Paricalcitol ปรับปรุงภาวะขาดออกซิเจนและ TGF- 1-กระตุ้นการบาดเจ็บในไต Pericytes

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Jeong-Hoon Lim, Ju-min York, Se-Hyun Oh, Soo-Jee Jeon, Hee-Won Noh, Hee-Yeon Jung, Ji-Young Choi, Jang-Hee Cho, Chan-Duck Kim, Yong-Lim Kim, และซุนฮีปาร์ค *

ภาควิชาอายุรศาสตร์, คณะแพทยศาสตร์, มหาวิทยาลัยแห่งชาติคยองพุก, โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยแห่งชาติคยองพุก, แดกู 41944, เกาหลี; jh-lim@knu.ac.kr (J.-HL); jumin18@naver.com (เจ.-MY);

ttily@nate.com (ส.-โฮ); hot716@naver.com (ส.-เจเจ); hwn1104@gmail.com (HWN); hy-jung@knu.ac.kr (H.-YJ); jyss1002@hanmail.net (J.-YC); jh-cho@knu.ac.kr (J.-HC); drcdkim@mail.knu.ac.kr (C.-DK); ylkim@knu.ac.kr (ย.-ลก)

* การโต้ตอบ: sh-park@knu.ac.kr; โทร.: บวก 82-53-200-5547; แฟกซ์: บวก 82-53-426-9464

บทคัดย่อ: เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้มีการศึกษาบทบาทของ pericytes ของไตในการเป็นพังผืดของไต การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินผลของ paricalcitol ต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนและ TGF- 1-ในเยื่อหุ้มไต เปริไซต์ที่เพาะเลี้ยงขั้นต้นถูกปรับสภาพด้วย paricalcitol (20 ng/mL) เป็นเวลา 90 นาทีก่อนที่จะทำให้เกิดการบาดเจ็บ จากนั้นพวกมันถูกสัมผัสกับ TGF- 1(5 ng/mL)หรือภาวะขาดออกซิเจน(1 เปอร์เซ็นต์ O2 และ 5 เปอร์เซ็นต์ CO2) .TGF- 1 เพิ่ม -SMA และตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดอื่นๆ แต่ลดการแสดงออกของ PDGFR ใน pericytes ในขณะที่ paricalcitol กลับการเปลี่ยนแปลง Paricalcitol ยับยั้ง TGF- 1- ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการย้ายเซลล์ของเพอริไซต์ ภาวะขาดออกซิเจนเพิ่ม TGF- 1, -SMA และตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดอื่นๆ แต่ลดการแสดงออกของ PDGFR ใน pericyte ในขณะที่ paricalcitol กลับด้าน ภาวะขาดออกซิเจนกระตุ้น HF-1o และโมเลกุลปลายน้ำรวมถึงโพรลิลไฮดรอกซีเลส 3 และตัวขนส่งกลูโคส-1 ในขณะที่ paricalcitol ลดการกระตุ้นของโมเลกุลที่ขึ้นกับ HIF-1 -และ TGF- 1/Smad เส้นทางการส่งสัญญาณในเซลล์ที่ขาดออกซิเจน การปิดเสียงของยีนของ HIF-1a ได้หายไปจาก TGF- 1 ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน, การปรับเพิ่ม -SMA และการปรับลด PDGFR ผลของ paricalcitol ต่อการเปลี่ยนแปลง HIF-1 - ขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนแปลงของตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดไม่มีนัยสำคัญหลังจากการทำให้ยีนเงียบของ HIF-1 นอกจากนี้ การขาดออกซิเจนยังทำให้ความเครียดออกซิเดชันใน pericytes รุนแรงขึ้น ในขณะที่ paricalcitol กลับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันโดยการเพิ่มเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในรูปแบบ HIF-1 -อิสระ โดยสรุป paricalcitol ปรับปรุงการเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ของเพอริไซต์เป็นมัยโอไฟโบรบลาสต์ในเพอริไซต์ที่ถูกกระตุ้นด้วย TGF- 1- นอกจากนี้ paricalcitol ปรับปรุงการแสดงออกของตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดใน pericytes ที่สัมผัสกับออกซิเจนในเลือดทั้งในลักษณะที่ขึ้นต่อกันและเป็นอิสระจาก HIF-1 -

คำสำคัญ: ขาดออกซิเจน; พาราไซทอล; เพอริไซท์; การเปลี่ยนแปลงของ pericyte-to-myofibroblast; TGF- 1; ตัวเอกของวิตามินดี

ประสบการณ์ cistanche นั้นดีมากสำหรับการทำงานของไต

1. บทนำ

พังผืดคั่นระหว่างไตเป็นผลทางพยาธิวิทยาที่พบบ่อยจากการบาดเจ็บที่ไตประเภทต่างๆ และการเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต (TGF)- 1 เป็นสาเหตุหลักที่ทำให้เกิดพังผืดในไต ภาวะขาดออกซิเจนเป็นที่รู้จักกันว่าเกี่ยวข้องกับการสูญเสียการทำงานของไตอย่างต่อเนื่องในขณะที่ส่งผลต่อประชากรเซลล์ต่างๆในไต ปัจจัยด้านอารมณ์ต่างๆ จากเซลล์เยื่อบุผิวท่อที่เสียหายและเซลล์อักเสบที่แทรกซึมทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ที่อาศัยอยู่ภายในคั่นระหว่างหน้า เช่น เพอริไซต์ไปเป็นมัยโอไฟโบรบลาสต์ เทคนิคการสืบเชื้อสายทางพันธุกรรมได้แสดงให้เห็นว่า pericytes เป็นแหล่งกำเนิดของ myofibroblasts ในการเป็นพังผืดของไต [1] โปรเกรสซีฟ tubulointerstitial fibrosis ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจนในไต ซึ่งทำให้การเกิดพังผืดแย่ลง ทำให้เกิดวงจรอุบาทว์ [2] เซลล์ที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนจะควบคุมปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน (HIF)-1a ซึ่งเป็นปัจจัยการถอดรหัสหลักที่จำเป็นในการปรับให้เข้ากับสภาวะขาดออกซิเจนโดยควบคุมสภาวะสมดุลของออกซิเจนและเมแทบอลิซึมของเซลล์ HIF-1 มีบทบาทที่แตกต่างกันในเซลล์ไตต่างๆ [3] HIF-1 มีความเกี่ยวข้องกับการลุกลามของโรคไตเรื้อรัง (CKD) และการเกิดพังผืดของไตโดยการเปิดใช้งานเส้นทางที่ขึ้นกับ TGF- 1- และเป็นตัวกลางในการเปลี่ยนผ่านของเยื่อบุผิวไปเป็นเยื่อหุ้มเซลล์ [4]

Pericytes ซึ่งเป็นเซลล์ mesenchymal ที่มีกิ่งแขนงล้อมรอบเซลล์บุผนังหลอดเลือดในเตียงของเส้นเลือดฝอยและหลอดเลือดโป่งพอง มีหน้าที่ห้ามเลือดในระหว่างกระบวนการสร้างเส้นเลือดใหม่ และมีส่วนเกี่ยวข้องกับการควบคุมโทนสีของหลอดเลือด นอกจากนี้ เพอริไซต์มีบทบาทสำคัญในกระบวนการเริ่มต้นและการลุกลามของโรคหลอดเลือดหรือเส้นใย หลักฐานที่สะสมได้เผยให้เห็นถึงหน้าที่ของเยื่อหุ้มไต เช่น การควบคุมการไหลของเลือดในไต ความคงตัวของ microvessel และการอยู่รอดของเยื่อบุผนังหลอดเลือด รวมทั้งมีบทบาทสำคัญในการบาดเจ็บที่ไต (เช่น การบาดเจ็บที่ไตเฉียบพลัน [AKI] และ CKD) [2,5, 6].

การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นด้วยการฉีดกระตุ้นการแสดงออกของ CYP2R1 (วิตามินดี 25-ไฮดรอกซีเลส) และตัวรับวิตามินดี (VDR) ในเยื่อหุ้มสมอง [7] ทำให้เราตั้งสมมติฐานว่าตัวกระตุ้น VDR อาจเกี่ยวข้องกับการบรรเทา การบาดเจ็บของ pericyte ในไต

ดังนั้น จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อประเมินผลของ paricalcitol ต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนและ TGF- 1-ในไต pericytes.

2. ผลลัพธ์

2.1. ผลการป้องกันของ Paricalcitol ต่อ TGF- 1-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการเปลี่ยนผ่านของ Pericyte–to–Myofibroblast

การกระตุ้น TGF{{0}} เพิ่มการแสดงออกของ mRNA ของเครื่องหมาย profibrotic เช่น alpha-smooth muscle actin ( -SMA), fibronectin, vimentin และ matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) ใน ลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา (รูปเสริม S1) เพื่อประเมินผลของ paricalcitol ต่อ TGF- 1-เกิดพังผืดในเพอริไซต์ การสัมผัส TGF- 1 ถูกดำเนินการหลังการปรับสภาพด้วย paricalcitol มาร์กเกอร์มีเซนไคมอลถูกวัดโดยใช้ PCR แบบเรียลไทม์ การแสดงออกของ -SMA, fibronectin และ vimentin mRNA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการกระตุ้น TGF- 1 (p < 0="" ทั้งหมด{{20}}5)="" (รูปที่="" 1a–c)="" paricalcitol="" cotreatment="" ลดทอนการควบคุมของ="" mesenchymal="" markers="" เช่น="" -sma,="" fibronectin="" และ="" vimentin="" expressions="" (ทั้งหมด="" p="">< 0.05)="" การแสดงออกของ="" mrna="" ของ="" mmp-9="" ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเสื่อมสภาพของเมทริกซ์นอกเซลล์="" (ecm)="" ก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน="" ในขณะที่="" paricalcitol="" cotreatment="" ปรับลดการแสดงออกของ="" mmp-9="" (p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 1d="" ).="" ระดับ="" mrna="" ของตัวรับปัจจัยการเจริญเติบโตที่ได้มาจากเกล็ดเลือด="" (pdgfr="" )="" mrna="" ลดลงหลังจากการกระตุ้น="" tgf-="" 1="" และ="" paricalcitol="" เพิ่มการแสดงออกของ="" pdgfr="" เมื่อเทียบกับทั้งกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่สัมผัส="" tgf-="" 1-="" (ทั้งสองกลุ่ม="" p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 1e)="" การแสดงออกของโปรตีนของ="" -sma="" เพิ่มขึ้นและ="" pdgfr="" ลดลงหลังจากการกระตุ้น="" tgf-="" 1="" (ทั้ง="" p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 1f,1g)="" ในขณะที่="" paricalcitol="" cotreatment="" กลับการเปลี่ยนแปลงของทั้งระดับโปรตีน="" -sma="" และ="" pdgfr="" (ทั้ง="" p="">< 0.05)="" ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสัมผัส="" tgf-="" 1="" ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของ="" pericyte–to–myofibroblast="" (pmt)="" และการรักษาด้วย="">

ปรับปรุง PMT

2.2. Paricalcitol ลดทอน Smad2 Phosphorylation ใน TGF- 1- Induced Fibrosis in Pericytes

เราตรวจสอบกลไกของผลของการรักษาด้วย paricalcitol ต่อทางเดินที่ขึ้นกับ Smad ใน PMT ที่เหนี่ยวนำด้วย TGF- 1- การแสดงออกของโปรตีนของวิถี Smad2 และ Smad3 ถูกวัดผ่านการวิเคราะห์ western blot (รูปที่ 2) ระดับของ p-Smad2 และอัตราส่วนของ p-Smad2 ต่อ Smad2 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการสัมผัส TGF{{10}} และการเพิ่มขึ้นดังกล่าวได้รับการบรรเทาหลังการให้ยา par1icalcitol cotreatment (รูปที่ 2B) ระดับของ p-Smad3 และอัตราส่วนของ p-Smad3 ต่อ Smad3 ก็เพิ่มขึ้นเช่นกันหลังจากการสัมผัส TGF- 1 (ทั้ง p < 0.05)="" แต่การบำบัดด้วย="" paricalcitol="" ไม่ได้เปลี่ยนระดับของ="" p="" -smad3="" และอัตราส่วนของ="" p-smad3="" ต่อ="" smad3="" (ทั้ง="" p=""> 0.05) (รูปที่ 2C)

2.3. Paricalcitol ลดลง TGF- 1-กระตุ้นการย้ายถิ่นของ Pericytes

เพื่อตรวจสอบว่า TGF- 1 กระตุ้นการย้ายถิ่นของเยื่อหุ้มเซลล์และประเมินบทบาทของ paricalcitol ในการย้ายถิ่นหรือไม่ เราตรวจสอบการย้ายถิ่นของ pericyte หลังการกระตุ้น TGF- 1 โดยมีหรือไม่มี paricalcitol cotreatment TGF- 1 เร่งการปิดแผลได้อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับรอบการควบคุมในการทดสอบการย้ายเซลล์ของรอย ในขณะที่การบำบัดด้วย TGF- 1 และ paricalcitol ชะลอการปิดแผลจากรอยขีดข่วนของ pericytes (รูปที่ 3A–C)

รูปที่ 1. ผลของ paricalcitol ต่อ TGF- 1-เกิดพังผืดที่เหนี่ยวนำ (A–C) TGF- 1 เพิ่มการแสดงออกของ mRNA ของมาร์กเกอร์มีเซนไคม์โปรไฟโบรติก, -SMA, ไฟโบรเนกติน และวิเมนติน และพาริคัลซิทอลลดเครื่องหมายไฟโบรติกในเพอริไซต์ (D) การแสดงออกของ MMP-9 mRNA เพิ่มขึ้นหลังจากการกระตุ้น TGF- 1 และ paricalcitol ลดทอนการแสดงออกของ MMP-9 (E) การแสดงออกของ PDGFR mRNA (เครื่องหมายเพอริไซต์) ลดลงหลังจากการบำบัดด้วย TGF- 1 และ paricalcitol เพิ่มการแสดงออกของ PDGFR (F,G) การแสดงออกของโปรตีนของ -SMA ลดลงและ PDGFR เพิ่มขึ้นหลังจากการกระตุ้น TGF- 1 Paricalcitol cotreatment ย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงของระดับโปรตีน -SMA และ PDGFR ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน n=4 ต่อแต่ละกลุ่ม * p < 0.05="" เทียบกับการควบคุม;="" **="" p="">< 0.01="" เทียบกับการควบคุม;="" ***="" p="">< 0.001="" เทียบกับการควบคุม;="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" tgf-="" 1="" กลุ่มการรักษา;="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับ="" tgf-="" 1="" กลุ่มการรักษา="" ตัวย่อ:="" -sma,="" แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบอัลฟา;="" mmp-9="" เมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน-9;="" pdgfr="">

รูปที่ 2 การแสดงออกของ Smad2 และ Smad3 ใน TGF- 1- เปริไซต์ที่เปิดเผย (A,B) TGF- 1 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทั้งระดับ p-Smad2 และอัตราส่วนของ p-Smad2 ต่อ Smad2 ใน pericytes และลดลงหลังการรักษาด้วย paricalcitol (A,C) นอกจากนี้ TGF{{10}} ได้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทั้งระดับ p- Smad3 และอัตราส่วนของ p-Smad3 ต่อ Smad3 และไม่เปลี่ยนแปลงหลังจากการรักษาด้วย paricalcitol ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน n=4 ต่อแต่ละกลุ่ม * p < 0.05="" เทียบกับการควบคุม;="" **="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มควบคุม;="" ***="" p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่มควบคุม="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" tgf-="" 1="" กลุ่มการรักษา="">

C, กลุ่มควบคุม; P, กลุ่มบำบัด paricalcitol; T, TGF- 1 กลุ่มบำบัด; T บวก P, TGF- 1 และหมู่ทรีตเมนต์ paricalcitol

รูปที่ 3 ผลของ paricalcitol ต่อ TGF- 1-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการย้ายถิ่นใน pericytes ในการสอบวิเคราะห์การย้ายเซลล์แบบ scratch และ transwell (A) ไมโครกราฟแบบเบาของโมโนเลเยอร์ของเซลล์ที่มีรอยขีดข่วนถูกถ่ายที่ 0, 24 และ 48 ชั่วโมงด้วย TGF- 1 และ/หรือ paricalcitol (B) การย้ายเซลล์ของรอยขีดข่วนสัมพัทธ์ถูกวัดเมื่อเวลาผ่านไปโดยใช้แพลตฟอร์มการถ่ายภาพสดของ Incucyte ทุกๆ 4 ชั่วโมงจนถึง 48 ชั่วโมงหลังจากการโยกย้ายเซลล์เริ่มต้น (C) การย้ายเซลล์ของรอยขีดข่วนสัมพัทธ์ที่ 48 ชั่วโมง n=4 ต่อแต่ละกลุ่ม (D) ภาพจำลองด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเพอริไซต์ที่อพยพแล้ว (ย้อมด้วย {{10}}.1 เปอร์เซ็นต์ คริสตัลไวโอเล็ต; กำลังขยายดั้งเดิม ×100) (E) การย้ายถิ่นแบบสัมพัทธ์ถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบจำนวนของ pericytes ที่ย้าย และนับใน 10 ฟิลด์ที่เลือกแบบสุ่มในแต่ละกลุ่ม n=4 ต่อกลุ่ม ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน ** p < 0.01="" เทียบกับกลุ่มควบคุม="" ***="" p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่มควบคุม="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มบำบัด="" tgf-="" 1;###="" p="">< 0.001="" เทียบกับ="" tgf-="" 1="">

นอกจากนี้ การทดสอบการย้ายถิ่นของ transwell ได้ดำเนินการเพื่อยืนยันผลของ paricalcitol ต่อการย้ายถิ่นของ pericyte ผ่านเมมเบรน TGF- 1 เพิ่มการเคลื่อนที่ของ pericyte อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ paricalcitol cotreatment ลด TGF- 1-ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของการย้ายถิ่น (รูปที่ 3D,E) โดยรวมแล้ว การรักษาด้วย paricalcitol ช่วยปรับปรุงการเปลี่ยนแปลงการย้ายถิ่นของ pericyte หลังจากได้รับ TGF- 1

2.4. ผลการป้องกันของ Paricalcitol ต่อการเกิดพังผืดที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนใน Pericytes

ต่อไป เราตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับเพอริไซต์และไฟโบรซิสในเพอริไซต์ที่สัมผัสกับออกซิเจน ทั้งการแสดงออกของยีน TGF- 1 และระดับโปรตีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะขาดออกซิเจนเมื่อเปรียบเทียบกับสภาวะปกติ (ทั้ง p < 0.05)="" (รูปที่="" 4a,g)="" การรักษาด้วย="" paricalcitol="" ใน="" pericytes="" ที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนทำให้ทั้งยีน="" tgf{8}}="" ที่ได้รับการควบคุมและระดับโปรตีนที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับไม่มีการรักษาด้วย="" paricalcitol="" (ทั้ง="" p="">< 0.05)="" ตัวบ่งชี้มีเซนไคม์ล="" เช่น="" -sma,="" ไฟโบรเนกติน="" และวิเมนติน="" และ="" mmp-9="" แสดงการแสดงออกของ="" mrna="" ที่เพิ่มขึ้นในเยื่อหุ้มเซลล์ที่ขาดออกซิเจน="" (ทั้งหมด="" p=""><0.05) ในขณะที่การรักษา="" paricalcitol="" กลับรายการ="" การแสดงออกของ="" mrna="" ที่ได้รับการควบคุม="" -sma,="" fibronectin,="" vimentin="" และ="" mmp-9="" ที่ได้รับการควบคุม="" (ทั้งหมด="" p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 4b–e)="" การบำบัดด้วยพาริคัลซิทอลยังย้อนกลับการแสดงออกของโปรตีนของ="" -sma="" ในเพอริไซต์ที่ขาดออกซิเจน="" (p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 4h)="" mrna="" และการแสดงออกของโปรตีนของ="" pdgfr="" ลดลงในเพอริไซต์ที่เผยออกซิเจน="" และ="" paricalcitol="" กลับ="" pdgfr="" mrna="" และการแสดงออกของโปรตีนเมื่อเปรียบเทียบกับทั้งเพอริไซต์กลุ่มควบคุมและเพอริไซต์ขาดออกซิเจน="" (ทั้งหมด="" p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 4f,i)="" ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการขาดออกซิเจนทำให้เกิด="" pmt="" ซึ่งสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของ="" tgf-="" 1="" ในขณะที่="" paricalcitol="" ปรับลด="" pmt="">

รูปที่ 4 ผลของ paricalcitol ต่อ TGF- 1 และตัวบ่งชี้การเกิดพังผืดในเยื่อหุ้มเซลล์ที่ขาดออกซิเจน (A) ภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มการแสดงออกของ TGF- 1 mRNA ในขณะที่การรักษาด้วย paricalcitol ลดระดับ TGF- 1 mRNA (B–D) ภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มการแสดงออกของ mRNA ของ profibrotic mesenchymal markers, -SMA, fibronectin และ vimentin ในขณะที่ paricalcitol ลดเครื่องหมาย fibrotic ใน pericytes (E) MMP-9 การแสดงออกของ mRNA เพิ่มขึ้นภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน และ paricalcitol ลดทอนการแสดงออกของ MMP-9 (F) ภาวะขาดออกซิเจนลดการแสดงออกของ mRNA ของ PDGFR เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม normoxic ในขณะที่ paricalcitol เพิ่มการแสดงออกของ PDGFR เมื่อเทียบกับ hypoxic pericyte (G) ภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มระดับโปรตีน TGF- 1 ในขณะที่การรักษาด้วย paricalcitol ลดระดับโปรตีน TGF- 1 (H, I) การรักษาด้วย Paricalcitol กลับการแสดงออกของโปรตีน -SMA ใน pericytes ที่ขาดออกซิเจน ระดับโปรตีน PDGFR ลดลงในเพอริไซต์ที่สัมผัสกับการขาดออกซิเจน และ paricalcitol ยังกลับการแสดงออกของโปรตีน PDGFR ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน n=4 ต่อกลุ่ม * p < 0.05="" เทียบกับการควบคุม="" normoxia;="" ***="" p="">< 0.001="" เทียบกับการควบคุม="" normoxia;="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ตัวย่อ:="" -sma,="" แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบอัลฟา;="" mmp-9="" เมทริกซ์เมทัลโลโปรตีน-9;="" pdgfr="">

2.5. Paricalcitol ลดทอน Smad2 Phosphorylation ใน Pericytes ที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจน

เราตรวจสอบกฎระเบียบของเส้นทางการส่งสัญญาณ Smad ใน pericytes ระหว่างการขาดออกซิเจนผ่านการวิเคราะห์ western blot การแสดงออกของ p-Smad2 และอัตราส่วนของ p-Smad2 ต่อ Smad2 ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญใน pericytes ที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจน ในขณะที่ paricalcitol กลับการควบคุมของเส้นทาง Smad2 ใน pericytes ที่สัมผัสกับออกซิเจน (ทั้ง p <{7}}.{{ 11}}5)="" (รูปที่="" 5a,="" b).="" อย่างไรก็ตาม="" paricalcitol="" ไม่ได้เปลี่ยนเส้นทางการส่งสัญญาณ="" smad3="" ที่ได้รับการควบคุมภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน="" (p=""> 0.05) (รูปที่ 5A, C)

รูปที่ 5. การแสดงออกของ Smad2 และ Smad3 ใน pericytes ที่ขาดออกซิเจน (A,B) การสัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทั้งระดับ p-Smad2 และอัตราส่วนของ p-Smad2 ต่อ Smad2 ใน pericytes และลดลงหลังการรักษาด้วย paricalcitol (A, C) ภาวะขาดออกซิเจนไม่ได้เปลี่ยนแปลงทั้งระดับ p-Smad3 และอัตราส่วนของ p-Smad3 ต่อ Smad3 และไม่ลดลงหลังการรักษาด้วย paricalcitol ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน n=4 ต่อกลุ่ม * p < 0.05="" เทียบกับการควบคุม;="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ตัวย่อ:="" nc,="" กลุ่มควบคุม="" normoxia;="" n="" บวก="" p,="" กลุ่มการรักษา="" normoxia="" และ="" paricalcitol;h,="" กลุ่มขาดออกซิเจน;="" กลุ่มบำบัด="" h="" plus="" p,="" hypoxia="" และ="">

2.6. Paricalcitol ลดทอนการบาดเจ็บของ Pericyte ที่เกิดจาก Hypoxia ในลักษณะ HIF-1a-Dependent

การกระตุ้นจากภาวะขาดออกซิเจนในการควบคุมการแสดงออกของยีน HIF-1 เมื่อเปรียบเทียบกับ pericytes ปกติ และ paricalcitol cotreatment ลดทอนการแสดงออกของ HIF-1 (p < 0.05)="" (รูปที่="" 6a).="" hif-1="" -การแสดงออกของยีนที่ขึ้นต่อกัน="" เช่น="" prolyl="" hydroxylase="" 3="" (phd3)="" และตัวขนส่งกลูโคส-1="" (glut-1)="" ก็เพิ่มขึ้นเช่นกันภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน="" แต่ลดลงหลังจากการรักษาด้วย="" paricalcitol="" cotreatment="" (ทั้ง="" p="">< 0.05)="" (รูปที่="" 6b,="" c)="" ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า="" paricalcitol="" ปรับลดการทำงานของเส้นทางที่ขึ้นกับ="" hif-1="" -="">

รูปที่ 6 ผลของ paricalcitol ต่อการกระตุ้น HIF-1 ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนและหลังจากการทำให้ยีนเงียบของ HIF-1 (A–C) Paricalcitol ลดทอนการแสดงออกของยีนที่ขึ้นกับ HIF-1 และ HIF-1 - (PHD3 และ GLUT-1) ​​ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน (D) การเปลี่ยนถ่ายของ pericytes ด้วย HIF-1 siRNA (5{{20}} uM, 6 hr) ยับยั้งการแสดงออกของ HIF-1 อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมและกลุ่ม siRNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย . (E–G) ผลกระทบของ paricalcitol ต่อ TGF- 1, PHD3 และ GLUT-1 ลดลงหลังจากการทำให้ยีนเงียบของ HIF-1 (H, I) ผลกระทบของ paricalcitol ต่อ -SMA และ PDGFR ลดลงหลังจากการทำให้ยีนเงียบของ HIF-1 ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน n=4 ต่อกลุ่ม ** p < 0.01="" เทียบกับการควบคุม="" normoxia;="" ***="" p="">< 0.{{30}}01="" เทียบกับการควบคุม="" normoxia;="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ###="" p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" และ="" &="" p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่ม="" nontarget="" sirna="" normoxia;="" §="" p="">< 0.05="" เทียบกับการควบคุมการขาดออกซิเจนของ="" sirna="" ที่ไม่ใช่เป้าหมาย="" †="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" sihif-1="" กลุ่มขาดออกซิเจน="" คำย่อ:="" hif,="" ปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน;="" phd3,="" โพรลิลไฮดรอกซีเลส="" 3;="" glut-1="" ตัวขนส่งกลูโคส-1;="" sirna,="" rna="" ที่รบกวนขนาดเล็ก;="" h,="" ขาดออกซิเจน;="" -sma,="" แอกตินของกล้ามเนื้อเรียบอัลฟา;="" pdgfr="">

เพื่อตรวจสอบบทบาทของ HIF-1 ในการบาดเจ็บที่ขาดออกซิเจนใน pericytes และบริเวณที่ทำงานของ paricalcitol เราประเมินผลของการปิดเสียงของยีนของ HIF-1 โดยใช้ RNA ที่รบกวน (si)RNA เล็กน้อย รูปที่ 6D แสดงการยับยั้งที่มีประสิทธิผลของ HIF-1 โดย HIF-1 siRNA TGF- 1 ไม่ได้เพิ่มขึ้นจากการปิดเสียงของยีนของ HIF-1 ใน pericytes ที่สัมผัสออกซิเจน และการรักษาด้วย paricalcitol ไม่ได้ลดระดับ TGF- 1 ลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการปิดเสียงของยีนของ HIF{{ 9}} (รูปที่ 6G) ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน การแสดงออกของยีนที่ขึ้นกับ HIF-1 - เช่น PHD3 และ GLUT-1 ก็ไม่เพิ่มขึ้นหลังจากการทำให้ยีนเงียบของ HIF-1 การบำบัดด้วย paricalcitol ลดการแสดงออกของ mRNA ของ PHD3 ลงอีก (รูปที่ 6E) แต่ไม่ได้เปลี่ยนการแสดงออกของ mRNA ของ GLUT-1 (รูปที่ 6F) การแสดงออกของ mRNA ของ -SMA และ PDGFR ยังไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญโดยการบำบัดด้วย paricalcitol หลังการรักษาด้วย HIF-1 siRNA ใน pericytes ที่ขาดออกซิเจน (รูปที่ 6H, I)

2.7. Paricalcitol ลดความเครียดออกซิเดชันที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนใน HIF-1a-Independent

รูปที่ 7 แสดงผลของ paricalcitol ต่อการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันใน pericytes ที่สัมผัสกับออกซิเจน เราวัดการเปลี่ยนแปลงของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ ซึ่งรวมถึงซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SODs) คาตาเลส และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดสในเพออริไซต์ที่ขาดออกซิเจนที่มีและไม่มีการปิดเสียงของยีนของ HIF-1 ในเพอริไซต์ที่สัมผัสออกซิเจน ระดับเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ (SOD1, SOD2, catalase และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส) ลดลง แต่เพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย paricalcitol (รูปที่ 7A–D) หลังจากการยับยั้งยีนของ HIF- 1 ใน pericytes การรักษาด้วย paricalcitol ได้ควบคุมการแสดงออกของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ (SOD1, SOD2, catalase และ glutathione peroxidase) ภายใต้สภาวะขาดออกซิเจน (all p < 0.05)="" (รูปที่="" 7e–h)="" นอกจากนี้="" ผลการวิจัยยังชี้ให้เห็นว่า="" paricalcitol="" อาจมีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในเยื่อ="" pericytes="" ที่ขาดออกซิเจน="" และผลกระทบเหล่านี้ไม่ขึ้นกับการแสดงออกของ="">

รูปที่ 7 ผลของ paricalcitol ต่อเอ็นไซม์ต้านอนุมูลอิสระใน hypoxic pericytes โดยมีหรือไม่มียีนที่ทำให้เงียบของ HIF-1 (A–D) เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระที่เกี่ยวข้องกับความเครียดออกซิเดชัน (SOD1, SOD2, catalase และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส) ลดลงอย่างมากใน pericytes ที่ขาดออกซิเจน ในขณะที่เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นหลังการรักษาด้วย paricalcitol (E–H) เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษาด้วย paricalcitol ใน pericytes ที่ขาดออกซิเจนด้วยการปิดเสียงของยีนของ HIF-1 ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการหรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน n=4 ต่อแต่ละกลุ่ม *** p < 0.{{10}}01="" เทียบกับการควบคุม="" normoxia;="" #="" p="">< 0.05="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ##="" p="">< 0.01="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" ###="" p="">< 0.001="" เทียบกับกลุ่มขาดออกซิเจน="" †="" p="">< 0.05="" เทียบกับ="" sihif-1="" กลุ่มขาดออกซิเจน;="" ††="" p="">< 0.01="" เทียบกับ="" sihif-1="" กลุ่มขาดออกซิเจน="" คำย่อ:="" hif,="" ปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน;="" sod,="" ซูเปอร์ออกไซด์="" dismutase;="" sirna,="" rna="" ที่รบกวนขนาดเล็ก;="" h,="">

3. อภิปราย

การศึกษานี้แสดงให้เห็นผลในการป้องกันของ paricalcitol ต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจนและการบาดเจ็บที่เกิดจาก TGF- 1-ใน pericyte ครอสทอล์คสามารถสังเกตได้ระหว่างภาวะไตวายและการขาดออกซิเจนของเนื้อเยื่อ และช่วยส่งเสริมการลุกลามของ CKD [2] ทั้งการกระตุ้น TGF- 1 และการสัมผัสของภาวะขาดออกซิเจนทำให้เกิด PMT และการรักษาด้วย paricalcitol ช่วยเพิ่มการเปลี่ยนแปลง fibrotic ใน pericytes ที่ได้รับบาดเจ็บ ผลต้านไฟโบรติกของ paricalcitol สัมพันธ์กับวิถีการส่งสัญญาณ Smad2 ที่ขึ้นกับ HIF-1 -และการปรับลด ยิ่งไปกว่านั้น paricalcitol มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระใน pericytes ที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนในลักษณะอิสระของ HIF-1 - ซึ่งอาจยับยั้ง PMT ได้เช่นกัน

Paricalcitol 19-หรือ-1,25-(OH)2-วิตามิน D2 เป็นวิตามินดีแบบแอนะล็อกที่ออกฤทธิ์และกระตุ้น VDR อย่างเลือกสรร ส่วนใหญ่จะใช้ในการรักษา hyperparathyroidism ทุติยภูมิ และผลการต้านไฟโบรติกและสารต้านอนุมูลอิสระเพิ่มเติมได้รับการพิสูจน์ในการศึกษาก่อนหน้านี้ [8–10] แม้ว่าตัวกระตุ้นวิตามินดีที่ไม่ผ่านการคัดเลือกจะมีผลดีเช่นเดียวกัน เช่น การต่อต้านการทำลายล้างและการปรับภูมิคุ้มกัน [11,12] พวกมันมักจะเพิ่มระดับแคลเซียมและฟอสเฟตในซีรัม Paricalcitol เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา VDR แบบคัดเลือกและมีผลดีต่อสภาวะสมดุลของแคลเซียมโดยไม่เพิ่มระดับอิเล็กโทรไลต์ มีผลดีหลายประการต่อโรคไตในการศึกษาทดลอง เช่น โรคไตจากเบาหวาน โรคไตอุดกั้น และการบาดเจ็บของไตขาดเลือด [13-15] Pericytes มีอยู่ทั่วไปในเนื้อเยื่อของหลอดเลือดทั้งหมดรวมทั้งไตและมีหน้าที่พื้นฐานที่เป็นสื่อกลางที่เกี่ยวข้องกับการรักษาเสถียรภาพของโครงสร้างของ microvasculature การควบคุมเลือด การสร้างเส้นเลือดใหม่ และการรักษาบาดแผล [5,6,16–18] เยื่อหุ้มเซลล์ที่หยุดนิ่งถูกกระตุ้นและเปลี่ยนแปลงโดยปัจจัยหลายประการ เช่น TGF- 1 และความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งมีการควบคุมในการบาดเจ็บที่ไตหรือภาวะขาดออกซิเจน [2,6,19] เพอริไซต์ที่กระตุ้นจะถูกแยกออกจากเส้นเลือดฝอยในช่องท้องและเปลี่ยนเป็นไมโอไฟโบรบลาสต์และทำให้เกิดไฟโบรซิสในไต [2] นอกจากนี้ เราได้แสดงผลการป้องกันของ paricalcitol ต่อภาวะขาดออกซิเจนและการเกิดพังผืดที่เกิดจาก TGF- 1- ใน pericytes ซึ่งอาจนำไปสู่การยับยั้งการลุกลามของ CKD

ภาวะไตวายเป็นลักษณะทางพยาธิวิทยาที่พบได้บ่อยของ CKD โดยไม่คำนึงถึงสาเหตุ และเป็นจุดเด่นของ CKD ที่ทำนายการทำงานของไตในระยะยาวและการลุกลามไปสู่โรคไตระยะสุดท้าย (ESKD) [2,20,21] ในการศึกษานี้ การกระตุ้น TGF- 1, PMT ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน และการรักษาด้วย paricalcitol ทำให้กระบวนการ profibrotic อ่อนลงโดยการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ TGF- 1/Smad myofibroblasts ของไตซึ่งเป็นเซลล์ mesenchymal ที่ถูกกระตุ้นซึ่งแสดง -SMA มีบทบาทสำคัญในการเกิดพังผืดในไตผ่านการสร้างและการสะสมของ ECM ใน tubulointerstitium ซึ่งถือเป็นแผลเป็นในไต [6] เกี่ยวกับการรักษาด้วยยาต้านไฟโบรติกเพื่อป้องกันการลุกลามของ CKD นักวิจัยได้ตรวจสอบเซลล์เป้าหมายหลักและผู้ไกล่เกลี่ยที่เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนของไมโอไฟโบรบลาสต์ [22–24] ยิ่งไปกว่านั้น ยังไม่มีการระบุที่มาที่แน่นอนของไมโอไฟโบรบลาสต์ เป็นที่ทราบกันดีว่าเกิดจากเซลล์ต่างๆ เช่น เพอริไซต์ ไฟโบรบลาสต์ที่อาศัยอยู่ เซลล์เยื่อบุผิว เซลล์บุผนังหลอดเลือด และเซลล์มีเซนไคม์สโตรมอล [25] อย่างไรก็ตาม โดยเฉพาะอย่างยิ่งในไต Humphreys et al. รายงานว่าไฟโบรบลาสต์มีเซนไคมอลที่ถูกกระตุ้นเหล่านี้ส่วนใหญ่ติดอยู่กับหลอดเลือดขนาดเล็กและมีต้นกำเนิดมาจากเยื่อหุ้มเซลล์ [19] สิ่งที่น่าสนใจคือ paricalcitol ปรับลดเส้นทางการส่งสัญญาณ Smad2 เพียงอย่างเดียว แต่ไม่ใช่เส้นทาง Smad3 ทั้งในภาวะขาดออกซิเจนและ TGF- 1- ที่เกิดจากการบาดเจ็บของ pericytes ในการศึกษานี้ Smad2 และ Smad3 มีความคล้ายคลึงกัน 90 เปอร์เซ็นต์ในลำดับกรดอะมิโน แต่มีความไวต่างกันในการถ่ายทอดสัญญาณ TGF- 1 [26] แม้ว่ากลไกที่แน่นอนในวิธีที่ paricalcitol ยับยั้งเส้นทาง Smad2 นั้นไม่สามารถอธิบายได้ในการศึกษานี้ แต่การยับยั้งฟอสโฟรีเลชันของ Smad2 อาจเป็นกลไกสำคัญสำหรับผลการต้านไฟโบรติกของ paricalcitol ใน pericytes ของไต

ไตเป็นอวัยวะที่ขาดออกซิเจนทางสรีรวิทยา แม้ว่าจะมีปริมาณเลือดมาก (20 เปอร์เซ็นต์ของการส่งออกของหัวใจในมนุษย์) เนื่องจากการแยกออกซิเจนในหลอดเลือดแดง [27–29] นอกจากนี้ ปริมาณออกซิเจนที่ส่งไปยังเยื่อหุ้มสมองของไตสามารถเปลี่ยนแปลงได้อย่างมากขึ้นอยู่กับสถานะของเลือดไปเลี้ยงไต [30] เนื่องจากสิ่งเหล่านี้นำมาซึ่งการใช้ออกซิเจนอย่างไร้ประสิทธิภาพและความแปรปรวนในระดับออกซิเจนในไต ไตจึงมีแนวโน้มที่จะเสี่ยงต่อการบาดเจ็บจากการขาดออกซิเจน [30] ในระยะเฉียบพลันของ AKI เซลล์เยื่อบุผิวท่อไตและเซลล์บุผนังหลอดเลือดในหลอดเลือดได้รับความเสียหายและกระตุ้น ส่งผลให้มีการควบคุมไซโตไคน์และคีโมไคน์ต่างๆ เพิ่มขึ้น ทำให้เกิดการเรียงซ้อนในทางเดินอาหาร และการบาดเจ็บรุนแรงขึ้น [31-13] ในระยะเรื้อรังของ AKI AKI จะทำให้ไตขาดออกซิเจนมากขึ้นโดยการกระตุ้นให้เกิดโรคพังผืดในหลอดเลือดเนื่องจากการสะสม ECM ที่มากเกินไปจะเพิ่มระยะห่างระหว่างเส้นเลือดฝอยในช่องท้องและเซลล์เยื่อบุผิวท่อส่งผลให้ประสิทธิภาพการแพร่กระจายของออกซิเจนลดลง [27] การหายากของเส้นเลือดฝอยผ่านการปลดปล่อย pericyte ด้วยการแสดงออกที่ลดลงของปัจจัยเกี่ยวกับหลอดเลือดก็เป็นสาเหตุสำคัญของการขาดออกซิเจนในไต ภาวะขาดออกซิเจนกระตุ้นเส้นทางการส่งสัญญาณ HIF-1 ซึ่งนำไปสู่การรวมเครือข่ายการส่งสัญญาณหลายเครือข่าย เช่น เส้นทาง TGF- /Smad, Notch และ NF-kB เพื่อกระตุ้นการเกิดพังผืดในไต [3] วงจรอุบาทว์นี้ระหว่างการเกิดพังผืดในไตและภาวะขาดออกซิเจนมีส่วนทำให้เกิดการลุกลามของ CKD ดังนั้นสิ่งเหล่านี้จึงเป็นเป้าหมายหลักในการรักษาอาการบาดเจ็บที่ไต

เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงที่เป็นพิษของเพอริไซต์และผลการป้องกันของพาริคัลซิทอลในสภาพแวดล้อมที่คล้ายคลึงกับการบาดเจ็บของไตอย่างชัดเจน เพอริไซต์ได้รับสภาวะขาดออกซิเจน การสัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนเพิ่มการแสดงออกของยีนที่ขึ้นกับ HIF-1 และ HIF-1 - HIF-1 ทำให้เกิดภาวะไตวายและลดการใช้ออกซิเจนโดยการยับยั้งเส้นทางการเผาผลาญและออร์แกเนลล์ภายในเซลล์ที่กินออกซิเจน [34–36] Paricalcitol แสดงผล antifibrotic โดยปรับลด HIF-1 ยีนที่ขึ้นกับ HIF-1 - ที่ตามมา และการแสดงออกของ TGF- 1 ใน pericytes ที่สัมผัสออกซิเจน ผลของการปิดเสียงของยีนของ HIF-1 ยังสนับสนุนว่า HIF-1 จะเป็นเป้าหมายหลักในการรักษาของ paricalcitol ในการบาดเจ็บที่เยื่อหุ้มเซลล์ ในขณะเดียวกัน การแสดงออกของ PHD3 ลดลงหลังการรักษาด้วย paricalcitol แม้หลังจากการปิดเสียงของ HIF-1 แม้ว่าระดับการลดลงจะลดลงก็ตาม ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับข้อเท็จจริงที่ว่า PHD3 ไม่เพียงแต่เป็นเซ็นเซอร์ออกซิเจนเท่านั้น แต่ยังกระตุ้นการตายของเซลล์ผ่านกลไกอิสระของ HIF-1 - [37] อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับฤทธิ์ต้านอะพอพโทซิสของ paricalcitol ในเพอริไซต์ นอกจากนี้ paricalcitol ยังได้แสดงเพื่อลดการบาดเจ็บจากความเครียดออกซิเดชันใน pericytes ที่สัมผัสกับออกซิเจนในเลือดต่ำในลักษณะที่ไม่ขึ้นกับ HIF-1 - ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันเป็นปัจจัยที่รู้จักกันดีซึ่งก่อให้เกิดภาวะไตวายและการอักเสบ [38] โดยรวม ภาวะขาดออกซิเจนในไตกระตุ้น PMT เพื่อพัฒนา CKD ในขณะที่ paricalcitol สามารถยับยั้งการเกิดพังผืดในลักษณะที่ขึ้นกับ HIF-1 - และ HIF-1 - อย่างอิสระ

เมื่อเร็ว ๆ นี้ การศึกษาจำนวนมากได้รายงานถึงความสำคัญของการขาดออกซิเจนในการเปลี่ยนจาก AKI-to-CKD [39,40] การเกิดพังผืดเป็นการตอบสนองการป้องกันที่จำเป็นต่อการบาดเจ็บของเนื้อเยื่อ แต่การเกิดพังผืดที่มากเกินไปเรื้อรังในไตทำให้เกิดการขาดออกซิเจนและเป็นอุปสรรคต่อกระบวนการซ่อมแซม [41] ตามความรู้ของเรา นี่เป็นการศึกษาครั้งแรกที่ตรวจสอบภาวะขาดออกซิเจนและ PMT ที่เหนี่ยวนำโดย TGF- 1- รวมถึงฤทธิ์ต้านไฟโบรติกและสารต้านอนุมูลอิสระของ paricalcitol ใน pericytes การศึกษานี้คาดว่าจะเป็นพื้นฐานสำหรับการวิจัยในอนาคตที่พิสูจน์ผลการรักษาของ paricalcitol ในการรักษาอาการบาดเจ็บที่ไตเพื่อยับยั้งการเปลี่ยนแปลงของ AKI–to–CKD อย่างไรก็ตาม การศึกษานี้มีข้อจำกัดหลายประการ ประการแรก เราไม่ได้ประเมินผลการต้านไฟโบรติกและสารต้านอนุมูลอิสระของ paricalcitol ในการทดลองเพาะเลี้ยงโค เนื่องจากเพอริไซต์ตั้งอยู่ใกล้กับเซลล์บุผนังหลอดเลือดฝอย ปัจจัยที่เกิดจากเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ได้รับบาดเจ็บจึงอาจส่งผลต่อผลกระทบของพาริคัลซิทอล [2] ประการที่สอง ไม่มีการประเมินกลไกโดยละเอียดของผลการป้องกันของ paricalcitol และวิธียับยั้ง phosphorylation ของ Smad2 จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อยืนยันกลไกการดำเนินการที่แน่นอน

โดยสรุป ภาวะขาดออกซิเจนหรือ TGF- 1 ชักนำ PMT ในลักษณะที่ขึ้นกับ HIF-1 -ผ่านวิถีการส่งสัญญาณ Smad2 Paricalcitol ปรับปรุง PMT ที่ถูกควบคุมโดยการปรับลดเส้นทางที่ขึ้นกับ HIF-1 -และการยับยั้งเส้นทางการส่งสัญญาณ TGF- 1/Smad2 เพอริไซต์ที่สัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนยังทำให้เกิดการบาดเจ็บจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ซึ่งได้รับการปรับปรุงเนื่องจากการรักษาด้วยพาริคัลซิทอลโดยการเพิ่มเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระในลักษณะที่เป็นอิสระของ HIF-1 - นอกจากนี้ ผลลัพธ์ของเราแนะนำว่า paricalcitol อาจเป็นทางเลือกในการรักษาในการรักษาภาวะไตวายโดยการกำหนดเป้าหมายทางชีววิทยาของ pericyte ในการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจนและ TGF- 1-

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. การแยกตัวและวัฒนธรรมของไตหนูเมาส์

เมาส์ C57BL/6ไตถูกแยกแคปซูล หั่นสี่เหลี่ยมลูกเต๋า แล้วฟักที่อุณหภูมิ 37 องศาเป็นเวลา 45 นาทีด้วย Liberase (0.5 มก./มล., โรช, มานน์ไฮม์, เยอรมนี) และ DNase (100 U/มล., นิวอิงแลนด์ Biolabs, Hitchin, UK) ใน DMEM/F12 ที่อุณหภูมิ 37 .C ในอ่างน้ำแบบเขย่า หลังจากการปั่นเหวี่ยง เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์การแยกสลายของ RBC ที่ 4 .C เป็นเวลา 5 นาที ล้าง แขวนลอยใหม่อีกครั้งในบัฟเฟอร์ BSA 0.5 เปอร์เซ็นต์ที่มี EDTA และกรองผ่านตัวกรองเซลล์ 70- และ 40-มม. หลังจากการปั่นเหวี่ยง เม็ดถูกแขวนลอยใหม่ในสารละลาย Percoll 45 เปอร์เซ็นต์ (v/v) และหมุนเหวี่ยงที่ 5525 × g เป็นเวลา 30 นาทีที่ 4 .C (โดยไม่เบรก) จากนั้นเก็บชั้นเซลล์จากชั้นบนสุดของสารละลาย Percoll หลังจากการปั่นแยก เม็ดเซลล์จะถูกติดฉลากด้วยแม่เหล็กด้วยไมโครบีด CD146 (LSEC) และแยกออกใน

ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นนำเซลล์ที่เก็บรวบรวมมาเพาะเลี้ยงใน

สื่อ pericyte เสริมด้วย FBS 2 เปอร์เซ็นต์, PGS 1 เปอร์เซ็นต์ และ P/S 1 เปอร์เซ็นต์ (ScienCell, Carlsbad, CA, USA) ที่ 37 .C ใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 และ 95 เปอร์เซ็นต์ของเครื่องปรับอากาศ เซลล์เพาะเลี้ยงหลักที่ใช้ในการศึกษาปัจจุบันอยู่ระหว่าง Passage 2 และ 6 ตัวกลางสำหรับการเจริญเติบโตจะเปลี่ยนทุก 3-4 วัน

เรายืนยันเพอริไซต์ที่เพาะเลี้ยงผ่านเซลล์ flow cytometry และ การย้อมด้วยมาร์คเกอร์เฉพาะ pericyte เช่น PDGFR , CD146 และ neuron–glial antigen 2 (NG2) (รูปเพิ่มเติม S2) ในการวิเคราะห์การคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยแสงเรืองแสง เพอริไซต์ที่เพาะเลี้ยงแสดงจำนวนที่เพิ่มขึ้นของเซลล์ที่เป็นบวก PDGFR , CD146 และ NG2 และจำนวนเซลล์บวกของ CD31 ไม่เปลี่ยนแปลง ในการวิเคราะห์การย้อมแบบอิมมูโนflออเรสเซนซ์ เพอริไซต์ที่เพาะเลี้ยงยังแสดงออกร่วมกันด้วย CD146/PDGFR , CD146/NG2 และ PDGFR /NG2 ความอยู่รอดของเพอริไซต์ถูกประเมินโดยใช้ชุดตรวจนับเซลล์-8 (CCK-8) ความอยู่รอดของเพอริไซต์ไม่เปลี่ยนแปลงหลังการบำบัดด้วยพาริคัลซิทอล (20 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) และ/หรือ TGF- 1 (5 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง

4.2. การรักษาเซลล์

หลังจากการอดอาหารของ growth factor เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพอริไซต์ถูกปรับสภาพด้วยหรือไม่มี paricalcitol (20 ng/mL) เป็นเวลา 90 นาที และต่อมาถูกกระตุ้นโดย TGF- 1 (5 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) เป็นเวลา 48 ชม. สำหรับภาวะขาดออกซิเจน เพอริไซต์ได้รับการเพาะเลี้ยงในออกซิเจน 1 เปอร์เซ็นต์และคาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ในเวิร์กสเตชันที่ขาดออกซิเจน (Invivo2 400, Baker Ruskin, Sanford, ME, USA)

4.3. การย้อมสีภูมิคุ้มกันของเพอริไซต์

เปริไซต์ถูกเพาะเลี้ยงบนสไลด์แชมเบอร์และตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 3.7 เปอร์เซ็นต์ใน PBS เป็นเวลา 30 นาที นอกจากนี้ เปริไซต์ถูกล้างด้วย PBS และซึมผ่านด้วยไทรทัน 0.3 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 15 นาที เซลล์ที่ถูกตรึงถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิต่อ PDGFR (1:50), CD146 (1:50) และ NG2 (1:50) ค้างคืนที่ 4 .C หลังจากล้างเพอริไซต์อีกครั้ง พวกมันจะถูกฟักด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (Alexa Fluor 488 และ Alexa Fluor 594, Life Technologies, Eugene, OR, USA) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง นิวเคลียสถูกย้อมทับด้วย 4/,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) และสไลด์ถูกติดตั้งด้วยน้ำยายึดติดที่ป้องกันการซีดจาง (Molecular Probes) ส่วนต่างๆ ได้รับการตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนเลนส์คอนโฟคอล Zeiss โดยใช้ LSM 5 Exciter (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)

4.4. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์

เพอริไซต์ถูกเพาะในเพลต 96-หลุมและบ่มโดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรัมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการอดอาหาร, เปริไซต์ถูกบำบัดด้วย paricalcitol (20 ng/mL) และ/หรือ TGF- 1 (5 ng/mL) วิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้การทดสอบ CCK-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลท (SPARK 10M, Tecan, Durham, NC, USA) ค่าถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม

4.5. การทดสอบการย้ายเซลล์รอยขีดข่วน

เปริไซต์ถูกชุบลงในเพลต IncuCyte ImageLock 96-หลุม (Essen BioScience, AnnArbor, MI, USA) และบ่มในชั่วข้ามคืน สื่อถูกเปลี่ยนเป็นอาหารที่สมบูรณ์ด้วย mitomycin-C (10 ug/mL, M4287; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงเพื่อยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์ เซลล์โมโนเลเยอร์แต่ละเซลล์ถูกขีดข่วนโดยใช้ 96-พิน WoundMaker (IncuCyte Zoom Live-Cell Imaging System; Essen BioScience) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากการเกา เพื่อศึกษาผลของ paricalcitol ต่อการย้ายถิ่นของเซลล์ เปริไซต์ถูกปรับสภาพด้วย paricalcitol (20 ng/mL) เป็นเวลา 90 นาที และต่อมาบ่มด้วย TGF- 1 (5 ng/mL) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังการรักษา ภาพจะได้รับ บันทึก และลงทะเบียนในระบบซอฟต์แวร์ IncuCyte ทุกๆ 4 ชั่วโมง ข้อมูลถูกวิเคราะห์โดยใช้ตัวชี้วัดแบบบูรณาการ และค่าถูกแสดงเป็นความหนาแน่นของบาดแผลสัมพัทธ์

4.6. การทดสอบการย้ายเซลล์ Transwell

เปริไซต์ถูกบำบัดด้วย TGF- 1 (5 ng/mL) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงหลังจากการบ่มล่วงหน้าด้วย paricalcitol (20 ng/mL) เป็นเวลา 90 นาที นอกจากนี้ เซลล์ถูกถอดออกด้วยทริปซิน–EDTA และเคลือบบน 24-เม็ดมีด Transwell (1 × 104 เซลล์/หลุม, ขนาดรูพรุน 8 มม.; 6.5 มม.

ทรานส์เวลล์ [#3422], Corning, NY, USA). หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ย้ายไปยังด้านล่างของเม็ดมีดจะถูกตรึงด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 3.7 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 10 นาที ในทางกลับกัน เซลล์ที่ย้ายที่ใบหน้าด้านล่างถูกย้อมด้วยคริสตัลไวโอเล็ต 0.1 เปอร์เซ็นต์ (V5265; Sigma– Aldrich, St. Louis, MO, USA) เป็นเวลา 5 นาที และเซลล์ใน 10 ช่องที่เลือกแบบสุ่มจะถูกนับภายใต้ กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงกำลังขยาย ×100

4.7. การเปลี่ยนถ่ายเพอริไซต์ด้วย HIF-1a siRNA

HIF{{0}} siRNA ของเมาส์และ siRNA ที่ไม่กำหนดเป้าหมาย (กลุ่มควบคุมเชิงลบ) ถูกซื้อจาก Dharmacon (Chicago, IL, USA) ถ่ายโดยใช้ Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Paisley, UK) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์เพอริไซต์ (5.0 × 104) ถูกเพาะก่อนการทรานส์เฟกชัน 1 วันก่อนการทรานส์เฟกชันและเพาะเลี้ยงเพื่อให้ถึงคอนซิชัน 40–50 เปอร์เซ็นต์ในวันรุ่งขึ้น ดูเพล็กซ์ RNAi สำหรับ HIF-1 ถูกผสมกับไลโปเฟคตามีนเพื่อสร้างสารเชิงซ้อนในการทรานส์เฟกชันที่เติมลงในเซลล์ที่เคลือบ หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 6 ชั่วโมง เซลล์ถูกบำบัดก่อนด้วย paricalcitol (20 ng/mL) เป็นเวลา 90 นาที จากนั้นถ่ายโอนไปยังห้องที่ขาดออกซิเจนและเปิดเผยภาวะขาดออกซิเจนเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ที่ทรานส์เฟกถูกใช้สำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่การถอดรหัสย้อนกลับแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณในเชิงปริมาณ (qRT-PCR)

4.8. การแยก RNA และการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ

RNA ทั้งหมดสกัดจาก pericytes ที่บำบัดด้วย Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต RNA ทั้งหมดหนึ่งไมโครกรัมถูกคัดลอกกลับด้านโดยใช้ชุดการสังเคราะห์ PrimeScript cDNA (Takara Shuzo Co., Otsu, Japan) ไพรเมอร์ทั้งหมดสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์ (Supplemental Table S1) ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์ Primer Express V1.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณดำเนินการบน ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) โดยใช้ SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ตัวอย่างทั้งหมดถูกคำนวณโดยใช้วิธี Ct เปรียบเทียบสำหรับการหาปริมาณสัมพัทธ์ของการแสดงออกของยีนและการทำให้เป็นมาตรฐานโดยคำนึงถึงการแสดงออกของ GAPDH

4.9. การวิเคราะห์ Western Blot

หลังการรักษา โปรตีนทั้งหมด (25 ไมโครกรัม) ถูกแยกออกโดยใช้โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟรีซิส 10 เปอร์เซ็นต์ และถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส เมมเบรนถูกปิดกั้นด้วยนมพร่องมันเนย 10 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและบ่มข้ามคืนที่ 4 องศาด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ต้านฟอสโฟ-Smad2 (1:1000, กิ้งกือ), Smad2 (1:200, Invitrogen), ฟอสโฟ-Smad3 (1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), Smad3 (1:1000, Cell Signaling), TGF- 1 (1:1000, ซานตาครูซ, ดัลลาส, เท็กซัส, สหรัฐอเมริกา) และ GAPDH (1:2000, การส่งสัญญาณของเซลล์) หลังจากล้าง เยื่อหุ้มเซลล์ถูกบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (P0448, Dako, Glostrup, เดนมาร์ก) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตรวจพบเมมเบรนโดยใช้รีเอเจนต์ ECL (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) และแสดงภาพบนระบบ ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Japan) ความหนาแน่นของแถบโปรตีนถูกหาปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ Scion Image (Scion, Frederick, MD, USA)

4.10. การวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลถูกนำเสนอเป็นวิธีการ o ข้อผิดพลาดมาตรฐานและได้มาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้การทดสอบแบบไม่มีพารามิเตอร์ การวิเคราะห์ดำเนินการโดยใช้ SPSS (เวอร์ชัน 20.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA) ค่า p ที่น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

วัสดุเสริม: ข้อมูลต่อไปนี้สามารถดูได้ทางออนไลน์ที่ https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22189751/s1

ผลงานของผู้แต่ง: Conceptualization, J.-HL และ S.-HP; ระเบียบวิธี, J.-HL, J.-MY และ S.-HP; การตรวจสอบความถูกต้อง, J.-HL, J.-MY และ S.-HP; การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ J.-HL และ J.-MY; การสืบสวน, J.-HL, J.-MY, S.-HO และ S.-HP; ทรัพยากร J.-MY และ S.-HP; การจัดการข้อมูล, J.-HL, J.-MY และ S.-HP; การเขียน—การเตรียมร่างต้นฉบับ, J.-HL, J.-MY และ S.-HP; การเขียน—ทบทวนและแก้ไข, J.-HL, S.-JJ, HWN, H.-YJ, J.-YC, J.-HC, C.-DK, Y.-LK และ S.-HP; การกำกับดูแล S.-HP; การบริหารโครงการ S.-HP ผู้เขียนทุกคนได้อ่านและตกลงที่จะตีพิมพ์ต้นฉบับของต้นฉบับ

เงินทุน: งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดยสถาบันวิจัยชีวการแพทย์ โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยแห่งชาติ Kyungpook (2019)

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล: ข้อมูลที่นำเสนอในการศึกษานี้มีให้ตามคำขอจากผู้เขียนที่เกี่ยวข้อง

ความขัดแย้งทางผลประโยชน์: ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีผลประโยชน์ทับซ้อน