ส่วนที่ 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide ยับยั้งการสูญเสียกระดูกที่เกิดจาก OVX ในหนูเมาส์และ Osteoclastogenesis ที่เกิดจาก RANKL

1. บทนำ

โรคกระดูกพรุน—โรคที่มีลักษณะเฉพาะโดยมวลกระดูกลดลง โครงสร้างจุลภาคของเนื้อเยื่อกระดูกผิดปกติ ความเปราะบางของกระดูกที่เพิ่มขึ้น และการแตกหัก (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli และ Ginaldi, 2006)— ปัจจุบันส่งผลกระทบต่อผู้คนมากกว่า 200 ล้านคนทั่วโลกและนำเสนอการแพทย์ที่สำคัญและ ภาระทางเศรษฐกิจและสังคมในสังคมสมัยใหม่ (Strom et al., 2011). การรักษาทางคลินิกของโรคกระดูกพรุนมุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนฮอร์โมน บิสฟอสโฟเนต หรือการบำบัดด้วยดีโนซูแมบเป็นหลัก วิธีการเหล่านี้มีประสิทธิภาพแต่ก่อให้เกิดผลข้างเคียงในระยะยาว เช่น ความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นจากมะเร็งเต้านมและกระดูกโคนขาหักผิดปกติ (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011) ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนในการสำรวจยาที่ไม่เพียงแต่ยับยั้งได้โรคกระดูกพรุนแต่ยังมีผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์น้อยกว่า

Cistanche deserticola(CD) ยาชูกำลังและอาหารทางการแพทย์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในประเทศจีน เรียกว่า "โสมทะเลทราย" เป็นลำต้นอวบน้ำแห้งที่มีเกล็ดของค. ทะเลทรายิโคลาYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) และมีความหลากหลายและมีประสิทธิภาพเภสัชวิทยากิจกรรมเช่น การควบคุมภูมิคุ้มกัน การต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน และการต่อต้านโรคกระดูกพรุนคุณสมบัติ (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). การศึกษาก่อนหน้านี้เกี่ยวกับสารออกฤทธิ์ของซีดีในการรักษาโรคกระดูกพรุนเน้นที่phenylethanoidไกลโคไซด์(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). อย่างไรก็ตาม ซีดียังมีส่วนประกอบที่มีประสิทธิภาพอื่นๆ เช่น อิริดอยด์ ลิกแนนพอลิแซ็กคาไรด์(หวาง, จาง, & Xie, 2012). การประยุกต์ใช้ทางคลินิกของการแพทย์แผนจีน (TCM) ส่วนใหญ่เป็นการต้มน้ำโพลีแซ็กคาไรด์เป็นส่วนประกอบที่ละลายน้ำได้และมักจะเป็นส่วนประกอบทางเภสัชพลศาสตร์หลักของ TCM พอลิแซ็กคาไรด์ที่สกัดจาก TCM มีรายงานว่ามีฤทธิ์ต้านโรคกระดูกพรุนผลกระทบและผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์บางประการซึ่งโดยทั่วไปแล้วจะใช้ในคลินิก (เช่น โพลีแซคคาไรด์ที่สกัดจาก Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) และ Morinda officinalis (Yan et al., 2019)) ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐานว่าCistanche deserticolaพอลิแซ็กคาไรด์(CDP) ที่สกัดจากซีดีอาจเป็นยาที่อาจปลอดภัยสำหรับการรักษาโรคกระดูกพรุน

โดยปกติ การสลายของกระดูกและการสร้างกระดูกจะรักษาสมดุลแบบไดนามิกในระหว่างการสร้างกระดูกใหม่โดยประสานกับเซลล์หลายประเภท รวมถึงเซลล์สร้างกระดูก เซลล์สร้างกระดูก เซลล์เยื่อบุกระดูก และเซลล์สร้างกระดูก (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012) การเสียสมดุลนี้อาจส่งผลให้เกิดโรคเกี่ยวกับการเผาผลาญของกระดูกได้หลายอย่าง เช่นโรคกระดูกพรุน(Zhu et al., 2018) และโรคกระดูกพรุน (Ihde et al., 2011). Osteoclasts ในฐานะเซลล์ที่มีความแตกต่างสุดท้ายที่ได้มาจากเชื้อสายโมโนนิวเคลียร์/มาโครฟาจ เป็นเซลล์เดียวที่มีฟังก์ชันการสลายของกระดูก (Teitelbaum, 2000) มีไซโตไคน์ที่สำคัญสองชนิดที่มีส่วนร่วมในการสร้างความแตกต่างและการเจริญเติบโตของ osteoclast (Koga et al., 2004): ปัจจัยกระตุ้นอาณานิคมของมาโครฟาจ (M-CSF) และตัวกระตุ้นตัวรับของปัจจัยนิวเคลียร์ κB (NF-κB) ลิแกนด์ (RANKL) M-CSF ไกล่เกลี่ยการสร้างความแตกต่างของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดไปเป็นต้นกำเนิดของ osteoclast และส่งเสริมการสร้างความแตกต่างของ osteoclasts โดยการปรับการแสดงออกของตัวรับ RANK (Takayanagi, 2007) การจับกันของ RANKL และ RANK บนพื้นผิวเซลล์ osteoclast ส่งผลให้เกิดสิ่งต่อไปนี้: (1) การจัดหาโมเลกุลตัวปรับสัญญาณเช่น TNF รีเซพเตอร์ที่เกี่ยวข้องกับแฟคเตอร์ 6 (TRAF6); (2) การกระตุ้นเป้าหมายดาวน์สตรีมหลายรายการ รวมถึง NF- κB และโปรตีนไคเนสที่กระตุ้นด้วยไมโตเจน (MAPKs); และ (3) การควบคุมระดับการแสดงออกของปัจจัยนิวเคลียร์ของทีเซลล์ที่ถูกกระตุ้น ไซโตพลาสซึม 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007) การกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณเหล่านี้จะควบคุมการแสดงออกของยีน osteoclast โดยตรง รวมถึงกรดฟอสฟาเตส 5 (Acp5) [การเข้ารหัสกรดฟอสฟาเตสที่ดื้อต่อทาร์เทรต (TRAcP)] เมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน 9 (MMP9) และคาเทปซินเค (CTSK) (บอยล์, ซิโมเนต์) , & เลซีย์, 2003). ดังนั้น การยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้องกับการสร้างความแตกต่างของ RANKL ที่เกิดจาก RANKL จึงเป็นวิธีการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับโรคกระดูกพรุน

ในการศึกษานี้ เรามุ่งที่จะพิจารณาผลของการรักษา CDP ต่อการตัดรังไข่ (OVX)โรคกระดูกพรุนแบบจำลองเมาส์ ในร่างกาย และกิจกรรม osteoclast ที่เกิดจาก RANKL ในหลอดทดลอง โดยเน้นที่การแสดงออกของยีนเฉพาะของ osteoclast และการกระตุ้น NFATc1 และเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ MAPK การค้นพบของเราอาจให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับศักยภาพของ CDP ในฐานะยาที่ปลอดภัยและมีประสิทธิภาพในการรักษาโรคกระดูกพรุน

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysaccharide Cistanche deserticola มีผลกับโรคกระดูกพรุนมากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. สารเคมีและการเก็บตัวอย่าง

ซีดี (หมายเลข 180801) ถูกซื้อจาก Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (มณฑลอานฮุย ประเทศจีน) และระบุโดยศาสตราจารย์ Haibo Huang จาก School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine เมืองกวางโจว ประเทศจีน เม็ด Estradiol valerate ถูกซื้อจากไบเออร์ (เลเวอร์คูเซ่น, นอร์ธไรน์-เวสต์ฟาเลีย, เยอรมนี) สื่อจำเป็นขั้นต่ำที่ดัดแปลงโดยอัลฟ่า

( -MEM) และซีรัมของตัวอ่อนในครรภ์ (FBS) ได้มาจาก Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ยาเพนนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซินและชุดย้อมสี TRAcP ได้มาจาก Solarbio (ปักกิ่ง ประเทศจีน) M-CSF ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมและ RANKL ของหนูเมาส์ชนิดลูกผสมถูกจัดหาจากระบบ R&D (มินนิอาโปลิส รัฐมินนิโซตา สหรัฐอเมริกา) แผ่นเคลือบไฮดรอกซีอะพาไทต์ซื้อมาจาก Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับ NFATc1 และ CTSK (เทคโนโลยีชีวภาพของซานตาครูซ, ซานตาครูซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา); IκB- , p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK และ P-JNK (เทคโนโลยีสัญญาณมือถือ, Danvers, MA, USA); และ -actin (CWBIO, ปักกิ่ง, จีน) ก็ได้รับเช่นกัน รีเอเจนต์อื่นๆ ที่ใช้ในการศึกษานี้เป็นระดับการวิเคราะห์ และน้ำถูกทำให้บริสุทธิ์โดยระบบทำน้ำให้บริสุทธิ์ Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA)

2.2. การสกัด CDP

ซีดีถูกบดเป็นผงละเอียดและผสมกับปิโตรเลียมอีเทอร์สามครั้งเพื่อกำจัดมัน เรซิดิวที่เป็นของแข็งถูกรวบรวมโดยการกรองแล้วทำให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง ดิพอลิแซ็กคาไรด์สกัดจากตัวอย่างที่บำบัดไว้ล่วงหน้าสามครั้งด้วยน้ำเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ทำให้เข้มข้น ตกตะกอนโดยการเติมเอธานอลที่ปราศจากน้ำจนถึงความเข้มข้นสุดท้าย 80 เปอร์เซ็นต์ (ปริมาตร/ปริมาตร) และเก็บไว้ที่ 4 ◦C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บตกตะกอนโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 20 นาที ละลายในน้ำกลั่น และทำให้บริสุทธิ์ (การกำจัดโปรตีนอิสระ) โดยใช้วิธี Sevag (Zhao et al., 2019) หายแล้วพอลิแซ็กคาไรด์ถูกฟอก, ตากแห้ง, และเก็บไว้จนกว่าจะใช้ต่อไป. นอกจากนี้ ผลองค์ประกอบทางเคมีพบว่าปริมาณน้ำตาล กรดยูริก ซัลเฟต และโปรตีนของ CDP เท่ากับ 6763 0.98 เปอร์เซ็นต์ , 21.05 0.49 เปอร์เซ็นต์ , 1.{{7 }}.24 เปอร์เซ็นต์ และ 8.{10}}.36 เปอร์เซ็นต์

องค์ประกอบโมโนแซ็กคาไรด์และการวิเคราะห์ฟูเรียร์ทรานส์ฟอร์มอินฟราเรดของ CDP แสดงในรูปที่ 1 และ 2 เพิ่มเติม

2.3. แบบจำลองหนูเมาส์โรคกระดูกพรุนที่เกิดจาก OVX

การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว (อนุมัติ SYXK 2019-0202) หนู C57BL/6 เพศเมียอายุสามสิบ 6-สัปดาห์ จัดหาโดยศูนย์สัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนกวางโจว หลังจากการเคยชินกับสภาพเป็นเวลา 1 สัปดาห์ หนูกลุ่มหนึ่งได้รับการผ่าตัดหลอก (กลุ่มหลอกลวง) ในขณะที่หนูที่เหลือได้รับการผ่าตัดรังไข่ (กลุ่ม OVX) หลังการผ่าตัด หนูได้รับอนุญาตให้ฟื้นตัวเป็นเวลา 1-สัปดาห์ จากนั้น แบบจำลองหนูที่ประสบความสำเร็จจะถูกแบ่งแบบสุ่มออกเป็น 5 กลุ่ม โดยมีหนู 6 ตัวต่อกลุ่ม:

(1) กลุ่มหลอกลวง: บำบัดด้วยน้ำกลั่น (2) กลุ่ม OVX: บำบัดด้วยน้ำกลั่น (3) กลุ่ม OVX E2 (E2): บำบัดด้วยยา estradiol valerate 0.13 มก./กก. (4 ) กลุ่มที่ได้รับยา OVX CDP ต่ำ (CDP-L): บำบัดด้วย CDP 300 มก./กก. (5) กลุ่มที่มีขนาดยาสูง OVX CDP (CDP-H): รับการรักษาด้วย CDP 600 มก./กก. น้ำกลั่น, E2 หรือ CDP ถูกบริหารให้โดยทางสายยางวันละครั้ง หนูทุกตัวถูกสังเวยหลังช่วงการรักษา 12- สัปดาห์ (รูปที่ 1A) มดลูกถูกรวบรวมและชั่งน้ำหนักและรวบรวมกระดูกหน้าแข้งซ้ายเพื่อการตรวจครั้งต่อไป เก็บตัวอย่างเลือดครบส่วนและหมุนเหวี่ยงที่ 5,000 รอบต่อนาทีสำหรับ

15 นาทีที่ 4 ◦C สารเหนือตะกอนในซีรัมถูกสำลักและเก็บไว้ที่

—80 ◦C จนกว่าจะวิเคราะห์ต่อไป

2.4. การตรวจเอกซเรย์คอมพิวเตอร์ด้วยไมโครคอมพิวเตอร์ (micro-CT) และฮิสโตมอร์โฟเมทรีของกระดูก

กระดูกแข้งด้านซ้ายถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 48 ชั่วโมง และจากนั้นนำไปใส่ในหลอดหมุนเหวี่ยงที่มีน้ำเกลือปกติ ตัวอย่างคงที่ถูกสแกนด้วยเครื่องมือ Skyscan 1172 micro-CT (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, เบลเยียม) โดยใช้การตั้งค่าต่อไปนี้: แรงดันไฟฟ้า 80 kV; แหล่งกระแส 100 μA; อัล, ตัวกรอง 0.5 มม.; พิกเซล

ขนาด 9.76 ไมครอน; และขั้นตอนการหมุน 0.6◦ พารามิเตอร์หลายอย่างของ

กระดูก trabecular รวมถึงความหนาแน่นของมวลกระดูก (BMD) เศษส่วนของปริมาตรกระดูก (BV/TV) พื้นผิวกระดูกต่อปริมาตรทั้งหมด (BS/TV) จำนวน trabecular (Tb. N) และระยะห่าง trabecular (Tb. Sp) ถูกวัดโดยใช้ ซอฟต์แวร์ CT- Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan) ภาพสามมิติถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan)

ตามการวิเคราะห์ด้วย micro-CT กระดูกหน้าแข้งด้านซ้ายถูก decalcified ในสารละลาย EDTA 14 เปอร์เซ็นต์และฝังลงในพาราฟินสำหรับการแบ่งส่วน ตัวอย่างถูกหั่นเป็นส่วนๆ 5 ไมโครเมตรโดยใช้ไมโครโทมก่อนการทดลองย้อมฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (H&E) และ TRAcP ส่วนที่เปื้อนได้รับการตรวจสอบและบันทึกโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan)

Cistancheสามารถเพิ่มความหนาแน่นของกระดูกและบรรเทาโรคกระดูกพรุนได้

2.5. การวิเคราะห์เซรั่ม

ความเข้มข้นของแคลเซียม (Ca) และฟอสฟอรัส (P) ถูกกำหนดตามคำแนะนำในชุดอุปกรณ์ที่ออกแบบโดยสถาบัน Nanjing Jiancheng Bioengineering (หนานจิง ประเทศจีน) ระดับ TRAcP-5b และ RANKL ในซีรัมถูกวิเคราะห์โดยใช้ TRAcP-5b ELISA kit (CUSABIO, หวู่ฮั่น, จีน) และ RANKL ELISA kit (Cloud-CloneCorp., หวู่ฮั่น, จีน) ตามลำดับ

2.6. ในหลอดทดลอง osteoclastogenesis assay

BMM ถูกแยกออกจากกระดูกแข้งและกระดูกโคนขาของหนูเมาส์ C57BL/6 เพศเมียอายุ 6-สัปดาห์ เซลล์ที่ถูกแยกเดี่ยวถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง -MEM ที่มี M-CSF 25 ng/mL, FBS 10 เปอร์เซ็นต์ และเพนิซิลลิน/สเตรปโตมัยซิน 1 เปอร์เซ็นต์ เมื่อไปถึงการบรรจบกัน BMM (1 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมและบำบัดด้วย CDP ในการมีอยู่ของ 50 ng/mL RANKL สื่อและ CDP ถูกแทนที่ทุก 2 วัน หลังจาก 7 วัน เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์และย้อมสำหรับการมีอยู่ของ TRAcP จำนวนเซลล์สร้างกระดูกซึ่งกำหนดเป็น TRAcP- เซลล์ที่เป็นบวกที่มีนิวเคลียสตั้งแต่สามนิวเคลียสขึ้นไป ถูกนับและจัดทำเป็นเอกสารโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

2.7. การทดสอบการเพิ่มจำนวนเซลล์

BMM (1 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจาน96-หลุมและบ่มข้ามคืน ต่อจากนี้ เซลล์ถูกบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 และ 40 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง การบรรจบกันของเซลล์ถูกตรวจพบและวิเคราะห์โดยใช้ IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) ซึ่งเป็นระบบสร้างภาพเซลล์มีชีวิตแบบไดนามิกแบบเรียลไทม์ในระยะยาว

2.8. การทดสอบการสลายของไฮดรอกซีอะพาไทต์

BMM ({{0}} เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจานที่เคลือบด้วยไฮดรอกซีอะพาไทต์ บำบัดด้วย CDP ที่ความเข้มข้นที่ระบุ (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) และเพาะเลี้ยงใน -MEM ที่สมบูรณ์ ที่มี M-CSF 25 ng/mL และ 50 ng/mL RANKL หลังจากผ่านไป 7 วัน เซลล์จะถูกล้างด้วยสารละลายฟอกขาว 10 เปอร์เซ็นต์เพื่อเอาส่วนประกอบของเซลล์ออก ภาพของพื้นที่การดูดกลืนไฮดรอกซีอะพาไทต์ถูกจับโดยใช้ IncuCyte ZOOM® และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003)

2.9. การแยก RNA และการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณการถอดรหัสย้อนกลับแบบเรียลไทม์ (RT-qPCR)

BMM ({{0}} เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจาน 6-หลุมและกระตุ้นด้วย RANKL และ M-CSF ในการมีอยู่ของ CDP ที่ความเข้มข้นต่างกัน (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 5 วัน RNA ทั้งหมดถูกแยกออกจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อกระดูกของหนูเมาส์โดยใช้รีเอเจนต์ TRIzol (Sigma- Aldrich) DNA เสริมถูกสังเคราะห์จาก RNA ทั้งหมด 2 ไมโครกรัมโดยใช้ชุด reverse transcriptase (TransGen Biotech, Beijing, China) ปฏิกิริยา RT-qPCR ถูกเตรียมโดยใช้ PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) และตรวจพบโดยระบบ ABI 7500 (ประยุกต์

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) พารามิเตอร์การปั่นจักรยานสำหรับ PCR ถูกกำหนดไว้ดังนี้: 95 ◦C เป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 40 รอบที่ 95 ◦C เป็นเวลา 15 วินาที และ 60 ◦C เป็นเวลา 30 วินาที ไพรเมอร์จำเพาะที่ใช้แสดงไว้ในตารางที่ 1 และปริมาณของยีนเป้าหมายแต่ละยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานเป็น GAPDH (กลุ่มควบคุมภายใน)

2.10. การวิเคราะห์ Western blot

BMM ({{0}} เซลล์/หลุม) ถูกเพาะในจาน 6-หลุม สำหรับการทดลองในระยะเวลาสั้นๆ เซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ CDP (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และจากนั้นบำบัดด้วย RANKL 50 ng/mL เป็นเวลา 30 นาที . เป็นเวลานาน เซลล์ถูกกระตุ้นด้วย RANKL 50 นาโนกรัม/มิลลิลิตรในวันที่ 3, 5 และ 7 ในการมีอยู่ของ CDP (0, 5 และ 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) โปรตีนทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ RIPA lysis buffer (CWBIO) โปรตีนถูกแยกออกโดย 10 เปอร์เซ็นต์ SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเยื่อ PVDF เยื่อเมมเบรนถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนยร้อยละ 5 ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง บ่มด้วยน้ำนมปฐมภูมิ

แอนติบอดีในชั่วข้ามคืนที่อุณหภูมิ 4 ◦C และตามด้วยรองที่สอดคล้องกัน

แอนติบอดีเป็นเวลา 1.5 ชั่วโมง เมมเบรนได้รับการพัฒนาโดยใช้รีเอเจนต์ ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) และถ่ายภาพโดยใช้ Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Shanghai, China)

Cistancheสามารถเพิ่มความหนาแน่นของกระดูก

2.11. การตรวจจับการโยกย้าย NFATc1 โดยใช้การทดสอบอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์

BMM ถูกเพาะลงบนแผ่นปิด {0}} หลุม กระตุ้นด้วย RANKL และ M-CSF และบำบัดด้วย CDP 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เป็นเวลา 5 วัน เซลล์ถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาที ล้างสามครั้งด้วย PBS และซึมผ่านด้วย 0.1 เปอร์เซ็นต์ Triton X-100 เป็นเวลา 10 นาที เซลล์ถูกผสมกับซีรัมแพะ 10 เปอร์เซ็นต์ (CWBIO) และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ต่อจากนั้น เซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิในชั่วข้ามคืนที่ 4 ◦C และจากนั้นด้วยแอนติบอดีรองต้านเมาส์ของแพะ Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, USA) ในความมืดเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แผ่นปิดถูกล้างด้วย PBS, ติดตั้งใน Prolong Gold Antifade Reagent ด้วย 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar) และ

ตรวจสอบโดยใช้ Zeiss LSM 800 กับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

2.12. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลการทดลองทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ทางสถิติ SPSS 250 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA) ข้อมูลสำหรับการศึกษาในสัตว์และเซลล์แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM และค่าเฉลี่ย ± SD ตามลำดับ ผลลัพธ์ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียวหรือการทดสอบ t ของนักเรียน ค่าของ p < 0.05="">

Cistancheลดได้อะพอพโทซิสและเสริมสร้างกระดูกความหนาแน่น