ส่วนที่ 1: echinacoside กระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็ง Apoptotic โดยการยับยั้งเอนไซม์ฆ่าเชื้อในสระนิวคลีโอไทด์ MTh1

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com

เชิงนามธรรม:การยับยั้งเอนไซม์ฆ่าเชื้อในสระนิวคลีโอไทด์ MTH1 ทำให้เกิดความเสียหายต่อ DNA ออกซิเดชันอย่างกว้างขวางและการตายของเซลล์มะเร็ง และด้วยเหตุนี้จึงอาจใช้เป็นกลยุทธ์ในการต้านมะเร็ง เนื่องจากผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเป็นแหล่งสารเคมีทางการแพทย์ที่อุดมสมบูรณ์ ในการศึกษานี้ เราใช้ MTH1-เร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์เป็นปริมาณงานสูงในการตรวจคัดกรองในหลอดทดลอง เพื่อค้นหาสารประกอบธรรมชาติที่สามารถยับยั้ง MTH1 ได้เอ็กไคนาโคไซด์, สารประกอบที่ได้จากพืชสมุนไพรCistancheและ Echinacea ยับยั้งกิจกรรมการเร่งปฏิกิริยาของ MTH1 ในการทดสอบในหลอดทดลองได้อย่างมีประสิทธิภาพ การรักษาเซลล์มะเร็งในเซลล์ต่างๆ ของมนุษย์ด้วยเอ็กไคนาโคไซด์ส่งผลให้ระดับเซลล์ของออกซิไดซ์ guanine (8-oxoguanine) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ระดับของออกซิเจนในปฏิกิริยาของเซลล์ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ซึ่งบ่งชี้ว่าเอ็กไคนาโคไซด์ยังยับยั้งการทำงานของเซลล์ MTH1 ดังนั้น การรักษาด้วย Echinacoside ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและน่าทึ่งในเครื่องหมายความเสียหายของ DNA และการปรับเพิ่มของสารยับยั้ง G1/S-CDK p21 ซึ่งตามมาด้วยการตายของเซลล์ apoptotic ที่ทำเครื่องหมายไว้และการหยุดวงจรของเซลล์ในมะเร็งแต่ไม่พบในเซลล์ที่ไม่เป็นมะเร็ง เมื่อนำมารวมกัน การศึกษาเหล่านี้ระบุสารประกอบธรรมชาติเป็นตัวยับยั้ง MTH1 และแนะนำว่าผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติสามารถเป็นแหล่งสำคัญของสารต้านมะเร็ง

คำสำคัญ: เอ็กไคนาโคไซด์, MTH1, 8-oxoG, ความเสียหายของดีเอ็นเอ, การตายของเซลล์, การจับกุมวงจรเซลล์

Cistancheสารสกัดมีต้านมะเร็งประโยชน์ต่อสุขภาพ

คลิกที่นี่เพื่อส่วนที่ 2

บทนำ

นิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (NTP) ระดับเซลล์และไมโตคอนเดรียและกลุ่มดีออกซีนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (dNTP) เป็นเป้าหมายที่สำคัญของออกซิเจนปฏิกิริยาหลายชนิด (ROS) 1–3 เนื่องจากความจำเพาะของดีเอ็นเอโพลีเมอเรสน้อยกว่าที่สมบูรณ์แบบ dNTP ที่ออกซิไดซ์ 4,5 จึงสามารถ รวมเข้ากับ DNA ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่เพื่อทำให้เกิดความคลาดเคลื่อนทางพันธุกรรมหากไม่ได้รับการแก้ไข ตัวอย่างเช่น เบสที่ออกซิไดซ์หลักในสระนิวคลีโอไทด์ 8-oxoguanine (8-oxoG) สามารถจับคู่เบสกับไซโตซีนและอะดีนีนได้ เมื่อใส่เข้าไปในอะดีนีนตรงข้ามระหว่างการจำลองดีเอ็นเอ อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลง T: A=G: C ซึ่งเป็นหนึ่งในการกลายพันธุ์ที่พบบ่อยที่สุดที่พบในมะเร็งในมนุษย์8,9 แม้ว่า dNTP ที่ปลอดออกซิไดซ์ส่วนใหญ่ จะถูกลบออกโดยเอนไซม์ฆ่าเชื้อในสระนิวคลีโอไทด์ จากการศึกษาในอดีตพบว่าสระนิวคลีโอไทด์ยังคงเป็นแหล่งสำคัญของเบสออกซิไดซ์ในโมเลกุลดีเอ็นเอและมีส่วนสำคัญต่อความเสียหายของดีเอ็นเอที่เกิดจากออกซิเดชัน3,10 เอนไซม์ที่สำคัญที่สุดในการฆ่าเชื้อนิวคลีโอไทด์ สระ 15 อย่างไรก็ตาม แม้ภายใต้การเฝ้าระวังโดยเอนไซม์ฆ่าเชื้อสระนิวคลีโอไทด์ ส่วนสำคัญของ dNTP ที่ถูกออกซิไดซ์ก็ถูกรวมเข้าใน DNA และเบสในโมเลกุล DNA ยังสามารถออกซิไดซ์ได้โดยตรงโดย ROS6 จากนั้นเซลล์ต้องอาศัยกลยุทธ์ที่ซับซ้อนมากขึ้นซึ่งเกี่ยวข้องกับความหลากหลาย DNA glycosylases เช่น OGG1 และ MUTYH และกระบวนการซ่อมแซม DNA รวมถึงการซ่อมแซมการตัดตอนฐาน (BER) และการซ่อมแซมที่ไม่ตรงกัน (MMR) เพื่อแก้ไขฐานที่มีปัญหาในโมเลกุลดีเอ็นเอ10,16,17 BER a nd MMR ปกติจะซ่อมแซมฐานออกซิไดซ์จำนวนมากใน DNA ต่อวัน และด้วยเหตุนี้จึงมีบทบาทสำคัญในการปกป้องความสมบูรณ์และความเสถียรของจีโนม

ในเซลล์ที่อยู่ภายใต้ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้น การรวมตัวกันของนิวคลีโอไทด์ที่ถูกออกซิไดซ์ใน DNA ที่เพิ่มขึ้นอาจครอบงำความสามารถในการซ่อมแซมเซลล์และทำให้เกิดการตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA (DDR) การส่งสัญญาณ DDR แบบถาวรจะนำไปสู่การหยุดวงจรของเซลล์ การเสื่อมสภาพของเซลล์ก่อนวัยอันควร หรืออะพอพโทซิสจึงเป็นอุปสรรคสำหรับการสร้างเนื้องอก19 ถึงกระนั้น แม้ว่าเซลล์มะเร็งจะแสดงความตึงเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เพิ่มขึ้นอย่างมาก และสร้างภาระที่อาจถึงตายของนิวคลีโอไทด์ที่ถูกออกซิไดซ์ 20 เซลล์เหล่านี้สามารถอยู่รอดได้ในภาวะชราภาพที่เกี่ยวข้องกับ DDR หรืออะพอพโทซิส.21 จากการศึกษาจำนวนมากแสดงให้เห็นว่า MTH1 ซึ่งกำจัด 8-oxodGTP และ 2-OH-dATP ที่เป็นอันตรายจำนวนมากในเซลล์เนื้องอกได้อย่างมีประสิทธิภาพ มีบทบาทสำคัญในการพัฒนาของมะเร็ง22 MTH1 คือ พบว่ามีการแสดงออกมากเกินไปในมะเร็งประเภทต่างๆ ระดับ 23–25 และ 8-oxoG และขอบเขตของรอยโรค DNA ออกซิเดชันในเนื้องอกต่ำกว่าในเนื้อเยื่อปกติโดยรอบ 26–28 ในทางปฏิบัติ การแสดงออกของ MTH1 มากเกินไปลดลงอย่างมีนัยสำคัญ จำนวนการกลายพันธุ์ของ DNA ที่พบในไฟโบรบลาสต์ตัวอ่อนของตัวอ่อนของเมาส์ที่ขาด MMR10 และอนุญาตให้เซลล์เอาชนะการเสื่อมสภาพของเซลล์ก่อนวัยอันควรและการตายของเซลล์ที่เกิดจาก Ras ที่เกิดจาก Ras 29 ในขณะที่การปราบปรามของ MTH1 ช่วยป้องกันการพัฒนาของมะเร็งใน OGG1-หนูที่บกพร่อง 30 และได้รับการส่งเสริม DDR ที่เหนี่ยวนำโดย ROS และการเสื่อมสภาพของเซลล์ในเซลล์ที่แปลงด้วย Ras3,29,31 ดังนั้น แม้ว่า MTH1 จะมีบทบาทในการป้องกันโดยการป้องกันการกลายพันธุ์ที่เกิดจาก ROS ในเซลล์ที่มีสุขภาพดี แต่การศึกษาเหล่านี้พบว่า MTH1 มีความจำเป็นอย่างยิ่งสำหรับการเกิดขึ้นและการอยู่รอด ของเซลล์มะเร็ง การศึกษาล่าสุดได้ให้หลักฐานเพิ่มเติมเพื่อสนับสนุนบทบาทของ MTH1 ในการพัฒนามะเร็ง 31–34 การปราบปราม MTH1 โดย RNAi หรือสารยับยั้งโมเลกุลขนาดเล็กในเซลล์มะเร็งต่างๆ ส่งผลให้การรวมตัวของ 8-oxo d G เข้ากับจีโนมดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งนำไปสู่ความเสียหายของ DNA อย่างกว้างขวาง การตายของเซลล์ apoptotic และการอยู่รอดของเซลล์มะเร็งลดลง32,33 ในการศึกษาการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ของหนูเมาส์ การยับยั้ง MTH1 ยับยั้งการเจริญเติบโตของสารแยกมะเร็งได้อย่างมีประสิทธิภาพ ที่สำคัญ การยับยั้ง MTH1 ไม่ได้ส่งผลกระทบต่อการเติบโตและการอยู่รอดของเซลล์ปกติ อาจเป็นเพราะเซลล์ปกติมี ROS ที่ต่ำกว่า ดังนั้นจึงไม่ต้องพึ่งพา MTH1 ในการอยู่รอด32,33 การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการยับยั้ง MTH1 เป็นกลยุทธ์ใหม่ที่น่าสนใจในการต่อสู้กับโรคมะเร็ง

ผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเป็นแหล่งที่อุดมไปด้วยสารประกอบทางยา35 การบำบัดรักษาสมัยใหม่จำนวนมาก รวมทั้งยาต้านมะเร็ง ได้มาจากการเตรียมสมุนไพรหรือพฤกษศาสตร์36–39 กระนั้น สมุนไพรแผนโบราณจำนวนมากเสนอให้มีคุณสมบัติในการรักษาที่หลากหลายให้คงอยู่ ที่มีลักษณะเฉพาะ ส่วนใหญ่เกิดจากความยากลำบากในการควบคุมองค์ประกอบของพวกมันเพื่อกำหนดประสิทธิภาพและกลไกการออกฤทธิ์ของพวกมันอย่างไม่น่าสงสัย40 จำเป็นต้องมีวิธีการใหม่ที่ช่วยให้สามารถตรวจหาสารประกอบออกฤทธิ์และการวิเคราะห์กลไกระดับโมเลกุล ในเรื่องนี้ การตรวจคัดกรองในหลอดทดลองที่มีปริมาณงานสูงตามเป้าหมายสามารถเป็นเครื่องมือในการค้นหาสารประกอบทางยาที่กำหนดโดยกลไกจากทรัพยากรธรรมชาติ ในการศึกษานี้ เราใช้ MTH1-ปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาเป็นการทดสอบในหลอดทดลองที่มีปริมาณงานสูงเพื่อค้นหาสารประกอบธรรมชาติที่สามารถยับยั้ง MTH1 น่าแปลกที่การคัดกรองพบว่าเอ็กไคนาโคไซด์ซึ่งเป็นผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่ขึ้นชื่อในเรื่องฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพ สามารถยับยั้ง MTH1 ได้

เอ็กไคนาโคไซด์ใน cistanche canแอนตี้อะพอพโทซิส

วัสดุและวิธีการ

วัสดุ

สารประกอบสมุนไพรธรรมชาติซื้อมาจาก Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, สาธารณรัฐประชาชนจีน ชื่อ หมายเลขแค็ตตาล็อก หมายเลขทะเบียน Chemical Abstracts Service (CAS) และความบริสุทธิ์ของสารประกอบแต่ละชนิดแสดงอยู่ในตารางที่ S1 สารละลายสต็อกของสารประกอบถูกเตรียมใน 100 เปอร์เซ็นต์ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) (ซิกมา-อัลดริช, เซนต์หลุยส์, มิสซูรีสหรัฐอเมริกา) และสารละลายทำงานถูกเตรียมในบัฟเฟอร์สำหรับทดสอบหรืออาหารเลี้ยงเซลล์ที่สมบูรณ์ สารละลายเดียวกันโดยไม่มีสารประกอบทดสอบแต่มี DMSO ปริมาณเท่ากันถูกใช้เป็นตัวควบคุมด้วยกระสายยา (S)-crizotinib ซื้อมาจาก Selleck Chemicals, Houston, TX, USA

การตรวจคัดกรองในหลอดทดลอง

การสอบวิเคราะห์ด้วยเอนไซม์ ในหลอดทดลอง ใช้เพื่อคัดกรองสารประกอบสมุนไพรธรรมชาติตามขั้นตอนที่อธิบายไว้โดย Gad et al.32 โดยย่อ การเจือจางแบบอนุกรมของสารประกอบแต่ละชนิดถูกเตรียมในบัฟเฟอร์สำหรับการสอบวิเคราะห์ซึ่งประกอบด้วย 100 มิลลิโมลาร์ ทริส- อะซิเตท (pH 8.0), 40 mM NaCl, 10 mM Mg อะซิเตท, 0.005 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 และ 1 mM DTT ถัดไป 0.5 nM recombinant humanMTH1 (Abcam, Cambridge, UK), 100 μM dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) และไพโรฟอสฟาเตสอนินทรีย์ 0.2 U/mL (Thermo Fisher Scientific) และเพลตถูกบ่มบน เขย่าจานเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ปริมาตรของปฏิกิริยาสุดท้ายคือ 100 ไมโครลิตรในจาน 96-หลุม ในตอนท้ายของปฏิกิริยา มาลาไคต์กรีน (J&K Scientific, ปักกิ่ง, สาธารณรัฐประชาชนจีน) ถูกเติม 41 และแผ่นเปลือกโลกถูกฟักที่อุณหภูมิห้องต่อไปอีก 15 นาที การดูดซับที่ 630 นาโนเมตรวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) ค่าความเข้มข้นในการยับยั้ง (IC50) ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์การถดถอยแบบไม่เชิงเส้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism

การเพาะเลี้ยงเซลล์

MG-63 osteosarcoma ของมนุษย์, SK-HEP-1มะเร็งตับ, มะเร็งเต้านม MCF7, มะเร็งลำไส้ใหญ่ SW480, ไตตัวอ่อน HEK293 และสายเซลล์ไฟโบรบลาสต์ NIH/3T3 ของหนูเมาส์มาจาก American Type Culture Collection และภาวะปกติของมนุษย์ เซลล์ตับ L-O2 ซื้อมาจาก KenGen Biotech, Nanjing, สาธารณรัฐประชาชนจีน เซลล์เหล่านี้ถูกรักษาไว้ที่ 37 องศาในบรรยากาศที่มีความชื้นโดยมีคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ ตามคำแนะนำของผู้ให้บริการ คณะกรรมการตรวจสอบของสถาบันไม่ต้องการคำแถลงด้านจริยธรรมสำหรับการใช้เซลล์เหล่านี้

การวัดระดับ oxoG ภายในเซลล์ {{0}}oxo ในเซลล์ 8-ระดับ oxoG ถูกวัดโดยการย้อมสีด้วย Cy3-conjugated avidin.42 ทั้งหมด 1×104 เซลล์ถูกวัด เพาะบนใบปะหน้ากลมในจานหลุม 12-หลุม วันรุ่งขึ้น เซลล์ถูกบำบัดด้วยเอไคนาโคไซด์ 0 ไมโครโมลาร์ 15 ไมโครโมลาร์ 30 ไมโครโมลาร์ 60 ไมโครโมลาร์ หรือ 80 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 5 ชั่วโมง 12 ชั่วโมง หรือ 24 ชั่วโมง จากนั้นตรึงด้วยน้ำแข็ง -เมทานอลเย็นเป็นเวลา 20 นาที ตามด้วยบ่มในน้ำเกลือ Tris-buffered (TBS) ด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 (Sigma-Aldrich) เป็นเวลา 15 นาที ตัวอย่างถูกบล็อกใน TBS ด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 และซีรัมของทารกในครรภ์ 15 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและจากนั้นย้อมด้วย Cy3-conjugated avidin (0.5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) ในสารละลายบล็อคเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 37 องศา หลังจากล้างด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) 3 ครั้งเป็นเวลา 5 นาที แผ่นปิดถูกผนึกบนแผ่นกระจก แผ่นป้องกันแมลง Mounting Medium with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA , สหรัฐอเมริกา). ถ่ายภาพและวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Zeiss LCM 510

การวัดระดับ Ros Intracellular ROS ภายในเซลล์วัดโดยโฟลว์ไซโตเมทรีโดยใช้ชุดทดสอบ ROS แบบใช้เซลล์ (Beyotime Biotechnology, Haimen, สาธารณรัฐประชาชนจีน) เซลล์ที่เติบโตในเพลตหกหลุมถูกบำบัดด้วยเอชินาโคไซด์ 0 ไมโครโมลาร์, 15 ไมโครโมลาร์, 30 ไมโครโมลาร์, 60 ไมโครโมลาร์ หรือ 80 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 5 ชั่วโมง, 12 ชั่วโมงหรือ 24 ชั่วโมง, ล้างสองครั้งด้วย PBS และบ่มด้วย 10 μM dichlorofluorescein diacetate เป็นเวลา 30 นาที ที่ 37 องศา จากนั้นเซลล์จะถูกทดลองและวิเคราะห์โดย FACSCaliber flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ระดับ ROS ภายในเซลล์แสดงเป็นความเข้มของการเรืองแสงของไดคลอโรไดไฮโดรฟลูออเรสเซนโดยเฉลี่ยของเซลล์ ตัวเลขที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ยของการทดลองอิสระสามครั้ง

การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

เซลล์ที่เติบโตบนแผ่นปิดได้รับการบำบัดด้วยเอไคนาโคไซด์ {{0}} ไมโครโมลาร์, 15 ไมโครโมลาร์, 30 ไมโครโมลาร์, 60 ไมโครโมลาร์ หรือ 80 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 5 ชั่วโมง, 12 ชั่วโมง หรือ 24 ชั่วโมง จากนั้นล้างด้วย PBS หนึ่งครั้ง ตรึงด้วย พาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ใน PBS เป็นเวลา 20 นาที และบล็อกใน TBS ด้วย Triton X 0.1 เปอร์เซ็นต์-100 และซีรั่มวัวในครรภ์ 15 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง เซลล์แบบตายตัวถูกย้อมเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ต้าน 8-oxoG (โมโนโคลนัลของเมาส์ต้าน-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (สารต้านกระต่าย-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery , TX, USA) หรือ active caspase-3 (rabbit anti-caspase-3, Bioss, Beijing, People's Republic of China) ตามด้วยการย้อมสีด้วย Alexa 488-แอนติเมาส์ลาคอนจูเกต ( Abcam) หรือ Cy3-conjugated goat anti-rabbit (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) แอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างด้วย PBS 3 ครั้งเป็นเวลา 5 นาที แผ่นปิดถูกปิดผนึกบนสไลด์แก้วใน VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories) รูปภาพถูกถ่ายโดยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอล Zeiss LCM 510

การทดสอบการก่อตัวของอาณานิคม

วันก่อนการบำบัด เซลล์ถูกเพาะในจานหกหลุมที่ความเข้มข้น 1×104 เซลล์ต่อหลุม จากนั้นพวกมันถูกบำบัดด้วย 0 μM, 60 μM หรือ 80 μM Echinacoside เป็นเวลา 7 วัน หลังจากล้างด้วย PBS เซลล์จะถูกตรึงด้วยเมทานอลที่เย็นจัดและย้อมด้วยสารละลายคริสตัลไวโอเล็ต (ซิกมา- อัลดริช) (0.5 เปอร์เซ็นต์ในเมทานอล 25 เปอร์เซ็นต์) ภาพถ่ายถูกถ่ายหลังจากทำให้จานแห้งในชั่วข้ามคืน ผลึกไวโอเล็ตคริสตัลละลายโดยการเติมเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์ และการดูดกลืนแสงที่ 595 นาโนเมตรถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท BioRad 680 วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism

การทดสอบ MTT

หนึ่งวันก่อนการบำบัด เซลล์ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมที่ความเข้มข้น 1×104 เซลล์ต่อหลุม ตามด้วยการบำบัดด้วยการเจือจางแบบอนุกรมของเอชินาโคไซด์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหรือ 48 ชั่วโมง หรือด้วยเอชินาโคไซด์ 60 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 5 ชั่วโมง 12 ชั่วโมง หรือ 24 ชม. สื่อถูกกำจัดออก และเซลล์ถูกล้างด้วย PBS จากนั้น 20 ไมโครลิตรของ 3-(4,5-ไดเมทิลไทอะซอล-2-อิล)-2,{{15} }สารละลายไดฟีนิล เตตราโซเลียม โบรไมด์ (MTT) (5 มก./มล. ใน PBS, pH 7.2) (Thermo Fisher Scientific) ถูกเติมลงในแต่ละหลุม เพลตถูกบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลาอีก 4 ชั่วโมง ในท้ายที่สุด สารละลาย MTT ถูกกำจัดออก และเติม DMSO 150 ไมโครลิตรในแต่ละหลุม เพลตถูกบ่มบนเชคเกอร์เพลตเป็นเวลา 10 นาที และการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตรถูกวัดโดยเครื่องอ่านไมโครเพลท BioRad 680 การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการสองครั้งในสามเท่า วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism ค่า IC50 ถูกกำหนดหาโดยใช้การวิเคราะห์การถดถอยแบบไม่เชิงเส้น

การวิเคราะห์วัฏจักรเซลล์

เซลล์ในเพลตหกหลุมได้รับการบำบัดด้วย 0 μM, 6{{10}} μM หรือ 80 μM Echinacoside เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บเกี่ยวด้วยทริปซิน (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) ล้างด้วย PBS สองครั้ง จากนั้นตรึงด้วยเอทานอลเย็นจัด (70 เปอร์เซ็นต์) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ -20 องศา เซลล์แบบตายตัวถูกล้างสองครั้งใน PBS เย็นและแขวนลอยใหม่ใน 300 ไมโครลิตรของ PBS ที่เตรียมใหม่ด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100, 0.2 มก./มล. RNase A ที่ปราศจาก DNase (Sigma- Aldrich), 10 ug/mL โพรพิเดียมไอโอไดด์ ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd. บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) หลังจากการฟักไข่ที่ 37 องศาในที่มืดเป็นเวลา 20 นาที เซลล์ถูกกรองผ่านตาข่ายไนลอน Falcon (BD Biosciences) บรรจุลงในโฟลว์ไซโตมิเตอร์ FAC-SCalibur และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ ModFit (BD Biosciences)

การวิเคราะห์การกระจายตัวของดีเอ็นเอ

เซลล์ที่เติบโตในเพลตหกหลุมถูกบำบัดด้วย 0 μM, 60 μM หรือ 80 μM Echinacoside เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและตรึงในพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์ที่เย็นจัด (Sigma-Aldrich) เป็นเวลา 20 นาที หลังจากการล้างด้วย PBS เซลล์ถูกผนึกใน VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI (Vector Laboratories) สัณฐานวิทยานิวเคลียร์ถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงโอลิมปัส ในการตรวจหาการแตกตัวของ DNA บนเจล agarose นั้น สกัด DNA โดยใช้ QIAamp DNA micro kit (Qiagen NV, Venlo, เนเธอร์แลนด์) และดำเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสบนเจล agarose 2 เปอร์เซ็นต์ที่มีเอทิเดียมโบรไมด์ 0.1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

การวิเคราะห์อะพอพโทซิสโดยโฟลว์ไซโตเมทรี เซลล์อะพอพโทติกถูกตรวจสอบโดยใช้ชุดตรวจหาการตายของเซลล์ Apoptosis ของ Annexin V-FITC (Bestbio เซี่ยงไฮ้ สาธารณรัฐประชาชนจีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ที่เติบโตในเพลต 96-หลุมถูกบำบัดด้วยเอไคนาโคไซด์ 0 ไมโครโมลาร์, 15 ไมโครโมลาร์, 30 ไมโครโมลาร์, 60 ไมโครโมลาร์, 80 ไมโครโมลาร์ หรือ 160 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 2 ชั่วโมง, 5 ชั่วโมง, 12 ชั่วโมงหรือ 24 ชั่วโมง ล้างสองครั้งด้วย PBS แล้วแขวนลอยใหม่อีกครั้งในบัฟเฟอร์การจับ ต่อมา, 5 ไมโครลิตรของแอนเนกซิน V-FITC และ 5 ไมโครลิตรของ PI (โรช) ถูกเติมตามลำดับ และเซลล์ถูกบ่มเป็นเวลา 15 นาทีในความมืดที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกโหลดเข้าสู่ FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences) และวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์ Cell Quest (BD Biosciences)

การวิเคราะห์ Western blot

เซลล์ที่เติบโตในเพลตหกหลุมถูกบำบัดด้วย 0 μM, 6{{10}} μM หรือ 80 μM เอไคนาโคไซด์ เป็นเวลา 5 ชั่วโมง, 12 ชั่วโมงหรือ 24 ชั่วโมง ล้างสองครั้งด้วย PBS และขูดออกจากเพลตโดยใช้ 100 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์เรดิโออิมมูโนพรีซิชั่น (150 มิลลิโมลาร์ NaCl, 1.0 เปอร์เซ็นต์ IGEPAL CA-630, 0.5 เปอร์เซ็นต์ โซเดียม ดีออกซีโชเลต, 0.1 เปอร์เซ็นต์ โซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต และทริส 50 มิลลิโมลาร์, pH 8.0) (ซิกมา-อัลดริช) ที่มีฟีนิลมีเทน ซัลโฟนิลฟลูออไรด์ 1 มิลลิโมลาร์ ตัวอย่างถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000× g เป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 องศา ความเข้มข้นของโปรตีนในสารเหนือตะกอนถูกกำหนดโดยรีเอเจนต์ของแบรดฟอร์ด (Dingguo, Changchun, สาธารณรัฐประชาชนจีน) ตัวอย่างถูกทำให้เสียสภาพที่ 95 องศาเป็นเวลา 10 นาที และแยกบนเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสแบบเจลโซเดียม โดเดซิล ซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์ 12 เปอร์เซ็นต์ หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อพอลิไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (Millipore) ตามด้วยการปิดกั้นในน้ำเกลือ Tris-buffered ด้วย Tween 20 (10 mM Tris, pH 7.5; 100 mM NaCl; 0.1 เปอร์เซ็นต์ Tween 20) ที่มี 5 เปอร์เซ็นต์ (w/v) นมที่ไม่มีไขมันเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง บล็อตถูกตรวจสอบด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ต้าน p21 (Abcam), โพลี (ADP-ไรโบส) โพลีเมอเรส (ไบออส) หรือแคสเปสที่ถูกกระตุ้น-3 (ไบออส) ตามด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่คอนจูเกตที่คอนจูเกตด้วยฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (Jackson ImmunoResearch Laboratories) สัญญาณได้รับการพัฒนาโดยใช้ชุดตรวจจับ Western blotting ที่ได้รับการปรับปรุงด้วยเคมีลูมิเนสเซนซ์ (Transgen Biotech, Changchun, สาธารณรัฐประชาชนจีน) การทดลองซ้ำสามครั้ง

เอ็กไคนาโคไซด์ใน cistanche canแอนตี้อะพอพโทซิสและต่อต้านอนุมูลอิสระ

การวัดไมโตคอนเดรีย

ศักยภาพของเมมเบรน

วัดศักย์ของเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียโดยใช้สีย้อม JC{{0}} (เทคโนโลยีชีวภาพ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ที่เติบโตในเพลตหกหลุมถูกบำบัดด้วยเอไคนาโคไซด์ 0 ไมโครโมลาร์, 60 ไมโครโมลาร์ หรือ 80 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 5 ชั่วโมง, 12 ชั่วโมงหรือ 24 ชั่วโมง ล้างสองครั้งใน PBS แล้วจึงบ่มด้วย JC-1 เป็นเวลา 20 นาที รูปภาพถูกถ่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ของโอลิมปัส

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism ความสำคัญคำนวณโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว และ P0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ ผลลัพธ์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน

เอ็กไคนาโคไซด์ใน cistanche canแอนตี้อะพอพโทซิสและปรับปรุงภูมิคุ้มกัน