ส่วนที่ 4: การทำแผนที่การทำงานร่วมกันระหว่าง Epigenomic และ Transcriptomic ระหว่างการสร้างหน่วยความจำและการเรียกคืนในชุด Engram Hippocampal
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
RNA-seq
น้ำที่ปราศจากกรดนิวคลีเอส) เป็นเวลา 30 นาทีที่ 37c โดยเขย่าเบาๆ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เติมแต่งถูกขยายและบาร์โค้ดโดยใช้ปฏิกิริยา PCR (1 รอบ; 5 นาที – 72c, 30 วินาที – 98c, 10 รอบ; 15 วินาที – 98c, 30 วินาที – 60c, 3 นาที – 72c) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต DNA ที่ขยายแล้วได้รับการทำความสะอาดและทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เม็ดบีด AMPure 1.8x (ลูกปัด AmpureXP, Beckman Coulter, A63880) หลังจาก QC ของตัววิเคราะห์ทางชีวภาพสำหรับขนาดและการกระจายของห้องสมุด ห้องสมุดถูกจัดลำดับบนแพลตฟอร์ม Illumina Nextseq 550 ที่ MIT BioMicro Center
Cistanche และ Cistanches สำหรับการปรับปรุงหน่วยความจำ
การวิเคราะห์ ATAC-seq—ข้อมูล raw fastq ของ 40-bp paired-end sequencing read ถูกจัดแนวให้สอดคล้องกับจีโนมอ้างอิง mm9 ของเมาส์โดยใช้ Bowtie 20 ในโหมด paired-end50 คอลเลกชัน Samtools 51 ใช้เพื่อจัดเรียง ลบ PCR ที่ซ้ำกัน (rmdup) ไฟล์ดัชนี BAM (ดัชนี) และคำนวณสถิติห้องสมุด (flagstat ดูตารางเสริม 13) ไฟล์ BAM ถูกลดขนาดจากการจัดตำแหน่งที่ถูกต้อง จับคู่และอ่านค่าที่ไม่ซ้ำกันเป็น 50M พีคโครมาตินแบบเปิดถูกวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ MACS252 บริเวณที่เข้าถึงได้แบบดิฟเฟอเรนเชียล (DAR) ถูกระบุโดย Diffbind v1.16.353 ด้วยพารามิเตอร์และการตั้งค่าเริ่มต้นเพื่อใช้ DESeq2 (จุดตัด; FDR < 0.01;="" การเปลี่ยนแปลงแบบพับ=""> 1.5) เมทริกซ์เต็มรูปแบบของการนับที่ทำให้เป็นมาตรฐาน (RPKM54) ถูกดึงข้อมูลโดยแพ็คเกจ DiffBind สำหรับรุ่นของแทร็ก bigwig ไฟล์สัญญาณ pileup (การแตกส่วนย่อยต่อการอ่านหนึ่งล้านครั้ง) ในรูปแบบชีวประวัติถูกสร้างขึ้นโดยใช้ฟังก์ชันจุดสูงสุดของการเรียก MACS2 กับแฟล็ก -B –SPMR จากนั้น การเพิ่มสมรรถนะการพับปกติ (FE) เหนือแทร็กแลมบ์ดาอินพุตถูกสร้างขึ้นโดยใช้ฟังก์ชัน bdgcmp ของ MACS2 ด้วยการตั้งค่า - m FE จากนั้นไฟล์ bedGraph จะถูกแปลงเป็นรูปแบบ bigwig
เครื่องมือ IGV55 ใช้สำหรับสร้างภาพไฟล์ bigwig ChromHMM56 ถูกใช้เพื่อสร้างแบบจำลองสถานะโครมาตินจากการศึกษาอิสระสองชิ้นที่ใช้เนื้อเยื่อฮิปโปแคมปัสจำนวนมากก่อนและหลังการกระแทกที่เท้า 21,22 และเพื่อกำหนดเพื่อเพิ่มการเสริม DARs เหนือแบบจำลองสถานะ การวิเคราะห์ Motif Enrichment 57,58 และคำอธิบายประกอบ Peaks ดำเนินการโดยเครื่องมือ HOMER59 รหัสทั้งหมดมีอยู่ในไฟล์ซอฟต์แวร์เสริม การแยก RNA และการเตรียมห้องสมุด—ปฏิบัติตามการตรึงและการจัดเรียงทันที (ดูการเตรียมเนื้อเยื่อ) เติมโปรตีเอส 4 ul ลงในบัฟเฟอร์การย่อย (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit สำหรับ FFPE, Life Technologies, AM1975) . ตัวอย่างถูกบ่มในบล็อกความร้อนเป็นเวลา 15 นาทีที่ 50 องศา จากนั้น 15 นาทีที่ 80 องศา ถัดไป 0.75 มล. ของ Trizol LS (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) และ 0.2 mL ของฟีนอล: สารละลายคลอโรฟอร์ม (Phenol : Chloroform: Isoamyl Alcohol,1 Phase, VWR International, K169) ถูกเติมในแต่ละตัวอย่างตามด้วย เขย่าอย่างแรงเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง (RT) สารแขวนลอยถูกวางลงในหลอดหนักเจลล็อคเฟส (PLG, 5 ไพร์ม, 2302830) และหมุนลงที่ 13,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที เฟสในน้ำที่มีกรดนิวคลีอิกถูกสกัดจากหลอดไปยังหลอด Eppendorf สดด้วยเอธานอล 100 เปอร์เซ็นต์ในปริมาณที่เท่ากัน การทำให้บริสุทธิ์ RNA ดำเนินการโดย Direct-zol™ RNA MicroPrep kit (Zymo Research, R2060) สำหรับการทำให้บริสุทธิ์ RNA ตามคำแนะนำของผู้ผลิต RNA ถูกชะ (10 ul, DEPC) และเก็บไว้ที่ −80 องศา SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) ใช้สำหรับการเตรียมและการขยายห้องสมุด 3 สำเนาทางชีวภาพ (N=3) ถูกใช้สำหรับการเตรียมห้องสมุด ไลบรารีถูกจัดเตรียมตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยไม่มีขั้นตอนการแตกแฟรกเมนต์เพิ่มเติม (FFPE, ตัวเลือกที่ 2, ดูคู่มือ) โดยที่ไรโบโซม cDNA และการขยาย PCR สุดท้าย (15 รอบ) หมดลง ห้องสมุดได้รับการจัดลำดับบนแพลตฟอร์ม Illumina HiSeq 2000 ที่ MIT BioMicro Center
การวิเคราะห์ RNA-seq—ข้อมูล fastq ดิบถูกจัดแนวกับการอ้างอิง mm9 ของเมาส์
จีโนมโดยใช้ Bowtie 20 การอ่านที่แมปจากเนื้อยีน (รวมถึง exons และ introns read) ถูกประมวลผลโดย Cufflinks 2.260 และ DEseq261 พร้อมคำอธิบายประกอบของยีนอ้างอิง UCSC mm9 เพื่อประเมินปริมาณการถอดรหัส การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันและการวิเคราะห์ปลายน้ำถูกดำเนินการโดยใช้ DEseq2 และสคริปต์ R แบบกำหนดเอง ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของการถอดเสียงถูกวัดโดยแฟรกเมนต์ต่อกิโลเบสของเอ็กซอนต่อล้านแฟรกเมนต์ที่แมป (FPKM)
สำหรับการวิเคราะห์โปรแกรมการถอดความ การแสดงออกของยีนแต่ละตัวได้รับการประเมินค่าที่แตกต่างกันหน่วยความจำเฟส (Activated -early, Activated -late, Reactivated) โดยการเปลี่ยนแปลง log2 fold (log2FC) จากสถานะฐาน 1,095 ของยีนที่แสดงความแตกต่าง (DEG) ผ่านเกณฑ์การตัด ซึ่งเราสังเกตอย่างน้อยในการเปรียบเทียบค่า P ของ< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Cistanche ช่วยเพิ่มความจำ
การจับรูปแบบโครโมโซม (Hi-C)
นิวเคลียสจากเซลล์ตายตัว (ดูการเตรียมเนื้อเยื่อ) ถูกคัดแยกลงในหลอดเอพเพนดอร์ฟ 1.5 มล. ที่มีบัฟเฟอร์ไลซิสที่เย็นด้วยน้ำแข็งสด 500 ไมโครลิตร (10 มิลลิโมลาร์ ทริส pH=8, 10 มิลลิโมลาร์ NaCl, 0.2 เปอร์เซ็นต์ Igepal CA{{ 9}}, น้ำเกรด Pi และ PCR) และแช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งและเก็บไว้ที่ −80c จนกว่าจะถูกใช้ ไลบรารี Hi-C ถูกเตรียมจาก 100 000 เซลล์/ต่อกลุ่ม (รวบรวมจากสัตว์สองตัว) ในการจำลองทางชีวภาพสองแบบ โดยใช้คู่มือ Dovetail™ Hi-C kit (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA) ไลบรารี Hi-C ทั้งหกถูกจัดลำดับ (ปลายคู่) บนแพลตฟอร์ม Illumina Nextseq 500 ไปป์ไลน์ HOMER Hi-C ใช้เพื่อกรองสิ่งประดิษฐ์ทดลอง เช่น การทำให้เป็นวงกลม การผูกตัวเอง และการทำสำเนา PCR การอ่านที่กรองแล้วถูกจัดแนวกับจีโนมของเมาส์อ้างอิง (mm9) และประมวลผลเพิ่มเติมโดยใช้ไปป์ไลน์ HOMER HI-C
เครื่องมือ Hi-C ของ HOMER ถูกใช้เพื่อทำการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) กับข้อมูล Hi-C เพื่อระบุช่องย่อยนิวเคลียร์ (A และ B) ที่ความละเอียด 50 Kb (ดูซอฟต์แวร์เสริม) สำหรับการวิเคราะห์สวิตช์ช่อง ขั้นแรกเราจะลบค่า PC1 ระหว่างกลุ่ม ต่อไป เราระบุช่วงการเปลี่ยนภาพ BtoA อันดับต้นๆ เป็นภูมิภาคที่ PC1 เปลี่ยนแปลงเหนือเปอร์เซ็นไทล์ที่ 90 และการเปลี่ยน AtoB ด้านบนเป็นภูมิภาคที่มี PC1 เปลี่ยนแปลงต่ำกว่าเปอร์เซ็นไทล์ที่ 10 เนื่องจากช่องย่อยนิวเคลียร์ถูกควบคุมเป็นหน่วยหลายร้อยกิโลเบส เราจึงรวมกลุ่ม AtoB หรือ BtoA 50 Kb ที่ต่อเนื่องกันซึ่งอยู่ภายในระยะห่าง 100 Kb ซึ่งกันและกัน โดเมนรวมที่มีขนาดรวมน้อยกว่า 200 Kb ที่เราละทิ้ง สวิตช์ช่องจะพิจารณาก็ต่อเมื่อค่าลบถูกแปลงเป็นค่าบวก (และในทางกลับกัน) สุดท้าย ค่าบวกและค่าลบขององค์ประกอบแรกถูกเปรียบเทียบระหว่างประชากรของเซลล์ประสาททั้งสามกลุ่ม (Basal, Activated - early และ Activated -late)
โปรโมเตอร์จับภาพ Hi-C
ปฏิบัติตามการตรึงและการคัดแยกเซลล์ (ดูการเตรียมเนื้อเยื่อ) เซลล์ถูกจัดแยกเป็นหลอด Eppendorf 1.5 มล. ที่มีบัฟเฟอร์ไลซิสที่เย็นด้วยน้ำแข็งสด 500 ul (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0.2 เปอร์เซ็นต์ Igepal CA{ {9}} น้ำเกรด Pi และ PCR) แช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งและเก็บไว้ใน −80c จนกว่าจะถูกใช้ ไลบรารี Hi-C ถูกเตรียมจาก 10,{13}} เซลล์ /ต่อกลุ่ม (N=3–4) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้62 โดยมีการดัดแปลงบางอย่าง ตัวอย่างถูกปั่นลง (4 องศา , 1,600 กรัม เป็นเวลา 20 นาที) และเม็ดถูกแขวนลอยใหม่ใน 400 ul ของ 1.2x Cutsmart buffer (New England Biolabs,
สหรัฐอเมริกา). การย่อยแบบจำกัดแรกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในโปรโตคอลดั้งเดิมโดยมี 1,500 U ของ HindIII (R3104L, New England Biolabs, USA) เป็น 6-ตัวตัดฐาน (แทนที่จะเป็น BglII ในโปรโตคอลดั้งเดิม) หลังจากการติดฉลากไบโอตินและการทำ ligation ข้ามคืน (ดูรายละเอียดในโปรโตคอลดั้งเดิม) ตัวอย่างถูกปั่น (4 องศา , 1,600 × g เป็นเวลา 15 นาที) และปล่อยเม็ดยาอีกครั้งใน 25 ul ของ PBS สารแขวนลอยถูกบ่มใน 65c ด้วยโปรตีน K 3 ul เป็นเวลา 12–16 ชั่วโมง การทำให้บริสุทธิ์ของ Hi-C DNA ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในโปรโตคอลดั้งเดิมด้วย 100 ul ของ streptavidin-beads (Dynabeads M-280–streptavidin, Life Technologies, 11205D) สำหรับเอนไซม์จำกัดที่สอง เราใช้เครื่องตัดฐาน 4- Hpych4V (10 U / ต่อตัวอย่าง, R0620S, New England Biolabs, USA) หลังจากปฏิกิริยา A-tailing (ดูรายละเอียดในโปรโตคอลดั้งเดิม) ตัวอย่างถูกขยายโดยใช้ PCR (17 รอบ) และทำให้บริสุทธิ์ด้วยเม็ดบีด AMPure XP คลัง Hi-C ถูกชะใน 20 ul ของ 10 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl (pH 8.5) การออกแบบระบบดักจับเหยื่อสำหรับโปรโมเตอร์ Capture Hi-C – รายชื่อโปรโมเตอร์ยีนของเมาส์จำนวน 5,000 รายการได้มาจากโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ในเชินเฟลเดอร์ และคณะ 29. รายการนี้มีเฉพาะสำเนาที่มีไบโอไทป์ของบริเวณที่มีการเข้ารหัสโปรตีน โดยมีไซต์ย่อยข้อจำกัดของ HindIII โพรบดักจับ 120 bp สองตัวได้รับการออกแบบ หนึ่งตัวต่อปลายแต่ละส่วน โพรบถูกสังเคราะห์โดย Agilent Technologies ตามระบบการตกแต่งเป้าหมายของ SureSelect (Agilent Technologies)
โปรโมเตอร์จับภาพการเตรียมการและการจัดลำดับไลบรารี Hi-C – ในการจับภาพผลิตภัณฑ์ Hi-C ligation ที่มีลำดับโปรโมเตอร์ เราใช้โปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้29 โดยย่อ ตัวบล็อกไฮบริไดเซชัน (Agilent Technologies) ถูกเพิ่มไปยังไลบรารี Hi-C DNA บัฟเฟอร์ไฮบริไดเซชันและอาร์เอ็นเอสำหรับดักจับเหยื่อถูกจัดเตรียมตามคำแนะนำของผู้ผลิต (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies) ต่อมา ตัวบล็อก DNA/ไฮบริไดเซชันของไลบรารี Hi-C ถูกให้ความร้อนเป็นเวลา 5 นาทีที่ 95 องศา ก่อนลดอุณหภูมิลงเหลือ 65 องศา ดีเอ็นเอของไลบรารี Hi-C ถูกผสมกับบัฟเฟอร์ไฮบริไดเซชัน (อุ่นล่วงหน้า 5 นาที ถึง 65 องศา ) และต่อมาด้วยระบบเหยื่อดักจับที่ออกแบบเอง (อุ่นล่วงหน้า 3 นาที ถึง 65 องศา ) ซึ่งประกอบด้วย 10,000 biotinylated RNA ที่กำหนดเป้าหมายส่วนการจำกัด HindIII สิ้นสุดของโปรโมเตอร์ยีนของเมาส์ 5,000 ตัว (Agilent Technologies ดูวัสดุเพิ่มเติมสำหรับการออกแบบเหยื่อดักจับ) หลังจากผ่านไป 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 65 องศาในเครื่อง PCR ไบโอตินแบบดึงลง (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) และการล้างจะดำเนินการตามโปรโตคอลการเสริมสมรรถนะ SureSelect Target (Agilent Technologies) หลังจากการล้างครั้งสุดท้าย เม็ดบีดถูกแขวนลอยใหม่ใน 30 ไมโครลิตร NEBuffer 2 โดยไม่มีการชะของ DNA ก่อนหน้า และ PCR หลังการจับ (สี่รอบการขยายโดยใช้ไพรเมอร์ยูนิเวอร์แซลอิลลูมีน) ถูกดำเนินการบน DNA ที่จับกับเม็ดบีดผ่านทาง RNA ที่เติมด้วยไบโอติน ไลบรารี Capture Hi-C ถูกจัดลำดับแบบคู่ (Nextseq 500, Illumina)
การวิเคราะห์ Hi-C ของผู้จัดโปรโมเตอร์ – ไปป์ไลน์ HiCUP63 ถูกใช้เพื่อประมวลผลการอ่านลำดับ fastq แบบดิบ ไปป์ไลน์นี้ใช้เพื่อแมปคู่การอ่านกับจีโนมของเมาส์ (mm9) เพื่อกรองสิ่งประดิษฐ์ทดลอง (เช่น การอ่านแบบวงกลมและการเชื่อมโยงใหม่) และเพื่อลบการอ่านที่ซ้ำกัน สำหรับข้อมูล pc-HiC ไฟล์ BAM ที่เป็นผลลัพธ์จะถูกลดขนาดตัวอย่างและประมวลผลโดยใช้ CHiCAGO เวอร์ชัน 1.2.064 ตามการตั้งค่าเริ่มต้นเพื่อเรียกการโต้ตอบที่สำคัญ รายละเอียดทั้งหมดของไปป์ไลน์นี้หาได้จาก Babraham Bioinformatics
Cistanche ช่วยเพิ่มความจำ
การฉีดไวรัสที่เกี่ยวข้องกับ Stereotaxic Adeno
หนูเมาส์ ArcCreERT2 ถูกวางยาสลบด้วย avertin และสำหรับ AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (Serotype5 ที่ได้จากแกนไวรัส UNC) ขั้นแรก ทำรูเล็กๆ ในกะโหลกศีรษะเหนือฮิปโปแคมปัสหลัง (เทียบกับ Bregma: anterior-posterior −2.0 และตรงกลาง ± 1.5) วางหลอดฉีดยา Hamilton ที่มี 33-เข็มวัดลง ถึง −1.8 DV และ 500 ηl ของไวรัสถูกเติมด้วยอัตราการไหลที่ 50 ηl ต่อนาทีในฮิปโปแคมปีทั้งสอง เข็มถูกถอนออก หลังจากผ่านไป 10 นาทีหลังการฉีด และอนุญาตให้หนูพักฟื้นเป็นเวลา 4 วัน
