ส่วนที่ 1 การตรวจหา Cistanches Herba (Rou Cong Rong) ผลิตภัณฑ์ยาโดยใช้ลายเซ็นนิวคลีโอไทด์เฉพาะชนิด

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* และ Shi-lin Chen 3

1 ห้องปฏิบัติการหลักของการใช้สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพและการใช้ทรัพยากรของยาสมุนไพรจีน กระทรวงศึกษาธิการ สถาบันพัฒนาพืชสมุนไพร สถาบันวิทยาศาสตร์การแพทย์แห่งจีน และวิทยาลัยยาปักกิ่ง ปักกิ่ง ประเทศจีน 2 NHP Research Alliance, Biodiversity Institute of Ontario (BIO) ), มหาวิทยาลัย Guelph, Guelph, ON, แคนาดา,

3 ห้องปฏิบัติการหลักของกรุงปักกิ่งสำหรับการระบุและประเมินความปลอดภัยของยาจีน สถาบัน Chinese Materia Medica สถาบันวิทยาศาสตร์การแพทย์จีนแห่งประเทศจีน กรุงปักกิ่ง ประเทศจีน

Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

ซิสตันเชส เฮอร์บาเป็นพืชสมุนไพรที่มีคุณสมบัติในการล้างพิษและนิยมใช้ในเอเชีย เนื่องจากความไม่สมดุลระหว่างอุปสงค์และอุปทาน สารเจือปนจึงมักถูกเพิ่มเพื่อผลกำไร อย่างไรก็ตาม ไม่มีการกำกับดูแลด้านกฎระเบียบ เนื่องจากเครื่องมือควบคุมคุณภาพไม่เพียงพอสำหรับการระบุผลิตภัณฑ์แปรรูปจำนวนมาก ด้วยเหตุนี้จึงได้มีการพัฒนาเครื่องมือระดับโมเลกุลแบบใหม่ที่มีพื้นฐานมาจากลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์และไพรเมอร์เฉพาะสปีชีส์ ภูมิภาค ITS2 จาก 251ซิสตันเชส เฮอร์บาและสุ่มตัวอย่างสารเจือปน บนพื้นฐานของไซต์ SNP ลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์สี่ตัวภายใน 30∼37 bp และไพรเมอร์เฉพาะสปีชีส์หกชนิดได้รับการพัฒนา และพวกเขาได้รับการตรวจสอบโดยสารผสมทดลองเทียมซึ่งประกอบด้วยสปีชีส์ที่แตกต่างกันหกชนิดและอัตราส่วนที่แตกต่างกัน วิธีนี้ใช้ตรวจจับ66 .ด้วยซิสตันเชส เฮอร์บาผลิตภัณฑ์ในตลาด รวมทั้งสารสกัดและยาสิทธิบัตรจีน ผลลัพธ์แสดงให้เห็นประโยชน์ของลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์ในการระบุสารเจือปนในสารผสม การศึกษาตลาดพบว่ามีการปลอมปน 36.4 เปอร์เซ็นต์: 19.7 เปอร์เซ็นต์เกี่ยวข้องกับการปลอมปนกับ Cynomorium songaricum หรือCistancheSinensis และ 16.7 เปอร์เซ็นต์เกี่ยวข้องกับการแทนที่ด้วย Cy ซองการิคัม, ซี. sinensis หรือ Boschniakia rossica ผลการวิจัยยังเปิดเผยว่าไซ songaricum เป็นการล่วงประเวณีที่พบบ่อยที่สุดในตลาด ดังนั้น เราแนะนำให้ใช้ลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์จำเพาะสำหรับสปีชีส์เพื่อควบคุมการเจือปนและตรวจสอบการประกันคุณภาพของห่วงโซ่อุปทานของผลิตภัณฑ์ยา โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับผลิตภัณฑ์แปรรูปที่มีดีเอ็นเอเสื่อมโทรม

คำสำคัญ: ซิสตันเชส เฮอร์บา, ยาสิทธิบัตรจีน, ลายเซ็นนิวคลีโอไทด์, DNA เสื่อมโทรม, การควบคุมคุณภาพยา

การแนะนำ

ซิสตันเชส เฮอร์บา(Rou Cong Rong) เป็นยาที่บันทึกโดยเภสัชตำรับที่รู้จักกันดีในเอเชีย (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Japan Pharmacopeial Convention, 2016); ยานี้ได้มาจากลำต้นฉ่ำแห้งของCistanche deserticolaYC หม่าหรือCistanche tubulosaยาชูกำลังเนื่องจากไม่เป็นพิษและสามารถรับประทานได้เป็นเวลานาน (Li et al., 2016). นอกจากนี้,CistanchesHerba ได้รับเกียรติให้เป็น "โสมทะเลทราย" เนื่องจากมีคุณค่าทางยาที่ดี โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการเสริมสร้างสมรรถภาพทางเพศชาย (Zhang and Su, 2014; Gu et al., 2016) มียาสิทธิบัตรจีนมากกว่า 100 รายการที่บันทึกไว้ในคณะกรรมาธิการเภสัชตำรับจีน (2015) และในมาตรฐานอื่นๆ ที่เป็นทางการของท้องถิ่นที่ประกาศใช้ (Wang et al., 2012) เมื่อประชากรสูงอายุเพิ่มขึ้น ความต้องการซิสตันเชส เฮอร์บาและผลิตภัณฑ์ยา อย่างไรก็ตาม ทรัพยากรวัตถุดิบเริ่มหายากขึ้นเรื่อยๆ อันที่จริงทั้งสองสายพันธุ์ดั้งเดิมของซิสตันเชส เฮอร์บาได้เพิ่มลงในสมุดข้อมูลพืชสีแดงของจีนว่าเป็นพืชป่าที่ได้รับการคุ้มครองโดยรัฐ (ประเภท II) (Fu, 1991) วัสดุยาในท้องตลาดส่วนใหญ่ปลูกในจีนตะวันตกเฉียงเหนือ

เนื่องมาจากความไม่สมดุลระหว่างอุปสงค์และอุปทานของCistanchesเฮอร์บา ผู้ล่วงประเวณีจำนวนมากเข้าสู่ตลาด สิ่งเจือปนเหล่านี้ไม่สอดคล้องกับมาตรฐานและสามารถคุกคามความมั่นคงของยาได้ สารเจือปนที่รู้จัก ได้แก่ ลำต้นแห้งฉ่ำของ Cynomorium songaricum Rupr (Cynomorii Herba, Suo Yang ในภาษาจีน),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan และ Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch et Flerov (Sun et al., 2012). สิ่งเจือปนเหล่านี้มีลักษณะทางสัณฐานวิทยาคล้ายกับของCistanchesHerba ทำให้การระบุอนุกรมวิธานแบบดั้งเดิมทำได้ยาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งหลังจากที่วัสดุถูกแปรรูปเป็นผลิตภัณฑ์ยา ไม่มีการระบุด้วยกล้องจุลทรรศน์เพราะCistanchesเฮอร์บาไม่มีลักษณะเฉพาะของกล้องจุลทรรศน์ที่ชัดเจนหรือเฉพาะเจาะจง เครื่องมือเคมีวิเคราะห์ในปัจจุบันไม่เพียงพอสำหรับการตรวจหาการปลอมปนของ Cistanches Herba เนื่องจากสารประกอบที่คล้ายกันยังมีอยู่ในสารเจือปน Ci ที่รู้จักอีกด้วย ซัลซ่า (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) และ Ci. เนซิส (Liu et al., 2013). ดังนั้น การพัฒนาวิธีการระดับโมเลกุลอย่างรวดเร็วสำหรับการรับรองความถูกต้องของ Cistanches Herba และผลิตภัณฑ์ของบริษัทจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับระบบควบคุมคุณภาพที่เหมาะสมในอุตสาหกรรมยาสิทธิบัตรของจีนและอุตสาหกรรมผลิตภัณฑ์ยาอื่นๆ

เฉินและคณะ ครั้งแรกที่แนะนำตัวเว้นวรรคการถอดเสียงภายใน 2 (ITS2) เป็นบาร์โค้ดสากลสำหรับพืชสมุนไพร (Chen et al., 2010) ซันและคณะ ตรวจสอบภูมิภาค ITS2 ว่าเป็นบาร์โค้ด DNA ที่ดีกว่าสำหรับการระบุCistanchesHerba และสารแปลกปลอม (Sun et al., 2012). อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถใช้ ITS2 เพื่อแยกแยะยาสิทธิบัตรของจีนกับ DNA ที่เสื่อมสภาพได้ เมื่อเร็ว ๆ นี้ จำนวนการศึกษาที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่า "บาร์โค้ดขนาดเล็ก" เป็นวิธีที่มีประโยชน์สำหรับการขยายดีเอ็นเอที่เสื่อมโทรม (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2558). อย่างไรก็ตาม ลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์มีความเหมาะสมมากกว่าบาร์โค้ดขนาดเล็ก เนื่องจากตัวแบบอ้างอิงถึงนิวคลีโอไทด์ตั้งแต่หนึ่งชนิดขึ้นไปที่มีลักษณะเฉพาะสำหรับสปีชีส์เดียวและสามารถนำมาใช้อย่างมีประสิทธิภาพด้วยเทคนิคระดับโมเลกุลหลายอย่าง เช่น โพรบดีเอ็นเอ ไมโครฟลูอิดิกส์ และการขยายไอโซเทอร์มอลแบบวนรอบ ( de Boer et al., 2015). ฮันและคณะ พัฒนาลายเซ็นนิวคลีโอไทด์สำหรับโสม Panax, Angelica Sinensis และ Lonicera japonica และประสบความสำเร็จในการระบุยาสิทธิบัตรจีนที่เกี่ยวข้อง (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017)

ผลิตภัณฑ์ที่ประกอบด้วยCistanchesเฮิร์บา. โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เรา (1) ได้พัฒนาลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์สี่ตัวและไพรเมอร์เฉพาะคู่หกคู่เพื่อสร้างความแตกต่างของของแท้CistanchesHerba และสารเจือปนที่รู้จัก (2) ตรวจสอบลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์สี่รายการในการทดลอง รวมถึงส่วนผสมของบัตรกำนัลอนุกรมวิธานที่รู้จักซึ่งใช้ในการเตรียมผลิตภัณฑ์ Cistanches Herba ที่มีส่วนผสมแท้และปลอมปน และ (3) ดำเนินการสำรวจตลาด 66 รายการCistanchesผลิตภัณฑ์เฮอร์บาผ่านลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์

Cistancheมีผลมากมายและสามารถเพิ่มประสิทธิภาพการทำงานของไต

วัสดุและวิธีการ

การรวบรวมและการเตรียมตัวอย่าง

โดยรวมแล้ว เก็บตัวอย่าง 251 ตัวอย่างจากมองโกเลียใน ซินเจียง และหนิงเซี่ย รวมถึงพื้นที่อื่นๆ ตัวอย่างเหล่านี้รวม 214ซิสตันเชส เฮอร์บาและสารเจือปน 37 รายการและมีรายละเอียดอยู่ในตารางเสริม S1 ตัวอย่างบัตรกำนัลที่เกี่ยวข้องได้รับการตรวจสอบโดยนักอนุกรมวิธานและฝากไว้ในสมุนไพรของสถาบันพัฒนาพืชสมุนไพร สถาบันวิทยาศาสตร์การแพทย์จีน ปักกิ่ง ประเทศจีน ผง เครื่องเทศ และสารสกัดจาก . รวม 35 ชุดCistanchesHerba ถูกซื้อจากร้านค้าออนไลน์และร้านขายยาที่มีอิฐและปูนในปักกิ่งและเฉิงตู (ตารางที่ 1) รวม 31 ชุดของสิทธิบัตรยาจีนที่มีCistanchesHerba ถูกซื้อจากร้านขายยาหลายแห่ง (ตารางที่ 2) และองค์ประกอบที่ประกาศของยาสิทธิบัตรจีนต่างๆ จะแสดงในตารางเสริม S3 ลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกันของรูปแบบขนาดยาที่ต่างกันแสดงไว้ในรูปที่ 1

ตัวอย่างแบบผสม: ผงของ Ci.ทะเลทราย, ซี.tubulosa, ซี. ซองการิคัม, ซี. sinensis, B. rossica และ O. coerulescens ถูกผสมเทียมในชุดค่าผสมต่างๆ (ในอัตราส่วน 1:1) ก่อนทำการสกัด รายละเอียดของตัวอย่างผสมเหล่านี้แสดงไว้ในคำอธิบายของรูปที่ 3 นอกจากนี้ ผงของสารเจือปนสี่ชนิดยังผสมกับ Ci ของแท้ Deserticola ที่อัตราส่วนน้ำหนักต่างกัน: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 และ 60000:1 (ตารางที่ 3) และสินค้าของแท้ทั้ง 2 ชิ้นผสมกันในสัดส่วนที่เท่ากัน

ยาต้ม: ชิ้น Ci. Deserticola และ Cy. songaricum ถูกนำมาใช้เพื่อเตรียมยาต้ม ชิ้น (10 กรัม) ถูกต้มในน้ำกลั่นสองครั้ง 300 มล. เป็นเวลา 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 และ 240 นาที จากนั้นใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ

การสกัดดีเอ็นเอ การขยายปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และการจัดลำดับ

ตัวอย่าง ยาต้ม และตัวอย่างผสม: ตัวอย่าง (40– 50 มก.) ถูกบดเป็นผงละเอียดโดยใช้เครื่องผสมสำหรับห้องปฏิบัติการ Retsch MM400 (Retsch Co. ประเทศเยอรมนี) ที่ความถี่ 30 Hz ต่อมาได้สกัดจีโนม DNA ด้วย Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co., China) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ITS2 ได้รับการขยายโดยไพรเมอร์สากล 2F/3R (Chen et al., 2010)

แบบขนานต่อชุด ผงยาสิทธิบัตรจีนถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์พรีล้าง 700 ไมโครลิตร [100 มิลลิโมลาร์ Tris-HCl, pH 8.0; 20 มิลลิโมลาร์ กรดเอทิลีนไดเอมีนเตตระอะซิติก (EDTA), pH 8.0;

70 NaCl 0 มิลลิโมลาร์; โพลิไวนิลไพร์โรลิโดน 2 เปอร์เซ็นต์ (PVP)-40; และ 0.4 เปอร์เซ็นต์ -เมอร์แคปโตเอธานอล] หลาย ๆ ครั้งจนกระทั่งส่วนลอยเหนือตะกอนนั้นใสและไม่มีสี หลังจากนั้นก็ปั่นเหวี่ยงส่วนผสมที่ 7500 × g เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ต่อมาตะกอนถูกใช้เพื่อสกัดจีโนม DNA ผ่าน Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co. ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ในท้ายที่สุด ดีเอ็นเอจากแต่ละแบทช์ถูกทำให้เข้มข้นในหลอดเดียว คู่ไพรเมอร์เฉพาะสปีชีส์หกคู่—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR และ LDF/LDR—ได้รับการออกแบบผ่าน Primer Premier

6.0 ซอฟต์แวร์ (Premier Co., Canada) เพื่อขยาย Cistanches Herba และสารเจือปน (รายละเอียดแสดงในตารางที่ 4) PCR ถูกดำเนินการในปฏิกิริยาปริมาตร 50 ไมโครลิตรที่มี 1 ไมโครลิตรของ

KOD FX (Toyobo Co. , Japan), 25 µL ของ 2 × PCR buffer, 10 µL ของ dNTPs (2 mM), 1.5 µL ของไพรเมอร์แต่ละตัว (10 µM) และ 4 µL (∼50 ng) ของเทมเพลต DNA; ปริมาณที่เหลือเป็นน้ำกลั่นสองครั้ง ปฏิกิริยาถูกดำเนินการโดย

เครื่องทำความร้อน (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); โปรแกรมระบายความร้อนแสดงอยู่ในตารางที่ 4 ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการตรวจสอบผ่าน 3 เปอร์เซ็นต์ของ agarose gel electrophoresis และทำให้บริสุทธิ์สำหรับการจัดลำดับแบบสองทิศทางด้วยซีเควนเซอร์ ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) ตามวิธีการจัดลำดับ Sanger จากนั้น ความไวของไพรเมอร์ทั้งหกได้รับการทดสอบผ่านการทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qRT-PCR) ด้วย CFX96 Real-time System (Bio-rad Lab., USA) ระบบคำนวณเกณฑ์รอบโดยอัตโนมัติผ่านโมเดล "PCR Baseline Subtracted Curve Fit" qRT-PCR ถูกดำเนินการในปฏิกิริยาปริมาตร 15 ไมโครลิตรที่มี 7.5 ไมโครลิตรของพรีมิกซ์ SYBRⓍR Ex ​​TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co. ประเทศญี่ปุ่น), 1.0 µL ของไพรเมอร์แต่ละตัว (10 µM) และเทมเพลต DNA 1.0 µL โดยปริมาตรที่เหลือประกอบด้วยน้ำกลั่นสองครั้ง qRT-PCR ดำเนินการด้วยการจำลองทางเทคนิคสามครั้งโดยพิจารณาจากข้อผิดพลาดมาตรฐานที่คำนวณไว้

การวิเคราะห์ลำดับ: ลำดับได้รับการแก้ไขและประกอบด้วยตนเองผ่าน CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA)

ลำดับ ITS จาก GenBank ได้รับการใส่หมายเหตุผ่านโมเดล Hidden Markov (HMM) เพื่อให้ได้ลำดับ ITS2 (Keller et al., 2009) จากนั้น ลำดับจะถูกจัดเรียงโดยซอฟต์แวร์ MEGA 5.0 ผ่านวิธีการจัดตำแหน่ง "กล้ามเนื้อ" (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011)

Cistancheมีผลมากมายและสามารถเพิ่มประสิทธิภาพไตการทำงาน

ผลลัพธ์

การพัฒนาลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์และไพรเมอร์เฉพาะชนิดสำหรับ Cistanches Herba และสารก่อมะเร็ง

อัตราความสำเร็จของการขยาย PCR และการจัดลำดับของตัวอย่าง 251 ตัวอย่างคือ 100 เปอร์เซ็นต์เมื่อใช้ไพรเมอร์คู่ 2F/3R ความยาวชิดกันของ Cy ลำดับเพลง ITS2 ของ songaricum คือ 229 bp (รูปที่ S1) เสริม การวิเคราะห์ลำดับจากพันธุ์พืชสมุนไพรและของสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดที่ดึงมาจาก GenBank (ตารางเสริม S2) เผยให้เห็นไซต์พหุสัณฐานของนิวคลีโอไทด์เดี่ยว (SNP) สองแห่งสำหรับ Cy ซองการิคัม บนพื้นฐานของ SNPs หนึ่ง Cy เอกลักษณ์เฉพาะของ songaricum 30- bp ลายเซ็นนิวคลีโอไทด์ (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') ได้รับการพัฒนา (รูปที่ 2A) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ให้ผลลัพธ์ใน NCBI แสดงให้เห็นว่าลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์นี้มีเอกลักษณ์เฉพาะสำหรับ Cy songaricum (ตารางที่ 5). ด้วยการวิเคราะห์ที่คล้ายคลึงกันของลำดับจากสปีชีส์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด SNP หนึ่งถึงสองถูกค้นพบจาก Ci sinensis, B. rossica และ O. coerulescens บนพื้นฐานของ SNPs ลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์สำหรับสารเจือปนอีกสามตัวยังได้รับการพัฒนาในทำนองเดียวกัน ซึ่งรวมถึงลายเซ็น 34 bp (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) สำหรับ Ci Sinensis, ลายเซ็น 37 bp (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') สำหรับ B. rossica และลายเซ็น 31 bp (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg g{{.26 co}er}′) สำหรับ Os (รูปที่ 2BD). การวิเคราะห์ BLAST ใน NCBI ยังเปิดเผยว่าลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์เหล่านี้มีความเฉพาะเจาะจงและไม่มีอยู่ในสปีชีส์อื่นใด (ตารางที่ 5)

ซิสตันเชส เฮอร์บาและสารเจือปนของมันสามารถถูกขยายพร้อมกันจากของผสมผ่านคู่ไพรเมอร์สากล 2F/3R ดังนั้นเราจึงออกแบบไพรเมอร์เฉพาะสปีชีส์สำหรับการขยายลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์โดยจัดแนวลำดับ ITS2 คู่ไพรเมอร์จำเพาะสี่คู่—SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR และ LDF/LDR—ได้รับการออกแบบเพื่อขยายลายเซ็นนิวคลีโอไทด์ของ Cy ซองการิคัม, บี. รอสซิกา, ซี. sinensis และ O. coerulescens ตามลำดับ (ตารางที่ 4) ความยาวของแอมพลิคอนคือ 123, 72, 131 และ 71 bp ตามลำดับ

นอกจากนี้ยังวิเคราะห์ลำดับ ITS2 ทั้งหมด 214 รายการจากวัสดุทดลอง Cistanches Herba ไพรเมอร์จำเพาะแบบสั้นสองตัว—HMRCF/HMRCR และ GHRCF/GHRCR สำหรับ Ci Deserticola และ Ci tubulosa ตามลำดับ—ได้รับการออกแบบมาเพื่อเพิ่มพื้นที่สั้นของตัวอย่างที่เสื่อมโทรม (ตารางที่ 4) ความยาวของแอมพลิคอนคือ 132 และ 134 bp ตามลำดับ

การตรวจสอบความถูกต้องของลายเซ็นนิวคลีโอไทด์และวิธีการไพรเมอร์เฉพาะชนิดตามของผสมเทียมและยาต้ม

ประสิทธิภาพการขยายเสียงของคู่ไพรเมอร์ใหม่ถูกตรวจสอบความถูกต้องจากของผสม ได้ผลิตภัณฑ์ PCR ผ่านไพรเมอร์แต่ละคู่สำหรับสปีชีส์เป้าหมายแต่ละชนิด ดังที่แสดง

ค่า cq ของ B. rossica หรือ O. coerulescens สามารถรับได้แม้สัดส่วนของตัวอย่างคือ 30000:1 หรือ 40000:1 และผลการขยายสัญญาณของ Ci ไซเนนซิส, ซี.tubulosaและตรวจพบ Ci Deserticola เมื่ออัตราส่วนเท่ากับ 20000:1 แต่ไม่สามารถหาผลลัพธ์ที่ตรวจพบได้สำหรับ Cy songaricum เมื่อเป็นสัดส่วน 20000:1.

เพื่อตรวจสอบว่าวิธีการลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์ทำงานกับวัสดุที่ผ่านกรรมวิธีหรือไม่ การต้มของ Ci. Deserticola และ Cy. Songaricum ถูกเตรียม ผลการวิจัยพบว่าบาร์โค้ดสั้นจาก Ci. Deserticola สามารถขยายได้แม้หลังจากที่ตัวอย่างถูกต้มเป็นเวลา 210 นาที นอกจากนี้ ลายเซ็นนิวคลีโอไทด์ของ Cy. Songaricum สามารถขยายได้หลังจากต้มตัวอย่างเป็นเวลา 150 นาที ในขณะที่ตรวจไม่พบผลิตภัณฑ์ PCR หลังจากต้มตัวอย่างเป็นเวลา 210 หรือ 240 นาที (รูปที่ 4) ผลการจัดลำดับแสดงให้เห็นว่าได้ลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์แบบสั้นจากยาต้มได้สำเร็จ

การสำรวจตลาดของการปลอมปนผ่านลายเซ็นนิวคลีโอไทด์และไพรเมอร์เฉพาะ

ใช้วิธีข้างต้นในการตรวจจับCistanchesผลิตภัณฑ์ของเฮอร์บาในตลาด สามสิบห้าชุดของCistanchesชิ้น ผงและสารสกัดของ Herba ถูกขยายและจัดลำดับโดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะที่ออกแบบมาหกชนิด (ผลลัพธ์ของเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสของ agarose จะแสดงในรูปที่ S2 เพิ่มเติม และลำดับแสดงอยู่ในเอกสารข้อมูลเสริม 1) การวิเคราะห์ลำดับผ่านลายเซ็นของนิวคลีโอไทด์เปิดเผยว่าชิ้นส่วนห้าชุดเป็นของจริง แบทช์สไลซ์หนึ่งแบทช์และหนึ่งแบทช์แบบผงถูกแทนที่ด้วย Cy songaricum และสารสกัดหนึ่งชนิดถูกแทนที่ด้วย Ci ไซเนนซิส ผงอีกหกชุดเป็นของผสม: ห้าชุดถูกเจือปนด้วย Cy songaricum และ Ci sinensis และอีกตัวหนึ่งถูกเจือปนด้วย Cy songaricum (ตารางที่ 1). นอกจากนี้ แทนที่ชุดหนึ่งชิ้นด้วย Salvia miltiorrhiza

Cistanches Herba ในยาสิทธิบัตรของจีนอยู่ภายใต้กระบวนการต่างๆ ที่ทำให้การรับรองความถูกต้องยากขึ้น ความสามารถของไพรเมอร์หกคู่ในการขยายขอบเขตลายเซ็นนิวคลีโอไทด์จำเพาะของสปีชีส์จากยาสิทธิบัตรจีนได้รับการทดสอบ ยาสิทธิบัตรของจีนส่วนใหญ่มีส่วนประกอบของสปีชีส์ประเภทต่างๆ ตัวอย่างเช่น ยาเม็ด Shihu Yeguang (ZCY34) มีส่วนผสม 25 ชนิด ได้แก่ Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) และ Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen) จากส่วนผสมเหล่านี้ Cistanches Herba สามารถขยายได้เฉพาะผ่านไพรเมอร์คู่ GHRCF/GHRCR การจัดลำดับโดยตรงของผลิตภัณฑ์ PCR เผยให้เห็นร่องรอยที่สะอาดมาก อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถรับแถบที่มองเห็นได้ด้วยไพรเมอร์คู่ HMRCF/HMRCR

อีกตัวอย่างหนึ่งคือยา Kangguzhi Zengsheng (ZCY44) มีส่วนผสมแปดอย่างนอกเหนือจากCistanchesHerba ในยาสิทธิบัตรจีนนี้ แต่ไม่มีแถบที่มองเห็นได้จาก GHRCF/GHRCR หรือ HMRCF/HMRCR ซึ่งหมายความว่าไม่มีซิสตันเชส เฮอร์บามีอยู่ อย่างไรก็ตามบริเวณที่เจือปนของ Cy. songaricum ได้รับการขยายสำเร็จโดยไพรเมอร์คู่เฉพาะ SYF1/SYR1 ผลการจัดลำดับแสดงให้เห็นลายเซ็นสั้นของนิวคลีโอไทด์ของ Cy ได้รับ songaricum สำเร็จแล้ว

Cistancheมีหลายหน้าที่และมีต้านการอักเสบเอฟเฟกต์