ส่วนที่ 1: Acteoside ยับยั้ง Microglia M1 โพลาไรซ์ผ่านการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κBและการกู้คืนฟังก์ชัน Mitochondria ที่เป็นสื่อกลาง AMPK

ติดต่อ: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 อีเมล:audrey.hu@wecistanche.com

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อส่วน2

เชิงนามธรรม:

พื้นหลัง:โรคอัลไซเมอร์ (AD)เป็นภาวะสมองเสื่อมประเภทที่พบได้บ่อยที่สุด ในขณะที่แอคทีโอไซด์จากสมุนไพรซิสแทนเช่(ACT) สารประกอบที่แยกได้จาก Cistanchetubulosaมีคุณสมบัติป้องกันระบบประสาท อย่างไรก็ตาม กลไกพื้นฐานในการควบคุมโพลาไรเซชันของไมโครเกลียยังคงไม่ชัดเจนวิธีการ:ในที่นี้ แบบจำลอง AD ที่เหนี่ยวนำโดย AlCl3-ในตัวอ่อนของม้าลายถูกนำไปใช้เพื่อค้นหาประสิทธิภาพการรักษาของ ACT เซลล์ BV-2 ถูกใช้เพื่อแสดงบทบาทของ ACT ต่อไมโครเกลียโพลาไรเซชัน RNA- Sequence, HPLC-Q-TOF-MS, western blot และการเทียบท่าระดับโมเลกุลถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อยืนยันกลไกของมันผลลัพธ์:ACT ช่วยแก้ไขความผิดปกติในการทดลองและความผิดปกติของระบบประสาทในม้าลายได้อย่างมีนัยสำคัญ ต่อจากนั้น มันระงับการโพลาไรซ์ M1 และเลื่อนระดับเป็นฟีโนไทป์ M2 ในเซลล์ BV-2 ที่เหนี่ยวนำโดย LPS ขั้นแรกเราแสดงให้เห็นว่า ACT ได้ส่งผลกระทบอย่างลึกซึ้งในการถอดรหัส ซึ่งเกี่ยวข้องกับการควบคุมเส้นทางการส่งสัญญาณที่สำคัญใน§ammation การสังเคราะห์อาร์จินีน ตลอดจนการสังเคราะห์ pantothenate และ CoA ซึ่งสัมพันธ์กับการทำงานของไมโตคอนเดรีย กระทำ(แอคทีโอไซด์จากสมุนไพรซิสแทนเช่) การรักษาลดการเกิดโพลาไรซ์ของ microglia M1 โดยการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และวิถีเมแทบอลิซึมถูกยืนยันเพิ่มเติมโดย HPLC-Q-TOF-MS นอกจากนี้ ACT ได้แก้ไข ROS ที่มากเกินไปเพื่อฟื้นฟูการทำงานของไมโตคอนเดรียผ่านการปรับควบคุม PGC-1 ที่เป็นสื่อกลาง AMPK และ UCP-2 ซึ่งสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึม น่าแปลกที่ ACT อาจผูกมัดโดยตรงกับทั้ง NF-κB และ AMPK ตามหลักฐานจากการเทียบท่าระดับโมเลกุลสรุป:การวิจัยได้ให้กลไกการแทรกซึมของ ACT และแสดงมุมมองใหม่โดยอิงจากความผิดปกติของไมโตคอนเดรียเพื่อเปิดเผยความเชื่อมโยงระหว่างเมแทบอลิซึมและโพลาไรเซชันของไมโครเกลีย

พื้นหลัง:

อัลไซเมอร์โรคประจำตัว(AD) เป็นโรคเกี่ยวกับความผิดปรกติของระบบประสาทร่วมกับความบกพร่องทางสติปัญญาและดายสกิน[1] มีลักษณะเฉพาะโดยการสูญเสียเซลล์ประสาทอย่างรุนแรง เนื้อเยื่อในวัยชรา และความยุ่งเหยิงของเส้นประสาทสมอง[2] การเกิดโรคของ AD มีหลายมิติและเชื่อมโยงกับ neuroin§ammate Neuroin§ammatic ถูกขับเคลื่อนโดยการกระตุ้นเซลล์ glial ซึ่งเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการพัฒนา AD[3, 4] ในระหว่างการพัฒนาและอาการกำเริบของ neuroin§ammate microglia ถือเป็นปัจจัยสำคัญ Microglia เป็นเซลล์ภูมิคุ้มกันหลักในระบบประสาทส่วนกลาง มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับกระบวนการต่างๆ ที่เรียงซ้อน ซึ่งประกอบด้วยการพัฒนาของสมอง การรักษาสภาพแวดล้อมที่เป็นกลาง ตลอดจนการตอบสนองต่อการบาดเจ็บและการซ่อมแซม[1] ยิ่งไปกว่านั้น ไมโครเกลียสามารถถูกกระตุ้นให้เป็นฟีโนไทป์ M1 และการแสดงออกของไซโตไคน์โปรอิน§ammatory จะเพิ่มขึ้นเมื่อเกิดโรคที่เกี่ยวข้องกับนิวโรอิน§ เช่น AD[5] การศึกษายังแสดงให้เห็นว่าโพลาไรเซชันของฟีโนไทป์ M1 มักมาพร้อมกับความผิดปกติของการเผาผลาญ[6] ทำให้เกิดความไม่สมดุลของการเผาผลาญพลังงานและความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย[7] การเปลี่ยนแปลงที่ไม่พึงประสงค์เหล่านี้มาจากการเสื่อมของระบบประสาท แม้กระทั่ง AD

แอคทีโอไซด์จากสมุนไพรซิสแทนเช่(ACT) ซึ่งเป็นฟีนิลทานอยด์ไกลโคไซด์ ส่วนใหญ่ได้มาจาก Cistanchetubulosa. หลักฐานที่เพิ่มขึ้นชี้ให้เห็นว่า ACT มีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยามากมาย รวมทั้งฤทธิ์ป้องกันระบบประสาท[8] การต่อต้านการแทรกซึม[9] และฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ[10] โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มีรายงาน ACT เพื่อปรับปรุงการเรียนรู้และความจำบกพร่อง รวมทั้งควบคุมการเผาผลาญพลังงานในหนูที่กระตุ้นด้วยสเตรปโตโซโตซิน[11] นอกจากนี้ยังได้รับการแนะนำเพื่อยับยั้งการตายของเซลล์ apoptotic ของเซลล์ประสาทและความเสียหายของยลในหนูทดลองโรคไข้สมองอักเสบภูมิต้านตนเองทดลอง [12] อย่างไรก็ตาม มีการศึกษาน้อยลงที่เน้นผลของ ACT ต่อโพลาไรเซชัน microglia M1/M2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง กลไกต่างๆ เช่น การซ่อมแซมการทำงานของไมโตคอนเดรียและการควบคุมการเผาผลาญของเซลล์ ยังไม่ได้ดำเนินการ นอกจากนี้ กลไกของ ACT ที่ส่งผลต่อโพลาไรซ์ของ microglia M1/M2 นั้นยังไม่มีการสำรวจ

รายงานนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพการรักษาของ ACT ตลอดจนกลไกระดับโมเลกุลของ ACT ใน AD ในที่นี้ ACT แสดงผลการป้องกันระบบประสาทที่มีนัยสำคัญในตัวอ่อน AD zebra¦sh ที่เหนี่ยวนำโดย AlCl3- นอกจากนี้ ACT ยังยับยั้งโพลาไรซ์ M1 อย่างมีประสิทธิภาพและส่งเสริมฟีโนไทป์ของ M2 ในเซลล์ BV-2 ที่เหนี่ยวนำโดย LPS RNA-Sequencing (RNA-Seq) ผสานรวมกับวิธีเมตาบอลิซึมเพื่อให้เข้าใจกลไกพื้นฐานของ ACT ได้ดีขึ้นในการควบคุมโพลาไรเซชันของ microglia ครอสทอล์คระหว่างเมแทบอลิซึมและโพลาไรเซชันของไมโครเกลียในแง่ของการทำงานของไมโตคอนเดรีย การศึกษานี้จะให้ความเคารพครั้งใหม่แก่การตรวจสอบเพิ่มเติมของ ACT ในฐานะตัวแทนการรักษาที่มีศักยภาพสำหรับการรักษาโรค AD

วิธีการ:

การจัดกลุ่มสัตว์และแบบจำลอง:

ม้าลายป่า (สายพันธุ์ AB อายุ 4 เดือน) ได้รับการคัดเลือกในการศึกษานี้ (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.) พวกมันถูกบำรุงรักษาภายใต้วัฏจักรแสง/ความมืด 14/10 ชั่วโมงที่ 28 องศา ตามวิธีการก่อนหน้า[13] ปุ๋ยธรรมชาติและตัวอ่อนที่พัฒนาตามปกติถูกสร้างและเพาะเลี้ยงจนถึง 3 วันหลังการปฏิสนธิ (dpf) ในตู้ฟักแบบให้แสงสว่าง การทดลองม้าลายทั้งหมดดำเนินการภายใต้การดูแลของคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์แห่งมหาวิทยาลัยยาจีน

ตัวอ่อนของม้าลายถูกแบ่งออกเป็นหกกลุ่มและรับการบำบัดจาก 3 dpf ถึง 7 dpf: กลุ่มควบคุม, กลุ่มแบบจำลอง, แบบจำลองและกลุ่ม Donepezil ไฮโดรคลอไรด์ (DPZ), โมเดลและกลุ่ม ACT กลุ่มควบคุมถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อด้วย 0.2 เปอร์เซ็นต์ DMSO และกลุ่มแบบจำลองได้รับการบำบัดด้วย 150 ไมโครโมลาร์ AlCl3 (pH 5.8) แบบจำลองบวกกับกลุ่ม DPZ ถูกบำบัดร่วมกับ AlCl3 และ 8 ไมโครโมลาร์ DPZ แบบจำลองบวกกลุ่ม ACT ถูกบำบัดร่วมกับ AlCl3 และความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ ACT (200, 100, 50 ไมโครโมลาร์) กระทำ(acteoside จากสมุนไพร cistanche)(ความบริสุทธิ์ของ HPLC มากกว่าหรือเท่ากับร้อยละ 98) ได้รับจาก Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China) AlCl3·6H2O และ DPZ ซื้อมาจาก Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (เซียงไฮ้ประเทศจีน).

การวิเคราะห์พฤติกรรม

การเคลื่อนไหวของตัวอ่อนของม้าลายถูกบันทึกด้วยเครื่องวิเคราะห์พฤติกรรมของ ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) ที่ 28 องศา Brie§y พารามิเตอร์พฤติกรรมและการประมวลผลผลลัพธ์สอดคล้องกับวิธีการที่เรากำหนดไว้ก่อนหน้านี้[13] ที่นี่ ความเร็วเฉลี่ย (AS), การเปลี่ยนแปลงความเร็ว (ΔS), อัตราการกู้คืนดายสกิน (DRR) และประสิทธิภาพการตอบสนอง (RE, เปอร์เซ็นต์ ) ถูกเลือกเพื่อประเมินการฟื้นตัวของดายสกินในม้าลาย

หลังการบำบัดตั้งแต่ 3 dpf ถึง 7 dpf ตัวอ่อนของม้าลายถูกรวบรวมเพื่อวัดการออกฤทธิ์ของ AChE และ Chat ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต กิจกรรมดังกล่าวถูกตรวจพบโดยชุดทดสอบอิมมูโนดูดซับที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China) และความเข้มข้นของโปรตีนของตัวอย่างต่างๆ ถูกกำหนดโดยวิธี BCA

BV-2 เซลล์ถูกเพาะใน 6-จานหลุมแยกกัน (n=6/กลุ่ม) หลังการบำบัด ตัวกลางจะถูกลบออก และเซลล์ถูกล้างสามครั้งด้วย PBS เย็น แล้วสัมผัสไนโตรเจนเหลวทันทีเพื่อยับยั้งการเผาผลาญของเซลล์ เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวด้วยเมทานอล 80 เปอร์เซ็นต์ที่เย็น (1 มล./หลุม) และสารแขวนลอยถูกถ่ายโอนไปยังหลอดเอพเพนดอร์ฟ 2 มล. เพื่ออำนวยความสะดวกในการตกตะกอนของโปรตีน ให้เขย่าอย่างแรงเป็นเวลา 1 นาทีและหมุนเหวี่ยงที่ 13,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศา สารแขวนลอยของเซลล์ถูกถ่ายโอนไปยังหลอดเอพเพนดอร์ฟ 2 มล. ใหม่และทำให้แห้งภายใต้กระแสไนโตรเจนและเก็บไว้ที่ -80 องศาจนถึงการวิเคราะห์ เรซิดิวที่แห้งถูกสร้างขึ้นใหม่ใน 150 ไมโครลิตรของอะซีโตไนไทรล์ 25 เปอร์เซ็นต์ที่ถูกทำให้เย็นก่อนทำให้เย็น เพื่อให้แน่ใจว่ามีความเสถียรและความถูกต้องของการวิเคราะห์ลำดับ ปริมาตรที่เท่ากัน (10 ไมโครลิตร) ของแต่ละตัวอย่างเซลล์ถูกรวมกันเป็นตัวอย่างการควบคุมคุณภาพ (QC) ในระหว่างการตรวจหาเมแทบอไลต์ ตัวอย่างเหล่านี้ถูกฉีดหลังจากตัวอย่างเซลล์ทุกๆ หกตัวอย่างเพื่อยืนยันความเสถียร อะลิควอต 1 ไมโครลิตรถูกฉีดสำหรับ HPLC-Q-TOF-MS

การวิเคราะห์ HPLC-Q-TOF-MS ถูกดำเนินการบนระบบ Agilent 1290 HPLC ที่เชื่อมต่อกับแมสสเปกโตรมิเตอร์ Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) การแยกสารดำเนินการบนคอลัมน์ ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×100 มม., 1.7 µm) เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยน้ำกรดฟอร์มิก 0.1 เปอร์เซ็นต์ (v/v; A) และอะซีโตไนไทรล์ (B)

อัตรา §ow ถูกกำหนดไว้ที่ {{0}}.4 มล./นาที โดยมีเงื่อนไขการชะแบบเกรเดียนต์ที่เหมาะสมที่สุดดังต่อไปนี้: 0 ถึง 2 นาที, 5 เปอร์เซ็นต์ B; 2 ถึง 20 นาที, 5 เปอร์เซ็นต์ถึง 95 เปอร์เซ็นต์ B (โหมดไอออนบวก); 0 ถึง 2 นาที 5 เปอร์เซ็นต์ B; 2 ถึง 20 นาที, 5 เปอร์เซ็นต์ ถึง 95 เปอร์เซ็นต์ B (โหมดไอออนลบ) พารามิเตอร์การทำงานของแมสสเปกโตรมิเตอร์ถูกกำหนดดังนี้: อุณหภูมิก๊าซ 320 องศา ; แก๊สแห้ง 10 ลิตร/นาที; เครื่องพ่นยาขยายหลอดลม 35 psi; VCap, 4000 โวลต์; แฟรกเมนต์ 120 V.

ข้อมูลดิบดำเนินการภายใต้ MassHunter Workstation Software เวอร์ชัน B.0700 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ข้อมูลดิบถูกประมวลผลล่วงหน้าโดยแพลตฟอร์ม XCMS การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) และการวิเคราะห์จำแนกบางส่วนน้อยที่สุดกำลังสอง (PLS-DA) ของข้อมูลที่ทำให้เป็นมาตรฐานได้ดำเนินการด้วย MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca) ร่วมกับวรรณกรรม สารอนุพันธ์ (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">