สารสกัดจากใบมะกอก (OLE) ทำให้การติดตาม Aquaporin-2 ที่เกิดจาก Vasopressin บกพร่องโดยการเปิดใช้งานตัวรับแคลเซียม

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม ติดต่อ:tina.xiang@wecistanche.com

Vasopressin (AVP) ช่วยเพิ่มการซึมผ่านของน้ำในไตรวบรวมท่อตามข้อบังคับการค้ามนุษย์ aquaporin-2 (AQP2) ความผิดปกติหลายอย่าง รวมถึงความดันโลหิตสูงและการหลั่งฮอร์โมนขับปัสสาวะที่ไม่เหมาะสม (SIADH) เกี่ยวข้องกับความผิดปกติในสภาวะสมดุลของน้ำ มันแสดงให้เห็นว่าไฟโตคอมพาวด์บางชนิดมีประโยชน์ต่อสุขภาพของมนุษย์ ที่นี่ ผลของสารสกัดจากใบมะกอก (OLE) ได้รับการประเมินโดยใช้แบบจำลองในหลอดทดลองและในร่างกาย การศึกษา Confocal แสดงให้เห็นว่า OLE ป้องกันการโยกย้าย AQP2 ที่เกิดจาก vasopressin ไปยังพลาสมาเมมเบรนในเซลล์ MCD4 และหนูไต. การฟักไข่ด้วย OLE ช่วยลดการเพิ่มขึ้นของค่าสัมประสิทธิ์การซึมผ่านของน้ำที่ออสโมติก (Pf) ขึ้นกับ AVP เพื่อชี้แจงถึงผลที่เป็นไปได้ของ OLE แคลเซียมภายในเซลล์ได้รับการประเมิน OLE เพิ่มแคลเซียมภายในเซลล์ผ่านการกระตุ้นแคลเซียม Sensing Receptor (CaSR).NPS2143 ซึ่งเป็นสารยับยั้ง CaSR แบบคัดเลือก ยกเลิกผลการยับยั้งของ OLE ต่อการซึมผ่านของน้ำที่ขึ้นกับ AVP การทดลองในร่างกายเปิดเผยว่าการรักษาด้วย OLE เพิ่มการแสดงออกของ CaSR mRNA และลด AQP2 mRNA ควบคู่ไปกับการเพิ่มขึ้นของ AQP2-การกำหนดเป้าหมาย miRNA-137 การค้นพบนี้ร่วมกันชี้ให้เห็นว่า OLE ต่อต้านการกระทำของ vasopressin โดยการกระตุ้น CaSR ซึ่งบ่งชี้ว่าสารสกัดนี้อาจเป็นประโยชน์ต่อการลดทอนความผิดปกติของสัญญาณ CaSR ที่ผิดปกติและส่งผลต่อการดูดซึมน้ำในไต

ใบมะกอกมีการใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นยาแผนโบราณในการรักษาโรคต่าง ๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในประเทศแถบเมดิเตอร์เรเนียน ใบมักบริโภคในอาหารของมนุษย์เป็นสารสกัดหรือผงเพื่อเตรียมเงินทุนหรือชาสมุนไพร การวิเคราะห์ลักษณะทางเคมีพบว่าใบมะกอกมีสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิดที่อาจส่งผลดีต่ออาการป่วยบางอย่าง เช่น โรคเมตาบอลิซึม ภาวะไขมันในเลือดผิดปกติ และความดันโลหิตสูง ในผู้ป่วยที่มีภาวะความดันโลหิตสูงที่จำเป็น OLE จะลดความดันโลหิต และระดับน้ำตาลในเลือดและแคลเซียมลดลงเล็กน้อย" โพลีฟีนอลจำนวนมาก เช่น oleuropein, hydroxytyrosol และ tyrosol ได้รับการค้นพบที่อุดมไปด้วยสารสกัดจากใบมะกอกเขียว (OLE)5 และเป็นที่ทราบกันดีว่ามีส่วนร่วมในการป้องกันโรคบางชนิดที่เกิดจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ดังนั้น ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ความสนใจในการศึกษาผลประโยชน์ที่เป็นไปได้ของสารสกัดจากใบมะกอกจึงเพิ่มขึ้นในหมู่นักวิทยาศาสตร์ในสาขาการวิจัยต่างๆ OIE แสดงผลการต้านการงอกขยายอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์มะเร็ง Mesothelioma โดยการเปลี่ยนแปลงพลวัตของแคลเซียมภายในเซลล์ ซึ่งอาจกำหนดเป้าหมายไปที่ T- พิมพ์ช่อง Ca2 plus ที่น่าสนใจคือพบว่า OLE มีฤทธิ์ลดความดันโลหิตต่อความดันโลหิตสูงในยีนในหนูที่มีความดันโลหิตสูงตามธรรมชาติ (SHR) ซึ่งเกี่ยวข้องกับการปรับปรุงการทำงานของหลอดเลือด* การดูดซึมน้ำที่มากเกินไปมีบทบาทสำคัญในการเกิดโรคของความดันโลหิตที่เพิ่มขึ้น ในผู้ป่วยความดันโลหิตสูงที่รักษาด้วยสารสกัดจากใบมะกอก พบว่าปัจจัยการอักเสบต่างๆ ลดลงอย่างมีนัยสำคัญซึ่งสัมพันธ์กับความดันโลหิตที่ลดลง นอกจากนี้ การกักเก็บน้ำที่มากเกินไปยังทำให้เกิดความผิดปกติหลายอย่าง เช่น โรคตับแข็ง ภาวะหัวใจล้มเหลว และการหลั่งฮอร์โมนขับปัสสาวะที่ไม่เหมาะสม (SIADH) สภาวะสมดุลของน้ำในร่างกายถูกควบคุมอย่างเข้มงวดโดยฮอร์โมน vasopressin (AVP) ยาแก้ขับปัสสาวะที่ปล่อยออกมาภายใต้สภาวะที่ขาดน้ำ AVP จับตัวรับ V2R ของ cognate ที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นที่เมมเบรน basolateral ของไตเซลล์หลักด้วยเหตุนี้จึงกระตุ้นเส้นทางสัญญาณของแคมป์ซึ่งส่งผลให้เกิดการเคลื่อนย้ายของถุงน้ำที่มีอควาพอริน-2(AQP2)จากแหล่งรวมภายในเซลล์ไปยังเมมเบรนพลาสมาส่วนปลายที่มีการดูดซึมน้ำกลับคืนมา ที่ระดับโมเลกุล ปัจจัยหลายประการอาจปรับความสมดุลของน้ำในไต ระดับแคลเซียมในลูมินอลที่เพิ่มขึ้นลดลงควบคุมการค้า AOP2 ที่ขึ้นกับ vasopressin ในระยะสั้นผ่านการกระตุ้นของตัวรับแคลเซียมที่สัมผัส (CaSR) 1,12 ในทางกลับกัน การกระตุ้น CaSR ในเซลล์เยื่อบุผิวท่อใกล้ไตที่เป็นอมตะแบบมีเงื่อนไข ซึ่งแยกได้จากปัสสาวะของมนุษย์ ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของแคลเซียมในเซลล์ และลดการเพิ่มขึ้นของแคมป์ที่เกิดจากฟอร์สโคลิน (FK) ซึ่งเป็นตัวกระตุ้นโดยตรงของอะดีนิเลต cvclase3 นอกจากนี้ ในเซลล์ท่อรวบรวม MCD4 ของไต การแสดงช่องน้ำ AOP2 อย่างเสถียร การกระตุ้น CaSR ได้ลดทอนการเพิ่มขึ้นของฟอสโฟรีเลชั่น AQP2 ที่ขึ้นกับแคมป์ที่ซีรีน 256 ซึ่งเป็นเหตุการณ์สำคัญในน้ำตกการส่งสัญญาณที่กระตุ้นโดยวาโซเพรสซิน และในที่สุดก็เพิ่มการซึมผ่านของน้ำ4 ,15 นอกจากนี้, ในไตชิ้นจากไตของเมาส์ไขกระดูกด้านใน การกระตุ้น CaSR ด้วยแคลเซียม NPS-R568 ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน AQP2-การกำหนดเป้าหมาย miRNA-137 ซึ่งยืนยันการโต้ตอบที่แน่นแฟ้นระหว่างเส้นทางสัญญาณ CaSR และ AQP{ {4}}ความสามารถในการซึมผ่านของน้ำขึ้นอยู่กับผลl.17.ในการศึกษานี้ ผลของสารสกัดจากใบมะกอกที่ได้จากพันธุ์โคราตินาในท้องถิ่น ได้รับการประเมินต่อการทำงานของ AQP2 ที่เกิดจากวาโซเพรสซินในเซลล์ MCD4 ของท่อรวบรวมไตที่แสดงออก AOP2 และใน dDAVP อย่างเสถียร หนูที่ได้รับการบำบัดด้วยสารสกัด เรามีหลักฐานว่าการรักษาด้วย OLE ต่อต้านการตอบสนองของ vasopressin ในเซลล์ไต ซึ่งอาจอธิบายผลการขับปัสสาวะได้ส่วนหนึ่ง น่าสนใจ ผลกระทบนี้ดูเหมือนจะเกี่ยวข้องกับการกระตุ้น CaSR ที่เหนี่ยวนำโดย OLE ซึ่งเป็นตัวรับที่ทราบกันว่ามีส่วนสัมพันธ์เชิงลบกับตัวรับวาโซเพรสซิน2

เรียนรู้ผลกระทบเพิ่มเติมของ cistanche ต่อไต

ผลลัพธ์

ผลของ OLE ต่อฟังก์ชัน AQP2 ที่เกิดจากวาโซเพรสซินในเซลล์ MCD4 เพื่อตรวจสอบการมีส่วนร่วมที่เป็นไปได้ของ OLE ต่อฟังก์ชัน AQP2 ที่ขึ้นกับ vasopressinไตการรวบรวมเซลล์ MCD4 ในท่อส่ง ซึ่งแสดงออกถึงวาโซเพรสซินรีเซพเตอร์ 2(V2R) และ AQP2 ของมนุษย์อย่างคงตัว ถูกใช้เป็นแบบจำลองการทดลอง18 การศึกษาแบบโฟกัสเฉพาะจุด (รูปที่ 1A) เปิดเผยว่า เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย dDAVP ซึ่งการย้อมสี AQP2 ถูกแปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังเมมเบรนพลาสมาส่วนปลาย การรักษาด้วย OLE จะป้องกันการแปลตำแหน่งเมมเบรนของ AOP2 ที่เกิดจากการกระตุ้นด้วย dDAVP สอดคล้องกับข้อสังเกตเหล่านี้ การบำบัดด้วย OLE บั่นทอนการเพิ่มขึ้นของการตอบสนองออสโมติกชั่วคราวที่เกิดจาก dDAVP (ระบุเป็น 1/t ในรูปที่ 1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 เปอร์เซ็นต์ , n=292 เซลล์เทียบกับ dDAVP=206.8±5.49 เปอร์เซ็นต์ ,n=186 เซลล์;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="191 cells" vs="" ole/ddavp="88.70±1.86%,n=292"><0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

ผลของ OLE ต่อไตของหนูที่ฉีด OLE

เพื่อตรวจสอบการกระทำของ OLE เพิ่มเติม ได้ทำการศึกษาในร่างกายแล้ว โดยเฉพาะอย่างยิ่ง หนูได้รับการฉีด OLE (250 มก./กก./วัน) วันละครั้งเป็นเวลาสามวัน อย่างเป็นทางเลือก หนูแรทถูกบำบัดร่วมกับ OLE เป็นเวลา 3 วัน และ dDAVP เป็นเวลา 30 นาที การประเมิน CaSR mRNA ที่แยกออกจากท่อรวบรวมไตของหนูและประมวลผลสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์ (รูปที่ 6) เผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน CaSR mRNA ใน OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} หนูเทียบกับ CTR=1.02±0.17, n=5 หนู; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="">ไตทำการวิเคราะห์แบบ Western blotting และการศึกษาคอนโฟคอล (รูปที่ 9) ในหนูที่ฉีด OLE/dDAVP ฟอสโฟรีเลชั่นของ AQP2 ที่ซีรีน 256 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อไตของสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย dDAVP (OLE/dDAVP=0 77±0.16, n=5 หนูเทียบกับ dDAVP=2.16±0.25,n=5 หนู; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

การอภิปราย

แคลเซียมเป็นตัวส่งสารภายในเซลล์ที่สำคัญซึ่งปรับการทำงานของเซลล์มากมายเหลือเฟือ2 การส่งสัญญาณแคลเซียมผิดปกติอาจนำไปสู่โรคต่างๆ รวมถึงภาวะหัวใจล้มเหลว มะเร็ง และความดันโลหิตสูง23 การควบคุมเฉพาะของการแสดงออกและกิจกรรมของโปรตีนที่ควบคุมสัญญาณแคลเซียมภายในเซลล์หลายตัวได้รับการพิสูจน์แล้วว่าประสบผลสำเร็จในการเผชิญกับความผิดปกติมากมาย ดังนั้นจึงน่าสนใจสำหรับการพัฒนายา การศึกษานี้ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับกลไกการออกฤทธิ์ของ OLE โดยแสดงความสามารถในการปรับสัญญาณแคลเซียมภายในเซลล์ผ่านการกระตุ้นของ CaSR ที่เกี่ยวข้องกับการปรับแต่งการค้าและการแสดงออกของ AQP2 ที่เกิดจาก vasopressin ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา AQP2 มีบทบาทสำคัญในการควบคุมสภาวะสมดุลของน้ำในร่างกาย25 การกระตุ้นของเครื่องจักรภายในเซลล์ ทำให้เกิดการแปลของ AQP2 ที่เยื่อหุ้มพลาสมาส่วนปลาย ส่งผลให้เกิดการกักเก็บน้ำผิดปกติและภาวะน้ำตาลในเลือดต่ำ เช่น ในกลุ่มอาการของฮอร์โมนขับปัสสาวะที่ไม่เหมาะสม (SIADH) การหลั่ง ตับแข็ง และภาวะหัวใจล้มเหลว แบบจำลอง SIADH ที่เกี่ยวข้องกับโรคไต polycystic 1 haploinsufficiency ระดับแคลเซียมภายในเซลล์พื้นฐานลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับระดับที่วัดได้ในท่อรวบรวมของหนูป่า แคลเซียมภายในเซลล์ต่ำปรับการทำงานของเอ็นไซม์บางชนิดรวมทั้งโปรตีน phosphatase PP2A ส่งผลให้มีการควบคุม AOP2 phosphorylation ที่ซีรีน 2561 ในทางตรงกันข้าม การกระตุ้น CaSR ด้วย calcimimetic NPS-R568 ช่วยเพิ่มความเข้มข้นของแคลเซียมภายในเซลล์และลดระดับแคมป์ในเซลล์ที่ขาด PKD1 ที่สำคัญ แคลเซียมในเซลล์สามารถลดระดับของอะดีนิเลเตตอะดีนิเลตที่ยับยั้งแคลเซียมได้ ซึ่งจะเป็นการปรับระดับภายในเซลล์ของแคมป์อย่างละเอียด ในเซลล์ MCD4 แท้จริงแล้วการกระตุ้น CaSR ด้วย NPS-R568 ทำให้ AQP ลดลง2-pS256 ผ่านการยับยั้งของอะดีนิเลต cyclase4 ในการศึกษานี้ การรักษาด้วย OLE ได้ป้องกันการเพิ่มขึ้นของ cAMP และ AOP2-pS256 ที่ขึ้นกับ vasopressin ซึ่งอาจเป็นผลรองจากการเพิ่มขึ้นของความเข้มข้นของแคลเซียมภายในเซลล์ ข้อควรทราบ การสัมผัสกับแหล่งภายนอกของแคมป์โดยใช้ 8-Br-cAMP ที่ซึมผ่านได้ ได้ตอบโต้ผลการยับยั้งของ OLE ในวิถี V2R อย่างมีนัยสำคัญ

ระดับแคลเซียม cytosolic ที่สูงอาจทำให้เซลล์ตายและการตายของเซลล์ อย่างไรก็ตาม การเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องของแคลเซียมภายในเซลล์จาก 250 นาโนโมลาร์เป็นมากกว่า 600 นาโนโมลาร์ที่ส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์ประสาท4.ในเซลล์ MCD4 การรักษาด้วย OLE ที่ 0.1 มก./มล. ไม่แสดง มีผลเป็นพิษต่อเซลล์ ที่ความเข้มข้นนี้ OLE (0.1 มก./มล.)เพิ่มระดับแคลเซียมภายในเซลล์เล็กน้อย การถ่ายภาพแคลเซียมเผยให้เห็นว่าการกระตุ้นแบบเฉียบพลันด้วย OLE ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของแคลเซียมภายในเซลล์ชั่วคราวผ่านการกระตุ้น CaSR ที่ถูกยกเลิกเมื่อเซลล์ถูกบ่มล่วงหน้าด้วยการเลือก CaSR antagonist NPS2143 ในเซลล์ท่อไตใกล้เคียง การกระตุ้น allosteric ของ CaSR ด้วย I-ornitine ลดการผลิต ROS ดังนั้นจึงปรับลดความเครียดออกซิเดชันของไมโตคอนเดรียที่ก่อให้เกิดการตายของเซลล์ 356 นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของตัวแปรที่ได้รับจากฟังก์ชันของ CaSR ลดการปลดปล่อย ROS และ S-glutathionylation ของ AQP237 การฟักตัวด้วย OLE ช่วยลดการสร้าง ROS ในเซลล์ MCD435 ซึ่งแสดงความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระ อย่างไรก็ตาม ในขณะนี้ยังไม่ชัดเจนว่า OLE ส่งผลต่อ AOP2-S-glutathionylation หรือไม่ การศึกษาจำนวนมากเปิดเผยว่า OLE หรือ oleuropein ซึ่งเป็นองค์ประกอบหลักของ OLE อาจมีบทบาทในการป้องกันโดยการยับยั้งการตายของเซลล์39 อย่างไรก็ตาม มีการอธิบายผลกระทบที่ขึ้นกับขนาดยาในหนูที่ได้รับ OLE ได้รับการตอบสนองที่เป็นประโยชน์ที่ขนาดยา 250 และ 500 มก./กก. ในทางตรงกันข้าม ที่ความเข้มข้นสูง การรักษาด้วย OLE อาจมีผลร้ายที่อาจเกิดจากการกระทำของโปรออกซิแดนท์ของไฟโตคอมพาวน์หลายชนิด ในการศึกษานี้ หนูถูกฉีด OLE ในขนาด 250 มก./กก. เป็นเวลาสามวันซึ่งแสดงถึงการควบคุม CaSR ที่เพิ่มขึ้น ระดับการแสดงออกของ CaSR เพิ่มขึ้นโดยสารประกอบบางชนิดที่ทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้น allosteric ของตัวรับ แคลซิมิเมติกส์ช่วยลดการกลายเป็นปูนของหลอดเลือดโดยการเพิ่มการสังเคราะห์ CaSR ในเซลล์กล้ามเนื้อเรียบของหลอดเลือดของมนุษย์0 ในการแข่งขันครั้งนี้ ไม่อาจแยกความเป็นไปได้ที่สารประกอบบางอย่างใน OLE อาจทำหน้าที่เป็นตัวปรับสภาพอัลโลสเตอริกของ CaSR ในอีกทางหนึ่ง การกระตุ้นด้วยวาโซเพรสซินอาจนำไปสู่การปลดปล่อย IL-6 ที่อาจนำไปสู่การเพิ่มระดับการแสดงออกของ CaSR42

ในไต การกระตุ้นการส่งสัญญาณ CaSR สัมพันธ์กับการลดการแสดงออกของ AQP2 ที่อาจเกิดขึ้นผ่าน miR-137 generation.miRNAs เป็นโมดูเลเตอร์หลังการถอดเสียงที่มีความสำคัญ miRNAs ที่ขึ้นกับ vasopressin หลายตัวที่กำหนดเป้าหมายการแสดงออกของ AQP2 ได้รับการอธิบายเช่นกัน43 การทรานส์เฟกชันด้วย miR-32 และ miR-137 ลดระดับการแสดงออกของ AOP2 ในเซลล์ mpkCCDc14 อย่างมีนัยสำคัญ ที่น่าสนใจคือ OLE สามารถลดสัญญาณการอักเสบและออกแรงป้องกันโดยการปรับระดับการแสดงออกของ miRNA หลายตัว" โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ในเซลล์ glioblastoma multiforme OLE ได้ส่งเสริมการแสดงออกของ miRNA ต่างๆ รวมทั้ง miR-13745 ซึ่งเกี่ยวข้องกับการลดระดับของ เส้นทางการส่งสัญญาณ Akt/mTOR 46 สิ่งที่ควรทราบ การรักษาด้วย oleuropein จะป้องกันการส่งสัญญาณ Akt/mTOR ผ่านการกระตุ้น CAMK และ AMPK ที่เกิดจากแคลเซียม" การเปิดใช้งาน CaSR ด้วย NPS-R568 จะกระตุ้น AMPK และลดกิจกรรม mTOR ในเซลล์ท่อใกล้เคียงของมนุษย์3 สอดคล้องกับการค้นพบนี้ การฟักตัวด้วย OLE จะเพิ่มแคลเซียมในเซลล์ ลดการทำงานของ PKA และลดขนาดซีสต์ในแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ 3 มิติ48 การค้นพบนี้ร่วมกันชี้ให้เห็นว่า OLE อาจมีประโยชน์ในการรักษาความผิดปกติที่มีลักษณะเฉพาะโดยการควบคุมการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมภายในเซลล์ที่ผิดปกติซึ่งเกี่ยวข้องกับการปรับลดสัญญาณ CaSR

สารสกัดจากใบมะกอกประกอบด้วยส่วนประกอบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิด รวมทั้งโพลีฟีนอล เส้นใย และแร่ธาตุ49 ในขณะนี้ ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าสารประกอบหนึ่งหรือการรวมกันของ phytocompounds ใน OLE อาจเป็นประโยชน์ในการปรับการตอบสนองภายในเซลล์ สารสกัดที่ใช้ในการศึกษานี้ถูกนำมาใช้เป็นสารเติมแต่งอาหารที่เป็นไปได้ ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องกำหนดผลกระทบทางสรีรวิทยาของสารสกัดด้วยตัวมันเอง โดยพิจารณาว่าอาจมีการกรองฟีนอลหลายตัวรวมถึงไฮดรอกซีไทโรซอลโดยไตและนำกลับคืนมาในปัสสาวะ50 การศึกษาเพิ่มเติมจะให้ประสิทธิภาพของส่วนประกอบเฉพาะที่อาจควบคุมการส่งสัญญาณแคลเซียมภายในเซลล์ผ่าน CaSR โดยสรุป การศึกษานี้แสดงหลักฐานว่า OLE อาจถูกพิจารณาว่าเป็นสารเสริมที่มีศักยภาพใหม่ซึ่งมีประโยชน์ในการบรรเทาความผิดปกติที่มีลักษณะเฉพาะโดยการลดการแสดงออกของ CaSR รวมถึงการส่งสัญญาณและส่งผลต่อการซึมผ่านของน้ำในไต

วัสดุและวิธีการ

สารเคมีและแอนติบอดีซื้อสารเคมีและยาปฏิชีวนะทั้งหมดจากเมอร์ค (เมอร์ค เคจีเอเอ ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) Calcein-AM, Fura-2-AM, สื่อเพาะเลี้ยงเซลล์, เซรั่มวัวในครรภ์ (FBS) และ Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates ถูกซื้อจาก Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)Aquaporin{ {2}}(AQP2) ตรวจพบโดยใช้แอนติบอดีจำเพาะ (C-tail Ab) ที่เลี้ยงต้านเปปไทด์สังเคราะห์ที่สอดคล้องกับกรดอะมิโนปลาย C 15 ตัวสุดท้ายของ AQP2 ของมนุษย์! AQP2-pS256 antibodies มอบให้โดย Prof. Peter Deen แอนติบอดีต่อกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดสที่ควบคู่กันกับกระต่ายจากแพะรองได้มาจากเมอร์ค (เมอร์ค KGaA, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) แอนติบอดีต่อกระต่ายกับแพะตัวที่สองที่ใช้ร่วมกับ Alexa-488 ถูกซื้อจาก Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)

การผลิตสารสกัดที่อุดมด้วยฟีนอลและการกำหนดลักษณะทางเคมีการผลิตสารสกัดที่อุดมด้วยฟีนอลจากใบมะกอกได้ดำเนินการตามรายงานใน Ranieri et al.35 หลังจากการโม่ด้วยเครื่องปั่น (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA) เติมน้ำ ddH2O (อัตราส่วน 1/20, w/y) แล้วนำไปอัลตราซาวนด์ (CEIA, Viciomaggio, Italy) สามครั้ง เป็นเวลา 30 นาที ที่ 35±5 องศาในแต่ละครั้ง สุดท้าย สารสกัดถูกกรองผ่านกระดาษกรอง แช่เยือกแข็ง และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส สารสกัดที่ได้รับถูกกรองด้วยตัวกรองไนลอน 0.45 ไมโครเมตร (Merck KGaA, ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) และใช้สำหรับแสดงลักษณะทางเคมี ปริมาณฟีนอลทั้งหมด ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ และการระบุสารประกอบฟีนอลิกเดี่ยวได้ดำเนินการตาม Difonzo et al..OLE แสดงเนื้อหาของโพลีฟีนอลที่กำหนดโดย Folin-Ciocalteu เท่ากับ 195 มก. เทียบเท่ากรดแกลลิก (GAE) และกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระที่กำหนดโดย ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt) คิดเป็น 750 μmol TE (เทียบเท่า Trolox) .

การเพาะเลี้ยงเซลล์และการรักษาเซลล์ MCD4 ในท่อรวบรวมเยื่อหุ้มสมองของหนูเมาส์ ซึ่งแสดงออก AQP2 ของมนุษย์อย่างคงตัวและ V2R-Rluc แบบไคเมริกถูกใช้เป็นแบบจำลองการทดลอง18 เซลล์ถูกทำให้เติบโตในส่วนผสม 1:1 ของอาหารเลี้ยงเชื้อของ Dalbec-cos ดัดแปลงของ Eagle และ F-12 ที่เสริมด้วย 5 เปอร์เซ็นต์ (y/y) fetal bovine serum 1 เปอร์เซ็นต์ (y/y) L-glutamine และ 1 เปอร์เซ็นต์ penicillin/streptomycin, 5 μM dexamethasone,400 ug/ml G418 (สำหรับการดื้อต่อ AQP2) และ puromycin 1 ug/ml (สำหรับการดื้อต่อ V2R-Rluc) ในบรรยากาศที่มีความชื้น CO 5% ที่ 37 องศา เซลล์ MCD4 ถูกปล่อยทิ้งไว้ภายใต้สภาวะที่เป็นเบส (CTR) หรือระยะยาวที่บำบัดด้วย OLE ที่ 0.1 มก./มล. O/N, dDAVP ที่ 100 นาโนโมลาร์ เป็นเวลา 30 นาที หรือถูกบำบัดร่วมกับ OLE และ dDAVP หรือ NPS2143 ที่ l μM O/N อีกวิธีหนึ่งคือ เซลล์สัมผัสกับ 8-Br-cAMP ที่ 500 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 45 นาที ทำการทดลองระยะสั้นด้วย OLE ที่ 1 มก./มล. เป็นเวลา 5 นาที และ NPS2143 ที่ 10 ไมโครโมลาร์ เป็นเวลา 15 นาที ทำการทดลอง 3-5 ครั้งโดยอิสระโดยใช้เซลล์จากข้อความต่างๆ

แบบจำลองสัตว์และการรักษาขั้นตอนทั้งหมดเสร็จสิ้นตามข้อตกลงกับแนวทางแห่งชาติของเดนมาร์กสำหรับการดูแลและการจัดการสัตว์ทดลองและแนวทางที่ตีพิมพ์ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ โปรโตคอลได้รับการอนุมัติจากสถาบันการแพทย์คลินิก มหาวิทยาลัย Aarhus ตามใบอนุญาตสำหรับการใช้สัตว์ทดลองที่ออกโดยกระทรวงยุติธรรมของเดนมาร์ก (หมายเลขการอนุมัติ 2015-15-0201-00658) การศึกษาได้ดำเนินการกับหนู Wistar เพศผู้ที่โตเต็มวัยที่มีน้ำหนักเริ่มต้น 200-225 กรัม เลี้ยงสัตว์ด้วยอาหารหนูมาตรฐาน (Altromin, Lage, Germany) และสามารถเข้าถึงน้ำประปาได้ฟรี ระหว่างการทดลอง หนูถูกเลี้ยงเป็นกลุ่มละสองตัวต่อกรง โดยมีวัฏจักรแสง-มืด 12:12 ชั่วโมง อุณหภูมิ 21±2 องศาเซลเซียส และความชื้น 55±2 เปอร์เซ็นต์ หนูห้าตัวได้รับการรักษาด้วยการฉีดใต้ผิวหนังของ 1 ng dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Denmark) ในน้ำเกลือ/สัตว์ 200 ตัว และหนูที่ได้รับการบำบัดด้วยกระสายยา 5 ตัวทำหน้าที่เป็นตัวควบคุม หลังจากผ่านไป 30 นาที หนูถูกฆ่า และไตได้รับการประมวลผลตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

เซลล์และ IMCD ไลเซทเซลล์เติบโตบนจาน {{0}}มม. และแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย 220 มิลลิโมลาร์ แมนนิทอล, 70 มิลลิโมลาร์ ซูโครส, {{10}}} 5 M EGTA pH 8.0,0.5 M EDTA pH 8.0,1 M Tris-HCl pH 7.4 ต่อหน้าโปรตีเอส (1 mM PMSF, 2 มก./มล. leupeptin และ 2 มก./มล. pepstatin A) และฟอสฟาเตส(10 mM NaF และ สารยับยั้งโซเดียมออร์โธวานาเดต) 1 มิลลิโมลาร์ ทางเลือก, ส่วนของไตประมาณ 0.5 มม. ถูกเตรียมและปรับสมดุลเป็นเวลา 10 นาทีในบัฟเฟอร์ที่มี 1i8 mM NaCl, 16 mM Hepes, 17 mM Na-Hepes, 14 mM กลูโคส, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2,1.8 mM MgSO4 และ KH2PO4 1.8 มิลลิโมลาร์ (pH7.4) ตุ่มไตถูกสับด้วยกรรไกรในบัฟเฟอร์เดียวกันโดยมีโปรตีเอส (1 มิลลิโมลาร์ PMSF,2 มก./มล. และ 2 มก./มล.เปปสแตติน A) และฟอสฟาเตส(10 มิลลิโมลาร์ NaF และโซเดียม 1 มิลลิโมลาร์ orthovanadate) inhibitors หลังจาก sonica-tion (60 kHz for 5 s) lysates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,{52}}×g เป็นเวลา 10 นาที supernatants ถูกรวบรวมและใช้สำหรับการศึกษา immunoblotting'8

กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลการศึกษา Confocal ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้1 โดยสังเขป เซลล์ถูกทำให้เติบโตบนเม็ดมีด PET สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์และบำบัดตามที่บรรยายไว้ข้างต้น อีกทางเลือกหนึ่ง ส่วนของไตที่ได้รับจากกลุ่มควบคุม, OLE, dDAVP และ OLE กับหนูที่บำบัดด้วย dDAVP อยู่ภายใต้การทดลองอิมมูโนฟลูออเรสเซนส์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ได้ภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบคอนโฟคอลสแกนด้วยเลเซอร์ Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Switzerland) เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสและอิมมูโนโบลทติ้ง แยกโปรตีนออกจากเจลโพลีอะคริลาไมด์ที่ปราศจากคราบ 12 เปอร์เซ็นต์ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, US.A.) ภายใต้สภาวะการลดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้=5,52 โดยสรุป แถบโปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน Immobilon-P (เมอร์ค KGaA, ดาร์มสตัดท์, เยอรมนี) และอิมมูโนบล็อตที่ถูกบล็อกโดยใช้แอนติบอดีต้าน AQP2 (Pre-C-tail Ab) และแอนติบอดีต้าน AQP2-pS256 ได้รับสัญญาณภูมิคุ้มกันโดยใช้ Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrates พร้อม Chemidoc System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) แถบถูกทำให้เป็นโปรตีนทั้งหมดโดยใช้เทคโนโลยีที่ปราศจากคราบ (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) การวิเคราะห์ความหนาแน่นดำเนินการโดยใช้ ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) และวิเคราะห์โดยใช้ GraphPad Prism (ซอฟต์แวร์ GraphPad, San Diego, CA, USA)

การทดสอบการซึมผ่านของน้ำการซึมผ่านของน้ำด้วยออสโมติกถูกวัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้43 โดยสังเขป เซลล์ MCD4 ถูกปลูกบนฝาครอบแก้ว 40-มม. หลังการรักษา เซลล์ถูกโหลดด้วย Calcein-AM ที่ซึมผ่านเมมเบรนได้ 10 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 45 นาทีที่ 37 องศา ,5 เปอร์เซ็นต์ CO ใน DMEM/F-12 แผ่นปิดถูกติดตั้งในห้องการกําเนิดการกําเนิด (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA) การวัดได้ดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ TE2000-S แบบกลับด้าน (กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ติดตั้งไว้สำหรับการวัดการเรืองแสงด้วยเซลล์เดียว และการวิเคราะห์ภาพ ตัวอย่างที่โหลดด้วย Calcein-AM ตื่นเต้นที่ 490 นาโนเมตร การวัดการเรืองแสง ตาม isosmotic (140 mM NaCl.5 mM KCl, 1 mM MgCl..1 mM CaCl., 10 mM Hepes sulfonic acid, 5 mM Glucose,pH7.4) หรือ hyperosmotic (สารละลาย isosmotic ที่เติมด้วย 135 mM Mannitol) . ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada) ข้อมูลการเรืองแสงของช่วงเวลาหลังการถ่ายเซลล์ด้วยสารละลายไอโซและไฮเปอร์ออสโมติก ระยะเวลาของการหดตัวของเซลล์วัดเป็นค่าคงที่ของเวลา (Ki แสดงเป็น 1/r วินาที) ซึ่งเป็นพารามิเตอร์ที่สัมพันธ์กับการซึมผ่านของน้ำ ซึ่งได้มาจากการปรับข้อมูลให้เหมาะสมด้วยฟังก์ชันเลขชี้กำลังที่วิเคราะห์โดยใช้ GraphPad Prism (ซอฟต์แวร์ GraphPad เมืองซานดิเอโก แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา)

การวัดการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรืองแสงในการประเมินการเปลี่ยนแปลงของแคมป์ภายในเซลล์ ได้นำเทคโนโลยีการถ่ายโอนพลังงานเรโซแนนซ์เรโซแนนซ์ (FRET) มาใช้ สำหรับการทดลอง FRET เซลล์ถูกทรานส์เฟกด้วยพลาสมิดซึ่งเข้ารหัสเซ็นเซอร์ H96 ที่มีแม่ลายฉันทามติสำหรับการจับแคมป์ของ EPAC1 ที่ฝังระหว่างโปรตีนเรืองแสงสีฟ้า (CFP) และ cp173Venus-Venus ตามที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้ 32.33.54 พลาสมิดที่เข้ารหัสโพรบ H96 เป็นของขวัญจาก Dr.K. จาลิงค์. การแสดงภาพเซลล์ที่แสดง ECFP และ/หรือ EYFP และการตรวจจับ FRET ดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ TE2000-S แบบกลับด้าน (กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ภาพแต่ละภาพได้รับการแก้ไขและวิเคราะห์ตามที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้55

การวัดแคลเซียมภายในเซลล์ การวัดแคลเซียมภายในเซลล์ได้ดำเนินการดังที่แสดงไว้ก่อนหน้านี้56 โดยย่อ เซลล์ MCD4 ถูกโหลดด้วย Fura 4 ไมโครโมลาร์-2 AM เป็นเวลา 15 นาทีที่ 37 องศาใน DMEM/F-12 สารละลายของ Ringer ถูกใช้เพื่อทำให้เซลล์กระจายตัวระหว่างการทดลองที่มี 140 mM NaCl, 5 mM KCl 1 mM MgCl, 10 mM HEPES, 5 mM กลูโคส, 1.8 mM CaCl, pH 7.4 ในการวัดค่าการเรืองแสง แผ่นปิดที่มีเซลล์โอเวอร์โหลดถูกติดตั้งในห้องกําเนิด (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA) การวัดดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ TE2000-S แบบกลับหัว (กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) อัตราส่วนของความเข้มของการเรืองแสงที่ 340 และ 380 นาโนเมตรถูกวางแผนและคำนวณเมื่อมีการเปลี่ยนแปลงของการเรืองแสง โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การกระตุ้นด้วย OLE (1 มก./มล.) หรือ NPS2143 (10 ไมโครโมลาร์) ถูกเปรียบเทียบในเซลล์ประเภทเดียวกันกับที่ได้รับหลังจากการกระตุ้นด้วยขนาดสูงสุดของตัวเอกที่อาศัยแคลเซียม ATP (100 ไมโครโมลาร์) ที่ใช้เป็น การควบคุมภายใน (ร้อยละ 100 ).

วัดระดับแคลเซียมภายในเซลล์ที่สภาวะคงตัวและสอบเทียบตามที่อธิบายโดย Grynkiewicz57 OLE และ NPS2143 ถูกใช้ในระยะยาวที่ 0.1 มก./มล. และ l uM ตามลำดับ และแต่ละตัวอย่างถูกสอบเทียบโดยการเติมไอโนโนซิน 5 ไมโครโมลาร์โดยมี EGTA (Rm.) 1 มิลลิโมลาร์ ตามด้วย 5 ไมโครโมลาร์ ไอโอโนซินใน 5 มิลลิโมลาร์ CaCl,(RMA)

การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์ของ AQP2 และ CaSR mRNA ในหนูที่ได้รับการควบคุมและบำบัดทำการทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เพื่อวัดการแสดงออกสัมพัทธ์ของ mRNA ในท่อรวบรวมไขกระดูกชั้นใน (IMCD) ที่แยกได้จากปุ่มควบคุมและ papillae ไตของหนูที่ได้รับการบำบัด ชิ้นไตประมาณ 0.5 มม. ถูกสร้างขึ้นและปรับสมดุลเป็นเวลา 10 นาทีในบัฟเฟอร์ที่มี 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM กลูโคส, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2,1.8 มิลลิโมลาร์ MgSO4 และ 1.8 มิลลิโมลาร์ KH2PO4 (pH 7.4) ตุ่มไตถูกแยกออกมาภายใต้กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ ตัวอย่างจากหนูควบคุมและหนูที่บำบัดแล้วถูกสับด้วยกรรไกรโดยตรงใน Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ทำการถอดความแบบย้อนกลับบน RNA ทั้งหมด 2.5 ugs โดยใช้ SuperScriptVilo Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (25C เป็นเวลา 10 นาที 42C เป็นเวลา 60 นาที 85C เป็นเวลา 5 นาที) การขยาย PCR แบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้ TagMan Fast Advanced Master Mix กับการทดสอบ CaSR, AOP2 และ GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ในระบบ PCR แบบเรียลไทม์ StepOne (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ) การตั้งค่าสภาวะวงจรความร้อนตามที่ผู้ผลิตกำหนด (95 องศา C เป็นเวลา 20 วินาที;40 รอบสลับกันที่ 95·C เป็นเวลา 1 วินาที และ 60 องศา C เป็นเวลา 20 วินาที) ผลลัพธ์แสดงเป็น 2- ค่า (การหาปริมาณสัมพัทธ์) ด้วย △ACt=(Ct target-Ct GAPDH) ที่บำบัดแล้ว-(Ct target-Ct GAPDH)Sham1

การประเมิน miRNA-137 ในหนูที่ได้รับการควบคุมและบำบัดเนื้อหา miRNA{{0}} ในการควบคุมและท่อรวบรวมไขกระดูกชั้นในของหนูที่บำบัดแล้วได้รับการประเมินโดยใช้ TagMan Advanced miRNA Assays (has-miR-137; Assay ID;477904 mir; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .US.A) ซึ่งเปิดใช้การแจ้งเตือนที่ละเอียดอ่อนและเฉพาะเจาะจงของ miRNA ที่โตเต็มที่โดยใช้ PCR เชิงปริมาณ ชิ้นไตประมาณ 0.5 มม. ถูกสร้างขึ้นและปรับสมดุลเป็นเวลา 10 นาทีในบัฟเฟอร์ที่มี 118 mM NaCl, 16 mM HEPES, 17 mM Na-Hepes, 14 mM กลูโคส, 3.2 mM KCl, 2.5 mM CaCl2,1.8 mM MgSO4 และ 1.8 mM KH2PO4(pH7.4) ตุ่มของไตถูกแยกออกมาภายใต้กล้องสเตอริโอไมโครสโคป ตัวอย่างจากหนูควบคุมและหนูที่บำบัดแล้วถูกสับด้วยกรรไกรโดยตรงใน Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) เพื่อแยก RNA ทั้งหมด TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (แค็ตตาล็อก n²∶A25576; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ใช้เพื่อให้ได้การสังเคราะห์ cDNA ตามโปรโตคอลที่จัดทำโดยผู้ผลิต (ปฏิกิริยาโพลี (A) tailing; ปฏิกิริยา ligation; ปฏิกิริยาการถอดรหัสย้อนกลับ ปฏิกิริยา miR-Amp) RNA สังเคราะห์ (UUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAG) ที่มีฟอสเฟอร์ 59- ถูกสังเคราะห์โดย Thermo Fisher Scientific และใช้เพื่อทำการปรับเทียบกราฟเพื่อสอดแทรกค่าตัวอย่าง miRNA และรับการประเมินที่แม่นยำ (เป็นนาโนกรัม) ของเนื้อหา miR-137 ใน ตัวอย่าง 16 โดยใช้ GraphPad Prism (ซอฟต์แวร์ GraphPad, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

การวิเคราะห์ทางสถิติ.ค่าทั้งหมดถูกรายงานเป็นค่าเฉลี่ย±SEM การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดย ANOVA ทางเดียวตามด้วยการทดสอบการเปรียบเทียบหลายรายการของ Newman-Keul ด้วย *p<0.05 considered="" statistically="" different="">

คำชี้แจง การอนุมัติทางจริยธรรม และความยินยอมในการเข้าร่วมการศึกษาในสัตว์ทดลองได้ดำเนินการตามข้อตกลงกับแนวทางแห่งชาติของเดนมาร์กสำหรับการดูแลและการจัดการสัตว์ทดลองและแนวทางที่ตีพิมพ์ของสถาบันสุขภาพแห่งชาติ คณะกรรมการจริยธรรมการดูแลสัตว์ของสถาบันเวชศาสตร์คลินิก มหาวิทยาลัย Aarhus อนุมัติโปรโตคอลการศึกษา ตามใบอนุญาตสำหรับการใช้สัตว์ทดลองที่ออกโดยกระทรวงยุติธรรมของเดนมาร์ก (หมายเลขการอนุมัติ 2015-15-0201-00658) ผู้เขียนยืนยันว่าวิธีการทั้งหมดได้ดำเนินการตามแนวทางและข้อบังคับที่เกี่ยวข้อง นอกจากนี้ ผู้เขียนยืนยันว่าการศึกษาได้ดำเนินการตามแนวทาง ARRIVE

อ้างอิง

1. El, SN & Karakaya, S. Olive tree (Olea europaea) ทิ้งผลกระทบที่เป็นประโยชน์ต่อสุขภาพของมนุษย์ Nutr. วว. 67, 632–638.

2. Javadi, H. , Yaghoobzadeh, H. , Esfahani, Z. , Reza Memarzadeh, M. & Mehdi Mirhasemi, S. ผลของสารสกัดจากใบมะกอกต่อการตอบสนองเมตาบอลิซึม การทำงานของตับและไต และ biomarkers การอักเสบในผู้ป่วยความดันโลหิตสูง PJBS 22, 342–348.

3. Saibandith, B. , Spencer, JPE, Rowland, IR & Commane, DM Olive polyphenols และกลุ่มอาการเมตาบอลิซึม โมเลกุล

4. Cherif, S. et al. การทดลองทางคลินิกของสารสกัด Olea ที่ไตเตรทในการรักษาภาวะความดันโลหิตสูงหลอดเลือดแดงที่จำเป็น เจ. ฟาร์ม. เบล. 51, 69–71 (1996).

5. Difonzo, GRA และคณะ สารสกัดสีเขียวจากพันธุ์คอร์ตินาโอลีฟให้คุณสมบัติต้านอนุมูลอิสระและฤทธิ์ทางชีวภาพ เจ. ฟังก์. อาหาร 31, 8

6. Herrero, M. et al. ความเป็นไปได้ใหม่ๆ ในการทำให้ผลิตภัณฑ์ผลพลอยได้ของน้ำมันมะกอกมีปริมาณมากขึ้น เจ. โครมาโตกร์. 1218, 7511–7520.

7. Marchetti, C. et al. สารสกัดจากใบมะกอกที่อุดมด้วย Oleuropein มีผลต่อการเปลี่ยนแปลงของแคลเซียมและทำให้เซลล์มะเร็งเยื่อหุ้มปอดเสื่อมลง อีแคม 2015, 908493.

8. Romero, M. et al. ฤทธิ์ลดความดันโลหิตของสารสกัดจากใบมะกอกที่อุดมด้วย oleuropein ในหนูที่มีความดันโลหิตสูงตามธรรมชาติ ฟังก์ชั่นอาหาร 7, 584–593.

9. Hall, JE ความผิดปกติของไตมากกว่าความผิดปกติของหลอดเลือดที่ไม่ใช่ไต สื่อกลางความดันโลหิตสูงที่เกิดจากเกลือ การไหลเวียน 133, 894–906.

10. Wilson, JL, Miranda, CA & Knepper, MA Vasopressin และข้อบังคับของ aquaporin-2 คลินิก ประสบการณ์ เนฟรอล 17, 751–764.