Obacunone ช่วยลดการเกิดพังผืดของตับด้วยการเพิ่มฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ GPx-4 และการยับยั้ง EMT
Jun 17, 2022
โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม
เชิงนามธรรม:Obacunone ซึ่งเป็นลิโมนินไตรเทอร์พีนอยด์ที่สกัดจากพืช Phellodendronchinense Schneid หรือ Dic-tamnus dasycarpusb Turcz ทำให้เกิดผลทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย เช่น ต้านการอักเสบ ต้านเนื้องอก ต่อต้านอนุมูลอิสระ และต้านการเกิดพังผืดในปอด อย่างไรก็ตาม ฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืดของโอบาโคนและกลไกพื้นฐานโดยละเอียดของการเกิดพังผืดในตับยังคงไม่ชัดเจน พังผืดของตับเป็นโรคที่ทำให้ร่างกายอ่อนแอซึ่งคุกคามสุขภาพของมนุษย์ Transforming growth factor (TGF)- /P-Smad เป็นเส้นทางสำคัญของการเกิดพังผืดที่โดดเด่นด้วยการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ (EMT) และการสะสมของคอลลาเจน พร้อมด้วยอนุมูลอิสระที่มากเกินไป Nrf-2 ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมการต่อต้านอนุมูลอิสระที่สำคัญซึ่งขับเคลื่อนการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระต่างๆ กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส-4(GPx-4) เป็นสมาชิกของตระกูลกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดสที่ยับยั้งการเกิดออกซิเดชันของฟอสโฟลิปิดโดยตรงเพื่อบรรเทาความเครียดออกซิเดชัน ในการศึกษานี้ เรามุ่งที่จะสำรวจบทบาทของกระดูกสันหลังในแบบจำลองการเกิดพังผืดในตับของหนูเมาส์ที่เกิดจากคาร์บอนเตตระคลอไรด์ (CCl4) และในเซลล์ตับ (LX2 เซลล์ไลน์) ที่ท้าทายด้วย TGF- Obacunone แสดงให้เห็นถึงผลการรักษาที่ดีขึ้นต่อการเกิดพังผืดของตับทั้งใน LX2 ที่ถูกกระตุ้นและในเนื้อเยื่อตับของหนูที่มีระดับ -SMA, collagen1 และ vimentin ลดลง Obacunone ยังยับยั้งสัญญาณ TGF- /P-Smad และกระบวนการ EMT ได้อย่างน่าทึ่ง ในขณะเดียวกัน obacunone ออกแรงต้านการเกิดออกซิเดชันที่มีศักยภาพโดยการลดระดับของ reactive oxygen species (ROS) ในทั้งสองรุ่น ผลการต้านอนุมูลอิสระของกระดูกสันหลังเกิดจากการกระตุ้นของ GPx-4 และ Nrf-2 นอกจากนี้ ผลการรักษาของกระดูกสันหลังบนเซลล์ LX2 ถูกกำจัดอย่างมีนัยสำคัญ ในหลอดทดลอง บวกกับ RSL3 ที่เป็นปฏิปักษ์ GPx-4 ควบคู่ไปกับระดับ ROS ที่ยกระดับขึ้นใหม่เพียวริแทน วิตามินซีดังนั้น เราแสดงให้เห็นว่ากระดูกสันหลังสามารถลดทอนการเกิดพังผืดของตับผ่านการเสริมสร้างสัญญาณ GPx-4 และการยับยั้งวิถี TGF- /P-Smad และกระบวนการ EMT
คำสำคัญ:กระดูกสันหลัง;พังผืดของตับ; EMT;เซลล์ตับ stellate; GPx-4;TGF- ;ความเครียดออกซิเดชัน
กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม
1. บทนำ
โรคตับอักเสบเรื้อรังมักเกิดจากไวรัสตับอักเสบ ภาวะไขมันพอกตับที่ไม่มีแอลกอฮอล์ โรคตับอักเสบจากแอลกอฮอล์ และโรคตับอักเสบจากภูมิต้านตนเอง การบาดเจ็บที่ตับอย่างต่อเนื่องอาจจบลงด้วยการเกิดพังผืดในตับ หรือแม้แต่มะเร็งตับ ซึ่งส่งผลร้ายแรงต่อสุขภาพของมนุษย์ [1] พังผืดที่ตับเป็นชนิดของการตอบสนองที่ไม่รักษาบาดแผลภายใต้ปัจจัยการบาดเจ็บอย่างต่อเนื่องซึ่งมีลักษณะเฉพาะโดยการสะสมของเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) และการเกิดแผลเป็นที่เกินจริง [2] เซลล์ตับ stellate (HSCs) มักจะอยู่ในสภาวะพักภายใต้สภาวะปกติ เซลล์เหล่านี้ถูกกระตุ้นอย่างผิดปกติภายใต้อาการบาดเจ็บที่ตับเรื้อรัง และมีการเพิ่มจำนวนและการหลั่งของ ECM สูง [3] ซึ่งแสดงว่าเป็น myofibroblasts [4] การทำความเข้าใจกลไกของการกระตุ้น HSC นั้นมีค่ามากสำหรับการพัฒนาวิธีการรักษาแบบใหม่สำหรับการรักษาโรคพังผืดในตับ
การเปลี่ยนแปลงปัจจัยการเจริญเติบโต (TGF- ) ส่งเสริมการตอบสนองต่อการอักเสบโดยกระตุ้นการแสดงออกของ Interleukin-1 (IL-1) และ Interleukin-6(IL-6) ในโมโนไซต์ [5] นอกจากนี้ ยังกระตุ้นการแพร่กระจายของมะเร็งผ่านการเปลี่ยนแปลงของเยื่อบุผิว-มีเซนไคม์ (EMT) และภูมิคุ้มกันของเนื้องอกที่หลบหนี [6-8] EMT หมายถึงกระบวนการทางสรีรวิทยาแบบไดนามิกซึ่งเซลล์เยื่อบุผิวสูญเสียขั้วและเปลี่ยนเป็นเซลล์มีเซนไคม์ เช่น ไฟโบรบลาสต์และไมโอไฟโบรบลาสต์ ซึ่งนำไปสู่การพัฒนาของพังผืด [9] การเกิดขึ้นของ EMT มักเกี่ยวข้องกับการปรับลด E-cadherin และการปรับขึ้นของ mesenchymal cell markers เช่น N-cadherin และ snail[10] TGF- -การกระตุ้นด้วย Smad เป็นหนึ่งในวิถีภายในเซลล์หลักใน EMT และการเกิด myofibroblast [11]
ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันถือเป็นหนึ่งในสาเหตุหลักของการเกิดพังผืดที่มีการผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยา (ROS) มากเกินไป[12] ROS ระดับสูงทำให้เกิดความเสียหายเชิงโครงสร้างต่อสารชีวโมเลกุล เช่น โปรตีน ลิปิด และดีเอ็นเอ ซึ่งท้ายที่สุดจะนำไปสู่การบาดเจ็บของเซลล์และส่งเสริมการเกิดพังผืด [13] ภายใต้ความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ไดเมอร์ของ Nrf-2-Keep-1 จะแยกออกจากกัน แฟคเตอร์การหายใจของนิวเคลียร์-2(Nrf-2)จะถูกส่งไปยังนิวเคลียส และเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของสารต่างๆ เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระโดยจับกับองค์ประกอบตอบสนองต่อสารต้านอนุมูลอิสระ (ARE) ช่วยลดระดับ ROS[14] กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส-4 (GPx-4) ทำหน้าที่เป็นโปรตีนต้านอนุมูลอิสระที่มีการทำงานของกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส ซึ่งมีหน้าที่หลักในการยับยั้งการเกิดออกซิเดชันของฟอสโฟลิปิดและการผลิต ROS ในกระบวนการเฟอร์รอพโทซิส [15]sistancheการศึกษาในหนูทดลองแสดงให้เห็นว่าการเกิดพังผืดรุนแรงขึ้นหลังจากการสูญเสีย Nrf-2 หรือ GPx-4 [16,17]
Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย
ปัจจุบัน มียาหลายชนิดที่ใช้รักษาภาวะพังผืดในตับ รวมทั้งยาที่มีคุณสมบัติในการต้านการอักเสบ [18] สารต้านอนุมูลอิสระ [19] และตัวเร่งปฏิกิริยา peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) [20] ในการศึกษาเมื่อเร็วๆ นี้ ศาสตราจารย์ Yu พบว่าผู้ป่วยที่เป็นโรคตับแข็งมีระดับออกซิเดชันของไขมันที่สูงกว่าเมื่อเทียบกับการควบคุมที่ดีต่อสุขภาพในตัวอย่างทางคลินิก [21] ยาต้านอนุมูลอิสระหลายชนิด เช่น resveratrol[19] และ ursolic acid |13] มีผลดีต่อการเกิดพังผืด หลักฐานนี้บ่งชี้ว่าสารต้านออกซิเดชันเป็นกลยุทธ์ที่มีแนวโน้มในการรักษาภาวะการเกิดพังผืด
Pirfenidone (PFD) เป็นยา pyridine สำหรับพังผืดที่ปอดไม่ทราบสาเหตุ (IPF) ในขณะที่ยังแสดงให้เห็นผลการรักษาที่ดีต่อการเกิดพังผืดของตับในการศึกษาหลายชิ้น [22,23] ดังนั้น PFD จึงถูกเลือกเป็นยาควบคุมเชิงบวกในการศึกษานี้ Obacunone(Oba) เป็นสารประกอบลิโมนอยด์ธรรมชาติที่สกัดจากพืชรูเทเชียส เช่น Phellodendri และ Dictamnus-dasycarpus [24] ซึ่งมีคุณสมบัติทางชีวภาพต่างๆ เช่น ต่อต้านการอักเสบ |25 ต้านอนุมูลอิสระ [26] และต้านเนื้องอก [27] รายงานล่าสุดเปิดเผยว่า Oba เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา Nrf-2 ที่แรง ซึ่งบรรเทาการพังผืดของปอดได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยการเหนี่ยวนำ CCL4 และทำลายเซลล์ MDA-MB-231 ที่เกิดจาก H, O2 ที่สำคัญ Oba ไม่เป็นพิษต่อหนู [28] อย่างไรก็ตาม ไม่มีรายงานเกี่ยวกับผลของ Oba ในการเกิดพังผืดของตับ โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน GPx-4 ซึ่งเป็นสื่อกลางในการต่อต้านฟอสโฟลิปิดออกซิเดชัน, TGF- -สัญญาณ Smad และกระบวนการ EMT ในที่นี้ เราตั้งใจที่จะสำรวจผลกระทบของ Oba ต่อการเกิดพังผืดของตับและกำหนดกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลัง
2. ผลลัพธ์
2.1. Oba ยับยั้ง TGF- -กระตุ้น Lx-2 การเปิดใช้งาน
Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM โอบา ที่น่าสนใจคือ ด้วยความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ Oba ผลการยับยั้ง a-SMA จึงไม่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1B)cistanche คืออะไรดังนั้นเราจึงเลือกความเข้มข้น 20 ไมโครโมลาร์สำหรับการทดลองต่อไปนี้ โดยให้ PFD เป็นตัวควบคุมเชิงบวก Oba ยับยั้งระดับโปรตีนของ -SMA, คอลลาเจน-1, วิเมนติน และปัจจัยการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน (CTGF) อย่างมีประสิทธิภาพ (รูปที่ 1C) ใน aHSCs[3,4] นอกจากนี้ Oba ยังลดระดับการแสดงออกของ mRNA ของ -SMA, คอลลาเจน-1 และวิเมนติน (รูปที่ 1D) ผล immunofluorescence ยืนยันเพิ่มเติมว่าสัญญาณการย้อมสีที่เป็นบวกของ -SMA ลดลงอย่างเห็นได้ชัดโดย Oba (เทียบกับสัญญาณในกลุ่ม TGF- เนื่องจากจำนวนเซลล์เม็ดเลือดแดงลดลงหลังการรักษาด้วย Oba) ใน Lx-2 (รูปที่ 1E) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Oba มีผลการยับยั้งที่ดีต่อการเปิดใช้งาน Lx-2
2.2.Oba ยับยั้งสัญญาณ TGF- /Smad, กระบวนการ EMT และฤทธิ์ต้านการอักเสบที่ออกแรง
เพื่อกำหนดกลไกระดับโมเลกุลที่อยู่ภายใต้ผลการต้านการเกิดพังผืดข้างต้น ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ TGF-Receptor, P-Smad และ -SMA ถูกสังเกตพบ ซึ่ง Oba ยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญใน aHSCs (รูปที่ 2A) นอกจากนี้ โปรตีน ระดับการแสดงออกของ N-cadherin และหอยทากลดลง ในขณะที่ระดับการแสดงออกของโปรตีนของ E-cadherin ได้รับการส่งเสริม (รูปที่ 2B) ซึ่งบ่งชี้ว่าวิถี EMT ถูกปิดกั้นด้วย [3] นอกจากนี้ เราพบว่า Oba ทำให้เกิดระดับ IL ที่ลดลง-6(รูปที่ 2C)ต่อต้านริ้วรอย cistancheเพื่อประเมินผลของ Oba ต่อการอักเสบ ขั้นแรกให้กระตุ้นเซลล์ HepG-2 (สายเซลล์มะเร็งตับในมนุษย์ชนิดหนึ่ง) ด้วย 20 nmol CCl4 ตามด้วยการบำบัดด้วย Oba 20 uM ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า Oba สามารถลด mRNA และระดับการแสดงออกของโปรตีนของ IL-6 ใน CCl4-HepG ที่กระตุ้น-2 (รูปที่ 2D) โดยรวมแล้ว oba แสดงผลการต่อต้านการเกิดพังผืดหลายอย่าง โดยยับยั้งสัญญาณ TGF- /Smad และกระบวนการ EMT รวมทั้งต้านการอักเสบ
2.3. ผลการต้านการเกิดพังผืดของ Oba ขึ้นอยู่กับความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่เพิ่มขึ้นโดยการเปิดใช้งาน GPXx-4
In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 μM ความอยู่รอดของเซลล์ของ Lx-2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น 0.75-μM RLS ถูกเลือกให้เข้าไปแทรกแซงในการแสดงออกของ GPx-4 ผลการทดสอบ Western blot แสดงให้เห็นว่าเมื่อเติม RSL3 ใน aHSC การแสดงออกของโปรตีน GPx-4 จะลดลงและ profibrotic markers รวมทั้ง -SMA และ vimentin ทั้งหมดกลับกันอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งบ่งชี้ถึงความสำคัญของ GPx-4 ในการไกล่เกลี่ยผลการต้านการเกิดพังผืดของ Oba(รูปที่ 3D) ในขณะเดียวกัน Oba ลดระดับ ROS ของ aHSCs ลงอย่างเห็นได้ชัดโดยเครื่องตรวจจับเรืองแสง ROS และเห็นได้ชัดว่าผลกระทบนี้ถูกบล็อกโดย RSL3 (รูป) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าระดับ ROS ฟอสโฟลิปิดที่ต่ำกว่าที่อาศัย GPx-4 เป็นตัวกลางในการต้านการเกิดพังผืด สัญญาณของโอบา
2.4. Oba ลดทอน CCl4-กระตุ้นการเกิดพังผืดในตับของเมาส์
CCl4-เกิดพังผืดในตับเป็นหนึ่งในแบบจำลองหนูเมาส์ที่ใช้บ่อยที่สุดเพื่อศึกษาการเกิดพังผืดในตับ [3] ในระดับจุลพยาธิวิทยา Oba บรรเทาพยาธิสภาพของตับได้อย่างมีนัยสำคัญ โดยเห็นได้จากการสะสมของคอลลาเจนที่ปรับปรุงให้ดีขึ้นซึ่งบ่งชี้ว่ามีการย้อมสี Masson และการย้อมสีด้วยสารต่อต้าน SMA (รูปที่ 4A-D). จากนั้น ระดับซีรัมของ alanine transaminase (ALT)/aspartate transaminase (AST) ถูกกำหนดเพื่อทดสอบระดับความเสียหายของตับ เมื่อเทียบกับหนูทดลอง CCL4 กลุ่ม Oba ในขนาดต่ำและกลุ่ม PFD จะลดระดับ ALT ลงอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">
2.5. Oba ปรับปรุงการแสดงออกของ GPx-4, การอักเสบที่ลดลง, การแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ EMT และลดระดับการออกซิเดชันของไขมันใน CCl4-การเกิดพังผืดในตับ
ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 5A Oba ยับยั้งการแสดงออกของโปรตีนของ IL-6 และการเกิดขึ้นของ EMT ในตับที่เป็นพังผืดของหนูที่มีระดับของหอยทากและ N-cadherin ที่ลดลง แต่มี E-cadherin ในระดับที่สูงกว่า นอกจากนี้ การแสดงออกของโปรตีนของ Nrf-2 และ GPx-4 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดหลังการรักษาด้วย Oba ขนาดปานกลางและสูง (รูปที่ 5B)ซิสทานเช เบเนฟิซิโอสผลการย้อมสีอิมมูโนฮิสโตเคมีคอล (IHC) แสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มแบบจำลอง จำนวนของเซลล์ที่เป็นบวก GPx-4 (สีน้ำตาล) ในกลุ่ม Oba ปริมาณสูงและปานกลางเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5C, E) ต่อไป เราทดสอบระดับความเครียดออกซิเดชันในตับของหนู และพบว่าเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ความเข้มการเรืองแสง ROS ของกลุ่มแบบจำลองนั้นสูงกว่าอย่างเห็นได้ชัด ในทางกลับกัน ระดับ ROS ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษาด้วย Oba (รูปที่ 5D, F)
3. อภิปราย
Fibrosis เป็นโรคที่น่ากลัวในโลก ไม่ว่าจะเป็นสาเหตุใดก็ตาม รวมถึงการติดเชื้อไวรัส ตับอักเสบจากแอลกอฮอล์หรือไม่มีแอลกอฮอล์ และการตอบสนองของภูมิต้านทานผิดปกติ ล้วนจบลงด้วยการเกิดพังผืดอันเนื่องมาจากอาการบาดเจ็บที่ตับเรื้อรัง [1] การกระตุ้นของ HSCs เป็นเหตุการณ์ศูนย์กลางที่เป็นต้นเหตุของการเกิดพังผืดในตับ HSC ถูกกระตุ้นด้วยการผลิตที่ผิดปกติของปัจจัยไฟโบรเจนิกที่หลากหลายและการสะสม ECM [2,3] มีรายงานว่าการส่งสัญญาณการเปิดใช้งาน Smad แบบบัญญัติที่เกี่ยวข้องกับ TGF- - กระบวนการ EMT และการอักเสบเรื้อรังที่เกี่ยวข้องกับ IL-6- มีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการข้างต้น [3,4] เพื่อประเมินผลการต้านการเกิดพังผืดของ Oba ต่อการเกิดพังผืดในตับ อันดับแรก เราจึงมุ่งเน้นไปที่การกำหนดผลกระทบต่อการกระตุ้น Lx-2 ที่เกิดจาก TGF- จากนั้นจึงตรวจสอบผลการต่อต้านการเกิดพังผืดในร่างกายโดยใช้ CCl4-เหนี่ยวนำแบบจำลองหนูเมาส์พังผืดในตับในที่สุด
Oba เป็นสารประกอบลิโมนอยด์ตามธรรมชาติ [24] และผลกระทบทางชีวภาพส่วนใหญ่ประกอบด้วยการต้านการอักเสบ [25] สารต้านอนุมูลอิสระ [26] และต้านเนื้องอก [27] เมื่อเร็ว ๆ นี้ พบว่า Oba เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา Nrf-2 ที่แข็งแกร่งและมีประสิทธิภาพ และมีฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืดในปอดในหนูทดลอง [28] อย่างไรก็ตาม หลักฐานยังขาดในฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืดของตับและกลไกระดับโมเลกุลที่เกี่ยวข้อง ที่นี่ การแสดงออกที่มากเกินไปของ -SMA คอลลาเจน 1 และ CTGF ทั้งหมดถูกยับยั้งโดย Oba ในแบบจำลอง Lx-2 ที่กระตุ้นด้วย TGF- การส่งสัญญาณ EMT ที่ปรับปรุงแล้วยังถูกระงับโดย Oba อย่างมีประสิทธิภาพ
ได้รับการยืนยันแล้วว่าความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันมีส่วนสำคัญต่อการเป็นพังผืด [12] ชนิดของออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) เป็นคำที่ใช้เรียกโมเลกุลหรือไอออนที่ออกซิไดซ์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพและการผลิต ROS ต่างๆ ในเซลล์ตับมากเกินไปอาจทำให้เสียชีวิตและทำให้เกิดพังผืดในตับ [13] ในทางตรงกันข้าม HSCs ขณะพักจะถูกกระตุ้นหลังจากเซลล์ตับได้รับบาดเจ็บ และ ROS ที่มากเกินไปจะขยายการเปิดใช้งาน HSCs มากขึ้นและจบลงด้วยการเกิดพังผืดในตับ [12] ดังนั้นการลดความเครียดออกซิเดชันที่เกินจริงจึงกลายเป็นวิธีการรักษาภาวะพังผืดได้อย่างมีประสิทธิภาพ
Nrf-2 เป็นตัวควบคุมที่สำคัญของความเค้นต้านออกซิเดชัน Nrf ที่กระตุ้นด้วยฟอสโฟรีเลต-2 ถูกย้ายไปยังนิวเคลียสเพื่อขับเคลื่อนการควบคุมที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนต้านอนุมูลอิสระที่ปลายน้ำ GST, HO1[15] มีรายงานว่าสารกระตุ้นทางเคมีธรรมชาติจำนวนมากของ Nrf2 มีฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืด เช่น เติร์ต-บิวทิลไฮโดรควิโนนและเคอร์คูมิน ในบรรดาโปรตีนต่อต้านอนุมูลอิสระทั้งหมด กลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส-4(GPx-4) เป็นสมาชิกของตระกูลกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GPx1-8) และช่วยให้สมดุลรีดอกซ์โดยการลดกลูตาไธโอน [ 30-32]. ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าการแสดงออกของกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดสที่สูงขึ้น-7 ยับยั้งโรคไขมันพอกตับที่ไม่มีแอลกอฮอล์โดยการลดการผลิต ROS [33] GPx-4 ลดฟอสโฟลิปิดเปอร์ออกไซด์บนเยื่อหุ้มไขมันเพื่อปกป้องเซลล์จากการบาดเจ็บจากปฏิกิริยาออกซิเดชันJ15] คาซึยะ สึโบจิ และคณะ พบว่าการแสดงออกของ GPx-4 ลดลงในเนื้อเยื่อปอดของปอดของหนูเมาส์ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยบลีโอมัยซิน และการเกิดพังผืดจะรุนแรงมากขึ้นเมื่อยีน GPx-4 ถูกทำให้ล้มลง นอกจากนี้ ลิพิดเปอร์ออกซิเดชันและวิถี TGF- /P-Smad ยังเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในไฟโบรบลาสต์ของปอดเมื่อยีน GPx-4 หมดลง [17] เมื่อเร็ว ๆ นี้ มีหลักฐานเพิ่มเติมที่สนับสนุนว่า ROS ที่ได้จากฟอสโฟลิปิดมีส่วนเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์พิเศษที่เรียกว่าเฟอร์รอปโตซิส ตัวยับยั้ง GPx-4 RSL3 ถูกนำไปใช้เป็นตัวเหนี่ยวนำเฟอร์รอปโทซิสด้วย [21,34]
ในการทดลองของเรา เราพบว่า Oba ใช้ความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระโดยเพิ่มการควบคุม Nrf-2 และ GPx-4 และควบคุม Nox-2 โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืดของ Oba ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อยีน GPx-4 ถูกยับยั้งโดย RSL3 ซึ่งเป็นตัวยับยั้ง GPx-4 อย่างต่อเนื่อง ระดับ ROS ที่ลดลงโดยการรักษาด้วย Oba ก็ได้รับการตรัสรู้เช่นกัน การสังเกตในหลอดทดลองเหล่านี้สนับสนุนอย่างสูงว่า ROS ต้านฟอสโฟลิปิดที่อาศัย GPx-4- มีความสำคัญต่อผลการป้องกันของ Oba
เพื่อตรวจสอบผลการรักษาต้านการเกิดพังผืดข้างต้นของ Oba ในเซลล์ LX2 การตรวจ CCl4-โรคพังผืดในตับของหนูเมาส์ได้รับการตรวจสอบด้วย CCl4 เป็นพิษต่อตับชนิดหนึ่ง เอนไซม์ไมโครโซมอล P450 ที่มีการย่อยสลายโดยอาศัยสื่อกลางทำให้เกิดอนุมูลอิสระที่มีปฏิกิริยาสูงเพื่อทำลายความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ ในทางกลับกัน ทำให้เกิดความผิดปกติของตับและการบาดเจ็บหลายชุด ในที่สุดก็พัฒนาเป็นพังผืดในตับ [35] ในการทดลองของเรา Oba แสดงผลการรักษาที่ดีต่อการเกิดพังผืดในตับที่เกิดจาก CCl มันบรรเทาความเสียหายของตับด้วยระดับ AST ที่ต่ำกว่า พื้นที่ของการรวมกลุ่มของเส้นใยคอลลาเจนมีขนาดเล็กลง และการแสดงออกของโปรตีนของ a-SMA, CTGF, คอลลาเจน-1, หอยทาก, N-cadherin และ IL{{10 }} ลดลงทั้งหมด ในขณะที่การส่งสัญญาณต่อต้านอนุมูลอิสระ การแสดงออกของโปรตีนของ Nrf-2 และ GPx-4 ก็สูงขึ้นเช่นกัน ระดับ ROS ที่สูงขึ้นก็ลดลง ผลลัพธ์เหล่านี้ยืนยันเพิ่มเติมถึงผลการต้านการเกิดพังผืดในหลอดทดลองโดย Oba และการส่งสัญญาณที่เกี่ยวข้อง โดยเฉพาะอย่างยิ่งการยับยั้ง EMT และผลต่อต้านอนุมูลอิสระโดย Nrf-2 และ GPx-4
โดยสรุป เราสรุปได้ว่า Oba บรรเทา TGF- -กระตุ้นการกระตุ้น HSCs และ CCl4-เหนี่ยวนำให้เกิดพังผืดในตับผ่านกลไกที่หลากหลาย ประการแรก Oba ยับยั้งการผลิต TGF- /Smad pathway, EMT และ IL-6 แบบคลาสสิก ประการที่สอง แสดงความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระที่ยอดเยี่ยมโดยการเพิ่มการแสดงออกของ Nrf-2 และ GPx-4 GPx-4สื่อกลางที่ต่อต้านฟอสโฟลิปิด ROS มีส่วนสำคัญต่อการมีผลต้านการเกิดพังผืดของมัน ดังนั้น Oba อาจทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมสารเคมีในการป้องกันและรักษาพังผืด
Oba แสดงผลการบ่มบางอย่างต่อการเกิดพังผืดของตับที่เหนี่ยวนำโดย CCl4-ในหนูเมาส์ C57 Oba สามารถลดการแสดงออกของโปรตีนไบโอมาร์คเกอร์ของพังผืดได้ เช่น -SMA, CTGF เป็นต้น ในขณะเดียวกัน Oba ลดการแสดงออกของโปรตีนของ I-6, E-cadherin เป็นต้น เป็นเรื่องที่น่าสนใจที่ Mid-Oba แสดงสัญญาณของผลลัพธ์ที่ดีกว่าสำหรับ low-Oba และ high-Oba ในแง่ของการแสดงออกสัมพัทธ์ของโปรตีนเหล่านี้ แม้ว่าจะไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ อย่างไรก็ตาม มันบ่งชี้ว่าปริมาณที่เหมาะสมอาจเป็นปัจจัยสำคัญในกระบวนการนี้ และเราจะสำรวจปรากฏการณ์นี้ในการทดลองครั้งต่อไป นอกจากนี้ เราพบว่า ROS และระดับการเกิดพังผืดในตับลดลงด้วยการแสดงออกที่ควบคุม Nrf-2 และ GPx-4 ดังนั้น เราเชื่อว่า Oba สามารถบรรเทาการเกิดพังผืดในตับได้โดยการควบคุม Nrf-2 และ GPx-4 อย่างไรก็ตาม PFD อาจให้การรักษาได้ดีกว่า Oba ทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง อย่างไรก็ตาม Oba นั้นดีกว่า PFD ในด้านฤทธิ์ต่อต้านอนุมูลอิสระ มันเอื้อต่อการเพิ่มความเป็นไปได้ในการค้นหายาตัวใหม่สำหรับฤทธิ์ต้านการเกิดพังผืดของตับจากด้านต่อต้านอนุมูลอิสระ และมีประโยชน์เล็กน้อยต่อสุขภาพของมนุษย์
4. วัสดุและวิธีการ
4.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์
Oba (หมายเลข B20553 ความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์) และ RSL3 (หมายเลข S81241 ความบริสุทธิ์มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์) ถูกซื้อจาก YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) และเลิกกิจการ ในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (DMSO) (หมายเลข R21950; YUANYE) จนถึงความเข้มข้น 72.64 มก./มล. และ 6 มม. ตามลำดับ หลังจากการฆ่าเชื้อด้วยตัวกรอง สารละลายที่เป็นผลลัพธ์ถูกคงไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส สารละลายถูกเติมลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อให้ได้ความเข้มข้น DMSO ขั้นสุดท้ายที่<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">
4.2. การเพาะเลี้ยงเซลล์และการออกแบบการทดลอง
Lx-2 เซลล์ตับมนุษย์ในตับมนุษย์และเซลล์มะเร็งตับในมนุษย์ Hepg-2 (ทั้งหมดมาจาก Department of Pharmacy, The Fourth Military Medical University, China) ได้รับการเพาะเลี้ยงใน Modified Eagle Medium ของ Dulbecco ( DMEM) เสริมด้วยซีรั่มโคนมในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์และเพนิซิลลิน 1 เปอร์เซ็นต์ (Thermo Fisher Scientific) และสเตรปโตมัยซิน (Thermo Fisher Scientific) 1 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นให้คงอุณหภูมิไว้ที่ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศที่มีความชื้น 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 และอากาศ 95 เปอร์เซ็นต์ เพื่อประเมินผลของ Oba ต่อความมีชีวิตของเซลล์ Lx-2 Lx-2 ถูกวางแผนด้วย 1×10* เซลล์/หลุมในจาน 96-หลุมและบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนการเติม ของโอบา จากนั้น Lx-2 ได้รับการบำบัดด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกันของ Oba (10,20, 40,80 และ 160 wM และเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24,48 หรือ 72 ชั่วโมง การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์โดย CCK8 เพื่อประเมิน ผลของ Oba ต่อการกระตุ้น Lx-2 Lx-2 ถูกเพาะเลี้ยงล่วงหน้าด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากซีรัมเป็นเวลา 12 ชั่วโมง ตามด้วยการกระตุ้นด้วย TGF- (10ng/mL, 24 ชั่วโมง) และการรักษาด้วย Oba หรือ PFD เพื่อประเมินผลของ Oba ต่อการอักเสบ Hepg-2 ถูกกระตุ้นโดย CCl4(20 nm,8 h) และบำบัดด้วย Oba 20 μM เมื่อสิ้นสุดการเพาะเลี้ยง Western blotting และการวิเคราะห์ qPCR แบบเรียลไทม์
4.3. การออกแบบสัตว์และการทดลอง
หนู C57 เพศผู้น้ำหนัก 20± 0.5 กรัม (ศูนย์สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารที่สี่) ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่อุณหภูมิ 25 องศา ± 2 องศาและวงจรแสง/ความมืด 12-ชม. การเข้าถึงน้ำและอาหารฟรี การทดลองทุกครั้งในการศึกษานี้ดำเนินการตามโปรโตคอลที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารแห่งที่สี่ด้านการดูแลสัตว์ หนูเมาส์ c57 ถูกสุ่มแจกเป็น 6 กลุ่ม (n=6 ในแต่ละกลุ่ม) ดังนี้: i) กลุ่มควบคุมเสแสร้ง, i) กลุ่มแบบจำลอง, ii) กลุ่มโอบาสูง (CCl4 บวก 6 มก./กก. Oba), io )กลุ่มขนาดกลาง-Oba(CCl4 บวก 3 มก./กก. Oba), ø)กลุ่มต่ำ-Oba (CCl4 บวก 1.5 มก./กก. Oba) และ vi) กลุ่ม PFD （CCl4＋ PFD） กลุ่มแบบจำลองได้รับการบำบัดด้วย CCl4 (30 เปอร์เซ็นต์ CCl4/น้ำมันมะกอก ฉีดเข้าช่องท้อง 5 มล./กก.) สามครั้งต่อสัปดาห์เป็นเวลา 6-สัปดาห์เพื่อกระตุ้นให้เกิดพังผืดในตับ กลุ่มอื่น ๆ ได้รับยา Oba หรือ PFD ในขนาดที่ต่างกันและมีปริมาณการติดเชื้อ CCil4 ในช่องท้องเท่ากันสำหรับ ช่วงเวลา 6-สัปดาห์ ปริมาณน้ำมันมะกอกที่เท่ากันแทน CCl4 ถูกควบคุมให้ C57 โดย ipas a sham control การทดลองทุกครั้งในบทความนี้ดำเนินการตามโปรโตคอลที่ได้รับอนุมัติโดยคณะกรรมการมหาวิทยาลัยการแพทย์ทหารแห่งที่สี่ด้านสัตว์ ดูแล.
4.4.การซับแบบตะวันตก
ตับหรือเซลล์ C57 ที่เพาะเลี้ยงถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันหรือแยกสลายในบัฟเฟอร์ RIPA โดยการใช้อุปกรณ์ตัดเนื้อเยื่อหรือการขูดเซลล์ (Service, KZ-2) วัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA ไลเซตถูกหมุนเหวี่ยง (4 องศา , 12,000 รอบต่อนาที, 5 นาที) และส่วนลอยเหนือตะกอนถูกรวบรวม มีการปฏิบัติตามขั้นตอนการทำงานตามที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้ [14] ตัวอย่างถูกสแกนภายใต้ระบบ Chemiluminescent Imaging and Analysis (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610)
4.5. การวิเคราะห์ qPCR แบบเรียลไทม์
ตับหรือเซลล์ C57 ที่เพาะเลี้ยงถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันหรือละลายในรีเอเจนต์ Trizol ด้วยความช่วยเหลือของอุปกรณ์ขัดเนื้อเยื่อเพื่อแยก RNA ทั้งหมด RNA ทั้งหมดถูกแปลงกลับเป็น cDNA โดยใช้ RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit -actin ถูกใช้สำหรับการอ้างอิงภายใน RT-qPCR ถูกดำเนินการบนระบบ qPCR แบบเรียลไทม์ 7500 (ระบบชีวภาพประยุกต์) ด้วยรีเอเจนต์ SYBR Premix Ex Taq ไพรเมอร์ของยีนมนุษย์ที่ใช้แสดงไว้ในตารางที่ 1
บทความนี้คัดลอกมาจาก Molecules 2021, 26, 318 https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules