ซี, แอล.; Montesano, R. การทํางานร่วมกันที่มีศักยภาพระหว่างปัจจัยการเจริญเติบโตของเยื่อบุผนังหลอดเลือดและปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐานในการเหนี่ยวนําการสร้างเส้นเลือดใหม่ในหลอดทดลอง ชีวเคมี. ชีวฟิสิกส์. Res. Commun.1992,189,824-831. [ครอสรีฟ

22. โกโตะ, ฉ.; โกโตะ, เค.; เวนเดล, เค.; Folkman, J.Synergistic ผลของปัจจัยการเจริญเติบโตของเยื่อบุผนังหลอดเลือดและปัจจัยการเจริญเติบโตของไฟโบรบลาสต์พื้นฐานต่อการแพร่กระจายและการสร้างสายสะดือของเซลล์บุผนังหลอดเลือดเส้นเลือดฝอยวัวภายในเจลคอลลาเจน Lab. Investig.1993,69, 508-551. [ผับเมด]

คลิกที่นี่เพื่อดูส่วนที่ 1