ส่วนที่ 1 Echinacoside ยับยั้งการปล่อยกลูตาเมตโดยการยับยั้งการป้อน Ca2 + ที่ขึ้นอยู่กับแรงดันไฟฟ้าและโปรตีนไคเนส C ในขั้วเส้นประสาทสมองของหนู

เฉิงเหว่ยลู่ 1,2, ซูหยูหลิน 1,2, ซูกวยหวง 1 และซูเจนหวัง 3,*

1 ภาควิชาวิสัญญีวิทยา, โรงพยาบาลฟาร์อีสเทิร์นเมโมเรียล, เขต Pan-Chiao, เมืองนิวไทเป 22060, ไต้หวัน; 22060 drluchengwei@gmail.com (C.W.L.); drlin1971@gmail.com (T.Y.L.);nskh9450n@yahoo.com.tw (เอส.เค.เอช.)

2 ภาควิชาวิศวกรรมเครื่องกลมหาวิทยาลัยหยวนเจ๋อเถาหยวน 32003 ไต้หวัน

3 คณะแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัยคาทอลิก Fu Jen เลขที่ 510 ถนนจงเจิ้งเขตซินจวงนิวไทเป 24205 ประเทศไต้หวัน

นามธรรม:ระบบกลูตาวัสดุอาจเกี่ยวข้องกับผลของการรักษาด้วยระบบประสาท Echinacoside ซึ่งเป็นฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ที่สกัดจากสมุนไพรจีนสมุนไพรจีนเฮอร์บา ซิสแตนเช่,มีผลป้องกันระบบประสาท การศึกษานี้ตรวจสอบผลของ echinacoside ต่อการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine-evoked ในขั้วเส้นประสาทสมองของหนู (synaptosomes) เอจินาโคไซด์ยับยั้งคา²⁺- ขึ้นอยู่กับ แต่ไม่ Ca²⁺- อิสระ 4-aminopyridine-evoked กลูตาเมตปล่อยในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น Echinacoside ยังลดการเพิ่มขึ้นของ 4-aminopyridine-evoked ใน Ca ที่ปราศจากไซโตพลาสซึม²⁺ความเข้มข้น แต่ไม่ได้เปลี่ยนแปลงศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ synaptosomal ผลการยับยั้งของ echinacoside ในการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine-evoked ถูกป้องกันโดย cu-conotoxin MVIIC ซึ่งเป็นตัวบล็อกสเปกตรัมกว้างของ Cav2.2 (N-type) และ Cav2.1 (P/ Q-type) แต่ไม่ไวต่อ Ca ภายในเซลล์ Ca²⁺ปล่อยสารยับยั้ง dantrolene และ 7-chloro-5-(2-คลอโรฟีนิล)-1,5-ไดไฮโดร-4,1-เบนโซไดอะซีปีน-2(3H)-หนึ่ง (CGP37157) นอกจากนี้ echinacoside ยังลดฟอสโฟรีเลชันที่เกิดจากโปรตีนไคเนส C ที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4-aminopyridine และสารยับยั้งโปรตีนไคเนสซีได้ยกเลิกผลของ echinacoside ต่อการปล่อยกลูตาเมต จากผลลัพธ์เหล่านี้เราขอแนะนําว่าผลการยับยั้งของ echinacoside ต่อการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากการเกิดมีความสัมพันธ์กับ Ca ที่ขึ้นอยู่กับแรงดันไฟฟ้าที่ลดลง²⁺การเข้าและการปราบปรามกิจกรรมโปรตีนไคเนสซีในภายหลัง

คำ:อิชินาโคไซด์; ปล่อยกลูตาเมต; ขั้วเส้นประสาทสมอง; Ca ที่ขึ้นกับแรงดันไฟฟ้า²+ ช่อง; โปรตีนไคเนส C ของโรคพาร์กินสัน, โรคอัลไซเมอร์, และการบดเคี้ยวของหลอดเลือดสมองกลาง[9-12]. อย่างไรก็ตามกลไกที่ echinacoside ก่อให้เกิดการป้องกันระบบประสาทยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์

สําหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

เอจินาโคไซด์ใน cistanche มีหลายฟังก์ชั่น

1. บทนํา

เอจินาโคไซด์เป็นฟีนิลธานอยด์ไกลโคไซด์ที่สําคัญที่มีอยู่ในเฮอร์บา ซิสแตนเช่ซึ่งเป็นยาแผนจีนที่รู้จักกันดีที่ใช้ในการรักษาอาการหลงลืมความอ่อนแอและท้องผูกเรื้อรัง [1]เอจินาโคไซด์มีฤทธิ์ทางชีวภาพต่าง ๆ เช่นสารต้านอนุมูลอิสระต้านการอักเสบต้านมะเร็งตับและการปรับภูมิคุ้มกัน [2–4] โดยเฉพาะอย่างยิ่งเอจินาโคไซด์มีผลป้องกันระบบประสาท; ตัวอย่างเช่นสามารถป้องกันภาวะพิษต่อระบบประสาทที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นหรือ neurotoxin ในเซลล์ประสาทเยื่อหุ้มสมองหนูปฐมภูมิเซลล์ neuroblastoma SH-SY5Y ของมนุษย์และเซลล์ pheochromocytoma (PC12) [5–8] อนึ่งเอจินาโคไซด์ลดทอนความเสียหายของสมองและปรับปรุงการทํางานของความรู้ความเข้าใจในรูปแบบสัตว์ของโรคพาร์กินสันโรคอัลไซเมอร์และการอุดตันของหลอดเลือดสมองกลาง [9–12] อย่างไรก็ตามกลไกที่เอจินาโคไซด์ก่อให้เกิดการป้องกันระบบประสาทยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์

การป้องกันระบบประสาทเป็นกระบวนการที่ซับซ้อนในการรักษาโครงสร้างเซลล์ประสาทและหน้าที่เมื่อดูถูกพิษ การลดความเป็นพิษต่อพิษของกลูตาเมตถือเป็นกลไกที่มีศักยภาพที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันระบบประสาทของสมอง กลูตาเมตซึ่งเป็นสารสื่อประสาทกรดอะมิโนกระตุ้นมีบทบาทสําคัญในการทํางานของสมองหลายอย่าง [13] อย่างไรก็ตามการยับยั้งการทํางานของตัวรับกลูตาเมตมากเกินไปภายใต้ความเข้มข้นของกลูตาเมตสูงทําให้เกิดการโอเวอร์โหลด Ca2 + ภายในเซลล์ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียการผลิตอนุมูลอิสระและการตายของเซลล์ประสาท [14,15] กระบวนการทางพยาธิวิทยานี้เกี่ยวข้องกับความผิดปกติของสมองจํานวนมากรวมถึงสมองขาดเลือดการบาดเจ็บที่สมองบาดแผลโรคลมชักและโรคทางระบบประสาท [16,17] ดังนั้นสารยับยั้งที่ปิดกั้นการส่งผ่านกลูตามาเตร์ริกพยาธิสรีรวิทยาจึงถือเป็นยาป้องกันระบบประสาทที่มีศักยภาพ ตัวอย่างที่โดดเด่นของสิ่งเหล่านี้คือคู่อริตัวรับกลูตาเมต [18,19]; อย่างไรก็ตามการทดลองทางคลินิกสําหรับยาเหล่านี้ล้มเหลวเนื่องจากผลกระทบน้อยลงและไม่พึงปรารถนาหรือแม้แต่ผลข้างเคียงที่เป็นพิษต่อเซลล์ [20,21] นอกเหนือจากการปิดล้อมตัวรับกลูตาเมตโดยตรงแล้วการยับยั้งการปล่อยกลูตาเมตอาจเป็นกลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพสําหรับการป้องกันระบบประสาท สารป้องกันระบบประสาทหลายชนิด (เช่น memantine และ riluzole) สามารถลดการปล่อยกลูตาเมตในเนื้อเยื่อสมองของหนู [22–24]

พิจารณาบทบาทของกลูตาเมตใน excitotoxicity และรายละเอียดการป้องกันระบบประสาทของเอจินาโคไซด์, การศึกษาในปัจจุบันใช้ขั้วประสาทที่แยกได้ (synaptosomes) บริสุทธิ์จากเปลือกสมองของหนูเพื่อตรวจสอบผลของเอจินาโคไซด์ในการปล่อยกลูตาเมตและสํารวจกลไกที่เป็นไปได้เพิ่มเติม การเตรียมขั้วประสาทที่แยกได้เป็นรูปแบบที่เป็นที่ยอมรับสําหรับการศึกษาการควบคุม presynaptic ของการปล่อยสารสื่อประสาทโดยยาเสพติดในกรณีที่ไม่มีผลกระทบ postynaptic ใด ๆ [25] ด้วยการใช้แบบจําลองนี้เราประเมินผลของเอจินาโคไซด์ในการปล่อยกลูตาเมต, ศักยภาพของเมมเบรน, การไหลเข้าของ presynaptic Ca2+ และกิจกรรมโปรตีนไคเนสซี จากการทบทวนวรรณกรรมของเรานี่เป็นรายงานฉบับแรกที่บันทึกกลไกที่เอจินาโคไซด์ยับยั้งการปล่อยกลูตาเมตภายนอกในระดับ presynaptic

Echinacoside สามารถป้องกันการเกิดออกซิเดชันได้

2. ผลลัพธ์

2.1.เอจินาโคไซด์ยับยั้งการปล่อยกลูตาเมต 4-Aminopyridine-Evoked จากขั้วเส้นประสาทสมองของหนูโดยการลดภาวะเซลล์เม็ดเลือดขาวจากตุ่ม

รูปที่ 1 แสดงผลกระทบที่ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเอจินาโคไซด์ในการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine-evoked จาก synaptosomes สมองของหนูบริสุทธิ์ ใน synaptosomes บ่มด้วย 1 mM CaCl2, 1 mM 4-aminopyridine ทําให้เกิดการปล่อยกลูตาเมต 7.4 ̆ 0.1 นาโนโมล / มก. / 5 นาทีซึ่งลดลง 1, 5, 10, 30 และ 50 μMเอจินาโคไซด์ถึง 6.5 ̆ 0.2, 5.8 ̆ 0.3, 4.8 ̆ 0.2, 4.1 ̆ 0.1 หรือ 2.3 ̆ 0.4 nmol/mg/5 นาที ตามลําดับ (F(5,24) = 67.1, p = 0.000) ค่า IC50 สําหรับเอจินาโคไซด์- การยับยั้งการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine-evoked ซึ่งได้มาจากเส้นโค้งการตอบสนองต่อขนาดยาคือ 24 μM นอกจากนี้ การปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจาก 1 mM 4-aminopyridine ในสารละลายที่ปราศจาก Ca2+-free 1 mM ที่มีเอทิลีนไกลคอลบิส 300 μM(β-aminoethyl ether)-N,N,N1,N1 -กรดเตตระอะซิติก (EGTA) คือ 2.1 ̆ 0.2 นาโนโมล/มก. /5 นาที (F(2,12) = 310.65, p = 0.000) และส่วนประกอบ Ca2+-อิสระของการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine-evoked นี้ไม่ได้รับผลกระทบจากการปล่อยกลูตาเมต 20 μMเอจินาโคไซด์(1.8 ̆ 0.2 นาโนโมล/มก./5 นาที; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p = 0.58; p รูปที่ 1) ใน synaptosomes ที่ได้รับการรักษาด้วย 0.1 μM bafifilomycin A1 สารยับยั้งการขนส่งตุ่ม [26], การปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัวลดลงอย่างมีความหมาย (2.2 ̆ 0.2 นาโนโมล/มก./มก./5 นาที; 2.2 F (2,12) = 249.518, p = 0.000) ในการปรากฏตัวของ bafifilomycin A1, 20 μM echinacoside ล้มเหลวในการยับยั้งการปล่อยกลูตาเมตอย่างมีความหมาย (2.1 ̆ 0.2 นาโนโมล / mg / 5 นาที; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0.94; p = 0. รูปที่ 1) ในทางตรงกันข้าม 10 μM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA ซึ่งเป็นสารยับยั้งการดูดซึมกลูตาเมต) [27] เพิ่มการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัวเป็น 11.8 ̆ 0.4 นาโนโมล/มก./5 นาที (t(8) = '11.31, p = 0.000) แม้ในที่ที่มี DL-TBOA, 20 μMเอจินาโคไซด์ยับยั้งการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine-evoked อย่างมีความหมาย (7.7 ̆ 0.2 นาโนโมล/มก./5 นาที; 7.7 ̆ 0.2 นาโนโมล/มก./5 นาที; 7.7 ̆ 0.2 นาโนโมล/มก./5 นาที; 7.7 ̆ ̆ 0.2 นาโนโมล/มก./5 นาที; 7.7 ̆ ̆ F(2,12) = 87.23, p = 0.000; รูปที่ 1)

1.Q. เอจินาโคไซด์ลดไซโตโซลิกแคลิฟอร์เนีย²+ความเข้มข้น แต่ไม่เปลี่ยนแปลง synaptosomal

ศักยภาพของ Mem brane

การขจัดขั้ว Synaptosome ที่เกิดจาก 1 mM 4-aminopyridine เพิ่มขึ้น Ca²+ ความเข้มข้น(ณ= 0.000; ตารางที่ 1) การประยุกต์ใช้ 20 |vMเอจินาโคไซด์ไม่ได้ส่งผลกระทบอย่างมีนัยสําคัญต่อบารัลคา²+ สมาธิ (t(8) = 0.06,p= 0.95) แต่ลดลงอย่างมีนัยสําคัญ 4-aminopyridine ที่เกิดจากการเพิ่มขึ้น iia Ca²+ สมาธิ (t(10)= 6.16,p =นอกจากนี้ 1 mM 4-aminopyridine เพิ่มขึ้นใน 3',3',3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine iodide [DiSC₃(5)] การเรืองแสง (p= 0.000) นอกจากนี้ o⁽20 fdM echinacoside ไม่ได้เปลี่ยนแปลงศักย์เมมเบรนพัก (t(8) = 0.976,p= 0.36) หรือเปลี่ยนแปลงการเพิ่มขึ้น 4-aminopyridine-mediated ใน DiSC อย่างมีนัยสําคัญ₃(5) การเรืองแสง (t(8) = —0.014,p= 0.99; ตารางที่ 1)

ซิสตันเช่เอจินาโคไซด์สามารถรักษาโรคไตได้

2.3.ลด- CO2+การไหลเข้าผ่านช่องทาง Cav2.2 (N-Type) และ Cav2.1 (P/Q-Type) อาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการปล่อยกลูตาเมต 4-Aminopyridine-Evoked โดยเอจินาโคไซด์

รูป2แสดงให้เห็นว่า 2 cu-conotoxin MVIIC, N-และ P / Q-ประเภท Ca²+ ตัวบล็อกช่อง

ลดการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัวจาก 7.4 土 0.2 เป็น 2.0 土 0.1 นาโนโมล /มก. / 5 นาที (t(9) = 25.35,p= 0.000) ในการปรากฏตัวของ cu-conotoxin MVIIC ผลของ 20 pM echinacoside ต่อการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine ทําให้เกิดไม่มีนัยสําคัญ (1.8 土 0.2 นาโนโมล / มก. / 5 นาที; 1.8 土 0.2 nmol / mg / 5 นาที; 1.8 土 0.2 nmol / mg / 5 นาที; 1.8 土 0.2 nmol / mg / 5 นาที; 1.8 土 0.2 nmol / mg / 5 นาที; 1.8 土 0.2 nmol / mg / 5 นาที; 1.8 土 0.2 nmol / mg / 5 นาที; 1.8t(8) = 1.06,p= 0.32) Dantrolene (10 ^M) ซึ่งเป็นสารยับยั้ง Ca ภายในเซลล์²+ ปล่อย Crom endoplasmic reticulum [28], ลดการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัว (5.6 土 0.3 นาโนโมล/มก./5 นาที; + F(2,14) = 104.95,p= 0.000) อย่างไรก็ตามในที่ที่มี dantrolene, 20 pJMเอจินาโคไซด์ยังคงสามารถยับยั้งการปล่อยกลูตาเมตอย่างมีนัยสําคัญ (3.3 土 0.2 นาโนโมล / mg / 5 นาที;p= 0.000) พบผลลัพธ์ที่คล้ายกันโดยใช้ 100 pM 7-chloro-5-(2-chloropheny)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazepin-2(3H)-one (CGP37157) ซึ่งเป็นตัวบล็อกเมมเบรน-permeaWe ของไมโตคอนเดรียนา⁺/ผบช.ท.²+ แลกเปลี่ยน ในการเตรียม synaptosomal ที่ตรวจสอบห้าครั้ง 20 pMเอจินาโคไซด์รวมกับ 100 pM CGP37157 ลดการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัวลง 48.3% 土 5.2% (F(2,13) = 136.79,p= 7.000) คล้ายกับการยับยั้งโดย echinacoside เพียงอย่างเดียว (46.2% 土 2.3%;p= 0.89;

2.4.เอจินาโคไซด์Inhibcts 4-Aminopyridine-Evoked (การปล่อยกลูตาเมตโดยการส่งสัญญาณผ่านโปรตีนไคเนส C

ดังแสดงในรูปที่ 3, 10 °jlM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimide (GF109203X), gen er al protein kinase C inhibitor [29], ลดการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจาก 4 อะมิโนไพริดีน (F(2,13) = 19.46, p = 0.000) ใน synaptosomes ที่ได้รับการรักษาด้วย GF109203X, 20 pM echinacoside ลดการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัวลงเพียง 5.5% 土 1.8% (p = 0.89) น้อยกว่านั้นโดย echinacoside เพียงอย่างเดียว (42.4% 土 2.3%; p = f.000) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันได้มาจาก 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976) ซึ่งเป็นตัวเลือกสําหรับไอโซฟอร์มโปรตีนไคเนส C ที่ขึ้นกับ Ca2+(a, |3I, |3II, y) [29] ต่อหน้า 3 pM Go6976, 20 pMเอจินาโคไซด์ลดการปล่อยกลูตาเมตลง 11.9% 土 2.9% (p = 0.59) ซึ่งหมายถึงการลดลงอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับโดย echinacoside เพียงอย่างเดียว (42.4% 土 2.3%; p = 0.000; p = 0.000; 42.4% 土 2.3%; p = 0.000; p = 0.000; p = 0.000; p = 0.000; p = 0.000; 42.4% 土 2.3%; p = 0.000; p = 0.000; 42.4% 土 2.3%; p = 0.000; p = 0.000; p = 0.000; p = 0. รูปที่ 3) ในทางตรงกันข้าม 3 pM rottlerin ซึ่งเป็นสารยับยั้งไคเนสโปรตีนอิสระ Ca2 + [30] ไม่ได้เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสําคัญ 4-aminopyridine (1 mM) - การปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากสาร (p = 0.45) อย่างไรก็ตามในการปรากฏตัวของ rottlerin, 20 pM echinacoside ได้อย่างมีประสิทธิภาพทําให้เกิดการยับยั้งเฉลี่ย 37.1% 土 5.6% ของการปลดปล่อย (F(2,13) = 19.72, p = 0.000) คล้ายกับที่โดย echinacoside เพียงอย่างเดียว (p = 0.41; F = 0.41) รูปที่ 3) นอกจากนี้สารยับยั้งไคเนสโปรตีนที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one) (PD98059) (50 pM) และโปรตีนไคเนส A ยับยั้ง N-[2-(p-bromocinnamylamino)เอทิล]-5-ไอโซควิโนลิเนซัลโฟนาไมด์ (H89) (100 pM) ลดลง 4-อะมิโนไพริดีน-อีโวคเลนส์กลูตาเมต (p = 0.000) แม้ในที่ที่มี PD98059 หรือ H89, 20 pMเอจินาโคไซด์ลดการปล่อยอย่างมีประสิทธิภาพ (F(2,13) = 52.3, p = 0.000; รูปที่ 3)

รูปที่ 4 แสดง tha11 mM 4-aminopyridine เพิ่มฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีนไคเนส C ในไซแนปโตโซม (t(4) = —6.871,p= 0.002) เมื่อ synaptosomes ถูกปรับสภาพด้วย 20 pM echinacoside เป็นเวลา 10 นาทีก่อนที่จะเติม 4-aminopyridine, 4-aminopyridine เหนี่ยวนําให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีนไคเนส C ลดลงอย่างมาก (F(2_a6) = 29.202,p= 0.00 1)

เอจินาโคไซด์ในcistancheสามารถเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

2.5.เอจินาโคไซด์- การยับยั้งการปล่อยกลูตาเมตที่เป็นสื่อกลางไม่เกี่ยวข้องกับกรดแกมมา - อะมิโนบิวทิริกชนิด A (GAB³A_A) ตัวรับ

ในรูปที่ 5 ผลของ echinacoside ต่อการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัวในกรณีที่ไม่มีหรือการปรากฏตัวของ SR95531 (ศัตรูของ GABA_Aตัวรับ) ถูกเปรียบเทียบ นอกจากนี้ 100 pM SR95531 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงการปล่อยกลูตาเมต 4-aminopyridine (1 mM) อย่างมีนัยสําคัญ ใน

ไซแนปโตโซมที่ได้รับการรักษาด้วย SR95531 การใช้ echinacoside 20 pM ส่งผลให้เกิดการยับยั้ง 43% ในการปล่อยกลูตาเมตที่เกิดจากอะมิโนไพริดีน 4 ตัว (F(2,12) = 42.63,p= 0.000) ซึ่งไม่แตกต่างจากการยับยั้งที่ผลิตโดย echinacoside เพียงอย่างเดียวอย่างมีนัยสําคัญ (40%;p= 0.000) ผลลัพธ์ที่คล้ายกันนี้ได้มาจากคู่อริตัวรับ GABAa อีกตัวหนึ่งคือ bicuculline (50 pM) การปลดปล่อยที่วัดได้ในที่ที่มีไบคิวคัลลีนและ