ส่วนที่ 1: ปริมาณแมกนีเซียมที่ไหลออกจากเซลล์ Drosophila Kenyon มีความสำคัญต่อความจำระยะยาวแบบปกติและแบบควบคุมอาหาร

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:Ali.ma@wecistanche.com

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อส่วน2

Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D Jovanoski1, Hiroaki Miki2, สก็อตต์ แวดเดลล์1*

1Centre for Neural Circuits and Behaviour, The University of Oxford, Tinsley Building, Oxford, สหราชอาณาจักร; 2ภาควิชาระเบียบเซลลูลาร์ สถาบันวิจัยโรคจุลินทรีย์ มหาวิทยาลัยโอซาก้า ซุยตะ ประเทศญี่ปุ่น

บทคัดย่อ อาหารเสริมแมกนีเซียม (Mg2 plus ) สามารถเสริมได้หน่วยความจำในหนูอายุน้อยและวัยชราหน่วยความจำ- การเพิ่มความจุถูกกำหนดโดยส่วนใหญ่เพื่อเพิ่มความหนาแน่น synaptic ของ hippocampal และการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของหน่วยย่อย NR2B ของตัวรับกลูตาเมตประเภท NMDA ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าการป้อน Mg2 บวกยังช่วยเพิ่มในระยะยาวหน่วยความจำในแมลงหวี่ Normal และ Mg2 plus - ปรับปรุง flyหน่วยความจำปรากฏเป็นอิสระจากตัวรับ NMDA ในร่างกายของเห็ด และต้องการการแสดงออกของตัวขนส่ง Mg2 ชนิด CNNM ที่อนุรักษ์ไว้บวก -efflux ที่อนุรักษ์ไว้ซึ่งเข้ารหัสโดยยีนที่ไม่ขยาย (uex) UEX ประกอบด้วยโดเมนความคล้ายคลึงที่จับกับนิวคลีโอไทด์ที่เป็นวัฏจักรสมมุติและการกลายพันธุ์แยกบทบาทที่สำคัญสำหรับ uex ออกจากฟังก์ชันในหน่วยความจำ. นอกจากนี้ การแปล UEX ในร่างกายของเห็ด Kenyon cells (KCs) จะถูกเปลี่ยนแปลงในหน่วยความจำ- แมลงวันที่มีข้อบกพร่องซึ่งมีการกลายพันธุ์ในยีนที่เกี่ยวข้องกับแคมป์ ภาพแสดงการทำงานแนะนำว่าจำเป็นต้องมีการไหลออกที่ขึ้นกับ UEX สำหรับการรักษาจังหวะช้าของ KC Mg2 plus เราขอเสนอว่า Mg2 plus efflux ของเซลล์ประสาทที่มีการควบคุมนั้นมีความสำคัญต่อภาวะปกติและ Mg2 plus ที่เสริมประสิทธิภาพหน่วยความจำ.

คลิกเพื่อร้านขายวิตามิน Cistanche และ Cistanche สำหรับหน่วยความจำ

บทนำ

แมกนีเซียม (Mg2 plus ) มีบทบาทสำคัญในการเผาผลาญของเซลล์และถือเป็นปัจจัยร่วมที่จำเป็นสำหรับเอนไซม์มากกว่า 350 ตัว (Romani and Scarpa, 2000; Vink and Nechifor, 2011) ด้วยเหตุนี้ การเปลี่ยนแปลงของ Mg2 บวกกับสภาวะสมดุลจึงสัมพันธ์กับภาวะทางคลินิกที่หลากหลาย รวมถึงอาการที่ส่งผลต่อระบบประสาท เช่น โรคต้อหิน (DeToma et al., 2014), โรคพาร์กินสัน (Hermosura et al., 2005; Hermosura and Garruto, 2007; Lin et al., 2014; Shindo et al., 2016), โรคอัลไซเมอร์ (Andra´si et al., 2000; Andra´si et al., 2005; Cilliler et al., 2007; Durlach et al. ., 1997; Glick, 1990; Lemke, 1995; Chui et al., 2011; Vural et al., 2010), ความวิตกกังวล (Sartori et al., 2012), ภาวะซึมเศร้า (Whittle et al., 2011; Murck, 2002; Murck, 2013; Rasmussen et al., 1990; Ghafari et al., 2015) และความพิการทางสติปัญญา (Arjona et al., 2014)

น่าแปลกใจที่การเพิ่ม Mg2 ของสมองบวกด้วยการรับประทานอาหารสามารถเพิ่มความยืดหยุ่นของเส้นประสาทและหน่วยความจำประสิทธิภาพของหนูอายุน้อยและอายุมาก วัดจากพฤติกรรมที่หลากหลาย (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013) นอกจากนี้ Mg2 ที่เพิ่มขึ้นบวกกับการขาดดุลทางปัญญาที่ลดลงในรูปแบบเมาส์ของโรคอัลไซเมอร์ (Li et al., 2013) และเพิ่มการสูญพันธุ์ของความทรงจำที่น่ากลัว (Abumaria et al., 2011) ผลประโยชน์ที่เห็นได้ชัดเหล่านี้นำไปสู่ข้อเสนอว่าอาหาร Mg2 plus อาจมีคุณค่าในการรักษาสำหรับผู้ป่วยที่มีความหลากหลายของหน่วยความจำปัญหาที่เกี่ยวข้อง (Billard, 2011).

แม้จะมีไซต์ที่มีศักยภาพจำนวนมากของ Mg2 บวกกับการกระทำในสมอง แต่หน่วยความจำ- การเพิ่มคุณสมบัติในหนูส่วนใหญ่เกิดจากการเพิ่มความหนาแน่นของไซแนปติกของฮิปโปแคมปัสและกิจกรรมของ N-methyl-D-aspartate glutamate receptors (NMDARs) Extracellular Mg2 plus บล็อกช่องรูพรุนของ NMDAR และด้วยเหตุนี้จึงยับยั้งทางเดินของไอออนอื่นๆ (Mayer et al., 1984; Digest สุภาษิตสุภาษิตที่ว่า 'คุณคือสิ่งที่คุณกิน' สรุปแนวคิดที่ว่าอาหารของเราสามารถมีอิทธิพลต่อทั้งจิตใจและจิตใจของเราได้อย่างสมบูรณ์ สุขภาพร่างกาย เรารู้ว่าอาหารที่ดีต่อหัวใจ เช่น ถั่ว มันปลา และผลเบอร์รี่ก็มีประโยชน์ต่อสมองเช่นกัน เรารู้เช่นกันว่าวิตามินและแร่ธาตุจำเป็นสำหรับการมีสุขภาพที่ดีโดยรวม แต่มีหลักฐานอะไรบ้าง ว่าการเพิ่มปริมาณวิตามินหรือแร่ธาตุที่เฉพาะเจาะจงสามารถช่วยเพิ่มพลังสมองของคุณหรือไม่?

แม้ว่ามันอาจจะฟังดูดีเกินกว่าจะเป็นจริง แต่ก็มีหลักฐานบางอย่างที่แสดงว่าเป็นกรณีนี้สำหรับแร่ธาตุอย่างน้อยหนึ่งอย่าง แมกนีเซียม การศึกษาในสัตว์ฟันแทะได้แสดงให้เห็นว่าการเติมแมกนีเซียมเสริมในอาหารช่วยปรับปรุงว่าสัตว์เหล่านี้ทำงานด้านความจำได้ดีเพียงใด สัตว์ทั้งเด็กและผู้ใหญ่ได้รับประโยชน์จากแมกนีเซียมเพิ่มเติม แม้แต่หนูสูงอายุที่มีอาการคล้ายกับโรคอัลไซเมอร์ก็มีอาการน้อยลงหน่วยความจำสูญเสียเมื่อได้รับอาหารเสริมแมกนีเซียม แต่แล้วสายพันธุ์อื่นล่ะ?

วูและคณะ ตอนนี้แสดงว่าอาหารเสริมแมกนีเซียมยังช่วยเพิ่มประสิทธิภาพหน่วยความจำในแมลงวันผลไม้ แมลงวันกลุ่มหนึ่งได้รับ cornmeal มาตรฐานเป็นเวลาหลายวัน ในขณะที่อีกกลุ่มได้รับ cornmeal เสริมด้วยแมกนีเซียม จากนั้นทั้งสองกลุ่มได้รับการฝึกอบรมให้เชื่อมโยงกลิ่นกับรางวัลอาหาร แมลงวันที่ได้รับแมกนีเซียมเกินมาแสดงอาการดีขึ้นหน่วยความจำสำหรับกลิ่นเมื่อทดสอบ 24 ชั่วโมงหลังการฝึก

วูและคณะ แสดงว่าแมกนีเซียมดีขึ้นหน่วยความจำในแมลงวันโดยใช้กลไกที่แตกต่างจากที่เคยรายงานไว้สำหรับหนู ในสัตว์ฟันแทะ แมกนีเซียมเพิ่มระดับของโปรตีนตัวรับสำหรับสารเคมีในสมองที่เรียกว่ากลูตาเมต ในทางตรงกันข้าม แมลงวันผลไม้หน่วยความจำการเพิ่มขึ้นอยู่กับโปรตีนที่ขนส่งแมกนีเซียมออกจากเซลล์ประสาท แมลงวันกลายพันธุ์ที่ไม่มีตัวขนส่งนี้แสดงความจำเสื่อม ต่างจากแมลงวันทั่วไปตรงที่แมลงวันไม่มีขนย้ายแสดงว่าความจำไม่ดีขึ้นหลังจากรับประทานอาหารที่อุดมด้วยแมกนีเซียม ผลการวิจัยชี้ให้เห็นว่าผู้ขนส่งอาจช่วยปรับระดับแมกนีเซียมภายในเซลล์สมองเพื่อตอบสนองต่อการทำงานของระบบประสาท

มนุษย์ผลิตสารลำเลียงแมกนีเซียมสี่สายพันธุ์ แต่ละชนิดเข้ารหัสด้วยยีนที่แตกต่างกัน หนึ่งในผู้ขนส่งเหล่านี้มีส่วนเกี่ยวข้องกับการพัฒนาสมองแล้ว การค้นพบของ Wu et al. แนะนำว่าผู้ขนส่งอาจทำหน้าที่ในสมองของผู้ใหญ่เพื่อโน้มน้าวการรับรู้ จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทดสอบว่าการกำหนดเป้าหมายไปยังผู้ขนส่งแมกนีเซียมสามารถรักษาสัญญาได้หรือไม่?หน่วยความจำความบกพร่อง

เบกเกอร์สและสตีเวนส์ 2536; Jahr และ Stevens, 1990; โนวักและคณะ, 1984) ที่สำคัญ การสลับขั้วของเซลล์ประสาทก่อนหน้า ซึ่งขับเคลื่อนโดยตัวรับส่งสัญญาณอื่น ๆ จะต้องปล่อยบล็อก Mg2 plus บน NMDAR และอนุญาตให้ Ca2 เกตที่มีกลูตาเมตบวกกับการไหลเข้า ดังนั้น NMDAR จึงมีบทบาทสำคัญในการทำให้เป็นพลาสติกของเซลล์ประสาทในฐานะเครื่องตรวจจับความบังเอิญแบบ Hebbian ระดับความสูงเฉียบพลันของ Mg2 นอกเซลล์บวกความเข้มข้น ([Mg2 บวก ] e) ภายในช่วงทางสรีรวิทยา (0.8–1.2 mM) สามารถต่อต้านการเหนี่ยวนำของศักยภาพระยะยาวที่ขึ้นกับ NMDAR (Dunwiddie และ Lynch, 1979; Malenka et al., 1992; Malenka และ Nicoll, 1993; Slutsky et al., 2004) ในทางตรงกันข้าม การเพิ่ม [Mg2 บวก ]e เป็นเวลาหลายชั่วโมงในวัฒนธรรมของเซลล์ประสาทนำไปสู่การปรับปรุงกระแสที่เป็นสื่อกลางของ NMDAR และการอำนวยความสะดวกในการแสดงออกของ LTP (Slutsky et al., 2004) ผลที่เพิ่มขึ้นของการเพิ่มขึ้น [Mg2 plus ]e ยังพบเห็นได้ในร่างกายในสมองของหนูที่เลี้ยงด้วย Mg2 plus -L-threonate (Slutsky et al., 2010) วงจรเซลล์ประสาทของฮิปโปแคมปัสได้รับการปั้นแบบ homeostatic (Turrigiano, 2008) เพื่อรองรับการเพิ่มขึ้น [Mg2 plus ]e โดยการเพิ่มการควบคุมการแสดงออกของ NMDAR ที่ประกอบด้วยหน่วยย่อย NR2B (Slutsky et al., 2004; Slutsky et al., 2010) ความหนาแน่นที่สูงขึ้นของไซแนปส์ของฮิปโปแคมปัสที่มี NR2B ที่มี NMDAR นั้นเชื่อว่าจะชดเชยการเพิ่มขึ้นเรื้อรังของ [Mg2 บวก ] e โดยการเพิ่มกระแส NMDAR ระหว่างการยิงแบบระเบิด เพื่อสนับสนุนโมเดลนี้ หนูที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมให้แสดงออก NR2B มากเกินไปจะแสดง LTP ของฮิปโปแคมปัสและพฤติกรรมที่ดีขึ้นหน่วยความจำ(Tang et al., 1999).

ดมกลิ่นหน่วยความจำใน Drosophila เกี่ยวข้องกับกลไก heterosynaptic ที่ขับเคลื่อนโดยการเสริมเซลล์ประสาท dopaminergic ซึ่งส่งผลให้เกิดภาวะซึมเศร้า presynaptic ของการเชื่อมต่อ cholinergic ระหว่างเซลล์ Kenyon ที่กระตุ้นกลิ่น (MB) กับเซลล์ Kenyon (KCs) และเซลล์ประสาทเอาท์พุทของเห็ดปลายน้ำ (MBONs) (Schwaerzel et al., 2003 ; Aso et al., 2010; Aso et al., 2012; Claridge-Chang et al., 2009; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Plac¸ais et al., 2013; Owald et al. ., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Oswald and Waddell, 2015) นอกจากนี้ ข้อมูลการดมกลิ่นยังถูกส่งไปยัง KCs โดยการส่งผ่านโคลิเนอร์จิกจากเซลล์ประสาทการดมกลิ่น (Yasuyama et al., 2002; Leiss et al., 2009) แม้ว่าจะเป็นไปได้ว่ากลูตาเมตถูกส่งไปยังเครือข่าย MB ผ่านเส้นทางที่ยังไม่ได้ระบุ ปัจจุบันยังไม่มีตำแหน่งที่ชัดเจนสำหรับความเป็นพลาสติกที่ขึ้นกับ NMDAR ในสถาปัตยกรรมที่รู้จักของชั้นอินพุตหรือเอาต์พุต cholinergic (Barnstedt et al., 2016 ). แมลงวันจึงให้แบบจำลองที่เป็นไปได้ในการตรวจสอบกลไกอื่นๆ ที่อาหาร Mg2 plus อาจช่วยเพิ่มหน่วยความจำ.

ผลการเสริมแรงของโดปามีนขึ้นอยู่กับตัวรับโดปามีนชนิด Dop1R D1- (Kim et al., 2007; Qin et al., 2012; Handler et al., 2019) ซึ่งประกอบกันในเชิงบวกกับการผลิต cAMP (Tomchik และ Davis, 2009; Boto et al., 2014) นอกจากนี้ การศึกษาในช่วงต้นของแมลงหวี่ได้ระบุ dunce และ rutabaga ที่เข้ารหัส cAMP phosphodiesterase และ type I Ca2 plus -stimulated adenylate cyclase ตามลำดับ เพื่อเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการดมกลิ่นหน่วยความจำ(Dudai et al., 1976; Byers et al., 1981; Dudai and Zvi, 1984; Chen et al., 1986; Livingstone et al., 1984; Levin et al., 1992) การศึกษาในเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้แสดงให้เห็นว่าฮอร์โมนหรือสารที่เพิ่มระดับ cAMP ของเซลล์มักจะกระตุ้นการอัดขึ้นรูปที่ขึ้นกับ Na บวกของ Mg2 plus อย่างมีนัยสำคัญในพื้นที่นอกเซลล์ (Romani and Scarpa, 1990b; Romani and Scarpa, 1990a; Romani and Scarpa, 2000; Vink และ Nechifor, 2011; Vormann และ Gu¨nther, 1987) อย่างไรก็ตาม ยังไม่ชัดเจนว่า Mg2 plus extrusion มีบทบาทในการประมวลผลในหน่วยความจำหรือไม่

ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่าแมลงหวี่ในระยะยาวหน่วยความจำ(LTM) สามารถเสริมได้ด้วยอาหารเสริม Mg2 plus เราพบว่ายีนที่ไม่ขยาย (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) ซึ่งเข้ารหัสออร์โธล็อกแมลงบินที่ใช้งานได้ของโปรตีน Cyclin M2 Mg2 plus -efflux transporter (CNNM) ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมนั้นมีความสำคัญต่อหน่วยความจำ-เสริมคุณสมบัติของ Mg2 plus ฟังก์ชัน UEX ใน MB KC จำเป็นสำหรับ LTM และการกู้คืนการทำงานของ uex เผยให้เห็นว่า MB เป็นไซต์หลักของการปรับปรุงหน่วยความจำที่ขึ้นกับ Mg2 plus เมแทบอลิซึมของแคมป์ที่เปลี่ยนแปลงอย่างเรื้อรังโดยการทำให้เกิดการกลายพันธุ์ในยีน dnc หรือ rut จะเปลี่ยนการแปลเป็นภาษาท้องถิ่นของ UEX นอกจากนี้ การกลายพันธุ์โดเมนโฮโมโลยีการจับนิวคลีโอไทด์ตามวัฏจักรที่อนุรักษ์ไว้ (CNBH) ที่อนุรักษ์ไว้ใน UEX จะแยกบทบาทสำคัญของ uex ออกจากการทำงานในหน่วยความจำ Mg2 plus efflux ที่ขับเคลื่อนด้วย UEX จำเป็นสำหรับการบำรุงรักษาจังหวะช้าของระดับ KC Mg2 plus ที่แนะนำบทบาทที่เป็นไปได้สำหรับการประมวลผล Mg2 plus flux ในหน่วยความจำ

ผลลัพธ์

การให้อาหาร Mg2 plus ช่วยเพิ่ม LTM ของแมลงวันป่า

การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่าการให้อาหารแก่หนูด้วยอาหารที่มีความเข้มข้นสูงของ Mg2 บวก - ช่วยเพิ่มความสามารถในการเรียนรู้และความจำของพวกมัน (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Abumaria et al., 2011; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). ดังนั้นเราจึงทดสอบว่ามีผลกระทบที่คล้ายกันในแมลงวันหรือไม่โดยการให้อาหารที่มีความเข้มข้นสูงของ Mg2 plus ก่อนการฝึก น่าแปลกที่แมลงวันป่าที่กินอาหารเป็นเวลา 4 วันก่อนการฝึกด้วยอาหารที่เสริมด้วยแมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) เพิ่มเติมแสดงประสิทธิภาพของหน่วยความจำ 24 ชั่วโมงที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ การเพิ่มประสิทธิภาพของหน่วยความจำขึ้นอยู่กับความเข้มข้นและจะสูงสุดเมื่ออาหารถูกเสริมด้วย 80 mM MgCl2 (รูปที่ 1A) ประสิทธิภาพของหน่วยความจำในทันทีไม่ได้เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 1B) ผลการเพิ่มประสิทธิภาพของ MgCl2 ยังพบเห็นได้ในแมลงวันที่เลี้ยงด้วยแมกนีเซียมซัลเฟต (MgSO4) แต่ไม่ใช่แคลเซียมคลอไรด์ (CaCl2) (รูปที่ 1C) นอกจากนี้ การให้อาหารแมลงวันเป็นเวลา 4 วันด้วยอาหารที่มีสตรอนเทียมคลอไรด์ 5 ถึง 80 มิลลิโมลาร์ (SrCl2) ส่งผลให้มีอัตราการตายและแมลงวันสูงที่รอดชีวิตจากการกินอาหาร SrCl2 ขนาด 5 มิลลิโมลาร์ ไม่ได้แสดงประสิทธิภาพของหน่วยความจำที่เพิ่มขึ้นในทันทีหรือ 24 ชั่วโมง (ไม่แสดงข้อมูล) . ดังนั้น ผลกระทบที่เพิ่มความจำจึงสามารถนำมาประกอบกับการเสริมอาหารของ divalent Mg2 plus ได้โดยเฉพาะ

Mg2 plus - เพิ่มหน่วยความจำโดยไม่ขึ้นกับ NMDAR ในตัวเห็ด

เนื่องจากแมกนีเซียม-แอล-ทรีโอเนตเพิ่มหน่วยความจำในหนูแรทมีความสัมพันธ์กับการเพิ่มการควบคุมของหน่วยย่อยฮิปโปแคมปัส NR2B ที่มี NMDAR (Slutsky et al., 2010) เราจึงทดสอบการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของตัวรับกลูตาเมตในแมลงวันที่ได้รับ MgCl2 การวิเคราะห์ RT-qPCR ไม่ได้เปิดเผยความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของ mRNA สำหรับตัวรับสมมุติ NMDA (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA) หรือ kainate-type (GluRIIA) ในหัวที่นำมาจากแมลงวันที่เลี้ยงเป็นเวลา 4 วันด้วย 80 mM MgCl2 เทียบกับที่เลี้ยงด้วย 1 mM MgCl2 (รูปที่ 1D)

ต่อไปเราทดสอบโดยตรงว่าหน่วยความจำที่เสริม Mg2 บวก - จำเป็นต้องใช้ฟังก์ชัน NMDAR หรือไม่โดยการลดการแสดงออกของยีน Nmdar1 หรือ Nmdar2 โดยใช้การรบกวน RNA ที่ขับเคลื่อนด้วย UAS ดัดแปลงพันธุกรรม

รูปที่ 1 อาหารเสริม Mg2 plus ช่วยเพิ่มความจำระยะยาวของแมลงหวี่ (A) แมลงวันป่าได้รับการฝึกอบรมและทดสอบหน่วยความจำที่น่ารับประทานเป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจากกินอาหารโดยสมบูรณ์ด้วยอาหารที่เสริมด้วย Mg2 plus เป็นเวลา 1-5 วัน หน่วยความจำได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญในแมลงวันที่เลี้ยงเป็นเวลา 4 วันด้วย 80 mM MgCl2 เมื่อเทียบกับที่เลี้ยงด้วย 1 mM 80 mM MgCl2 ให้ประสิทธิภาพที่สูงกว่า 50 mM หรือ 100 mM เล็กน้อย ดังนั้นจึงถือว่าเหมาะสมที่สุด (เครื่องหมายดอกจันหมายถึง p<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

เวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้มีเนื้อหาเพิ่มเติมต่อไปนี้สำหรับรูปที่ 1:

รูปที่ 1 การล้มลงของ N-methyl-D-aspartate glutamate receptor (NMDAR) ในร่างกายของเห็ดไม่ทำให้ Mg2 บวกกับหน่วยความจำที่ปรับปรุงแล้ว

(RNAi) โครงสร้าง (Dietzl et al., 2007; Perkins et al., 2015) จาก UAS-Nmdar1R- NAi อิสระสองเส้นและ UAS-Nmdar2RNAi สี่เส้นที่เราทดสอบ มีเพียงเส้นเดียว Nmdar1RNAi (BDSC 25941) เมื่อขับเคลื่อนในเซลล์ประสาททั้งหมดโดยเซลล์ประสาท Synaptobrevin (nSyb) -GAL4 มีประสิทธิภาพหน่วยความจำลดลง 24 ชั่วโมงอย่างมีนัยสำคัญ เช่น เมื่อเทียบกับแมลงวันควบคุมแบบเฮเทอโรไซกัส (รูปที่ 1—รูปที่ 1A) ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกที่เลือกสรรมากขึ้นของ UAS-Nmdar1RNAi นี้ใน ab KC ที่เกี่ยวข้องกับ LTM โดยใช้ c739-GAL4 ไม่ได้ทำให้ประสิทธิภาพหน่วยความจำ 24 ชั่วโมงลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1— รูปที่ 1B) ยิ่งกว่านั้น แมลงวันที่แสดง Nmdar1RNAi ในเซลล์ประสาท ab ยังคงรักษา Mg2 ที่แข็งแกร่งบวกกับหน่วยความจำที่ปรับปรุง (รูปที่ 1— รูปเสริม 1C) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าหน่วยความจำเสริม Mg2 บวกไม่เปลี่ยนแปลงการแสดงออกของตัวรับกลูตาเมต หรือต้องการฟังก์ชัน NMDAR ใน ab KCs

Mg2 บวกความเข้มข้นในเซลล์ประสาท ab เพิ่มขึ้นในแมลงวันที่ได้รับ Mg2 สูงบวก เราใช้ MagFRET ซึ่งเป็นเซ็นเซอร์ Mg2 plus เรืองแสงที่เข้ารหัสทางพันธุกรรมตัวแรก (Lindenburg et al., 2013) เพื่อทดสอบว่า Mg2 บวกกับการให้อาหารเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของ Mg2 ในเซลล์บวกหรือไม่ ([Mg2 บวก ]i) เราสร้างแมลงวันที่มีทรานส์ยีน UAS-MagFRET-1 และรวมเข้ากับ c739-GAL4 เพื่อแสดง MagFRET- 1 ใน ab KCs เราเปรียบเทียบสัญญาณ FRET ในสมองที่ตายตัวจาก c739; UAS-MagFRET-1 แมลงวันได้รับอาหาร MgCl2 ขนาด 1 mM หรือ 80 mM เป็นเวลา 4 วัน สัญญาณ MagFRET สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทั้งในหลักประกัน a และ b ของ ab KC ของแมลงวันที่เลี้ยงด้วย 80 mM มากกว่าสัญญาณที่เลี้ยงด้วย 1 mM (รูปที่ 1E) ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าการป้อน Mg ยกระดับเซลล์ประสาท [Mg2 plus ]i ด้วยความสัมพันธ์ของ MagFRET-1 (Kd=148 mM) และสัญญาณ FRET เพิ่มขึ้น ~50 เปอร์เซ็นต์เมื่อ Mg2 บวกการผูก (Lindenburg et al., 2013) เราประมาณการว่าการปรับปรุง ~8 เปอร์เซ็นต์ของ สัญญาณ MagFRET ที่วัดในแมลงวันที่ป้อน 80 mM MgCl2 สอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของ ab KC [Mg2 plus ]i โดยเฉลี่ย 50 mM

Mg2 plus transporter ชนิด CNNM ที่เข้ารหัสแบบไม่ขยายมีบทบาทในหน่วยความจำ

เราระบุ unextended (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) ว่าเป็น LTM กลิ่นที่น่ารับประทานที่ดัดแปลงยีนซึ่งเสริมด้วยรางวัลซูโครส แมลงวันที่มีการแทรก uexMI01943 MiMIC (Venken et al., 2011) แสดงให้เห็นข้อบกพร่องที่แข็งแกร่งในหน่วยความจำ 24 ชั่วโมง แต่ประสิทธิภาพทันทีหลังจากการฝึกอบรมไม่สามารถแยกแยะได้จากการควบคุมแบบไวด์ การวิเคราะห์รายละเอียดเพิ่มเติมของแมลงวัน uexMI01943 เผยให้เห็นหน่วยความจำที่เสื่อมลงอย่างต่อเนื่อง ซึ่งในตอนแรกมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญกับแมลงวันชนิดพันธุ์ป่า 12 ชั่วโมงหลังการฝึก (รูปที่ 2A) ไม่มีข้อบกพร่องของหน่วยความจำที่เห็นได้ชัดใน heterozygous uexMI01943/ บวกแมลงวัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอัลลีลเพศสมมุตินี้ด้อย

uex กระตุ้นความสนใจของเราเพราะมันเป็นออร์โธล็อกแมลงวันเดียวของยีน CNNM ของมนุษย์สี่ตัวที่เข้ารหัส Mg2 บวกกับตัวขนส่ง (Ishii et al., 2016) และยังมีโดเมน CNBH สมมุติที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างกับผู้ที่อยู่ในวงจรนิวคลีโอไทด์รั้วรอบขอบชิด ช่อง (Zagotta et al., 2003; Flynn et al., 2007; Kesters et al., 2015) การจัดแนวของลำดับ UEX ของกรดอะมิโน 834 กับ CNNM1-4 เผยให้เห็นการอนุรักษ์ลำดับที่สูงเป็นพิเศษด้วย CNNM2 และ CNNM4 ในโดเมน DUF21, คู่ CBS และ CNBH (รูปที่ 2—รูปที่เสริม 1A–C) ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่า UEX มีศักยภาพในการเชื่อมโยงผลการเสริมความจำของ Mg2 ในอาหารบวกกับความเป็นพลาสติกของเซลล์ประสาทที่ขึ้นกับค่าย

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >ห่างออกไป 230 kb ก่อนอื่นเรายืนยันตำแหน่ง MiMIC โดย PCR ผกผัน (Attrill et al., 2016) ที่สำคัญไม่พบการแทรก MiMIC เพิ่มเติมในแมลงวันเหล่านี้ ต่อไปเราทดสอบว่า uexMI01943 มีส่วนรับผิดชอบต่อข้อบกพร่องของหน่วยความจำหรือไม่โดยการเอาองค์ประกอบ MiMIC ออกอย่างแม่นยำโดยการตัดตอน Minos transposase-mediated (Arca` et al., 1997; รูปที่ 2— รูปเสริม 2A และ B) การลบ MiMIC ใน uexMI01943.ex1 และ uexMI01943.ex2 บินคืนประสิทธิภาพหน่วยความจำ 24 ชั่วโมงตามปกติ แสดงให้เห็นว่าจำเป็นต้องมีการแทรก MiMIC สำหรับ uexMI01943หน่วยความจำข้อบกพร่อง (รูปที่ 2C)

ทั้ง qRT-PCR ของ mRNA และการวิเคราะห์ western blot ของสารสกัดโปรตีนจากหัวแมลงวันล้มเหลวในการเปิดเผยความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในการแสดงออกของ uex/UEX ในแมลงวัน uexMI01943 ดังนั้นเราจึงใช้ CRISPR เพื่อแนะนำ codon หยุดในการเข้ารหัส exon ที่ห้าของ uex locus (รูปที่ 2B และรูปที่ 2—รูปที่ 2C เสริม) แมลงวันโฮโมไซกัสสำหรับการกลายพันธุ์ uexD ที่เกิดขึ้นนั้นไม่สามารถทำงานได้เมื่อโตเต็มวัย โดยจะตายที่ระยะตัวอ่อน ในทางตรงกันข้าม แมลงวัน heterozygous uexMI01943/uexD นั้นใช้ได้ แต่พวกมันกินได้ตลอด 24 ชั่วโมงหน่วยความจำมีความบกพร่องอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2D) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า uex เป็นยีนที่จำเป็น และ uexMI01943 เป็นอัลลีลไฮโปมอร์ฟิคที่ทำงานได้ของ uex

นอกจากนี้เรายังทดสอบสิ่งที่หลีกเลี่ยงหน่วยความจำประสิทธิภาพของแมลงวันกลายพันธุ์ uexMI01943 แมลงวัน Homozygous uexMI01943 ปรากฏขึ้นทันทีหน่วยความจำที่แยกไม่ออกจากกลุ่มควบคุมแบบเฮเทอโรไซกัสและแบบไวด์ (รูปที่ 2E) อย่างไรก็ตาม หน่วยความจำ 24 ชั่วโมงของพวกเขา เกิดขึ้นหลังจากการทดลองเว้นระยะห้าครั้ง (Tully et al., 1994; Jacob and Waddell, 2020) หรือการทดลองการอำนวยความสะดวกในการอดอาหารหนึ่งครั้ง (Hirano et al., 2013) มีความบกพร่องอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2E). การทดลองเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าแมลงวัน uexMI01943 นั้นโดยทั่วไปแล้วจะด้อยกว่าในเรื่องความสามารถในการสร้าง LTM เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น การวิเคราะห์ที่ตามมาทั้งหมดของหน่วยความจำในการศึกษานี้ใช้การปรับสภาพน้ำตาลที่น่ารับประทาน

รูปที่ 2 แมลงวันกลายพันธุ์ uexMI01943 มีข้อบกพร่องในระยะยาวหน่วยความจำ(แอลทีเอ็ม). (A) การทดสอบหน่วยความจำที่น่ารับประทานหลายครั้งหลังการฝึก แมลงวัน homozygous สำหรับ uexMI01943 มีข้อบกพร่องที่สำคัญในหน่วยความจำตั้งแต่ 12 ชั่วโมงหลังการฝึก เมื่อเทียบกับประสิทธิภาพของแมลงวัน heterozygous uexMI01943/ plus และแมลงวันกลุ่มควบคุมแบบป่า (p<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">หน่วยความจำข้อบกพร่องของ uexMI01943 (p<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

รูปที่ 2 ต่อ

เปรียบเทียบกับประสิทธิภาพของ heterozygous uexMI01943/ plus และแมลงวันควบคุมแบบ wild-type (p<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">หน่วยความจำไม่ได้รับผลกระทบจากแมลงวันกลายพันธุ์ homozygous uexMI01943

เวอร์ชันออนไลน์ของบทความนี้มีแหล่งข้อมูลต่อไปนี้และส่วนเสริมสำหรับรูปที่ 2:

แหล่งข้อมูล 1. ตารางการควบคุมระดับน้ำตาลและการดมกลิ่นสำหรับการทดลองเชิงพฤติกรรมทั้งหมดในต้นฉบับนี้

รูปที่ 1 การอนุรักษ์ UEX ด้วย orthologs

รูปที่ 2 รูปแบบการก่อสร้างสำหรับการตัดตอนของ uex Mino และการสร้างอัลลีล uexD