ส่วนที่ 1 ผลของสารต้านอนุมูลอิสระและสารต้านการแข็งตัวของเลือดของ Phenylpropanoid Glycosides ที่แยกได้จาก Broomrapes (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria และ P. Ramosa)
Mar 06, 2022
Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,
Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a*
a University of Ło´d´z ภาควิชาชีวเคมีทั่วไป คณะชีววิทยาและการคุ้มครองสิ่งแวดล้อม 90-236 Ł´od´z โปแลนด์
b ภาควิชาชีวเคมีและคุณภาพพืชผล สถาบันวิทยาศาสตร์ดินและการเพาะปลูกพืช สถาบันวิจัยแห่งรัฐ 24-100 Puławy ประเทศโปแลนด์
ศูนย์วิจัยและอนุรักษ์ความหลากหลายทางชีวภาพ ภาควิชาชีววิทยาสิ่งแวดล้อม สถาบันชีววิทยา Jan Kochanowski University 25-406 Kielce โปแลนด์
เชิงนามธรรม
พืช Holoparasitic ของ Orobanchaceae รวมทั้งCistanche, Orobanche และ Phelipanche spp เป็นที่รู้จักจากความอุดมสมบูรณ์ของฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์ (PPGs) พบว่าสารประกอบ PPG จำนวนมากมีกิจกรรมที่หลากหลาย เช่น ยาต้านจุลชีพ ต้านการอักเสบ ต้านอนุมูลอิสระ และเสริมสร้างความจำ เพื่อสำรวจศักยภาพทางชีวภาพของไม้กวาดไม้ถูพื้นยุโรปให้ดีขึ้น (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) และองค์ประกอบฟีนิลโพรพานอยด์ที่แยกได้ 10 ชนิด เราจึงตรวจสอบฤทธิ์ต้านเรเดียลของพวกมัน ฤทธิ์ป้องกันการเกิดออกซิเดชันในพลาสมาในหลอดทดลอง และอิทธิพลต่อพารามิเตอร์การแข็งตัวของเลือด สารสกัดที่ทดสอบแสดงให้เห็นกิจกรรมการกวาดล้าง 50–70 เปอร์เซ็นต์ของพลังของ Trolox สารสกัดจาก OC ที่อุดมไปด้วยแอคทีโอไซด์มีศักยภาพในการต้านสารอนุมูลอิสระได้ดีกว่าสารสกัด PR มากกว่าร้อยละ 20 ซึ่งเป็นชนิดเดียวที่มี PPG ที่ไม่มีมอยอิตี B-ring catechol ในหน่วย acyl นอกจากนี้ ยังพบว่า PPG ที่ทดสอบเพียงแปดตัวเท่านั้นที่แสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการต้านอนุมูลอิสระในพลาสมาของมนุษย์ที่บำบัดด้วย H2O2/Fe อย่างไรก็ตาม PPG ที่ทดสอบทั้งสามชนิดมีศักยภาพในการต้านการแข็งตัวของเลือดนอกเหนือจากคุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระ ปรากฏว่าโครงสร้างของ PPGs โดยเฉพาะอย่างยิ่งการมีอยู่ของ acyl และ catechol moieties นั้นส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับคุณสมบัติของสารต้านอนุมูลอิสระ ศักยภาพในการต้านการแข็งตัวของเลือดของสารประกอบเหล่านี้ยังสัมพันธ์กับโครงสร้างทางเคมีของสารประกอบเหล่านี้ด้วย PPG ที่เลือกแสดงศักยภาพในการรักษาโรคหัวใจและหลอดเลือดที่เกี่ยวข้องกับความเครียดออกซิเดชัน
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมกรุณาติดต่อ:Joanna.jia@wecistanche.com
Cistancheทูบูโลซ่ามีผลมากมาย
1. บทนำ
ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นที่ทราบกันดีว่ามีผลกระทบด้านลบต่อสุขภาพของสิ่งมีชีวิต รวมถึงการชราภาพอย่างรวดเร็วและมะเร็งบางชนิด การเกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเกี่ยวข้องกับความสมดุลระหว่างกลไกการออกซิเดชั่นและสารต้านอนุมูลอิสระ (รวมถึงเอนไซม์ (catalase, glutathione peroxidase) และการป้องกันที่ไม่ใช่เอนไซม์ (กลูตาไธโอน)) ในเซลล์ของร่างกาย [1] การผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) มากเกินไป รวมทั้งอนุมูลออกซิไดซ์และชนิดเปลือกปิด เป็นหนึ่งในกลไกหลักที่อยู่เบื้องหลังการก่อตัวของความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน อย่างไรก็ตาม ผลกระทบทางชีวภาพที่เกิดจาก ROS ขึ้นอยู่กับความเข้มข้น เวลาที่สัมผัส และตำแหน่งเป็นส่วนใหญ่ ภายใต้สภาวะปกติ (ความเข้มข้นต่ำ) อนุมูลออกซิเจน/ไนโตรเจนสามารถทำหน้าที่เป็นตัวส่งสารทุติยภูมิได้ แต่ในระดับที่สูงขึ้น พวกมันอาจเริ่มทำปฏิกิริยากับโครงสร้างทางชีวภาพ เช่น เยื่อหุ้มเซลล์ [2] ในบรรดาสปีชีส์ ROS ทั้งหมด อนุมูลไฮดรอกซิล (H2O.) ก่อให้เกิดความเสียหายที่ใหญ่ที่สุดต่อโมเลกุลชีวโมเลกุล ได้แก่ โปรตีน ลิพิด และดีเอ็นเอ เป็นที่ทราบกันดีว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีบทบาทสำคัญในโรคต่างๆ รวมทั้งโรคหลอดเลือดหัวใจ ความผิดปกติของระบบเลือดมีความสัมพันธ์และ/หรือนำหน้าด้วยการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์ต่างๆ ของการแข็งตัวของเลือดและไบโอมาร์คเกอร์ในพลาสมา [1,3]
ในทางกลับกัน สารธรรมชาติหลายชนิด เช่น โพลีฟีนอลและกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงซ้อน ได้รับการระบุว่าเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพซึ่งสามารถป้องกันการก่อตัวและ/หรือลดชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยาได้ สารประกอบที่มีคุณสมบัติดังกล่าวพบได้ในผลิตภัณฑ์อาหารและยาเตรียมจากพืชหลายชนิด อาหารที่อุดมด้วยผักและผลไม้สดและการบำบัดด้วยสารต้านอนุมูลอิสระที่มีสารต้านอนุมูลอิสระตามธรรมชาติจึงได้รับการแนะนำอย่างกว้างขวางเนื่องจากสามารถลดระดับความเครียดออกซิเดชันและป้องกันกระบวนการทางพยาธิสรีรวิทยาต่างๆ [4,5] โพลีฟีนอลจากพืชเป็นกลุ่มของสารทุติยภูมิที่หลากหลาย ซึ่งกรดฟีนอลถือเป็นส่วนสำคัญ เนื่องจากมีการกระจายอย่างกว้างขวางและแสดงผลทางชีวภาพที่หลากหลาย เช่น ยาต้านจุลชีพ สารต้านอนุมูลอิสระ และต้านการอักเสบ Phenylpropanoid glycosides (PPGs) เป็น ester de-relatives ของกรด hydroxycinnamic และเป็นสารกลุ่มหลัก/ชนิดเดียวของสารทุติยภูมิที่มีอยู่ในพืช Orobanchaceae ที่เป็นโฮโลพาราซิติก ได้แก่Cistanche, Orobanche และ Pelipanche spp. หลายสายพันธุ์ในตระกูลนี้เป็นศัตรูพืชร้ายแรงที่เกษตรกรต้องการกำจัดในทุ่งนา (ตัวอย่างของ Phelipanche ramosa) มีเพียงไม่กี่ชนิดที่ใช้ในด้านเภสัชวิทยา ในขณะที่ส่วนใหญ่มีความสำคัญเพียงเล็กน้อยต่อมนุษย์ เฮอร์บาCistancheมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในยาแผนโบราณของเอเชียในการรักษาภาวะไตบกพร่องและเป็นยาเสริมภูมิคุ้มกันและความจำ ต่อต้านริ้วรอยและต้านความเมื่อยล้า [6] การวิเคราะห์ไฟโตเคมิคอลของกลุ่มวิจัยต่างๆ แสดงให้เห็นว่า phenylpropanoid glycosides เช่น acetonide, echinacoside และ podium side เป็นหนึ่งในส่วนผสมหลักของ Herba Cistanche [7] การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้เกี่ยวกับไม้กวาดหลายชนิดที่พบในโปแลนด์โดย Jedrejek et al [8] ได้แสดงให้เห็นว่าวัสดุจากพืชนี้มีองค์ประกอบเชิงคุณภาพที่คล้ายคลึงกัน (การครอบงำของ PPGs) นอกจากนี้ยังเท่ากับหรือเกินกว่าCistancheเอสพีพี ในแง่ของเนื้อหาของสารออกฤทธิ์ [8]
Cistanche deserticola มีเอฟเฟกต์มากมาย คลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม
การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินศักยภาพในการต้านสารอนุมูลอิสระและสารต้านอนุมูลอิสระ ตลอดจนอิทธิพลต่อค่าพารามิเตอร์ห้ามเลือดของสารสกัดไม้กวาดสามชนิด (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA และ P. ramosa – PR) ที่อุดมไปด้วยฟีนิลต่างๆ -
prostanoids เช่นเดียวกับองค์ประกอบ PPG เดียวของพวกมัน วัดความจุต้านเรดิคัลโดยใช้ 2,2′-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid/Trolox Equivalent (ABTS/TE) และ 2,2-diphenyl-1-picrylhybrazil (DPPH) ) การทดสอบ ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในระบบการทดสอบในพลาสมาเกิดขึ้นโดยใช้ไฮดรอกซิลเรดิคัล (H2O2/Fe) จากนั้นจึงวัดระดับของไขมันเปอร์ออกซิเดชัน (ชนิดปฏิกิริยากรดไทโอบาร์บิทูริก (TBARS)) และวัดระดับของโปรตีนคาร์บอนิลและกลุ่มไทออล ในบรรดาพารามิเตอร์ที่กำหนดของการแข็งตัวของเลือด ได้แก่ เวลาที่เปิดใช้งาน thromboplastin บางส่วน (APTT), prothrombin time (PT) และเวลา thrombin (TT)
2. วัสดุและวิธีการ
2.1. เคมีภัณฑ์
2,2-ไดฟีนิล-1-พิคริลไฮดราซิล เรดิคัล (DPPH), 2,2′-azinobis-3-เอทิลเบนไทอะโซลีน-6-กรดซัลโฟนิก (ABTS), โพแทสเซียม เพอร์ซัลเฟต, {{9 }}ไฮดรอกซี-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-กรดคาร์บอกซิลิก (Trolox), ไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO), กรดไธโอบาร์บิทูริก (TBA), กรดฟอร์มิก (เกรด LC-MS), และ H2O2 ถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA) เมทานอล (เกรดเกรเดียนต์ HPLC) และอะซีโตไนไทรล์ (เกรด LC-MS) ได้มาจากเมอร์ค (ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) สิบฟีนิล-
สารประกอบโพรพาโนอิกที่ทดสอบในงานนี้ ได้แก่ 2′-O-acetylacteoside (97 เปอร์เซ็นต์ ), 2′-O-acetylpoliumoside (98 เปอร์เซ็นต์ ), 3-O-methylpoliumoside(96 เปอร์เซ็นต์ ), acetonide (99 เปอร์เซ็นต์ ), arena ภายใน (97 เปอร์เซ็นต์ ), crenatoside (98 เปอร์เซ็นต์ ), teniposide (99 เปอร์เซ็นต์ ), poliumoside (99 เปอร์เซ็นต์ ), tubuloside A (96 เปอร์เซ็นต์ ) และ wiedemannioside D (96 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกแยกโดยเราก่อนหน้านี้จากวัสดุจากพืชที่ต่ำกว่าที่กำหนด [ 8]. ความบริสุทธิ์ของสารประกอบถูกประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ UHPLC-PDA-MS น้ำบริสุทธิ์พิเศษถูกเตรียมขึ้นภายในบริษัทโดยใช้ระบบทำน้ำให้บริสุทธิ์ Milli-Q (Millipore Co.) รีเอเจนต์อื่นๆ มีระดับการวิเคราะห์และจัดหาโดยซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์ในประเทศ
2.2. วัสดุปลูก
ไม้ดอกของไม้กวาดสามชนิด ได้แก่ Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel และ P. Ramos (L.) Pomel ถูกระบุโดยศาสตราจารย์ Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski University, Kielce, Poland) และรวบรวมจากแหล่งธรรมชาติในโปแลนด์
ตัวอย่างบัตรกำนัล (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), ทุ่งหญ้า xerothermic, ปรสิต Galium boreale, พฤษภาคม 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), ทุ่งหญ้า psammoma- lous และ รกร้าง, parasitize Artemisia campestris, มิถุนายน 2014;
P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), field, parasitize Solanum Lycopersicum, กันยายน 2014) ถูกฝากไว้ที่ Herbarium ของ Jan Kochanowski University ใน Kielce (KTC) วัสดุจากพืชถูกแช่เยือกแข็งและบดละเอียดก่อนทำการสกัด
2.3. การเตรียมสารสกัดจากไม้กวาด
วัสดุพืชผง (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g และ P. ramosa (PR) – 3 g) สกัดด้วย MeOH 80 เปอร์เซ็นต์ที่ 40 ◦C และ 1500 psi (แรงดันตัวทำละลาย ) โดยใช้ ASE 200 เร่งความเร็ว
ตัวแยกตัวทำละลาย (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) สารสกัดถูกระเหยและทำให้แห้ง (เครื่องทำแห้งแช่แข็ง Gamma 2–16 LSC, Christ, เยอรมนี) ประสิทธิภาพการสกัดสำหรับ OC, PA และ PR เท่ากับ 55 เปอร์เซ็นต์ 37 เปอร์เซ็นต์ และ 43 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักของวัสดุจากพืช ตามลำดับ เนื่องจากคาร์โบไฮเดรตมีปริมาณสูง (ไม่แสดงข้อมูล) สารสกัดดิบจึงถูกทำให้บริสุทธิ์เพิ่มเติมโดยการสกัดด้วยโซลิดเฟส (SPE) บนไมโครคอลัมน์ Oasis HLB (500 มก.; Waters, Milford, MA, USA) น้ำตาลถูกกำจัดออกด้วย MeOH 1 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นสารประกอบที่น่าสนใจถูกชะด้วย MeOH 80 เปอร์เซ็นต์ หลังจากเอาตัวทำละลายออก สารสกัด OC, PA และ PR ถูกทำให้แห้งแบบเยือกแข็ง (เครื่องทำแห้งแบบเยือกแข็งแกมมา 2–16 LSC) และผลผลิตของการทำให้บริสุทธิ์ด้วย SPE คือ 53 เปอร์เซ็นต์ (OC), 67 เปอร์เซ็นต์ (PA) และ 51 เปอร์เซ็นต์ (PR) .
2.4. ลักษณะทางพฤกษเคมีของสารสกัดจากไม้กวาด
การวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณของสารสกัดจากบรูมเรปดำเนินการโดยใช้ระบบ ACQUITY UPLC (น้ำ) ที่เชื่อมต่อกับเครื่องตรวจจับอาร์เรย์โฟโตไดโอด (PDA) และแมสสเปกโตรมิเตอร์แบบควอดรูโพลแบบตีคู่ (TQD-MS/MS) สารสกัด OC, PA และ PR ที่แห้งโดยแช่แข็งถูกละลายใน 50 เปอร์เซ็นต์ของเมทานอลที่ความเข้มข้น 0.50 มก./มล. จากนั้น
โครมาโตกราฟีบนคอลัมน์ BEH C18 (100 × 2.1 มม., 1.7 µm, Waters) สภาวะโครมาโตกราฟีมีดังนี้ อุณหภูมิเตาอบ – 25 ◦C,
การไล่ระดับสีเชิงเส้น 10→25 เปอร์เซ็นต์ของเฟสเคลื่อนที่ B (0.1 เปอร์เซ็นต์กรดฟอร์มิกในอะซิโตไนไตรล์) ในเฟสเคลื่อนที่ A (0.1 เปอร์เซ็นต์ของกรดฟอร์มิกใน H2O) มากกว่า 12 นาที, อัตราการไหล – 0.4 มล./นาที, ปริมาตรการฉีด – 2 ไมโครลิตร, ช่วง UV – 190–490 นาโนเมตร (ความละเอียด 3.6 นาโนเมตร) การวิเคราะห์ MS ดำเนินการในโหมดไอออนลบด้วยอิเล็กโตรสเปรย์ไอออไนซ์ (ESI) โดยใช้การตั้งค่าต่อไปนี้: ช่วงการสแกน 100–1200 m/z; แรงดันเส้นเลือดฝอย 2.8 kV; แรงดันกรวย 35 V;
อุณหภูมิแหล่งกำเนิด 150 ◦C; อุณหภูมิการละลาย 450 ◦C; ความรกร้าง
การไหลของก๊าซ 900 ลิตร/ชม. และการไหลของก๊าซรูปกรวย 100 ลิตร/ชม. การรับและประมวลผลข้อมูลดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Waters MassLynx 4.1
พีคของฟีนิลโพรพานอยด์ไกลโคไซด์ (PPG) ถูกระบุโดยการเปรียบเทียบข้อมูล LC-MS ที่ได้รับกับข้อมูลเหล่านั้นของสารประกอบที่แยกได้ก่อนหน้านี้ [8] การหาปริมาณ PPG ในสารสกัดจากไม้กวาดใช้วิธีการ UPLC-UV ด้วยการตรวจจับที่ 330 นาโนเมตร และการสอบเทียบมาตรฐานภายนอกโดยใช้แอคทีโอไซด์(Sigma-Aldrich, 99 เปอร์เซ็นต์ , HPLC) เป็น
มาตรฐานกลุ่ม กราฟการปรับเทียบเชิงเส้นจัดทำขึ้นในความเข้มข้นหกระดับภายในช่วง 1–200 ไมโครกรัม/มล. และมีความเป็นเส้นตรงที่ดี (R2
0.999) ผลลัพธ์เชิงปริมาณแสดงถึงค่า SD เฉลี่ยของการฉีดสามครั้งและแสดงเป็นมิลลิกรัมแอคทีโอไซด์เทียบเท่า (eq) ต่อกรัมของสารสกัด (mgแอคทีโอไซด์เท่ากับ/กรัม)
2.5. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในหลอดทดลอง
2.5.1. ABTS การทดสอบการกำจัดอนุมูลอิสระ
การทดสอบการต้านสารอนุมูลอิสระของ ABTS ดำเนินการโดยใช้วิธีการที่อธิบายโดย Kontek และคณะ [9] โดยดัดแปลงเล็กน้อยดังนี้: ใช้ MeOH 20 เปอร์เซ็นต์เพื่อเตรียมรีเอเจนต์ (7 mM ABTS และ 4.9 mM โพแทสเซียมต่อ-
ซัลเฟต); สารละลายของสารสกัด OC, PA และ PR ที่ระดับความเข้มข้นสี่ระดับในช่วง 100—400 ug/mL และสารละลาย Trolox ที่ระดับความเข้มข้นหกระดับในช่วง 10 250 ug/mL ถูกเตรียมด้วย MeOH 50 เปอร์เซ็นต์ สัดส่วนของตัวอย่างต่อโซลูชันการทำงานของ ABTS คือ 1:25 (v/v) วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 734 นาโนเมตรหลังจากการฟักตัว 30 นาที
ในที่มืดโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV–vis (Evolution 260 Bio,
Thermo Fisher Scientific Inc., วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา)
การยับยั้งการดูดกลืนแสง ( เปอร์เซ็นต์ ) คำนวณได้ดังนี้
trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.
คำนวณค่า Trolox Equivalents (TE) ของสารสกัดจากไม้กวาด
ใช้สูตร TE=msample/mstandard โดยที่ m คือความชันของเส้นตรง
เส้นโค้งของเส้น (การยับยั้งการดูดซับเทียบกับความเข้มข้น) ค่า TE ของ
ตัวอย่างอธิบายกิจกรรมที่ทำให้เป็นมาตรฐานกับ Trolox (TEstandard =
1.0) ค่า IC50 สำหรับสารสกัด OC, PA และ PR และ Trolox เป็น
ถึงขั้นทดลองแล้วคำนวณจากเส้นตรง
เส้นโค้ง (การยับยั้งการดูดซับเทียบกับความเข้มข้น) และแสดงเป็น
ไมโครกรัม/มล.
การทดสอบดำเนินการเป็นสามเท่าและนำเสนอผลลัพธ์
หมายความว่า ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD)
2.5.2. DPPH Radical scavenging assay
การทดสอบการต้านสารก่อมะเร็งของ DPPH ดำเนินการโดยใช้วิธีการที่อธิบายโดย Jedrejek et al [8] และ Brand-Williams et al. [10] โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยดังนี้: สารละลายของสารสกัด OC, PA และ PR ที่ระดับความเข้มข้นสี่ระดับในช่วง 50▽ 250 ug/mL และสารละลาย Trolox ที่ระดับความเข้มข้นหกระดับในช่วง 10▽ 250 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร, ถูกเตรียมด้วย 50 เปอร์เซ็นต์ MeOH สัดส่วนของกลุ่มตัวอย่างต่อ DPPH คือ 1:19 (v/v) การดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรถูกวัดหลังจากการบ่ม 30 นาทีในที่มืดโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ UV–vis (Evolution 260 Bio) การยับยั้งการดูดกลืนแสง ( เปอร์เซ็นต์ ) คำนวณได้ดังนี้: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100 ค่า Trolox Equivalent (TE) และ IC50 ของตัวอย่างทดสอบคำนวณในลักษณะเดียวกับการทดสอบ ABTS (ข้อ 2.5.1) การทดสอบดำเนินการเป็นสามเท่า และผลลัพธ์ถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ย ± SD
2.6. สต็อกสารละลายของสารประกอบพืชและสารสกัดที่ทดสอบแล้วสำหรับการทดลองกับพลาสมาของมนุษย์
สารละลายสต็อคของสารประกอบที่ทดสอบและสารสกัดจากพืชถูกเตรียมใน DMSO 50 เปอร์เซ็นต์ ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO ในตัวอย่างที่ทดสอบต่ำกว่า 0.05 เปอร์เซ็นต์ และกำหนดผลกระทบของมันในการทดลองทั้งหมด
2.7. การแยกพลาสมาของมนุษย์
เลือดมนุษย์หรือพลาสมาได้มาจากผู้บริจาคปกติ 6 ราย (ชายและหญิงที่ไม่สูบบุหรี่) ไปยังธนาคารเลือด (Lodz, Poland) และศูนย์การแพทย์ (Lodz, Poland) เลือดถูกเก็บเป็นสารละลาย CPD (ซิเตรต/ ฟอสเฟต/เดกซ์โทรส; 9:1; เลือดในช่องท้อง/CPD) หรือสารละลาย CPDA (ซิเตรต/ ฟอสเฟต/เดกซ์โทรส/อะดีนีน; 8.5:1; v/v; เลือด/CPDA) ผู้บริจาคไม่ได้ทานยาหรือสารเสพติดใดๆ (รวมถึงยาสูบ แอลกอฮอล์ และการเสริมสารต้านอนุมูลอิสระ) เป็นเวลาอย่างน้อยสองสัปดาห์ก่อนการบริจาค การวิเคราะห์ตัวอย่างเลือดของเราดำเนินการภายใต้แนวทางของปฏิญญาเฮลซิงกิเพื่อการวิจัยในมนุษย์ และได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในการทดลองของมนุษย์ที่มหาวิทยาลัยลอดซ์ พลาสมาถูกเตรียมโดยการหมุนเหวี่ยงของเลือดมนุษย์สดที่ 4500x g เป็นเวลา 25 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ความเข้มข้นของโปรตีนคำนวณโดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างที่ทดสอบที่ 280 นาโนเมตร ตามขั้นตอนของ Whitaker และ Granum [11]
2.8. เครื่องหมายของความเครียดออกซิเดชันในพลาสมาของมนุษย์
2.8.1. การวัดไขมันเปอร์ออกซิเดชัน
การหาปริมาณลิพิดเปอร์ออกซิเดชันในพลาสมาโดยการวัดความเข้มข้นของสารปฏิกิริยากรดไธโอบาร์บิทูริก (TBARS) ความเข้มข้นของ TBARS คำนวณโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของกราม (ε=156,000 M 1 ซม. 1 ) วิธีการอธิบายอย่างละเอียดอย่างอื่นคือ [12,13] 2.8.2. การวัดกลุ่มคาร์บอนิล ระดับของกลุ่มคาร์บอนิลคำนวณโดยใช้สัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของโมลาร์ (ε=22,000 M 1 ซม. 1 ) และแสดงเป็นหมู่คาร์บอนิล nmol/มก. ของโปรตีนในพลาสมา ตาม Bartosz [ 13] และ Levine และคณะ [14]. 2.8.3. การกำหนดกลุ่ม Thiol เนื้อหากลุ่ม thiol ในโปรตีนพลาสม่าถูกวัดโดยสเปกโตรโฟโตเมตรีโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลทนาโน SPECTROstar (BMG LABTECH ประเทศเยอรมนี) โดยการดูดกลืนแสงที่ 412 นาโนเมตรด้วย 5,5′ -dithiol-bis- (2- กรดไนโตรเบนโซอิก) วิธีการนี้อธิบายรายละเอียดเพิ่มเติมที่อื่น [15–17]
2.9. พารามิเตอร์ของการห้ามเลือด
2.9.1. การวัดเวลา prothrombin (PT)
PT ถูกกำหนดโดย coagulometrically โดยใช้ Optic Coagulation
ตัวอักษรระบุผลการทดสอบของ Tukey (p < 0.05) มีค่าเท่ากัน
ตัวอักษรภายในแถวไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ
2.9.2. การวัดเวลา thrombin (TT)
TT ถูกกำหนดโดย coagulometrically โดยใช้ Optic Coagulation Analyzer (รุ่น K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poland) ตามวิธีการที่อธิบายโดย Malinowska et al [18].
2.9.3. การวัดเวลา thromboplastin บางส่วนที่เปิดใช้งาน (APTT)
APTT ถูกกำหนดโดย coagulometrically โดยใช้ K-3002 Optic Coagulation Analyzer (Kselmed, Grudziadz, Poland) ตาม Mali ตอนนี้ ska et al [18].
2.10. การวิเคราะห์ข้อมูล การทดสอบ Q-Dixon ดำเนินการเพื่อขจัดข้อมูลที่ไม่แน่นอน
ข้อมูลได้รับการทดสอบสำหรับการแจกแจงแบบปกติด้วยการทดสอบ Shapiro-Wilk และความเท่าเทียมกันของความแปรปรวนกับการทดสอบของ Levene ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติถูกระบุโดยใช้ ANOVA ตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Tukey หรือการทดสอบ Kruskal-Wallis การเปรียบเทียบถือว่ามีนัยสำคัญที่ p < 0.05="" ค่านี้แสดงเป็นค่าเฉลี่ย="" ±="">
