ส่วนที่ 1: การทำแผนที่การทำงานร่วมกันระหว่าง Epigenomic และ Transcriptomic ระหว่างการสร้างหน่วยความจำและการเรียกคืนในชุด Engram Hippocampal

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อส่วน2

Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1สถาบัน Picower เพื่อการเรียนรู้และหน่วยความจำ, สถาบันเทคโนโลยีแมสซาชูเซตส์ เมืองเคมบริดจ์ รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา

2ภาควิชาสมองและปัญญา สถาบันเทคโนโลยีแมสซาชูเซตส์ เมืองเคมบริดจ์ รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา

3ห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์คอมพิวเตอร์และปัญญาประดิษฐ์ สถาบันเทคโนโลยีแมสซาชูเซตส์ เมืองเคมบริดจ์ รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา

4 แผนกเวชศาสตร์ทารกแรกเกิด โรงพยาบาลเด็กบอสตัน โรงเรียนแพทย์ฮาร์วาร์ด เมืองบอสตัน รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา

5Broad Institute of Harvard และ MIT เมืองเคมบริดจ์ รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา

คลิกเพื่อร้านขายวิตามิน Cistanche และ Cistanche สำหรับหน่วยความจำ

เชิงนามธรรม

สถาปัตยกรรม epigenome และสามมิติ (3D) – จีโนมกำลังเกิดขึ้นเป็นปัจจัยสำคัญในการควบคุมแบบไดนามิกของโปรแกรมการถอดรหัสต่างๆ ที่จำเป็นสำหรับการทำงานของเซลล์ประสาท ที่นี่เราใช้ระบบการติดแท็กที่ขึ้นกับกิจกรรมในหนูทดลองเพื่อกำหนดสถานะอีพีเจเนติก สถาปัตยกรรม 3 มิติ และภูมิทัศน์การถอดรหัสของเซลล์เอ็นแกรมตลอดอายุขัยของหน่วยความจำการก่อตัวและการเรียกคืน ผลการวิจัยของเราเปิดเผยว่าหน่วยความจำการเข้ารหัสนำไปสู่เหตุการณ์ไพรเมอร์อีพีเจเนติก ซึ่งทำเครื่องหมายโดยการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นของเอนแฮนเซอร์โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงการถอดรหัสที่สอดคล้องกันหน่วยความจำการรวมเข้าด้วยกันส่งผลให้เกิดการปรับโครงสร้างเชิงพื้นที่ของเซ็กเมนต์โครมาตินขนาดใหญ่และปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเสริม ในที่สุด ด้วยการเปิดใช้งานอีกครั้ง เซลล์ประสาทเอ็นแกรมใช้ชุดย่อยของปฏิกิริยาระหว่างดีโนโวลอง โดยที่เอนแฮนเซอร์ไพรเมอร์ถูกนำไปติดต่อกับโปรโมเตอร์ตามลำดับเพื่อควบคุมยีนที่เกี่ยวข้องกับการแปลโปรตีนในท้องถิ่นในช่องไซแนปติก โดยรวมแล้ว งานของเราอธิบายการถอดความที่ครอบคลุม และผู้ใช้สามารถดู พิมพ์ คัดลอก และดาวน์โหลดข้อความและขุดข้อมูลเนื้อหาในเอกสารดังกล่าว เพื่อการวิจัยทางวิชาการ ภายใต้เงื่อนไขการใช้งานฉบับเต็มเสมอ:http://www.nature com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*ติดต่อกับ: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

ผลงานของผู้เขียน:

AM และ L.-HT คิดและออกแบบโครงการ AM และ AZ ทำการทดลองเชิงพฤติกรรม ISH ภูมิคุ้มกัน และการวิเคราะห์ MARIS CA ได้ทำการฉีดไวรัสและภูมิคุ้มกัน AM และ HSM ทำการทดลอง ATAC-seq AM และ AZ ทำการทดลอง RNA-seq นิวเคลียร์ AM, HSM และ VD ทำการทดลอง pc-Hi-C และ Hi-C AM, HSM, VD, RMR และ JDV ทำการวิเคราะห์ ATAC-seq AM, RMR, HSM, VD และ FG ทำการวิเคราะห์ RNA-seq นิวเคลียร์ AM, VD, HSM และ RMR ทำการวิเคราะห์ pc-Hi-C และ Hi-C ผู้เขียนทุกคนช่วยตีความข้อมูล AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK และ LHT เขียนต้นฉบับพร้อมข้อมูลจากผู้เขียนทั้งหมด LHT ได้จัดหาเครื่องมือและดูแลโครงการ

การแข่งขันความสนใจ:

ผู้เขียนประกาศไม่มีผลประโยชน์ที่แข่งขันกัน

ภูมิทัศน์ epigenomic ตลอดอายุขัยของหน่วยความจำการก่อตัวและการจำในชุดเอนแกรมฮิปโปแคมปัส

การก่อตัวและการเก็บรักษาความทรงจำระยะยาวขึ้นอยู่กับการแสดงออกของยีนที่ประสานกันและการสังเคราะห์โปรตีน synaptic1 กระบวนการระดับโมเลกุลเหล่านี้ทำหน้าที่ภายในกลุ่มเซลล์ประสาทที่เฉพาะเจาะจง ซึ่งเรียกว่า engram cells2–4 แนวทางล่าสุดโดยใช้การแสดงออกที่ขึ้นกับกิจกรรมของนักข่าวได้ให้กรอบการทำงานสำหรับการสำรวจเอ็นแกรมชุดที่5–8 แต่กลไกระดับโมเลกุลที่ควบคุมหน่วยความจำการจัดเก็บและดึงข้อมูลยังคงเป็นที่เข้าใจได้ไม่ดี โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การดัดแปลง epigenetic และสถาปัตยกรรม 3D-genomic กำลังเกิดขึ้นเป็นปัจจัยสำคัญในการควบคุมไดนามิกของการแสดงออกของยีน9– 17 และมีความซาบซึ้งมากขึ้นในความสำคัญในการทำงานของเซลล์ประสาท การพัฒนา และโรค 14, 16, 18

ในที่นี้ เราใช้แบบจำลองเมาส์ Targeted Recombination ใน Active Populations (TRAP)5,6 ซึ่งเซลล์ประสาทที่กระตุ้นการทำงานซึ่งแสดงยีน (Arc) ที่ควบคุมด้วยกิจกรรมถูกแท็กอย่างถาวรในลักษณะที่เหนี่ยวนำไม่ได้ เซลล์ประสาทที่เปิดใช้งานระหว่างหน่วยความจำการเข้ารหัส การรวม และการเรียกคืนถูกจัดเรียงและอยู่ภายใต้การจัดลำดับ RNA นิวเคลียร์ (nRNA-seq), การทดสอบสำหรับโครมาตินที่เข้าถึงได้แบบทรานส์โพเซสโดยใช้การจัดลำดับ (ATAC-seq) และการจับโครงสร้างโครโมโซม (Hi-C) ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าหน่วยความจำการเข้ารหัสนำไปสู่การเพิ่มความสามารถในการเข้าถึงโครมาตินทั่วทั้งจีโนม โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่คาดหวังในการแสดงออกของยีน นอกจากนี้ เราแสดงให้เห็นว่าช่วงท้ายของการรวมหน่วยความจำมีความเกี่ยวข้องกับการปรับตำแหน่งใหม่ของเซ็กเมนต์โครมาตินขนาดใหญ่ (ช่องย่อย) จากสภาพแวดล้อมที่ไม่ใช้งานไปจนถึงสภาพแวดล้อมที่อนุญาต และการจัดโครงสร้างใหม่ของภูมิทัศน์ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเสริม ในที่สุด การเปิดใช้งานของเซลล์ประสาทในช่วงหน่วยความจำการเรียกคืนมีความเกี่ยวข้องกับปฏิสัมพันธ์ระหว่างดีโนโวโปรโมเตอร์-ตัวเสริม โดยใช้ชุดย่อยขนาดใหญ่ของเอนแฮนเซอร์ที่เตรียมไว้ระหว่างหน่วยความจำการเข้ารหัส ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเสริมเหล่านี้สัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงที่แข็งแกร่งในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โปรตีนในท้องถิ่นและการสร้างมอร์โฟเจเนซิส synaptic

ผลลัพธ์

การระบุเวลาและเชิงพื้นที่ของเซลล์เอ็นแกรมที่ถูกกระตุ้นและกระตุ้นใหม่

การติดตามกิจกรรมของเซลล์ประสาทเมื่อเวลาผ่านไปเป็นหนึ่งในความท้าทายที่สำคัญในการศึกษาเซลล์ engram เนื่องจากเป็นตัวบ่งชี้สำหรับกิจกรรมของเซลล์ประสาทหรือที่เรียกว่ายีนระยะแรกในทันที (IEG) กลับสู่การตรวจวัดพื้นฐานไม่นานหลังจากการเหนี่ยวนำ1,2 ในการเอาชนะข้อจำกัดนี้ เราได้ใช้ประโยชน์จากแบบจำลอง TRAP5,6 ซึ่งต้องใช้ทรานส์ยีนสองตัว หนึ่งที่แสดงออก CreERT2 จากโปรโมเตอร์อาร์คที่ขึ้นกับกิจกรรม และอีกอันที่อนุญาตให้แสดงออกของนักข่าวโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (eYFP) ใน Cre- ลักษณะที่พึ่งพา การบริหาร tamoxifen (TAM) ให้กับหนู TRAP ส่งผลให้เกิดฉลาก eYFP ถาวรในเซลล์ประสาท Arc ที่เปิดใช้งาน หากไม่มี TAM CreERT2 จะยังคงอยู่ในไซโตพลาสซึมและ eYFP จะไม่ถูกแสดงออก (Extended Data รูปที่ 1a) หนูเมาส์ TRAP อยู่ภายใต้กระบวนทัศน์ของเงื่อนไขความกลัวตามบริบทของ Pavlovian (CFC) แบบคลาสสิก (รูปที่ 1a) ซึ่งเป็นวิธีการที่ใช้กันทั่วไปในการศึกษาความทรงจำที่หลีกเลี่ยง ประมาณ 1.5–2 ชั่วโมงหลังจากได้รับ FS สมองจะถูกรวบรวมเพื่อระบุ i) RNA binding protein fox-1 homolog 3 (Rbfox3) หรือที่เรียกว่า NeuN plus และ eYFP บวกกับเซลล์ประสาทที่ติดแท็กซึ่งถูกกระตุ้นในระหว่างการเปิดรับแสงครั้งแรก (เปิดใช้งาน -ช่วงต้น) ซึ่งสามารถแยกความแตกต่างได้จาก ii) NeuN plus /eYFP- เซลล์ประสาทในสถานะพื้นฐานที่ไม่ได้กระตุ้น (Basal) (รูปที่ 1a) หลังจากห้าวัน โดยไม่มีการดึงข้อมูล เรารวบรวม iii) NeuN บวก /eYFP บวกเซลล์ประสาทที่ถูกแท็กในวันฝึก แสดงถึงระยะยาวหน่วยความจำการรวมบัญชี (เปิดใช้งาน - ล่าช้า) ใน

กลุ่มที่ต่างกัน หนูถูกเปิดโปงอีกครั้งต่อสิ่งเร้าแบบมีเงื่อนไข และการแสดงออกของโปรตีน ARC ภายในร่างกายที่ตามมาถูกตรวจสอบ 1.5–2 ชั่วโมงหลังจากการสัมผัสซ้ำ สิ่งนี้เปิดใช้งานการระบุ iv) NeuN บวกสองเท่า /eYFP บวก / Arc บวกภายในเซลล์ประสาทเอ็นแกรมที่เปิดใช้งานระหว่างการฝึกและเปิดใช้งานอีกครั้งระหว่างหน่วยความจำเรียกคืน (เปิดใช้งานอีกครั้ง) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แม้ว่าการรวมตัวใหม่ของ DNA อาจไม่เกิดขึ้นเต็มที่ 1.5–2 ชั่วโมงหลังจาก FS แต่เราสังเกตเห็นการโลคัลไลเซชันสูง (เฉลี่ย 84 เปอร์เซ็นต์ ) ระหว่างโปรตีน Arc ภายนอกและตัวรายงาน Arc:eYFP (Extended Data รูปที่ 1b) ซึ่งก็เช่นกัน สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้า20.

เพื่อยืนยันหน่วยความจำการเข้ารหัสและการเรียกคืนระหว่าง CFC พฤติกรรมการเยือกแข็งถูกบันทึกในระหว่างการฝึกอบรมและการเปิดเผยอีกครั้งต่อสัญญาณที่กระตุ้นความกลัว (Extended Data รูปที่ 1c) สอดคล้องกับสิ่งพิมพ์ก่อนหน้านี้6,20 ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าจำนวนเซลล์ประสาท eYFP บวก (เปิดใช้งานในช่วงต้นและ - ปลาย) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในฮิบโปแคมปัส เมื่อเทียบกับหนูที่ยังไร้เดียงสาต่อ CFC ในกรงที่บ้าน (F (2, 70)=240.3, ป<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

การสร้างหน่วยความจำสัมพันธ์กับการเข้าถึงโครมาตินที่เพิ่มขึ้น

เพื่อให้เข้าใจถึงแรงของโมเลกุลที่ควบคุมโปรแกรมการถอดรหัสต่างๆ ได้ดีขึ้น เราจึงวัดการเปลี่ยนแปลงของการเข้าถึงโครมาตินทั่วทั้งจีโนมในช่วงต่างๆ ของหน่วยความจำ. เนื้อเยื่อฮิปโปแคมปัลถูกรวมกลุ่มและนิวเคลียสที่แยกได้ (Extended Data รูปที่ 2a, ตารางเสริม 1) อยู่ภายใต้การเตรียมไลบรารี ATAC-seq การวิเคราะห์ภูมิภาคที่เข้าถึงได้แบบแยกส่วน (DAR) (Diffbind, โหมด DESeq2) ระหว่างประชากรทั้งหมด (รูปที่ 2a) เปิดเผยว่าการเปลี่ยนแปลงส่วนใหญ่ในสถานะโครมาตินเกิดขึ้นในช่วงแรกของการสร้างหน่วยความจำ โดยที่ 7,{6}} ภูมิภาคทั่วทั้งจีโนมได้รับ การช่วยสำหรับการเข้าถึง (Basal vs. Early, ตารางเสริม 2) ในทางตรงกันข้าม เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงที่ค่อนข้างน้อยในสถานะของโครมาตินเมื่อเปลี่ยนจาก Activated-early เป็น Activated-late (582 DARs) และระหว่างเซลล์ประสาทที่ Activated-late และ Reactivated (725 DAR) โดยมีความเหลื่อมล้ำกัน 48 เปอร์เซ็นต์ (Extended Data รูปที่ 2b ). อย่างน่าทึ่ง เราระบุเปอร์เซ็นต์ที่มาก (52 เปอร์เซ็นต์) ของ DAR ที่ได้รับอย่างเสถียรซึ่งสามารถเข้าถึงได้มากขึ้นใน Activated-early และยังคงสามารถเข้าถึงได้ทั้งในเซลล์ประสาทที่ Activated-late และ Reactivated (รูปที่ 2b,c; ตารางเสริมที่ 2) ที่น่าสนใจคือในขณะที่ทั้งการเปลี่ยนแปลงในช่วงแรก (พื้นฐานเทียบกับช่วงต้น) และ DAR ที่ได้รับอย่างเสถียรนั้นได้รับการเสริมสมรรถนะสำหรับบริเวณที่มีพันธุกรรม แต่การเปลี่ยนแปลงของโครมาตินช่วงปลาย (ช่วงต้นกับช่วงปลายและช่วงปลายเทียบกับการเปิดใช้งานใหม่) ส่วนใหญ่ได้รับการเสริมสมรรถนะสำหรับไซต์โปรโมเตอร์ (รูปที่ 2d)

ข้อมูลเชิงลึกด้านการทำงานได้รับจากการประเมินว่า DAR ถูกทำเครื่องหมายโดยการปรับเปลี่ยนฮิสโตนที่แตกต่างกันอย่างไร ขั้นแรกเราใช้ ChromHMM เพื่อสร้างแบบจำลองสถานะโครมาตินจากการศึกษาอิสระสองชิ้นที่ใช้เนื้อเยื่อฮิปโปแคมปัสจำนวนมากก่อนและหลังการกระแทกที่เท้า 21,22 ต่อไป เราทำการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะแบบพับ (สังเกตจากการกระจายที่คาดไว้) ของ DAR สำหรับสถานะต่างๆ เหล่านี้ และเปิดเผยว่าการเปลี่ยนแปลงของโครมาตินในช่วงแรกและ DAR ที่เสถียรนั้นได้รับการเสริมสมรรถนะสำหรับเครื่องหมายเสริม (รูปที่ 2e; Extended Data รูปที่ 2c, ตารางเสริม 3) .

ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับสิ่งพิมพ์ก่อนหน้านี้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นการเพาะเลี้ยงเซลล์ประสาทปฐมภูมิทำให้เกิดกิจกรรมเอนแฮนเซอร์ที่ยืดเยื้อ 12,23 ต่อไป เราวิเคราะห์การทับซ้อนของ loci ที่เสถียรแต่ละรายการด้วย H3K4me1 และ H3K27ac21 เครื่องหมายฮิสโตนทั้งสองนี้แสดงถึงกลุ่มของเอนแฮนเซอร์ที่แตกต่างกัน ซึ่งสามารถ 'primed' (เฉพาะ H3K4me1), 'active' (H3K4me1 และ H3K27ac) หรือ 'แฝง' (ไม่มีเครื่องหมาย)18 พีคที่เสถียรแสดงการกระจายทั่วทั้งตัวเสริมไพรม์และแอคทีฟ (Extended Data รูปที่ 2d) โดยที่ 47 เปอร์เซ็นต์ของไซต์เหล่านี้ถูกคาดการณ์ว่าจะ 'แฝง' (ไม่มีการทับซ้อนระหว่าง DAR และเครื่องหมายฮิสโตน 21 ได้รับ 1 ชั่วโมงหลังจาก FS) เพื่อยืนยันแบบจำลองของเรา เราได้ดำเนินการ chromatin immunoprecipitation (ChIP) สำหรับ H3K4me1 และ H3K27ac histone markers ตามด้วย qPCR ไซต์ที่เลือกสี่แห่งได้รับเลือกจากการวิเคราะห์แบบจำลองการเพิ่มประสิทธิภาพสมมุติของเรา (Extended Data รูปที่ 2d; Enhancer 1 – ที่คาดการณ์ไว้ล่วงหน้า Enhancer 2- คาดการณ์ว่าใช้งานได้ Enhancer 3 และ 4 - แฝงที่คาดการณ์ไว้) ตามข้อตกลงกับโมเดลของเรา เราระบุตำแหน่ง 'แฝง' สองตำแหน่งในสถานะฐาน (ตัวเพิ่มประสิทธิภาพ 3 และ 4) ที่เปลี่ยนเป็นสถานะ 'ใช้งานอยู่' ระหว่างหน่วยความจำการก่อตัว (รูปที่ 2f) ยิ่งกว่านั้น สารเสริมสมมุติ 1 ถูกพบว่า 'ถูกเตรียมไว้' ในสถานะฐานและเริ่มทำงาน ซึ่งมีการเพิ่มขึ้นอย่างคงที่อย่างมีนัยสำคัญในเครื่องหมาย H3K27ac ในช่วงท้ายและการเรียกคืน (รูปที่ 2f) เมื่อรวมกัน ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่ารายการของเอนแฮนเซอร์ที่เข้าถึงได้ใหม่ถูกขยายในเซลล์ประสาทเอ็นแกรมที่มีศักยภาพ ซึ่งบริเวณแฝงหรือไพรม์ได้รับเครื่องหมาย H3K4me1 และ H3K27ac และด้วยเหตุนี้จึงกลายเป็นเอนแฮนเซอร์ที่ออกฤทธิ์

เพื่อทำความเข้าใจบทบาทหน้าที่ของภูมิภาคโปรโมเตอร์และเอนแฮนเซอร์ที่เข้าถึงได้ เราได้ทำการวิเคราะห์โมทีฟเสริมคุณค่า (ตารางเสริม 4) ข้อมูลของเราระบุว่าลวดลายส่วนใหญ่ (70 เปอร์เซ็นต์) บนโปรโมเตอร์ที่เข้าถึงได้นั้นได้รับการเสริมแต่งอย่างเท่าเทียมกันและถูกระบุในทุกขั้นตอนของหน่วยความจำ(ขยายข้อมูล รูปที่ 2e). ในทางตรงกันข้าม ไซต์เอนแฮนเซอร์ส่วนใหญ่แสดงรูปแบบที่ชัดเจนของโมทีฟซึ่งมีผลผูกพันการถอดรหัส (TF) ระหว่างเฟสหน่วยความจำที่ต่างกัน สิ่งที่น่าสนใจคือ รูปแบบที่แสดงออกอย่างแพร่หลายจาก Jun Proto-Oncogene, Ap-1 Transcription Factor Subunit (เช่น Jun-Ap1) และกลุ่ม Regulatory Factor X (Rfx) ของ TFs ได้รับการเสริมสมรรถนะอย่างมีนัยสำคัญหลังจากระยะเริ่มต้นของ การเข้ารหัส (Extended Data รูปที่ 2e) ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าคอมเพล็กซ์ Jun-Ap1 มีบทบาทสำคัญในการเลือกเอนแฮนเซอร์ และอาจทำหน้าที่เป็น TF ผู้บุกเบิกเพื่อกำหนดไซต์ที่เสริมประสิทธิภาพในระหว่างการพัฒนาสมองและกิจกรรมของเซลล์ประสาท12,24 การค้นพบนี้สอดคล้องกับข้อมูลของเราที่แสดงตำแหน่งแฝง/primed ที่มีเปอร์เซ็นต์สูงในสถานะฐาน (รูปที่ 2f, Extended Data รูปที่ 2c, d) ดังนั้น ดูเหมือนว่ากิจกรรมของเซลล์ประสาทอาจกระตุ้นการเชื่อมโยงของ Jun-Ap1 กับเอนแฮนเซอร์แฝง ซึ่งจากนั้นจะคัดเลือกตัวดัดแปลงโครมาตินที่กระตุ้นการเสริมที่แฝงอยู่ ในทำนองเดียวกัน การเสริมคุณค่าของปัจจัยการถอดความ Yin Yang 1 (Yy1) นั้นมีเฉพาะในสารเพิ่มประสิทธิภาพจากรัฐต้นและปลายเท่านั้น แสดงให้เห็นว่าองค์กรที่ส่งเสริมและส่งเสริมเป็นกระบวนการที่กระตือรือร้นของหน่วยความจำการก่อตัว ดังที่มีรายงานเมื่อไม่นานนี้ว่า Yy1 เอื้อต่อการก่อตัวของปฏิสัมพันธ์ระยะยาวนี้25 โดยรวมแล้ว ข้อมูลนี้ชี้ให้เห็นว่าระยะเริ่มต้นของหน่วยความจำการก่อตัวเปลี่ยนแปลงแนวความสามารถในการเข้าถึงของโครมาตินในเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้น โดยการเปลี่ยนแปลงที่คงอยู่ยาวนานเกิดขึ้นอย่างเด่นชัดภายในบริเวณเอนแฮนเซอร์

การเปลี่ยนแปลงแบบไดนามิกในสถาปัตยกรรมนิวเคลียร์เชิงพื้นที่และการเข้าถึงโครมาตินในช่วงเริ่มต้นหน่วยความจำการก่อตัวสอดคล้องกับความถี่การโต้ตอบของโปรโมเตอร์ที่เพิ่มขึ้นระหว่างหน่วยความจำจำ

สถาปัตยกรรม 3D นิวเคลียร์กำลังเกิดขึ้นในฐานะปัจจัยสำคัญในการควบคุมการแสดงออกของยีนแบบไดนามิกในหน้าที่ของเซลล์ประสาทต่างๆ26–28 ดังนั้นเราจึงสนใจที่จะอธิบายการเปลี่ยนแปลงที่แม่นยำที่เกิดขึ้นในการจัดโครงสร้างโครมาตินเชิงพื้นที่ระหว่างหน่วยความจำการก่อตัวและการรวม เราสร้างข้อมูล Hi-C จากสถานะฐานและ eYFP บวกกับเซลล์ประสาทที่แท็ก (ช่วงต้นและ - ปลาย ตารางเสริม 5) โครมาตินถูกแยกออกเป็นสองส่วนย่อยของนิวเคลียสที่แตกต่างกันเชิงพื้นที่ คือ 'A' และ 'B' ซึ่งสอดคล้องกับโครมาตินที่ออกฤทธิ์และไม่ได้ใช้งานการถอดรหัสตามลำดับ 15, 16,26 หลักฐานเบื้องต้นชี้ให้เห็นว่ากิจกรรมของเซลล์ประสาทและการส่งสัญญาณภายนอกอาจกระตุ้นให้เกิดการจัดระเบียบใหม่ของสถาปัตยกรรม 3D -chromatin14,27,28 การวิเคราะห์สถานะช่องของเรา 15, 16,26 (รูปที่ 3a–c) เปิดเผยการปรับตำแหน่งของกลุ่มโครมาตินขนาดใหญ่ใหม่จากที่ไม่ใช้งาน (B) เป็นสภาพแวดล้อมที่อนุญาต (A) (และในทางกลับกัน) ในช่วงเริ่มต้นและช่วงปลายของหน่วยความจำการก่อตัว (212 ส่วนเปลี่ยนจาก A เป็น B, 127 จาก B เป็น A, ขนาดเฉลี่ย ~ 436Kbp) ที่น่าสนใจคือ 52 เปอร์เซ็นต์ของภูมิภาคในระยะแรกที่เปลี่ยนจาก B เป็น A ยังคงรักษาสถานะนั้นไว้ในระยะสุดท้าย (เช่น ยังคงอยู่ในสถานะ A รูปที่ 3b,c; ตารางเพิ่มเติม 6) นอกจากนี้ เกือบทุกภูมิภาคเหล่านี้ทับซ้อนกับ DAR ที่ได้รับจากการวิเคราะห์ ATAC-seq ของเรา ซึ่งยืนยันการเปลี่ยนช่องย่อยจากสภาพแวดล้อมที่ไม่ใช้งานเป็นสภาพแวดล้อมที่อนุญาต (รูปที่ 3d) ข้อมูลนี้บ่งชี้ว่า loci บางส่วนได้รับการสลับช่องย่อยตามขั้นตอนหน่วยความจำที่แตกต่างกัน ดังนั้นจึงอาจส่งผลต่อการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติและการทำงานของเซลล์ประสาทในระยะยาวหลังจากการเปิดใช้งานครั้งแรก

ในขณะที่ข้อมูล Hi-C ของเราแนะนำการปรับโครงสร้างองค์กรขนาดใหญ่ แต่ก็ยังไม่ชัดเจนว่าการปรับแนวใหม่นี้เปิดใช้งานการโต้ตอบของรายการเพลงโปรโมเตอร์-ตัวเพิ่มประสิทธิภาพที่แปลกใหม่และการปรับแต่งโปรแกรมการถอดเสียงแบบต่างๆ อย่างละเอียดหรือไม่ (รูปที่ 3e) ด้วยการใช้เทคนิคโปรโมเตอร์-แคปเจอร์ Hi-C (pc-HiC) เราศึกษาการเปลี่ยนแปลงที่แม่นยำซึ่งเกิดขึ้นในปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์-ตัวเสริมระหว่างกระบวนการหน่วยความจำการก่อตัวและการเรียกคืน สำหรับการศึกษานี้ เราใช้ "เหยื่อ" ที่ออกแบบเองซึ่งกำหนดเป้าหมายผู้สนับสนุน ~5000 ราย29 ตามข้อตกลงกับสิ่งพิมพ์ก่อนหน้า29 เราตรวจพบปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์-ตัวเสริมสำคัญ ~19,000 (ต่อกลุ่ม) ที่มีนัยสำคัญ (67.5 เปอร์เซ็นต์ ) และปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์-โปรโมเตอร์ (46.2 เปอร์เซ็นต์ ) (Extended Data รูปที่ 3a,b)

เนื่องจากโปรโมเตอร์ในสมองของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอาจอยู่ภายใต้การควบคุมขององค์ประกอบด้านกฎระเบียบต่างๆ14,30,31 เราจึงวิเคราะห์การทับซ้อนกันระหว่างสารเพิ่มประสิทธิภาพที่มีปฏิสัมพันธ์ทั้งหมดและโปรโมเตอร์ตามลำดับ เราพบว่าในระหว่างแต่ละหน่วยความจำระยะ โปรโมเตอร์เดียวกันโต้ตอบบ่อยขึ้นกับชุดย่อยของเอนแฮนเซอร์ที่แตกต่างกัน (เช่น เฉพาะ, Basal – 3243, Early - 7602, Late - 7028, Reactivated – 7244; รูปที่ 4a,b; Extended Data รูปที่. 3c; ตารางเสริม 7) ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับการตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นว่าสารเพิ่มคุณภาพหลายตัวที่อยู่รอบยีนหลายตัว (c-Fos และ Arc) มีความสำคัญต่อการกระตุ้นของพวกมัน และความถี่ในการปฏิสัมพันธ์ของพวกมันกับโปรโมเตอร์ตามลำดับจะเปลี่ยนแปลงไปเพื่อตอบสนองต่อสารเปลี่ยนขั้วต่างๆ ในเซลล์ประสาทที่เพาะเลี้ยง31 นอกจากนี้เรายังระบุส่วนย่อยของการโต้ตอบที่โปรโมเตอร์มีปฏิสัมพันธ์กับตัวเพิ่มประสิทธิภาพเดียวกันในที่แตกต่างกันหน่วยความจำเฟส (เช่น ทั่วไป ~31 เปอร์เซ็นต์ของการโต้ตอบทั้งหมด; ตารางเสริม 7) นอกจากนี้ เซลล์ประสาทที่กระตุ้นใหม่ยังแสดงคะแนนการโต้ตอบที่แข็งแกร่งกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (ตามที่คำนวณโดยชิคาโก, รูปที่ 4b; Extended Data รูปที่ 3d) ดังนั้น แม้ว่าจำนวนการโต้ตอบที่ไม่ซ้ำจะใกล้เคียงกันในช่วงแรกๆ ช่วงปลายๆ และช่วงที่กระตุ้นใหม่ คะแนนการโต้ตอบที่แข็งแกร่งกว่าบ่งชี้ว่าการโต้ตอบระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเพิ่มประสิทธิภาพจำเพาะเกิดขึ้นบ่อยกว่าระหว่างหน่วยความจำ

จำ. แนวคิดนี้ได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติมโดยการทดลอง 3C โดยมีไพรเมอร์ที่ออกแบบมาเพื่อวัดความถี่ของปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอนแฮนเซอร์ที่เลือก (E) และโปรโมเตอร์ของยีน (P) ที่เข้ารหัสสำหรับปัจจัยการเริ่มต้นการแปลยูคาริโอต 3 ยูนิตย่อย D (Eif3d) หรือตัวรับกลูตาเมต, ไอโอโนทรอปิก, ไคเนต 3 (Grik3) (รูปที่ 4c) ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าเซลล์ประสาทที่ถูกกระตุ้นใหม่มีความถี่การโต้ตอบเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญระหว่างโปรโมเตอร์ Eif3d และเอนแฮนเซอร์ที่เลือก เมื่อเทียบกับประชากรอื่นๆ (รูปที่ 4c) โดยรวมแล้ว ข้อมูลนี้บ่งชี้ว่าการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเสริมนั้นเกิดขึ้นบ่อยขึ้นในช่วงหน่วยความจำจำ.

ต่อไป เราถามว่าการโต้ตอบระยะไกลแบบไดนามิกที่ระบุผ่าน pc-HiC นั้นสอดคล้องกับบริเวณโครมาตินที่เข้าถึงได้มากขึ้นหรือไม่ ตามที่กำหนดผ่าน ATAC-seq สิ่งนี้จะยืนยันว่าการเข้าถึงที่เพิ่มขึ้นนั้นมีผลที่ตามมาในการทำให้เกิดปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเสริมใหม่ เพื่อให้บรรลุสิ่งนี้ เราเปรียบเทียบการทับซ้อนระหว่างตัวเสริมการโต้ตอบในประชากรเซลล์แต่ละเซลล์กับ DAR (ที่สังเกตได้) หรือชุดสุ่มของตำแหน่งจีโนมที่เข้าถึงได้ (ที่คาดไว้) การวิเคราะห์ของเราเผยให้เห็นความเหลื่อมล้ำกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง DAR ทั้งสองที่ได้รับในเซลล์ประสาทที่กระตุ้นก่อนวัยอันควร และได้รับ DAR อย่างเสถียรด้วยตัวเพิ่มประสิทธิภาพการโต้ตอบ ในประชากรเซลล์ทั้งหมด (All Ps < 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 3e)="" ในทางตรงกันข้าม="">หน่วยความจำการรวมและการเปิดใช้งานใหม่ไม่ได้ทับซ้อนกับเอนแฮนเซอร์การโต้ตอบอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3e ข้อมูลที่ขยาย) เมื่อรวมกันแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการเข้าถึงได้ระหว่างการเข้ารหัสหน่วยความจำเป็นเหตุการณ์ไพรม์ และตำแหน่งไพรม์เหล่านี้มีส่วนร่วมในการโต้ตอบระหว่างโปรโมเตอร์และตัวเสริมการทำงานของ de-novo ในช่วงต่อมาของหน่วยความจำรูปแบบ. ภูมิทัศน์แบบไดนามิกนี้แสดงให้เห็นโดยการแสดงภาพบริเวณจีโนมรอบยีนปัจจัยเริ่มต้นการแปลยูคาริโอต 5 ยูนิตย่อย A (Eif5a) (รูปที่ 4d) การผ่าโมเลกุลชั่วคราวของอายุเอ็นแกรมนี้เน้นว่าการประสานรองพื้นของสถานะ epigenetic ของเซลล์ในระหว่างหน่วยความจำการเข้ารหัสและการรวมข้อมูลช่วยอำนวยความสะดวกในการโต้ตอบระยะยาวระหว่างการเปิดใช้งานอีกครั้ง