ไวรัสนิวคาสเซิลสายพันธุ์ใหม่ที่มีพื้นฐานมาจากวัคซีน Ovo ข้ามผ่านภูมิคุ้มกันของมารดาเพื่อให้การป้องกันอย่างเต็มที่จากความท้าทายที่รุนแรงในระยะแรก ตอนที่ 1

เชิงนามธรรม:

โรคนิวคาสเซิล (ND) เป็นหนึ่งในโรคสัตว์ปีกที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจมากที่สุด แม้จะมีความพยายามอย่างเข้มข้นกับโปรแกรมการฉีดวัคซีนในปัจจุบัน โรคนี้ยังคงเกิดขึ้นทั่วโลก ทำให้เกิดการตายอย่างมีนัยสำคัญแม้ในฝูงสัตว์ที่ได้รับวัคซีน สิ่งนี้มีสาเหตุบางส่วนจากช่องว่างในภูมิคุ้มกันในช่วงหลังการฟักไข่เนื่องจากการมีแอนติบอดีของมารดาที่ส่งผลเสียต่อการจำลองแบบของวัคซีนที่มีชีวิตที่ใช้กันทั่วไป ในวัคซีน ovo มีข้อดีหลายประการและนำเสนอโอกาสในการแก้ไขปัญหานี้

ปัจจุบันที่ใช้ในวัคซีน ovo ND คือวัคซีน recombinant herpesvirus of turkeys (HVT)- vectored ซึ่งแสดงแอนติเจนของไวรัสโรคนิวคาสเซิล (NDV) แม้ว่าจะได้รับการพิสูจน์แล้วว่ามีประสิทธิภาพ แต่วัคซีนเหล่านี้ก็มีข้อจำกัดบางประการ เช่น การสร้างภูมิคุ้มกันที่ล่าช้า และการไม่สามารถให้วัคซีน HVT ครั้งที่สองหลังฟักได้ ปัจจุบันไม่สามารถใช้วัคซีน ND ที่มีชีวิตสำหรับการฉีดวัคซีนในไข่และไข่ เนื่องจากสิ่งเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการตายของตัวอ่อนสูง ในการศึกษานี้ วัคซีนทดลอง NDV-เวกเตอร์รีคอมบิแนนท์ที่มีลำดับแอนติเซนส์ของนกอินเตอร์ลิวคิน 4 (IL4R) และกระดูกสันหลังของพวกมันถูกบริหารในไข่ในขนาดที่ต่างกันใน 18-ไข่เชิงพาณิชย์อายุหนึ่งวันที่มีระดับแอนติบอดีของมารดาสูง ลูกนกที่ฟักออกมาถูกท้าทายด้วย NDV ที่รุนแรงเมื่ออายุได้ 2 สัปดาห์ การไหลออกของวัคซีนหลังการฟัก การรอดชีวิตหลังการท้าทาย การหลั่งไวรัสที่ท้าทาย และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายได้รับการประเมินในหลายจุดเวลา นกที่ได้รับวัคซีน Recombinant NDV (rNDV) ลดอัตราการตายหลังฟักออกได้อย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับวัคซีน LaSota ชนิดธรรมชาติ

วัคซีน rNDV ทั้งหมดสามารถเจาะภูมิคุ้มกันของมารดาและกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในช่วงต้นที่แข็งแกร่ง นอกจากนี้ วัคซีน rNDV ยังป้องกันจากโรคทางคลินิกและลดการแพร่ระบาดของไวรัสได้อย่างมีนัยสำคัญหลังจากการทดสอบ NDV ที่มีความรุนแรงในระยะแรกในช่วงสองสัปดาห์หลังฟักไข่ ระดับแอนติบอดีที่ยับยั้ง hemagglutination หลังการทดสอบในกลุ่มที่ได้รับวัคซีนยังคงเทียบได้กับระดับก่อนการทดสอบ ซึ่งบ่งชี้ถึงความสามารถของวัคซีนที่ศึกษาเพื่อป้องกันการจำลองแบบของไวรัสท้าทายอย่างมีประสิทธิภาพ การรอดชีวิตหลังการฟักไข่หลังการฉีดวัคซีนด้วยวัคซีน rNDV-IL4R ขึ้นอยู่กับขนาดยา โดยอัตราการรอดชีวิตเพิ่มขึ้นเมื่อขนาดยาลดลง การอยู่รอดที่ดีขึ้นและข้อมูลการขึ้นกับขนาดยาบ่งชี้ว่าวัคซีนชนิดใหม่ถูกลดทอนลงในวัคซีนที่ใช้ ovo rNDV ซึ่งสามารถแทรกซึมภูมิคุ้มกันของมารดาเพื่อกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่งได้เร็วที่สุดเท่าที่ 14 วันหลังการฟักไข่ ส่งผลให้มีการป้องกันสูงหรือเต็มที่จากความท้าทายที่รุนแรง แสดง สัญญาว่าจะเป็นผู้มีส่วนร่วมในการควบคุมโรคนิวคาสเซิล

นอกจากการฉีดวัคซีนของมนุษย์แล้ว คนยังสามารถรับประทานอาหารและอาหารเสริมได้อีกด้วย Cistanche ประกอบด้วยสารเคมีหลายชนิด เช่น โพลีแซคคาไรด์ สเตียรอยด์ อัลคาลอยด์ ฟลาโวนอยด์ เป็นต้น สารเหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการควบคุมระบบภูมิคุ้มกัน ในหมู่พวกเขา โพลีแซคคาไรด์สามารถส่งเสริมการกระตุ้นและเพิ่มจำนวนเซลล์ภูมิคุ้มกัน และเพิ่มภูมิคุ้มกันของร่างกาย สเตียรอยด์สามารถควบคุมการทำงานของเซลล์ภูมิคุ้มกันและเพิ่มการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน อัลคาลอยด์และฟลาโวนอยด์สามารถต้านออกซิเดชั่น ต้านการอักเสบ ต้านแบคทีเรีย และเพิ่มภูมิคุ้มกัน ดังนั้น Cistanche จึงมีผลควบคุมภูมิคุ้มกันที่สำคัญ และสามารถใช้เป็นอาหารเพื่อสุขภาพและยาเพื่อปรับปรุงภูมิคุ้มกัน

คลิก ประโยชน์ต่อสุขภาพของ cistanche

1. บทนำ

โรคนิวคาสเซิล (ND) โรคร้ายแรงในสัตว์ปีกที่อาจทำให้นกตายได้ 100 เปอร์เซ็นต์ เกิดจากเชื้อไวรัสโรคนิวคาสเซิลสายพันธุ์รุนแรง (NDV) [1] ไวรัสสายพันธุ์นี้เพิ่งเปลี่ยนชื่อเป็น Avian orthoavulavirus 1 ซึ่งเป็นสมาชิกของครอบครัว Paramyxoviridae [2,3] ไวรัสโรคนิวคาสเซิลมีการเข้ารหัสจีโนม RNA แบบเนกาทีฟแบบสายเดี่ยว ไม่มีการแบ่งกลุ่ม สำหรับโปรตีนโครงสร้างอย่างน้อยหกชนิด (30—นิวคลีโอโปรตีน [NP]— ฟอสโฟโปรตีน [P]—เมทริกซ์โปรตีน [M]—ฟิวชันโปรตีน [F]— hemagglutinin-neuraminidase [HN]—และ RNA-polymerase ขนาดใหญ่ [L]—50 ) และประกอบด้วยหนึ่งในสามขนาดจีโนม (นิวคลีโอไทด์ 15,186, 15,192 และ 15,198) [4,5] โรคนิวคาสเซิลถือเป็นโรคในสัตว์ปีกที่สำคัญอันดับสามทั่วโลก [6] และยังคงระบาดในหลายประเทศทั่วเอเชีย แอฟริกา และอเมริกา [7]

การควบคุม ND รวมถึงความปลอดภัยทางชีวภาพที่เข้มงวดเพื่อป้องกันการนำ NDV ที่เป็นพิษ (vNDV) เข้าสู่ฟาร์มสัตว์ปีก [8,9] และการบริหารวัคซีนที่เหมาะสม [10] อย่างไรก็ตาม การระบาดของโรค ND หลายครั้งที่เกิดขึ้นทั่วโลก [11] บ่งชี้ว่าวัคซีนและขั้นตอนการให้วัคซีนในปัจจุบันไม่มีประสิทธิภาพอย่างเต็มที่ นอกเหนือไปจากวัคซีนมีชีวิตและวัคซีนเชื้อตายแบบดั้งเดิมแล้ว ยังมีการสำรวจแนวคิดต่างๆ สำหรับการฉีดวัคซีน ND ในช่วงสองทศวรรษที่ผ่านมา รวมถึงวัคซีนเวกเตอร์ แอนติเจน-แอนติบอดีเชิงซ้อน อนุภาคคล้ายไวรัส และวัคซีนลิแกนด์ตัวรับที่มีลักษณะเหมือนโทร และอื่นๆ [1, 8,9]. วัคซีนสำหรับสัตว์ปีกหลายตัวได้รับการออกแบบมาเพื่อแสดงไซโตไคน์กระตุ้นภูมิคุ้มกันร่วมกัน ได้รับการแนะนำเพื่อปรับปรุงภูมิคุ้มกันป้องกัน [12] อีกแนวทางหนึ่งที่มีการสำรวจคือการใช้วัคซีนที่จับคู่กับแอนติเจน แม้ว่า NDV ทั้งหมดจะถือว่าเป็นสมาชิกของซีโรไทป์เดียว [3,13] แต่ก็มีความแปรผันของแอนติเจนระหว่างสายพันธุ์ [14] การศึกษาก่อนหน้านี้กับไก่ที่มีอายุต่างกันได้แสดงให้เห็นว่าไก่ที่ได้รับการฉีดวัคซีนสายพันธุ์ที่จับคู่แอนติเจนกับไวรัสท้าทายจะหลั่งปริมาณของความท้าทาย vNDV น้อยกว่าปริมาณที่ไก่ได้รับวัคซีนต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ [15–17] ข้อควรทราบ แอนติบอดีต่อต้าน NDV ของมารดาที่ถ่ายโอนแบบพาสซีฟแม้ว่าจะปกป้องไก่ในช่วงสัปดาห์แรก ๆ ที่สำคัญของชีวิต แต่ก็รบกวนการพัฒนาภูมิคุ้มกันของเจ้าบ้านหลังการฉีดวัคซีน [18]

ในการให้วัคซีน ovo เป็นแนวทางที่ให้ข้อดีหลายอย่าง เช่น การลดต้นทุนอย่างมาก การสร้างมาตรฐาน การใช้วัคซีนจำนวนมาก การฉีดวัคซีนอัตโนมัติที่โรงเพาะฟัก การส่งมอบวัคซีนอย่างสม่ำเสมอในไข่แต่ละฟอง และไม่ทำให้นกเครียด [19–21]— และเป็นวิธีการสร้างภูมิคุ้มกันที่น่าสนใจสำหรับอุตสาหกรรมสัตว์ปีก [22] ระหว่าง 80 เปอร์เซ็นต์ถึง 90 เปอร์เซ็นต์ของไก่เนื้อที่เลี้ยงในสหรัฐอเมริกาในปัจจุบันได้รับการฉีดวัคซีน ovo 2-3 วันก่อนฟัก [23,24] และระบบอัตโนมัติของกระบวนการช่วยให้สามารถออกไข่ได้ถึง 70,000 ฟอง ได้รับวัคซีนต่อชั่วโมง [23]

ทั่วโลก วิธีการบริหารวัคซีนนี้ใช้ใน 26 จาก 30 ประเทศผู้ผลิตสัตว์ปีกชั้นนำของโลก [23] ขณะนี้มีวัคซีน in-ovo บางตัวสำหรับป้องกัน NDV แต่พวกมันทั้งหมดถูกสร้างขึ้นโดยใช้เวกเตอร์ที่ไม่ใช่ NDV วัคซีนเวกเตอร์ที่ใช้ไวรัส Fowlpox (FPV) ซึ่งแสดงโปรตีน NDV F และ HN ที่ใช้ใน ovo ได้รับการแสดงเพื่อป้องกันสัตว์ปีกจากความท้าทายด้วย vNDV [25,26]

อย่างไรก็ตาม วัคซีนรีคอมบิแนนท์ FPV-ND ไม่ได้ใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากการรบกวนทางภูมิคุ้มกันจากการฉีดวัคซีนหรือการสัมผัสของ FPV ครั้งก่อน (FPV มีอยู่ทั่วไปในสิ่งแวดล้อม) และขาดการปรับให้เหมาะสมสำหรับการใช้งานด้วยวิธีจำนวนมาก [9] เวกเตอร์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับ ND recombinant ในการผลิตวัคซีน ovo คือ Meleagrid alphaherpesvirus 1 หรือที่เรียกกันทั่วไปว่า herpesvirus of turkeys (HVT) หรือ serotype 3 Marek's disease virus [12,23] เฉพาะในสหรัฐอเมริกาเพียงแห่งเดียว มีการผลิตวัคซีน HVT (rHVT)-ND แบบรีคอมบิแนนท์ (rHVT)-ND จำนวน 8.2 พันล้านโดสในปี 2561 เทียบกับวัคซีน ND แบบธรรมดาจำนวน 3.6 พันล้านโดส [27]

นอกจากข้อดีของการใช้ใน ovo แล้ว วัคซีน rHVT ที่แสดงโปรตีน NDV จะกระตุ้นภูมิคุ้มกันที่แข็งแรงและยาวนานหลังจากการใช้เพียงครั้งเดียว [28] นอกจากนี้ พวกมันได้รับผลกระทบชั่วคราวจากการมีแอนติบอดีต่อต้าน NDV ที่ได้มาจากแม่ [8] อย่างไรก็ตาม วัคซีน rHVT-ND มีข้อจำกัดบางประการ เช่น ภูมิคุ้มกันที่ล่าช้า และการฉีดวัคซีน HVT ก่อนหน้านี้ดูเหมือนว่าจะดื้อต่อการใช้วัคซีน HVT เสริมในนกตัวเดียวกัน [9,29] วัคซีน HV เกี่ยวข้องกับเซลล์และจำเป็นต้องเก็บและขนส่งในไนโตรเจนเหลว ซึ่งเป็นข้อจำกัดในการใช้งานในหลายประเทศ

โอกาสของวัคซีน ovo ใหม่กำลังเพิ่มขึ้น [23] มีการสำรวจพาหะที่แตกต่างกันสำหรับเส้นทางการให้ยาแบบ in-ovo และมีการรายงานผลลัพธ์ที่คาดหวังด้วยวัคซีน adenovirus- [30] และ alphavirus- vectored ที่ไม่จำลองแบบของมนุษย์ [31] แม้ว่าจะไม่มีความก้าวหน้าในการใช้งานเชิงพาณิชย์ตามปกติ แต่ก็มีความพยายามในการพัฒนาวัคซีนชนิดใหม่ที่ไม่ใช่ HVT NDV ของ ovo [32–35] การใช้วัคซีน ND ที่มีชีวิตใน ovo เป็นสิ่งที่ท้าทาย ในขณะที่วัคซีน ND ที่มีชีวิต เช่น LaSota, B1, Clone 30 และ Ulster ให้การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแรงและมักใช้สำหรับการฉีดวัคซีนไก่ที่อายุน้อยกว่าหนึ่งวัน พวกมันมีความสัมพันธ์กับการตายของตัวอ่อนสูงเมื่อ บริหารที่อายุ 18 วันของตัวอ่อน มีรายงานการเสียชีวิตสูงถึงร้อยละ 100 โดยใช้ไวรัสที่มีความรุนแรงต่ำชนิดป่า และร้อยละ 80 โดยใช้ไวรัสที่มีชีวิตที่ลดทอนพันธุกรรมได้รับการรายงานหลังจากการใช้ในรังไข่ และในปัจจุบันยังไม่มีการใช้วัคซีน ND ที่มีชีวิตสำหรับวิธีการบริหารวัคซีนนี้ [36,37] .

วัคซีนทดลองชนิดรีคอมบิแนนต์ NDV (rNDV) แบบเวกเตอร์ที่มีแอนติเซนส์นกอินเตอร์ลิวคิน 4 แทรก (IL4) ชื่อ ZJ1*l-IL4R เพิ่งแสดงให้เห็นว่ามีแนวโน้มที่ดีในผู้สมัครรับวัคซีน ovo หลังการประเมินแบบปลอดเชื้อโรค (SPF) ) ไข่ไก่ตัวอ่อน (ECE) [38]. การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินเพิ่มเติมถึงการประยุกต์ใช้วัคซีน NDV- vectored ชนิดลูกผสมและกระดูกสันหลังชนิดลูกผสม (ลดตำแหน่งรอยแยกจากไวรัสชนิดป่า) และไวรัส LaSota-IL4R ชนิดลูกผสมสำหรับการฉีดวัคซีนในไข่อายุ 18-วัน ไข่เชิงพาณิชย์ที่มีระดับแอนติบอดีของมารดาสูง วัคซีน LaSota และ rHVT-ND ที่มีจำหน่ายทั่วไปรวมอยู่ในกลุ่มควบคุม นอกจากนี้ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินประสิทธิภาพการป้องกันของวัคซีนที่ศึกษาต่อความท้าทายในระยะแรกด้วย vNDV ที่นี่ แสดงให้เห็นถึงความสามารถของวัคซีนรีคอมบิแนนท์เหล่านี้ในการเอาชนะภูมิคุ้มกันของมารดาได้อย่างมีประสิทธิภาพ แม้ในปริมาณต่ำ และกระตุ้นให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่แข็งแกร่ง วัคซีน rNDV ทดลองแสดงให้เห็นถึงการป้องกัน 100 เปอร์เซ็นต์หลังจากการท้าทายครั้งแรกกับ vNDV

2. วัสดุและวิธีการ

2.1. ไวรัส

ห่านที่มีไวรัส/จีน/ZJ1/2000 (ZJ1, หมายเลขทะเบียน GenBank AF431744) NDV ซึ่งเป็นสมาชิกของ sub-genotype VII.1.1 (อดีต VIId) ถูกใช้เป็นไวรัสท้าทายในการศึกษานี้ ไวรัส ZJ1 ชนิดรีคอมบิแนนต์ (ZJ1 เวอร์ชันลดทอน) ที่มีตำแหน่งรอยแยกที่มีความรุนแรงต่ำ (ZJ1*L) ซึ่งก่อนหน้านี้สร้างขึ้นในห้องปฏิบัติการของเราผ่านพันธุกรรมแบบย้อนกลับ [39] ถูกใช้เป็นแกนหลักในการสร้างวัคซีน ZJ1*L ชนิดรีคอมบิแนนต์และเป็นวัคซีน ไวรัส. สายพันธุ์วัคซีน LaSota (LS) ที่มีความรุนแรงต่ำถูกใช้เป็นวัคซีนควบคุมและเป็นแกนหลักในการสร้างวัคซีน LS-IL4R ชนิดลูกผสม ไวรัสทั้งหมดได้มาจากพื้นที่เก็บข้อมูลของห้องปฏิบัติการวิจัยสัตว์ปีกตะวันออกเฉียงใต้ (SEPRL) ของศูนย์วิจัยสัตว์ปีกแห่งชาติสหรัฐอเมริกา (USNPRC) กระทรวงเกษตรของสหรัฐอเมริกา (USDA) นอกจากนี้ยังใช้วัคซีน rHVT-ND ที่มีขายทั่วไป (การแทรกยีนฟิวชัน) เป็นตัวควบคุมด้วย

วัคซีนทดลอง NDV ชนิดรีคอมบิแนนต์ที่ใช้ในการศึกษานี้สร้างขึ้นโดยใช้พันธุกรรมย้อนกลับตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [38,39] โดยสังเขป ลำดับการเข้ารหัสของ IL4 ของนกถูกโคลนเข้าไปในกระดูกสันหลังของ ZJ1*L และ LS ในทิศทางตรงกันข้าม (IL4R) ระหว่างยีน P และ M ซึ่งสร้างไวรัสที่มีชีวิตแบบรีคอมบิแนนท์ที่ทำให้อ่อนฤทธิ์สองตัว—กล่าวคือ ZJ1*L-IL4R และ LS- IL4R (หมายเลขภาคยานุวัติ GenBank MM680659 และ MM680665 ตามลำดับ) ไวรัสรีคอมบิแนนท์ได้รับการช่วยเหลือโดยใช้ไวรัสวัคซีนดัดแปลงอังการาที่แสดง T7 พอลิเมอเรส (MVA/T7) ตามโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ [38–41] การแสดงแผนผังของโครงสร้างมีอยู่ในรูปที่เสริม S1A สำหรับวัตถุประสงค์ของงานนี้ คำว่า "วัคซีน DV" ที่ใช้ต่อจากนี้หมายถึง ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R และ LS-IL4R

สต็อกที่ใช้งานได้ของ NDV ทั้งหมดได้รับการเผยแพร่ใน {{0}} ถึง 11-ไข่ไก่ที่มีตัวอ่อน SPF (ECE) อายุวัน (ECE) [42] ไวรัสที่ใช้ในการเพาะไข่ในการศึกษานี้ถูกเจือจางในน้ำซุปสมอง (BHI) (BD Biosciences, MD, USA) ที่มี gentamicin 200 µg/mL, 2{{22} }0เพนิซิลลิน 0 U/mL และ amphotericin B 4 µg/mL ถึงระดับเป้าหมายที่แตกต่างกัน 3 ระดับ คือ 105.5/0.1 มล., 104.5/0.1 มล. และ 103.5/0.1 มล. ปริมาณการติดเชื้อในตัวอ่อน (EID50) ยกเว้น LS ซึ่งถูกเจือจางเป็น 105.5/0.1 มล. และ 104.5/0.1 มล. EID50 ระดับไทเทอร์ของสต็อคที่เจือจางของวัคซีนเชื้อเป็นได้รับการยืนยันโดยการไตเตรทย้อนกลับใน 9- ถึง 11-SPF ECEs ตามขั้นตอนมาตรฐานตามที่อ้างถึงข้างต้น วัคซีน rHVT-ND ถูกเจือจางโดยตรงโดยใช้สารเจือจางซูโครสฟอสเฟตกลูตาเมตอัลบูมินสำหรับวัคซีน rHVT ที่อธิบายไว้ในพิธีสารทดสอบทางชีววิทยาทางสัตวแพทย์ของ USDA [43]

2.2. ไข่

ไข่เชิงพาณิชย์ (ไม่มีค่า SPF) สองร้อยหกสิบสองฟองจากไก่ไข่ Hy-Line Rockside W-36 (Mansfield, GA, USA) ได้รับบริจาคสำหรับการทดลองนี้ ฝูงไก่ได้รับการฉีดวัคซีน LaSota เป็นประจำ ภูมิคุ้มกันของฝูงได้รับการทดสอบอย่างสม่ำเสมอโดย ELISA และแม้ว่าผลลัพธ์เหล่านี้จะแปลโดยตรงไม่ได้ว่าเป็นระดับ hemagglutination-inhibition (HI) แต่ระดับแอนติบอดีต่อต้าน NDV โดยเฉลี่ยของฝูงพ่อแม่นั้นสูงมาก (เช่น 15,534 โดยมีจุดตัดสำหรับผลบวก ตัวอย่างของ 1159) แหล่งที่มาของ SPF ECEs (ไข่ 42 ฟอง) คือฝูง SEPRL SPF White Leghorn ไข่ทั้งหมดฟักที่อุณหภูมิ 37.5 ◦C และความชื้นสัมพัทธ์ 55–60 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 18 วัน

2.3. การฉีดวัคซีน

ไข่เชิงพาณิชย์ (n {{{{10}}}}) และ SPF (n=42)) ที่อายุ 18 วันของตัวอ่อน (DOE) ถูกแยกออกเป็น 14 กลุ่ม โดยแต่ละกลุ่มมีไข่ 21 ฟอง (ยกเว้นกลุ่มควบคุม BHI และ Hatch ซึ่งมีไข่อย่างละ 26 ฟอง) ใช้เข็มฉีดยา 1 มล., 24 G × 1/2 ฉีดไข่แต่ละฟองเข้าไปในโพรงอัลลันโทอิกด้วยวัคซีนเจือจางหรือ BHI 0.1 มล. ยกเว้นกลุ่มควบคุมการฟักไข่ซึ่งไข่ไม่ถูกจัดการที่ ทั้งหมด. มีไข่ที่ได้รับการฉีดวัคซีนทั้งหมด 13 กลุ่ม โดยแบ่งเป็นกลุ่มทดลอง 7 กลุ่มและกลุ่มควบคุม 6 กลุ่ม กลุ่มทดลองเจ็ดกลุ่มมีดังนี้: ZJ1*L-IL4R 104.5, ZJ1*L-IL4R 105.5, LS-IL4R 103.5, LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5, ZJ1*L 104.5 และ ZJ1*L 105.5 แต่ละกลุ่มได้รับ ขนาดยา EID50 ของหัวเชื้อต่อ 0.1 มล. ตามที่ระบุไว้ในชื่อกลุ่ม นอกจากนี้ยังมีการสร้างกลุ่มควบคุมหกกลุ่ม ไข่เชิงพาณิชย์สองกลุ่มได้รับการฉีดวัคซีนตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วย BHI และ rHVT-ND ตามลำดับ กลุ่มควบคุมของไข่เชิงพาณิชย์สองกลุ่มได้รับการฉีดวัคซีนตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วยขนาดยา LS 104.5 และ LS 105.5 EID50 ต่อ 0.1 มล. กลุ่มควบคุมสองกลุ่มของไข่ SPF ถูกฉีดวัคซีนด้วย ZJ1*L 103.5 และ ZJ1*L-IL4R 103.5 การแสดงแผนผังของการออกแบบการศึกษามีอยู่ในรูปที่เสริม S1B, C

หลังจากการฉีดวัคซีน ไข่ถูกวางไว้ใน Turbofan Hova-Bator Incubators (GQF Manufacturing Company Inc., GA, USA) ซึ่งต่อมาถูกวางไว้ในห้องแยกในศูนย์ความปลอดภัยทางชีวภาพของสัตว์ระดับ 2 (ABSL-2) ตู้อบได้รับการควบคุมด้วยเทอร์โมสตัทเพื่อรักษาอุณหภูมิคงที่ที่ 37.5 ◦C และความชื้นสัมพัทธ์ระหว่าง 55 เปอร์เซ็นต์ถึง 60 เปอร์เซ็นต์

2.4. การฟัก การสุ่มตัวอย่าง การตาย

หลังจากฟักไข่ที่ 21 DOE ลูกไก่จะถูกเลี้ยงในเครื่องแยกแรงดันลบ (ABSL-2) และให้อาหารและน้ำโดยไม่จำกัด ไก่ที่ไม่มีค่า SPF ห้าตัวจากทั้งกลุ่มควบคุมการฟักไข่และกลุ่ม BHI ถูกสังเวยและตกเลือดทันทีหลังฟักไข่เพื่อสร้างระดับไตเตอร์พื้นฐานของแอนติบอดีต่อต้าน NDV HI ของมารดา ไก่ทุกตัวชั่งน้ำหนักที่ 1, 8 และ 13 วันหลังฟัก (DPH) เก็บ Oropharyngeal และ Cloacal Swab ใน BHI จากนกแต่ละตัวที่ 2 และ 4 DPH มีการบันทึกสัญญาณทางคลินิกและการตายวันละสองครั้งตลอดระยะหลังฟักไข่ และเก็บตัวอย่างเลือดที่ 13 DPH

2.5. ท้าทาย

นก 12 ตัวจากแต่ละกลุ่ม (ยกเว้น LS 1{{10}}5.5 ซึ่งนกทุกตัวตายด้วย 6 DPH) ถูกย้ายไปยังศูนย์ ABSL-3E ที่ 13 DPH นกถูกจัดให้อยู่ในเครื่องแยกแรงดันลบและปล่อยให้ปรับตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนการทดสอบ นกทุกตัวถูกทดสอบที่ 14 DPH ด้วย ZJ1 NDV ที่มีความรุนแรงที่ 106 EID50/0.1 mL โดยทางตาและจมูก มีการสังเกตนกทุกวันเพื่อหาอาการทางคลินิกและการเสียชีวิต Oropharyngeal และ Cloacal Swab เก็บจากนกแต่ละตัวที่ 2 และ 4 วันหลังการทดสอบ (DPC) นกที่รอดตายทั้งหมดได้รับการชั่งน้ำหนักและเจาะเลือดที่ 14 DPC และทำการุณยฆาตโดยการเคลื่อนของปากมดลูกหลังจากการดมยาสลบด้วยสารละลายคีตามีน/ไซลาซีน 0.2 มล. (คีตามีน 66 มก./มล. และไซลาซีน 6.6 มก./มล.) ฉีดเข้ากล้ามด้วย 25-เข็มวัด

2.6. RT-PCR แบบเรียลไทม์

แยก RNA ออกจากตัวกลางทั้งหมดโดยใช้ชุดแยก RNA ของไวรัส MagMAX 96 AI/ND (Ambion, Inc. Austin, TX, USA) ด้วยตัวประมวลผลอนุภาคแม่เหล็ก KingFisher (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ด้วยการดัดแปลงการกำจัดสารยับยั้งที่อธิบายโดย Das et al [44]. RT-PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (rRT-PCR) สำหรับการตรวจจับ NDV ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ยีนเมทริกซ์ (M) ดำเนินการโดยใช้ AgPath-ID ชุด RT-PCR ขั้นตอนเดียว (Ambion) และ ABI 750{{31 }} ระบบ PCR แบบเรียลไทม์ที่รวดเร็ว (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) โดยใช้ไพรเมอร์และโพรบที่ Wise และคณะอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [45]. เงื่อนไขการทดสอบเป็นการถอดรหัสแบบย้อนกลับเป็นเวลา 10 นาทีที่ 45 ◦ซ; เสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นเป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 ◦C; 40 รอบของการเสียสภาพธรรมชาติเป็นเวลา 10 วินาทีที่ 94 ◦C การหลอมไพรเมอร์เป็นเวลา 30 วินาทีที่ 56 ◦C และการยืดตัวของไพรเมอร์เป็นเวลา 10 วินาทีที่ 72 ◦C ปริมาตรรวมของปฏิกิริยาทั้งหมด 25 µL สำหรับแต่ละตัวอย่างประกอบด้วยน้ำเกรดโมเลกุล— 2.5 µL; บัฟเฟอร์ 2X—12.5 µL; ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์—0.25 µL (20pmol/µL); รีเวิร์สไพรเมอร์—0.25 µL (20 pmol/µL); โพรบ—0.50 µL (6pmol/µL); เอนไซม์ผสม 25X—1.0 µL; และเทมเพลต RNA— 8.0 µL สำหรับการหาปริมาณไวรัส มีการกำหนดเส้นโค้งมาตรฐานสำหรับไวรัสแต่ละตัว โดย RNA ที่สกัดจากสต็อกที่ไตเตรทของไวรัสชนิดเดียวกันที่ใช้ในการเพาะเลี้ยงไข่ (สำหรับตัวอย่างไม้กวาดที่เก็บภายหลังการฟัก) หรือไวรัสท้าทาย -ท้าทาย).

รายงานผลเป็น EID50/มล. ขีดจำกัดการตรวจจับด้านล่างที่คำนวณได้ของการสอบวิเคราะห์คือระหว่าง 101.7 และ 101.9 EID50/มล. สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่า rRTPCR ตรวจพบกรดนิวคลีอิกของไวรัส และค่าที่ประมาณไว้ไม่จำเป็นต้องแสดงถึงไวรัสที่ติดเชื้อ ค่า EID50/mL ไม่ได้มีจุดประสงค์เพื่อแสดงการแพร่เชื้อและใช้เพื่อระบุวิธีการเปรียบเทียบสัมพัทธ์ของการแพร่ของไวรัสระหว่างกลุ่มต่างๆ แม้จะใช้โปรโตคอลการสกัดกรดนิวคลีอิกในการกำจัดสารยับยั้ง แต่เทมเพลต RNA ที่มีปริมาณมากอาจส่งผลกระทบต่อการคำนวณจากเส้นโค้งมาตรฐาน โปรดทราบว่า เทมเพลต RNA ในปริมาณที่เท่ากันถูกใช้ในทุกปฏิกิริยา และสารยับยั้งสารตกค้างที่อาจเกิดขึ้นจะส่งผลต่อผลลัพธ์ทั้งหมดอย่างเท่าเทียมกัน

2.7. การทดสอบ HI

Hemagglutination inhibition (HI) assay ใช้เพื่อประเมินการมีอยู่และ titers ของแอนติบอดีในตัวอย่างซีรัมที่เก็บรวบรวมตลอดการทดลอง ตามขั้นตอนมาตรฐาน [46] ไวรัสที่ใช้เป็นแกนหลักสำหรับวัคซีนแต่ละตัวถูกใช้เป็นแอนติเจนสำหรับแต่ละกลุ่มของซีรั่ม (ZJ1*L สำหรับกลุ่ม ZJ1 ทั้งหมด และ LS สำหรับกลุ่ม LS ทั้งหมด) สำหรับตัวอย่างซีรั่มที่รวบรวมหลังการทดสอบ ไวรัส ZJ1 ที่มีความรุนแรงถูกใช้เป็นแอนติเจนในการทดสอบ HI Titers ถูกคำนวณเป็นส่วนกลับของการเจือจางซีรั่ม HI-positive ล่าสุด และตัวอย่างที่มีค่า HI titers of log2 3 และต่ำกว่านั้นถือว่าเป็นค่าลบ

2.8. การวิเคราะห์ทางสถิติ

Prism v.7.03 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล และระบุค่าผิดปกติโดยใช้การทดสอบ ROUT การทดสอบภาวะปกติของ D'Agostino–Pearson ดำเนินการเพื่อประเมินว่าค่าในแต่ละกลุ่มมาจากการแจกแจงแบบเกาส์เซียนหรือไม่ จากการแจกแจงแบบปกติ การทดสอบ Kruskal– Wallis แบบไม่อิงพารามิเตอร์กับการทดสอบหลังเรียนของ Dunn ใช้สำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการระหว่างกลุ่ม สำหรับวัตถุประสงค์ทางสถิติ ตัวอย่าง Swab ทั้งหมดซึ่งตรวจไม่พบไวรัสจะได้รับค่าตัวเลข 1 บันทึกที่ต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับสำหรับไวรัสแต่ละตัว เส้นโค้งการอยู่รอดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้การทดสอบ Log-rank (Mantel–Cox) มีการกำหนดนัยสำคัญทางสถิติที่ค่า p < 0.05

3. ผลลัพธ์

3.1. ความสามารถในการฟัก การอยู่รอดหลังการฟักไข่ และน้ำหนักตัว

การอยู่รอดหลังการฟักสำหรับทุกกลุ่มที่ฟักจากไข่เชิงพาณิชย์แสดงเป็นเส้นโค้งการอยู่รอดในรูปที่ 1 (แยกไว้ในรูปที่ 1A และ B เพื่อความชัดเจนและเพื่อหลีกเลี่ยงความแออัดของกราฟิก) กราฟรวมมีอยู่ในรูปที่เสริม S2 กลุ่มควบคุมการฟัก (ไม่ฉีดวัคซีน) รวมอยู่ในการออกแบบเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีความสามารถในการฟักไข่ที่ผิดปกติหรือการตายหลังการฟักที่ไม่เกี่ยวข้องกับการฉีดวัคซีนของไข่

ตามที่คาดไว้ การตายหลังการฟักที่ต่ำมาก (rHVT-ND) ถึงไม่มี (การฟักไข่และ BHI) ในกลุ่มควบคุมสามกลุ่ม ในทางตรงกันข้าม กลุ่มควบคุม LS มีอัตราการรอดชีวิต 57.1 เปอร์เซ็นต์และ 0 เปอร์เซ็นต์เมื่อใช้ 104.5 และ 105.5 โดสตามลำดับ ซึ่งก่อนหน้านี้มีรายงานสำหรับวัคซีน ND ที่มีชีวิตทั่วไป ไข่สองฟองไม่ฟักในกลุ่ม LS-IL4R 105.5 และไข่หนึ่งฟองไม่ฟักในกลุ่ม LS 104.5 อัตราการตายผันแปรพบได้ในกลุ่มอื่นๆ ขึ้นอยู่กับวัคซีนและปริมาณการฉีดวัคซีน กลุ่ม ZJ1*L-IL4R 104.5 และ 105.5 มีการรอดชีวิต 90.5 เปอร์เซ็นต์ และ 71.4 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ และการรอดชีวิตที่บันทึกไว้ในกลุ่ม ZJ1*L 104.5 และ 105.5 คือ 80.9 เปอร์เซ็นต์ และ 76.2 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ (รูปที่ 1A) แต่ความแตกต่างคือ ไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ การอยู่รอดในกลุ่ม LS-IL4R 103.5 คือ 95.2 เปอร์เซ็นต์ อัตราการรอดชีวิตที่สังเกตได้ในกลุ่ม LS-IL4R 104.5 และ 105.5 คือ 85.7 เปอร์เซ็นต์ และ 66.7 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ (รูปที่ 1B)

ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการรอดชีวิตระหว่างกลุ่มที่ได้รับวัคซีน ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R และ LS-IL4R และกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND แต่เปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตในกลุ่มควบคุมเหล่านี้สูงกว่าตัวเลข โดยมีความสัมพันธ์เชิงลบระหว่างขนาดวัคซีนกับการรอดชีวิตหลังฟัก (การรอดชีวิตเพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณวัคซีนลดลง) กลุ่มควบคุม LS 1{{10}}5.5 มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการอยู่รอดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มทดลอง (ค่า p ระหว่าง 0.0001 และ 0.02) กลุ่มควบคุม LS 104.5 แม้ว่าจะไม่แตกต่างกันทางสถิติ แต่มีอัตราการรอดชีวิตที่ต่ำกว่าอย่างมากเมื่อเทียบกับกลุ่มทดลองที่ได้รับขนาดยาเท่ากัน กลุ่มควบคุม LS สองกลุ่มมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการอยู่รอดเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND (ค่า p ระหว่าง 0.0001 ถึง 0.04) ไม่พบสัญญาณทางคลินิกในกลุ่มใด ๆ หลังการฟักไข่ ในกลุ่มที่มีการตายหลังฟักไข่ พบนกตายจากการตรวจสอบทุกวัน

ชั่งน้ำหนักนกทุกตัวในวันที่ 1, 8 และ 13 หลังฟัก (ตารางที่ 1) ที่ 1 DPH น้ำหนักตัวเฉลี่ยต่อนกในกลุ่มส่วนใหญ่อยู่ระหว่าง 38.5 ถึง 42.6 กรัม (ก.) มีความแตกต่างของน้ำหนักตัวอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง rHVT-ND และ ZJ1*L-IL4R 104.5 กลุ่มจากด้านหนึ่งและ ZJ1*L 104.5 และกลุ่มควบคุม LS 1{{4{{42} }}}4.5 จากอีกกลุ่มหนึ่ง (นกในสองกลุ่มแรกมีน้ำหนักมากกว่านกในกลุ่มควบคุม) (ค่า p ระหว่าง 0.0001 และ 0.017 ตามลำดับ) ที่ 8 DPH กลุ่ม ZJ1*L สองกลุ่มและ LS-IL4R 104.5, กลุ่ม LS-IL4R 105.5 และกลุ่ม LS ควบคุม (น้ำหนักเฉลี่ย 50–63 กรัม) มีน้ำหนักตัวลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับนกจากฟักไข่ กลุ่มควบคุม BHI และ rHVT-ND (น้ำหนักเฉลี่ย 77–82 กรัม) (ค่า p ระหว่าง 0.0001 ถึง 0.03) กลุ่มเดียวกันที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากกลุ่มควบคุมที่ 8 DPH (ยกเว้น LS-IL4R 104.5) มีน้ำหนักตัวต่ำกว่ากลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND อย่างมีนัยสำคัญที่ 13 DPH เช่นกัน (ค่า p ระหว่าง 0.0001 ถึง 0.01) นกจากกลุ่มควบคุม SPF ที่ได้รับการฉีดวัคซีนไม่รวมอยู่ในการเปรียบเทียบนี้ เนื่องจากไข่ SPF (และนกที่ฟักออกจากไข่) มีขนาดเล็กกว่าปกติและเบากว่าไข่ที่ขายตามท้องตลาด

รูปที่ 1 การอยู่รอดของไก่หลังฟักไข่หลังการเพาะเชื้อไข่เชิงพาณิชย์ที่อายุตัวอ่อน 18 วัน โดยทดลองในวัคซีน ovo NDV ไข่ Hy-Line Rockside W-36 ได้รับการฉีดวัคซีนด้วยไวรัสรีคอมบิแนนท์และ LaSota กลุ่มควบคุมสามกลุ่มได้รับการฉีดวัคซีน BHI หรือ rHVT-ND หรือไม่ได้ฉีดวัคซีน (กลุ่มควบคุมฟักไข่) ติดตามนกเป็นเวลา 13 วันหลังฟักไข่ เส้นกราฟการอยู่รอดแสดงเป็นสองตัวเลข: (A) กลุ่มควบคุมและกลุ่ม ZJ1*L และ (B) กลุ่มควบคุมและกลุ่ม LS-IL4R ตัวอักษรตัวยกที่แตกต่างกันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่ม (p-value < 0.05) ตัวย่อของกลุ่ม: HATCH—ไข่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีน; BHI—ไข่ที่ได้รับการฉีดวัคซีน BHI; rHVT-ND—ไข่ที่ฉีดวัคซีน HVT recombinant; ZJ1*L—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยไวรัส ZJ1*L ชนิดรีคอมบิแนนท์ ซึ่งบริเวณรอยแยกถูกแก้ไขให้มีความรุนแรงต่ำ ZJ1*L-IL4R—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วย ZJ1*L ที่มีความรุนแรงต่ำชนิดรีคอมบิแนนท์พร้อมกับใส่ยีนอินเตอร์ลิวคิน-4 ในทิศทางตรงกันข้าม LS—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยสายพันธุ์ LaSota; LS-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วยไวรัส LaSota ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนอินเตอร์ลิวคิน-4 แทรกอยู่ในทิศทางตรงกันข้าม ปริมาณไวรัสที่ไข่ในแต่ละกลุ่มได้รับจะแสดงเป็นตัวเลขตามหลังชื่อกลุ่มใน EID50/ต่อไข่

ตารางที่ 1 น้ำหนักเฉลี่ย (และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน) ของไก่ที่อายุ 1, 8 และ 13 วันหลังฟักไข่หลังฟักไข่เชิงพาณิชย์ ที่อายุ 18 วันของการเลี้ยงตัวอ่อนด้วยวัคซีน ovo และที่ 14 วันหลังการท้าทายด้วยโรคนิวคาสเซิลที่มีความรุนแรง ไวรัส.

3.2. การกำจัดไวรัสวัคซีนหลังการฉีดวัคซีนตามที่สาธิตโดย rRT-PCR

ที่ 2 DPH ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการหลั่งของไวรัสในกลุ่มที่ได้รับวัคซีน (รูปที่ 2A) ในทำนองเดียวกัน ที่ 4 DPH ความแตกต่างระหว่างกลุ่มไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 2B) ไม่พบการแพร่กระจายของไวรัสในนกควบคุม Hatch และ BHI

รูปที่ 2 ค่าเฉลี่ยการหลั่งของวัคซีนหลังการฟักจากไก่ที่ฟักจากไข่เชิงพาณิชย์ที่เพาะเชื้อที่อายุ 18 วันของตัวอ่อนในประเทศที่มีการทดลองในวัคซีน ovo จุดข้อมูลแต่ละจุดแสดงถึงนกหนึ่งตัวและไทเทอร์ NDV ที่ตรวจพบใน oropharyngeal (OP) และ cloacal (CL) swab ในวันหลังฟักไข่ (DPH) ที่ต่างกัน การผลัดขนจะแสดงแยกกันสำหรับ 2 วันหลังฟัก (A) และ 4 วันหลังฟัก (B) แท่งแสดงถึงส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย Swab ทั้งหมดซึ่งตรวจไม่พบไวรัสจะได้รับค่าตัวเลข 1 บันทึกที่ต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับสำหรับไวรัสแต่ละตัวตามลำดับ ขีดจำกัดของการตรวจพบ rRT-PCR แสดงเป็นเส้นประแนวนอน (ใช้ขีดจำกัดต่ำสุด) ตัวย่อของกลุ่ม: HATCH—ไข่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีน; BHI—ไข่ที่ได้รับการฉีดวัคซีน BHI; rHVT-ND—ไข่ที่ฉีดวัคซีน HVT recombinant; ZJ1*L—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยไวรัส ZJ1*L ชนิดรีคอมบิแนนท์ ซึ่งบริเวณรอยแยกถูกแก้ไขให้มีความรุนแรงต่ำ ZJ1*L-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วย ZJ1*L ที่มีความรุนแรงต่ำชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนอินเตอร์ลิวคิน-4 แทรกในทิศทางตรงกันข้าม LS—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยสายพันธุ์ LaSota; LS-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วยไวรัส LaSota ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนอินเตอร์ลิวคิน-4 แทรกอยู่ในทิศทางตรงกันข้าม ปริมาณไวรัสที่ไข่ในแต่ละกลุ่มได้รับจะแสดงเป็นตัวเลขตามหลังชื่อกลุ่มใน EID50/ต่อไข่

3.3. การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายหลังการฟักไข่

การวิเคราะห์ตัวอย่างซีรั่มที่รวบรวมที่ 13 DPH (แถบที่เต็มไปด้วยแถบแนวทแยง) โดยการทดสอบ HI (การตรวจหาแอนติบอดี hemagglutination ต่อ NDV) แสดงในรูปที่ 3 เพื่อสร้าง titer ของแอนติบอดี HI มารดา NDV ที่ถ่ายโอนแบบพาสซีฟในไข่เชิงพาณิชย์ 10 ไก่ถูกไล่ออกทันทีหลังฟัก (0 DPH) HI titers ที่แฮทช์จะแตกต่างกันไประหว่าง log2 5 และ log2 8 โดยมีค่าเฉลี่ยเป็น log2 7.17 (รูปที่ 3 เส้นประแนวนอนสีแดง) แอนติบอดีที่ 13 DPH ในกลุ่ม Hatch, BHI และ rHVT-ND (ค่าเฉลี่ยของ log2 4}.7) เป็นแอนติบอดีของมารดาที่หลงเหลือ เนื่องจากกลุ่มนี้ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนหรือได้รับวัคซีน rHVT-ND ซึ่งไม่ ไม่กระตุ้นแอนติบอดี HI ต่อ NDV ระดับแอนติบอดีในกลุ่ม ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R และ LS 104.5 สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND ไม่พบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มโดสที่แตกต่างกันของวัคซีนที่มีแกนหลักเดียวกัน กลุ่ม LS-IL4R มีระดับ HI หลังการฉีดวัคซีนต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่ม ZJ1*L-IL4R และ ZJ1*L แม้ว่าความแตกต่างเหล่านี้จะไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ ข้อควรทราบ แม้ว่าตัวเลขจะสูงขึ้นเล็กน้อย แต่ค่า HI titers หลังการฉีดวัคซีนของนกในกลุ่ม LS-IL4R ทั้งหมดไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจาก titers ที่วัดได้ในนกที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีนกลุ่มควบคุม

รูปที่ 3 ระดับแอนติบอดี HI ก่อนและหลังการทดสอบ (และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน) จากไก่ที่ฟักจากไข่เชิงพาณิชย์ที่เพาะเลี้ยงในตัวอ่อนอายุ 18 วันด้วยการทดลองในวัคซีน ovo และการทดสอบเริ่มต้นกับไวรัสโรคนิวคาสเซิลที่มีความรุนแรงที่ 14 วันหลังการฟัก แถบที่มีแถบเป็นเส้นทแยงแสดงระดับไทเทอร์ก่อนการท้าทายที่ 13 วันหลังการฟักไข่ แท่งทึบแสดงถึง titers หลังการทดสอบที่ 14 วันหลังการทดสอบ ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มต่างๆ จะแสดงด้วยตัวอักษรพิมพ์เล็กเหนือแต่ละกลุ่ม (p-value<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. สัญญาณทางคลินิกและการอยู่รอดหลังจากเริ่มท้าทายกับ CDV

ในกลุ่มควบคุม สัญญาณทางคลินิกแรกที่ต้องสังเกตคือในกลุ่ม Hatch และ BHI ที่ 3 DPC นกสามตัวในกลุ่ม Hatch และนกหนึ่งตัวในกลุ่ม BHI หายใจลำบาก ที่ 4 DPC, ขนนกที่น่าระทึกใจและการสั่นของศีรษะถูกพบในกลุ่ม BHI และฟัก และที่ 5 DPC ในกลุ่ม rHVT-ND; ในกลุ่มหลังพบ ataxia และ torticollis รุนแรงในนกสองตัว นกในกลุ่มควบคุมฟักแสดงอาการเซื่องซึมที่ 5 DPC และนกสองตัวในกลุ่ม BHI แสดงอาการเป็นอัมพาต ความง่วงและเป็นอัมพาตถูกพบในกลุ่ม rHVT-ND ที่ 6 และ 7 DPC Opisthotonos, torticollis และการหายใจลำบากถูกพบในกลุ่มควบคุม Hatch และ BHI เริ่มต้นที่ 9 DPC ในกลุ่ม rHVT-ND พบ torticollis ได้เร็วถึง 5 DPC การหายใจลำบากและ ataxia เริ่มต้นที่ 6 DPC และ opisthotonos เริ่มที่ 13 DPC จาก DPC 14 ตัว นกทุกตัวยกเว้นนก Hatch สองตัว BHI หนึ่งตัว และนก rHVT-ND สองตัว (ร้อยละ 83.3 ร้อยละ 91.6 และร้อยละ 83.3 ตามลำดับ) ตายหรือมีอาการทางคลินิกทางระบบประสาทอย่างเด่นชัด เช่น ataxia, opisthotonus, torticollis, tremors และเป็นอัมพาต นกที่แสดงอาการทางคลินิกรุนแรง หยุดกินหรือดื่ม หรือยังคงนอนนิ่งอยู่จะถูกการุณยฆาตและรายงานว่าตายในวันถัดไปเพื่อคำนวณเวลารอดชีวิต ไม่มีสัญญาณทางคลินิกถูกสังเกตพบในกลุ่ม ZJ1*L และ ZJ1*L-IL4R ใดๆ อาการทางคลินิกเล็กน้อยของ opisthotonos หรือ torticollis ถูกสังเกตพบในนกตัวเดียว (การป่วยร้อยละ 8.4) ในแต่ละกลุ่ม LS-IL4R และกลุ่ม LS 104.5 ที่ 14 DPC

การรอดชีวิตหลังการทดสอบด้วย ZJ1 NDV ที่มีความรุนแรงแสดงเป็นเส้นกราฟการอยู่รอดในรูปที่ 4 ในขณะที่ทุกกลุ่มที่ฉีดวัคซีน recombinant และ LS แสดงการรอดชีวิต 100 เปอร์เซ็นต์ นกในกลุ่ม Hatch, BHI และ rHVT-ND มี 58.3 เปอร์เซ็นต์ รอดชีวิตร้อยละ 58.3 และ 66.6 ตามลำดับ การอยู่รอดหลังการทดสอบในกลุ่มควบคุม Hatch และ BHI นั้นต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มที่ได้รับวัคซีนทดลอง ข้อควรทราบ แม้ว่าน้ำหนักตัวของนกในกลุ่มที่ได้รับวัคซีนจะผันผวนหลังการฟักเมื่อเทียบกับชุดควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND แต่นกที่ได้รับวัคซีน rNDV ทุกตัว (282–328 กรัม) มีน้ำหนักมากกว่านกที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีน ควบคุมนกหลังความท้าทาย (255–266 ก.) (ตารางที่ 1) อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างของน้ำหนักตัวที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มที่ศึกษา

รูปที่ 4 การอยู่รอดของไก่หลังจากเพาะไข่เชิงพาณิชย์ที่ระยะตัวอ่อน 18 วัน โดยทดลองวัคซีน ovo และทดลองกับไวรัสโรคนิวคาสเซิลระยะเริ่มต้นที่ 14 วันหลังฟักไข่ นกถูกตรวจสอบเป็นเวลา 14 วันหลังการทดสอบ ตัวอักษรตัวยกที่แตกต่างกันบ่งบอกถึงความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่ม (p-value < 0.05) ตัวย่อของกลุ่ม: HATCH—ไข่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีน; BHI—ไข่ที่ได้รับการฉีดวัคซีน BHI; rHVT-ND—ไข่ที่ฉีดวัคซีน HVT recombinant; ZJ1*L—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยไวรัส ZJ1*L ชนิดรีคอมบิแนนท์ ซึ่งบริเวณรอยแยกถูกแก้ไขให้มีความรุนแรงต่ำ ZJ1*L-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วย ZJ1*L ที่มีความรุนแรงต่ำชนิดรีคอมบิแนนท์พร้อมกับใส่ยีนอินเตอร์ลิวคิน-4 ในทิศทางตรงกันข้าม LS—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยสายพันธุ์ LaSota; LS-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วยไวรัส LaSota ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนอินเตอร์ลิวคิน-4 แทรกอยู่ในทิศทางตรงกันข้าม ปริมาณไวรัสที่ไข่ในแต่ละกลุ่มได้รับจะแสดงเป็นตัวเลขตามหลังชื่อกลุ่มใน EID50/ต่อไข่

3.5. กำจัดความท้าทายหลังการพิสูจน์โดย rRT-PCR

ที่ 2 DPC นกในกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND จะหลั่งระดับไวรัสสูง (1{{20}}5.3−5.7 EID50/mL) ทางปาก ขณะที่ทุกกลุ่มที่ได้รับวัคซีน มีค่า titers เฉลี่ยของการไหลออกต่ำกว่า 104 EID50/mL (รูปที่ 5A) ผลลัพธ์ของการแพร่กระจายของไวรัสผ่าน Cloaca ต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับของการทดสอบในทุกกลุ่ม ที่ 2 DPC นกในกลุ่ม ZJ1*L และ ZJ1*L-IL4R ทั้งหมดและนกในกลุ่ม LS-IL4R 105.5 มีการตรวจพบ RNA ของไวรัสผ่านทางปากน้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND (ค่า p อยู่ระหว่าง 0.001 ถึง 0.02) ที่ 4 DPC การไหลออกทางปากในกลุ่ม Hatch, BHI และ rHVT-ND อยู่ในระดับสูง (106.2−6.9 EID50/mL) (รูปที่ 5B)

ในทางตรงกันข้าม มีการสังเกตการหลั่งน้อยลงในทุกกลุ่มวัคซีนที่ 4 DPC เมื่อเทียบกับ 2 DPC โดยมีค่าเฉลี่ย titer สูงสุดที่ 102.9 EID50/mL ในกลุ่ม ZJ1*L 104.5 และ titer เฉลี่ยต่ำสุดที่ 101.5 EID50/mL ในกลุ่ม ZJ1* กลุ่ม l-IL4R 104.5 (ตรวจไม่พบ RNA ของไวรัสในนกบางตัว) กลุ่มที่ได้รับวัคซีน rNDV ทดลองทั้งหมดจะหลั่งไวรัสน้อยลงอย่างมีนัยสำคัญทางปากเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND (ค่า p จาก<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

รูปที่ 5 ค่าเฉลี่ยการหลั่งของไวรัสหลังการทดสอบจากไก่หลังการเพาะเชื้อไข่เชิงพาณิชย์ที่อายุ 18 วันของการเลี้ยงตัวอ่อนด้วยการทดลองในวัคซีน ovo และการทดสอบระยะแรกกับไวรัสโรคนิวคาสเซิลที่มีความรุนแรงที่ 14 วันหลังฟัก จุดข้อมูลแต่ละจุดแสดงถึงไทเทอร์ NDV ที่ตรวจพบใน oropharyngeal (OP) และ cloacal (CL) swab ในวันหลังการทดสอบ (DPC) ที่ต่างกัน การปลดจะนำเสนอแยกกันเป็นเวลา 2 วันหลังการแข่งขัน (A) และ 4 วันหลังการแข่งขัน (B) แท่งแสดงถึงส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย การเก็บตัวอย่างทั้งหมดซึ่งตรวจไม่พบไวรัสจะได้รับค่าตัวเลข 1 บันทึกที่ต่ำกว่าขีดจำกัดการตรวจจับ ขีดจำกัดการตรวจพบ rRT-PCR แสดงเป็นเส้นประแนวนอน

ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างกลุ่มต่างๆ จะแสดงด้วยตัวอักษรพิมพ์เล็กเหนือแต่ละกลุ่ม (p-value < 0.05) ตัวย่อของกลุ่ม: HATCH—ไข่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีน; BHI—ไข่ที่ได้รับการฉีดวัคซีน BHI; rHVT-ND—ไข่ที่ฉีดวัคซีน HVT recombinant; ZJ1*L—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยไวรัส ZJ1*L ชนิดรีคอมบิแนนท์ ซึ่งบริเวณรอยแยกถูกแก้ไขให้มีความรุนแรงต่ำ ZJ1*L-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วย ZJ1*L ที่มีความรุนแรงต่ำชนิดรีคอมบิแนนท์พร้อมกับใส่ยีนอินเตอร์ลิวคิน-4 ในทิศทางตรงกันข้าม LS—ไข่ที่ฉีดวัคซีนด้วยสายพันธุ์ LaSota; LS-IL4R—ไข่ที่เพาะเชื้อด้วยไวรัส LaSota ชนิดรีคอมบิแนนท์ที่มียีนอินเตอร์ลิวคิน-4 แทรกในทิศทางตรงกันข้าม ปริมาณไวรัสที่ไข่ในแต่ละกลุ่มได้รับจะแสดงเป็นตัวเลขตามหลังชื่อกลุ่มใน EID50/ต่อไข่

3.6. เซโรโลยีหลังความท้าทาย

นกทุกตัวในกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND แสดงระดับ HI-antibody เพิ่มขึ้น (มากกว่าสองเท่า) ที่ 14 DPC (เหนือบันทึก2 10) เมื่อเทียบกับระดับก่อนการทดสอบที่ 13 DPH (บันทึก{ {6}}.7). ความแตกต่างของ titers ในทั้งสามกลุ่มนี้ก่อนและหลังการทดสอบมีนัยสำคัญ (p-value<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. กลุ่มควบคุม SPF ที่ได้รับการฉีดวัคซีน

การอยู่รอดในกลุ่มควบคุม SPF หลังฟักไข่คือ 66.7 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มที่ฉีดวัคซีน ZJ1*L 103.5 และ 57.1 เปอร์เซ็นต์ในกลุ่มที่ฉีดวัคซีน ZJ1*L-IL4R 103.5 (รูปที่ S3A เพิ่มเติม) ตรวจพบการแพร่กระจายของไวรัสที่ใช้งานอยู่ในนกในกลุ่มควบคุม SPF ผ่านทั้งสองเส้นทางโดยตรวจพบ titers ที่สูงขึ้นในตัวอย่างไม้กวาดของ oropharyngeal (ดูรูปที่ S3B เพิ่มเติม) ค่าไตเตอร์ HI หลังการฉีดวัคซีนของนกควบคุม SPF ที่ได้รับการฉีดวัคซีนสูงกว่าค่าไตเตอร์ในกลุ่มควบคุม Hatch, BHI และ rHVT-ND และถึงค่าเฉลี่ยของ log2 7.08 และ log2 7 58 ที่ 13 DPH ในกลุ่ม ZJ1*L-IL4R 103.5 และ ZJ1*L-IL4R 103.5 ตามลำดับ (ดูรูปเพิ่มเติม S3C) ไม่พบสัญญาณทางคลินิกหรือการตายหลังการท้าทายในกลุ่มควบคุม SPF ที่ได้รับการฉีดวัคซีนทั้งสองกลุ่ม (ดูรูปเพิ่มเติม S3D สำหรับเส้นโค้งการอยู่รอด) นกจากกลุ่มควบคุมที่ได้รับวัคซีน SPF จะหลั่งไวรัสทางปากน้อยกว่าอย่างมีนัยสำคัญที่ 2 DPC และ 4 DPC เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ค่า p จาก<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com