ส่วนที่ 3 การศึกษาพบว่า Autophagy มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการสะสม LD ของเซลล์

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

บทคัดย่อ

หลักฐานที่เกิดขึ้นใหม่บ่งชี้ว่าการสะสมของหยดไขมัน (LD) ที่ไม่คาดคิดและการเกิดเปอร์ออกซิเดชันสามารถเร่งความเครียดของออร์แกเนลล์และมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของโรคทางระบบประสาท (NDDs) ในการศึกษาก่อนหน้านี้ เรายืนยันว่า kaempferol (Ka) ซึ่งเป็นโมเลกุลขนาดเล็กที่มีฟลาโวนอยด์ตามธรรมชาติ แสดงผลทางประสาทในหนูที่เป็นโรคพาร์กินสัน (PD) ที่เกิดจาก LPS นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า autophagy มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการสะสม LD ของเซลล์ ในการศึกษาปัจจุบัน เราพบว่า Ka ป้องกัน TH บวกกับการสูญเสียเซลล์ประสาทและการขาดดุลทางพฤติกรรมในหนูเมาส์ PD ที่เกิดจาก MPTP/p ร่วมกับความเครียดออกซิเดชันของไขมันที่ลดลงใน substantia nigra pars compacta (SNpc) ในเซลล์ประสาทที่เพาะเลี้ยง Ka แสดงช่วงความเข้มข้นที่ค่อนข้างปลอดภัยและยับยั้งการสะสม LD และการตายของเซลล์ที่เกิดจาก MPP plus อย่างมีนัยสำคัญ การศึกษาเพิ่มเติมระบุว่าผลการป้องกันของ Ka ขึ้นอยู่กับ autophagy โดยเฉพาะ lipophagy ที่สำคัญ Ka ส่งเสริม autophagy เพื่อไกล่เกลี่ยการเสื่อมสภาพของ LD ในไลโซโซม ซึ่งจากนั้นก็บรรเทาการสะสมของไขมันและการเกิดเปอร์ออกซิเดชัน และความเสียหายของไมโตคอนเดรียที่เป็นผลลัพธ์ ส่งผลให้เซลล์ประสาทตายน้อยลง นอกจากนี้ AAV-shAtg5-ไกล่เกลี่ย Atg5 ล้มลงได้ยกเลิกผลทางประสาทของ Ka ต่อการเกิดออกซิเดชันของไขมันในหนูเมาส์ PDCistanche สำหรับการปรับปรุงหน่วยความจำงานนี้แสดงให้เห็นว่า Ka ป้องกันการเสื่อมของเซลล์ประสาทโดปามีนใน PD ผ่านการยับยั้งความเสียหายของไมโตคอนเดรียที่อาศัยไขมันเปอร์ออกซิเดชันโดยการส่งเสริม lip-autophagy และให้กลยุทธ์การรักษาแบบใหม่สำหรับ PD และ NDD ที่เกี่ยวข้อง

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

โรคพาร์กินสัน (PD) เป็นโรคเกี่ยวกับความผิดปรกติของระบบประสาท (NDD) ที่มีลักษณะทางพยาธิวิทยาโดยการสูญเสียเซลล์ประสาท dopaminergic (DA) แบบก้าวหน้าใน substantia nigra pars compacta (SNpc)[1] แม้ว่าสาเหตุที่แน่ชัดและเส้นทางตามธรรมชาติของอาการป่วยนี้ยังไม่ได้รับการชี้แจงอย่างสมบูรณ์ แต่กระบวนการและความผิดปกติในระดับระบบจำนวนมาก รวมถึงหน้าที่ของไมโตคอนเดรีย สภาวะสมดุลของโดปามีน การอักเสบของเส้นประสาท และ autophagy มีส่วนเกี่ยวข้องในการเกิดโรคของ PD [1, 2]. รายงานล่าสุดเปิดเผยว่าความเป็นพิษต่อไขมันที่เกี่ยวข้องกับหยดไขมัน (LD) อาจมีส่วนร่วมในพยาธิสภาพของ PD [3,4] LD เป็นออร์แกเนลล์แบบไดนามิกสูงที่โผล่ออกมาจากเยื่อหุ้มเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม (ER) และโดยปกติทำหน้าที่เป็นตำแหน่งภายในเซลล์ของการจัดเก็บไขมันที่เป็นกลาง [5 ] เมื่อเร็ว ๆ นี้พบว่า LDs มีบทบาทที่กว้างกว่าการจัดเก็บกรดไขมัน (FA) และมีส่วนร่วมในโรคต่างๆ (cistanche para que serve) ตัวอย่างเช่น เซลล์มัยอีลอยด์ ซึ่งรวมถึงมาโครฟาจ ลิวโคไซต์ และอีโอซิโนฟิล ก่อตัวเป็น LDs เพื่อตอบสนองต่อการอักเสบและความเครียดcistanche ใน ภาษาจีนและ LDs เป็นแหล่งผลิตและจัดเก็บไซโตไคน์ที่มีการอักเสบและมีส่วนเกี่ยวข้องเพิ่มเติมในการนำเสนอแอนติเจนและการขจัดเชื้อโรค [6] ที่สำคัญ ในหลอดเลือด เซลล์โฟมที่อุดมด้วย LD ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นอันตรายในทุกขั้นตอนของโรค [7]

Cistanche สามารถปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

อย่างไรก็ตาม LDs ยังไม่ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางในระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) โดยมีเอกสารไม่กี่ฉบับที่รายงานการปรากฏตัวของ LDs ในเนื้อเยื่อสมองของมนุษย์ [8,9] ถึงกระนั้น LDs อาจมีหน้าที่ที่สำคัญในสมอง เนื่องจากการศึกษาล่าสุดยืนยันว่า LDs รวมใน glia เร่งการเสื่อมของระบบประสาทในแบบจำลองแมลงหวี่ [10] มีรายงานเมื่อเร็วๆ นี้ว่าในหนูทดลอง เซลล์ไขมันที่รับภาระ O-positive สีแดง รวมทั้งเซลล์ประสาท glial fibrillary acidic protein (GFAP)t astrocytes และโมเลกุลตัวปรับต่อแคลเซียมที่แตกตัวเป็นไอออน-1 (IBA{{7} })t microglia มีอยู่ในบริเวณสมองหลายแห่งและแสดงให้เห็นว่ามีส่วนร่วมในกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับอายุ [11] งานก่อนหน้านี้ของเรายังแสดงให้เห็นถึงการสะสม LD ในสมองที่เพิ่มขึ้นในแบบจำลองเมาส์ PD [12] จากการศึกษาร่วมกันพบว่า LDs อาจเกี่ยวข้องกับการเกิดโรคของ PD เช่นเดียวกับ NDDs อื่นๆ

โดยปกติ LDs ภายในเซลล์จะถูกย่อยสลายในไลโซโซมและส่ง FA ไปยังไมโทคอนเดรียเพื่อการบริโภคเป็นแหล่งพลังงานทางเลือกในช่วงระยะเวลาที่สารอาหารหมดไป [13] อย่างไรก็ตาม เซลล์ประสาทมีความสามารถในการใช้ FA ของไมโตคอนเดรียต่ำสำหรับการผลิตพลังงาน [14] ลักษณะนี้ทำให้เซลล์ประสาทไวต่อการสะสม LD และการเกิดเปอร์ออกซิเดชันเป็นพิเศษ นอกจากนี้ การสะสมของ LDs ยังช่วยเพิ่มอัตราการเกิดออกซิเดชันของ FA และสร้างแรงกดดันอย่างต่อเนื่องในห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอนในไมโตคอนเดรีย ซึ่งจะเพิ่มการผลิตออกซิเจนในปฏิกิริยา (ROS) โดยโซ่ขนส่งอิเล็กตรอนเชิงซ้อน I และ III [15] เพื่อขยายความเค้นออกซิเดชัน ไขมันส่วนเกินยังนำไปสู่การผลิต ROS โดยแหล่ง extramitochondrial เช่น nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) ออกซิเดสและเอนไซม์ออกซิเดชันอื่นๆ เมื่อรวมกับการแสดงออกที่ลดลงของเอ็นไซม์ต้านอนุมูลอิสระและความจุต่ำสำหรับการบริโภค FA ในเซลล์ประสาท การสะสม LD จะเป็นสื่อกลางจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน และสามารถนำไปสู่ความเสียหายต่อไมโตคอนเดรีย ความผิดปกติของไลโซโซม การ autophagy ที่บกพร่อง และการกระตุ้นการตอบสนองการอักเสบ [16,17] เว้นแต่ว่า LDs ที่สะสมไว้สามารถยับยั้งหรือขจัดออกไปได้ เซลล์ประสาทที่มีฤทธิ์สูงจะได้รับพยาธิสรีรวิทยา ทำให้เกิดการเสื่อมของระบบประสาท [17] (cistanche penis) หลักฐานบ่งชี้ว่ากระบวนการ catabolic ที่อาศัย lysosome ที่เรียกว่า autophagy มีบทบาทสำคัญในการรักษาสภาวะสมดุลของ LD ในระดับเซลล์ในเนื้อเยื่อต่างๆ [17,18] ในรายละเอียด,การเจริญเติบโตขององคชาต cistancheLDs สามารถถูกคัดแยกอย่างเลือกสรรในออโตฟาโกโซมและส่งไปยังไลโซโซมเพื่อการย่อยสลายโดยไลเปสกรดไลโซโซม ซึ่งเป็นกระบวนการที่รู้จักอย่างจำเพาะในชื่อ lipophagy [19] ดังนั้นการกำหนดเป้าหมาย LD และเส้นทางการกำจัด autophagic อาจเป็นแนวทางใหม่ในการจัดการความเสื่อมของระบบประสาท

การศึกษาผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติและสารควบคุมอาหารเพื่อเป็นแหล่งสำหรับการรักษา NDD และกลยุทธ์ต่างๆ ได้รับความสนใจอย่างมากในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา (20) กระชาย (Ka) เป็นโมเลกุลขนาดเล็กโพลีฟีนอลตามธรรมชาติที่สามารถพบได้ในสมุนไพรจีนและแหล่งอาหารจำนวนมาก [21] มีรายงานว่า Ka ออกแรงต้านแบคทีเรีย ต่อต้านริ้วรอย และกระตุ้นภูมิคุ้มกัน เช่นเดียวกับฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและป้องกันระบบประสาท [20,22,23] ก่อนหน้านี้ มีรายงานว่า Ka ยับยั้งการอักเสบในเซลล์ BV2 microglial ในหลอดทดลอง [24] และเพิ่มความต้านทานของเซลล์ประสาท DA ต่อการอักเสบของเส้นประสาทในร่างกาย [25] อย่างไรก็ตาม ยังไม่มีการตรวจสอบผลกระทบของ Kaon LD ใน PD

เมื่อพิจารณาถึงความสำคัญของ LD และความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดระหว่าง LDs, mitochondria และ autophagy [16] ซึ่งล้วนเกี่ยวข้องกับ PD เราตั้งสมมติฐานว่า Ka ยับยั้ง LD peroxidation และป้องกันการเสื่อมของ DA ใน PD ในการศึกษานี้ เราแสดงให้เห็นว่า Ka ปกป้องการเสื่อมสภาพของระบบประสาทอย่างมีนัยสำคัญในแบบจำลอง PD ของหนูโดยการยับยั้งการสะสม LD (cistanche powder) จากการศึกษาเพิ่มเติมพบว่า Ka กระตุ้น autophagy และลดการสะสมของ LDs ที่ถูกออกซิไดซ์เพื่อบรรเทาความผิดปกติของ mitochondrial และการผลิต mitochondrial ROS (mtROS) เพื่อป้องกันการตายของเซลล์ประสาท apoptoticcistanche propiedadesผลการวิจัยที่ได้รับในการศึกษานี้อาจช่วยชี้นำการตัดสินใจทางคลินิกโดยตรงเกี่ยวกับการใช้โมเลกุล Ka ใน NDD เช่น PD

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สัตว์ทดลอง

หนูเมาส์ C57BL/6J (เพศผู้ 4-เดือน) ได้รับมาจาก Animal Core ของมหาวิทยาลัยแพทย์หนานจิง (หนานจิง)ซิสแทนเช่ ทูบูโลซ่า ประโยชน์หนูได้รับการบำรุงรักษาและขยายพันธุ์ในศูนย์ทรัพยากรสัตว์ของคณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง และในสถานเลี้ยงสัตว์ที่โรงพยาบาลหอกลองนานจิง หนูสามารถเข้าถึงอาหารและน้ำได้ฟรีในห้องที่มีอุณหภูมิแวดล้อม 22 องศา ±2 องศา และวัฏจักรแสง/ความมืด 12:12 ชั่วโมง ขั้นตอนสำหรับสัตว์ทั้งหมดได้ดำเนินการอย่างเคร่งครัดตามแนวทางของสถาบันสุขภาพแห่งชาติเพื่อการดูแลและการใช้สัตว์ทดลอง

2.2.รีเอเจนต์

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 เปอร์เซ็นต์ ,96,353) สำหรับการทดลองในหลอดทดลองได้มาจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) และ DHE (D11347) ถูกซื้อมาจาก Thermo Fisher Scientific สำหรับการทดลองในสัตว์ทดลอง Ka ถูกละลายในสารละลาย 10 เปอร์เซ็นต์ DMSO ใน 16 เปอร์เซ็นต์ SBE- -CD ในน้ำเกลือปลอดเชื้อ สำหรับการทดลองในเซลล์ Ka ถูกเตรียมใน DMSO (Sigma-Aldrich) และ PBS (ความเข้มข้น DMSO สุดท้ายคือ 0.01 เปอร์เซ็นต์ ), pH 7.4

2.3. การชักนำและการบำบัดแบบจำลองหนูเมาส์ PD ที่เหนี่ยวนำด้วยเมทิล-4-ฟีนิล-1,2,3,6-เตตระไฮโดรไพริดีน (MPTP)

เพื่อประเมินผลของ Ka ในแบบจำลอง PD ของความเป็นพิษ MPTP/p หนู (เพศผู้ อายุ 4-5 เดือน) ถูกสุ่มแบ่งออกเป็นกลุ่มที่ได้รับน้ำเกลือ กลุ่มที่ได้รับ MPTP กลุ่มที่ได้รับ MPTP ร่วมกับ Ka และกะคนเดียวรักษากลุ่ม ในกลุ่มที่ได้รับ MPTP หนูได้รับการบริหาร MPTP แบบเรื้อรังด้วยโปรโตคอลที่คล้ายกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [26]: MPTP ถูกละลายในน้ำเกลือและฉีดเข้าใต้ผิวหนังที่ 25 มก./กก. ตามด้วยโพรเบเนซิด 250 มก./กก. (ละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์) การฉีดเข้าช่องท้อง (ip) ในช่วงเวลา 1 ชั่วโมง ทุกๆ 3.5 วัน ในช่วง 5 สัปดาห์ (ราก cistanche) หนูควบคุมได้รับการฉีดน้ำเกลือและโพรเบเนซิด ในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย MPTP ร่วมกับ Ka หนูได้รับ Ka(50 มก./กก. ฉีดครั้งเดียว/วันระหว่างการทดลอง Jingzhu Biotechnology, Nanjing, China) ในช่องท้อง (ip) ทุกวัน 3 วัน ก่อนการรักษาด้วย MPTP และมากกว่า 5 MPTP สัปดาห์ที่ฉีด หนึ่งสัปดาห์หลังจากการฉีด MPTP ครั้งสุดท้าย หนูได้รับการทดสอบพฤติกรรมโดยปิดบังกลุ่ม หลังจากนั้น หนูทุกตัวได้รับการดมยาสลบด้วยโซเดียม เพนโทบาร์บิทัล 40 มก./กก. และเสียสละเพื่อตรวจหาโปรตีนในสมองและการวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมีหรือการวิเคราะห์ qPCR

2.4. การผ่าตัด stereotaxic ในร่างกายและการรักษาทดลอง

การผ่าตัด Stereotaxic ภายใต้การระงับความรู้สึกโซเดียม เพนโทบาร์บิทัล (40 มก./กก., ip) ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้ [25] Atg5 ของเมาส์และ shRNA ควบคุมถูกทรานส์เฟกด้วยเวกเตอร์บรรจุภัณฑ์ (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP) เพื่อสร้าง AAV สำหรับการฉีดแบบไมโคร หนูที่ดมยาสลบจะถูกวางในอุปกรณ์สเตอริโอแทกซิก พวกเขาถูกฉีดด้วย 1 ไมโครลิตร AV โดยอิเล็กโทรดแก้วโดยมุ่งไปที่ DG (AP:-0.3 มม.; ML: ±0.13 มม.; DV:-0.45 มม.） ในอัตรา ที่ 0.25 ไมโครลิตร/นาที จากนั้นเข็มจะถูกเก็บไว้เป็นเวลาเพิ่มเติม 2- นาที 2 สัปดาห์หลังจากการฉีดไมโครไวรัส หนูเมาส์ถูกนำแบบจำลอง PD ที่เหนี่ยวนำโดย MPTP และ (หรือ) การบำบัดด้วย Ka

Atg5 shRNA ได้มาจาก Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. สำหรับความเงียบของ Atg5 ไพรเมอร์แสดงในตารางเสริม 1

2.5. การวิเคราะห์พฤติกรรม

หนึ่งสัปดาห์หลังจากการฉีด MPTP หรือน้ำเกลือครั้งสุดท้าย การทดสอบโรทารอดและการทดสอบขั้วได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า [27] สำหรับการทดสอบ rotarod หนูทดลองถูกปรับให้เข้ากับ rotarod ในการทดลองสองครั้ง (6 นาทีด้วยความเร็วเร่ง 12-20 รอบต่อนาที) ต่อวันเป็นเวลา 2 วันก่อนเริ่มการทดลอง จากนั้น หนูทดลองถูกทดสอบที่ 20 รอบต่อนาที เป็นเวลา 300 วินาที เป็นเวลา 3 วันติดต่อกัน เวลาในการตอบสนองที่ลดลงถูกบันทึกโดยใช้ Rotarod Analysis System (Jiliang, Shanghai, China) สำหรับการทดสอบเสานั้น หนูถูกวางหัวไว้บนเสาไม้แนวตั้ง (พื้นผิวขรุขระ สูง 50 ซม. เส้นผ่านศูนย์กลาง 1 ซม.) หนูทุกตัวคุ้นเคยกับอุปกรณ์นี้ 2 วันก่อนการทดสอบและทดสอบสามครั้งในวันที่สาม เวลาทั้งหมด (T-total จนกระทั่งเมาส์ถึงพื้นด้วยอุ้งเท้าทั้งสี่) และเวลาเลี้ยว (T-turn เพื่อให้เมาส์หันหัวลงจนสุด) ถูกบันทึกไว้ การทดลองปิดบังกลุ่มเมาส์สำหรับการทดสอบพฤติกรรมแต่ละครั้ง และทำการทดสอบสามครั้ง

2.6. การเก็บตัวอย่างสมอง

หลังจากการทดสอบพฤติกรรมครั้งสุดท้าย หนูเมาส์ถูกทำให้ชาด้วยโซเดียม เพนโทบาร์บิทัล (40 มก./กก., ip) สำหรับการวิเคราะห์ qPCR, western blotting และการวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) สมองทั้งหมดถูกสกัดอย่างรวดเร็วจากสัตว์ จากนั้นเนื้อเยื่อส่วนกลางและเนื้อเยื่อ striatum จะถูกผ่าอย่างรวดเร็ว แช่แข็งล่วงหน้าโดยไนโตรเจนเหลว ตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ -80 องศาจนกระทั่งทำการวิเคราะห์

สำหรับการวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมิคัล หนูเมาส์ถูก perfused trans-cardially ด้วย 4 เปอร์เซ็นต์ paraformaldehyde (PFA) สมองถูกสกัด หลังตรึง ขาดน้ำ ฝังใน OCT (Tissue-Tek) และแยกส่วนต่อเนื่องของสมองด้วยการแช่แข็ง (30 ไมโครเมตรต่อชิ้น) ผ่านแต่ละชั้นและสมองส่วนกลางโดยใช้ไมโครโทมแช่แข็ง (Leica CM1950, Nussloch ประเทศเยอรมนี ). ทุกส่วนถูกรวบรวมในชุดที่แยกจากกันหกชุด และชิ้นสมองถูกเก็บไว้ในกลีเซอรีน 50 เปอร์เซ็นต์ และแช่แข็งใน -20 องศาจนถึงการวิเคราะห์

สำหรับ TEM หนูได้รับกลูตาราลดีไฮด์ 2.5 เปอร์เซ็นต์และพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 2 เปอร์เซ็นต์ตามที่อธิบายไว้ 【12】 ส่วนเล็ก ๆ （<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. การวิเคราะห์อิมมูโนฮิสโตเคมี

ล้างชิ้นสมองใน PBS ตามด้วย H2O2 3 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นบ่มด้วย 0.3 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 ใน PBS เสริมด้วย BSA 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนั้น สไลด์ถูกฟักด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืนใน PBS ที่มี 5 เปอร์เซ็นต์ BSA ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน จากนั้นล้างและฟักในแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตามด้วยการฟักตัวด้วยไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB) หรือติดตั้งใน DAPI (Life Technologies, Cat P36931) สำหรับการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เป็นเวลา 5 นาที สำหรับการย้อมสี Nissl สไลด์ถูกผสานในสารละลายครีซิล ไวโอเลต (CV) (0.1 กรัม เครซิล ไวโอเลต 99 มล. H20 และกรดอะซิติก 1 เปอร์เซ็นต์ 1 มล.) เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจึงทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์และไซลีน มีการสังเกตรูปภาพและถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์ Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, United States) จำนวนรวมของเซลล์ประสาท TH-positive และ Nissl's-positive ทั้งหมดใน SNpc ได้มาด้วยวิธีทางซีรั่มโดยใช้วิธีการแยกส่วนแสงด้วยซอฟต์แวร์ MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, USA)

2.7.การวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)

ตัวอย่าง striatal ของหนูเมาส์ถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วย {{0}}.1 M กรดเปอร์คลอริก (เนื้อเยื่อ 1 มก. ใน 100ไมโครลิตรของกรดเปอร์คลอริก) และ 0.1 มิลลิโมลาร์ EDTA บำบัดด้วยอัลตราโซนิกและ หมุนเหวี่ยงที่ 20,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 30 นาที ตามที่รายงาน [27] จากนั้นจึงรวบรวมของเหลวเหนือตะกอนเพื่อวัด เฟสเคลื่อนที่เป็นสารละลายผสมที่ประกอบด้วยโซเดียมฟอสเฟตโมโนเบสิก 90 มิลลิโมลาร์, กรดออกเทนซัลโฟนิก 1.7 มิลลิโมลาร์, ซิเตรต 50 มิลลิโมลาร์, EDTA 50 ไมโครโมลาร์, อะซิโตไนไทรล์ 10 เปอร์เซ็นต์ที่มีอัตราการไหล 0.2 มล./นาที ในแบบคู่ขนานสำหรับการคำนวณเส้นโค้งมาตรฐานเชิงปริมาณ สารละลายมาตรฐานสต็อคสำหรับโดปามีนและกรดไดไฮดรอกซี-ฟีนิลอะซิติก (DOPAC) (ซิกมา-อัลดริช สหรัฐอเมริกา) ถูกเตรียมใน 0.1 โมลาร์ HClO4 ปริมาณ 10 ul ของ supernatant ที่เตรียมไว้หรือสารละลายมาตรฐานถูกฉีด เข้าสู่เฟสเคลื่อนที่และทดสอบโดยเครื่องตรวจจับไฟฟ้าเคมี ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific) ตัวอย่างถูกวัดและหาปริมาณสูงสุด ความเข้มข้นของโมโนเอมีนถูกหาปริมาณโดยเปรียบเทียบกับมาตรฐานโดยใช้ซอฟต์แวร์ ClarityChrom (Knauer ประเทศเยอรมนี) จากนั้น เนื้อหาในชั้นถูกแปลงตามอัตราส่วนการเจือจาง เส้นโค้งมาตรฐานของ DA และ DOPAC แสดงในรูปที่ 1a และ b เพิ่มเติม

2.8. การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษา

มีการเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทปฐมภูมิแบบมีเซนเซฟาลิกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [12] โดยสังเขป เนื้อเยื่อ mesencephalic ของหนู C57BL/6 ในวันที่ตัวอ่อนในวันที่ 14/15 (E14/15) ถูกเอาออกอย่างระมัดระวัง โดยแยกกลไกทางกลไกเพื่อเอาเยื่อและหลอดเลือดขนาดใหญ่ออก แล้วผ่าออก ต่อมา พวกมันถูกย่อยด้วยทริปซิน-EDTA (Amresco, Solon, OH, USA) จากนั้นกรองผ่านตัวกรอง 100-um เพื่อให้ได้สารแขวนลอยเซลล์เดียว ต่อจากนั้น เซลล์ถูกเคลือบบนเพลตที่เคลือบด้วยโพลี-L-ไลซีนล่วงหน้า 12-/24-หลุมที่ 2.5 ×10 องศาเซลล์/มิลลิลิตรที่มีตัวกลาง Neurobasal (Cat 21103049,GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA) เสริมด้วย B27 (2 เปอร์เซ็นต์ v:v, Cat 1750404,GibcoTM) และ penicillin/streptomycin (0.5 เปอร์เซ็นต์ v:v) วัฒนธรรมได้รับการบำรุงรักษาในห้องที่มีความชื้น (37 องศา , ตู้บ่ม CO2 ร้อยละ 5) อาหารเลี้ยงเชื้อถูกเปลี่ยนทุก 3 วันและเซลล์สามารถใช้ได้ที่ 7-10 วัน

สายพันธุ์ของเซลล์: สายพันธุ์ของเซลล์ SH-SY5Y ถูกเพาะเลี้ยงใน 10 เปอร์เซ็นต์ของ FBS และ 1 เปอร์เซ็นต์ของเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซินในตู้ฟักไข่ที่ทำความชื้นที่ 37 องศาและ 5 เปอร์เซ็นต์ของ CO2 ในการทดลอง เซลล์ SH-SY5Y ได้รับการรักษาด้วย MPP บวก (200 ไมโครโมลาร์) หรือขนาดยาที่แตกต่างกันของ Ka (0,3,30,60,100,300,600uM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงKa(3,10, 30,60μM,3 ชั่วโมง) ไพรเมอร์-SH- เซลล์ SY5Y ถูกกระตุ้นด้วย MPPt (400 μM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง Ka(30μM, 3h) โดยมี （หรือไม่มี）3-MA（3mM,1h）หรือ -tocopherol（50μM,1 h, Sigma-Aldrich,47783 )เซลล์ที่ถูกไพรเมด-SH-SH5Y ถูกกระตุ้นด้วย MPPT(200μM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง

2.9. การทดสอบ CCK8 ความมีชีวิตของเซลล์

ความมีชีวิตของเซลล์ที่เปลี่ยนแปลงไปของการรักษาด้วย Ka ตรวจพบโดย Cell Counting Kit-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, USA) โดยสังเขป เซลล์ SHSY5Y ถูกเพาะใน 96- จานดีแล้วบำบัดด้วย Ka (3,30,60,100,300,600,600 uM) ที่มีความเข้มข้นต่างกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น 10ul ของ CCK-8 รีเอเจนต์ถูกเติมในแต่ละหลุมเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ในที่สุด การดูดกลืนแสงถูกตรวจพบโดย Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) ที่ 450 นาโนเมตร

2.10. การทดสอบ ATP

ระดับ ATP ของเซลล์ตรวจพบโดย ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังการบำบัด เซลล์ถูกสลายและหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 องศาและส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวม สารละลายในการทำงาน (100μL) ถูกเติมลงในตัวอย่าง 20μL ในเพลท 96-หลุม และวัดการเรืองแสงทันทีบนเครื่องอ่านไมโครเพลทอัตโนมัติ การวัดจากตัวอย่างทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงความเข้มข้นของโปรตีน

2.11.Na plus -K plus -ATPase assay

สำหรับการวัด Nat-K plus -ATPase (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, China) เซลล์ถูกโซนิเคตและหมุนเหวี่ยงที่ 600 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อให้ได้ส่วนลอยเหนือตะกอน เติมสารละลายปฏิกิริยาของการตรวจจับ Nat-Kt-ATPase และฟักไข่ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นตรวจพบการดูดกลืนแสงที่ 660 นาโนเมตร การวัดของตัวอย่างทั้งหมดถูกทำให้เป็นมาตรฐานจนถึงความเข้มข้นของโปรตีน

2.12. การวิเคราะห์การซับแบบตะวันตก

เซลล์หรือเนื้อเยื่อสมองถูกสลายในบัฟเฟอร์ RIPA (50 mM Tris (pH 7.4)cistanche คือ150 mM NaCl,1 เปอร์เซ็นต์ NP-40 (FNN0021,Thermo),0.5 เปอร์เซ็นต์โซเดียม ดีออกซีโคเลต (D6750, Sigma),0.1 เปอร์เซ็นต์ SDS (74255, Sigma)เสริมด้วยโปรตีเอส และสารยับยั้งฟอสฟาเตส (โรช เซี่ยงไฮ้ จีน) กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนด้วย Micro BCA Kit （Beyotime, Shanghai, China） โปรตีน 30-ug ของแต่ละตัวอย่างถูกแยกโดย SDS-PAGE โดยใช้เจลพอลิอะคริลาไมด์ TGX (Bio-Rad, Hercules, California, USA) จากนั้นจึงถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนไดฟลูออไรด์ (PVDF) (Millipore, Bedford, MA) หลังจากการปิดกั้น เยื่อหุ้ม PVDF ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิจำเพาะต่างๆ ใน ​​TBST ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน จากนั้นล้างและบ่มในแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) ที่สอดคล้องกันเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แถบอิมมูโนเรทีฟแอกทีฟถูกมองเห็นและตรวจพบโดยเคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (ECL) บวกกับรีเอเจนต์การตรวจจับ (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) และวิเคราะห์โดยใช้ระบบการสร้างภาพ ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)

2.13.Real-time quantitative(Q)-และการถอดความแบบย้อนกลับ (RT)-PCR

RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากเนื้อเยื่อสมองและเซลล์ที่เพาะเลี้ยงโดยใช้รีเอเจนต์ Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) การถอดความแบบย้อนกลับดำเนินการโดยใช้ชุดรีเอเจนต์ TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa ประเทศญี่ปุ่น) qPCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) ในเครื่องมือ StepOnePlus (Applied Bio-systems) ไพรเมอร์ถูกซื้อและตรวจสอบโดยนายพล (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ qPCR ถูกแสดงไว้ในตารางเสริม 2

บทความนี้คัดลอกมาจาก Redox Biology 41 (2021) 101911