Norwogonin ช่วยลดความเครียดที่เกิดจากออกซิเจนและการตายของเซลล์ในเซลล์ PC12

สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม:ali.ma@wecistanche.com

เชิงนามธรรม

ความเป็นมา: Norwogonin เป็นฟลาโวนธรรมชาติที่มีกลุ่มฟีนอลิกไฮดรอกซิลสามกลุ่มในโครงสร้างโครงกระดูกและมีคุณสมบัติที่ดีเยี่ยมสารต้านอนุมูลอิสระกิจกรรม. อย่างไรก็ตาม ฤทธิ์ป้องกันระบบประสาทของนอร์โวโกนินยังคงไม่ชัดเจน ที่นี่ เราตรวจสอบความสามารถในการป้องกันของนอร์โวโกนินต่อความเสียหายจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจากการขาดออกซิเจนในเซลล์ PC12 วิธีการ: ตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์และการตายของเซลล์โดยวิธี MTT assay และการย้อมสี Annexin V-FITC/PI ตามลำดับ ปริมาณของชนิดออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา (ROS) ถูกวัดโดยใช้การสอบวิเคราะห์ DCFH-DA แลคเตท ดีไฮโดรจีเนส (LDH), มาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) และสารต้านอนุมูลอิสระระดับเอนไซม์ถูกกำหนดโดยใช้ชุดเครื่องมือทางการค้า การแสดงออกของยีนและโปรตีนที่เกี่ยวข้องถูกวัดโดย PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์และ Western blotting ตามลำดับ ผลลัพธ์: เราพบว่า norwogonin บรรเทาการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจนในเซลล์ PC12 โดยเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์ ลดการปล่อย LDH และทำให้การเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของเซลล์ดีขึ้น Norwogonin ยังทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระโดยการกำจัด ROS, ลดการผลิต MDA, รักษากิจกรรมของซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD), คาตาเลส (CAT) และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GPx) และลดระดับการแสดงออกของ HIF-1 และ VEGF นอกจากนี้ โวโกนินยังป้องกันการตายของเซลล์โดยการยับยั้งระดับการแสดงออกของแคสเปส-3, ไซโตโครมซี และแบ็กซ์ ในขณะที่เพิ่มระดับการแสดงออกของ Bcl-2 และอัตราส่วนของ Bcl-2/Bax สรุป: Norwogonin ช่วยลดอาการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจนในเซลล์ PC12 โดยการดับ ROS โดยคงไว้ซึ่งกิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระเอ็นไซม์ และยับยั้งวิถีอะพอพโทซิสของไมโตคอนเดรีย

คำสำคัญ: นอร์โวโกนิน,ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ, ภาวะขาดออกซิเจน, ความเครียดออกซิเดชัน, การตายของเซลล์

พื้นหลัง

สิ่งมีชีวิตแบบแอโรบิกต้องการออกซิเจน (O2) เพื่อผลิตพลังงาน ภาวะขาดออกซิเจนถูกกำหนดให้เป็นปริมาณ O2 ที่ไม่เพียงพอต่อการรักษาการทำงานของเซลล์ในเนื้อเยื่อ และมักเกิดขึ้นในสถานการณ์ทางสรีรวิทยาบางอย่าง เช่น ระดับความสูง [1] และในสถานการณ์ทางพยาธิวิทยาหลายอย่าง เช่น โรคหลอดเลือดสมอง [2] สมองมีความอ่อนไหวเป็นพิเศษต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจนเนื่องจากการใช้ออกซิเจนสูง อุดมไปด้วยกรดไขมันไม่อิ่มตัว และต่ำสารต้านอนุมูลอิสระความจุ [3] หลักฐานที่เพิ่มขึ้นบ่งชี้ว่าการขาดออกซิเจนสามารถทำให้เกิดผลเสียต่อสมอง [4–6]

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia และ Huiping Ma

Department of Pharmacy, 940th Hospital of Joint Logistics Supportforce of PLA, หลานโจว 730050, กานซู่, จีน

ความเครียดออกซิเดชันและการตายของเซลล์ถือเป็นปัจจัยสองประการในการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจน [7, 8] มีรายงานการสัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจนเพื่อเพิ่มการผลิตออกซิเจนชนิดปฏิกิริยาภายในเซลล์ (ROS) ซึ่งช่วยให้เกิดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน ROS ที่มากเกินไป เช่น ซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน (O2−˙ ), ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) และไฮดรอกซิลเรดิคัล (H2O•) นำไปสู่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างและการทำงานของเซลล์โดยโจมตีไขมัน เยื่อหุ้ม โปรตีน และ DNA และต่อมาทำให้เซลล์เสียหาย [ 9].

Click to Cistanches สำหรับสารต้านอนุมูลอิสระ

ในขณะเดียวกัน ROS ที่ผลิตมากเกินไปยังช่วยอำนวยความสะดวกในการเปิดรูพรุนการเปลี่ยนผ่านของยล (mPTP) [10] และถ่ายโอนโปรตีนโปรอะพอพโทซิสไปยังเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียชั้นนอก ซึ่งทำให้เกิดการสลับขั้วของเยื่อไมโทคอนเดรียและการปล่อยไซโตโครมค [11] การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ทำให้เกิดอะพอพโทซิสที่ขึ้นกับไมโตคอนเดรียในที่สุด [12] จึงเชื่อกันว่าสารต้านอนุมูลอิสระด้วยความสามารถในการยับยั้งหรือขจัด ROS ที่มากเกินไปอาจใช้ผลการป้องกันผ่านการลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน จากการศึกษาจำนวนมากได้พิสูจน์แล้วว่าสารต้านอนุมูลอิสระอาหารเสริม เช่น วิตามินซี [13] ไอโซฟลาโวน [8] และอนุมูลไนตรอกไซด์ [14] สามารถจำกัดการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจนในหลอดทดลองและในร่างกายได้ ฟลาโวนอยด์เป็นกลุ่มเมตาโบไลต์ทุติยภูมิของพืชที่แพร่หลายและหลากหลาย ถือว่าเป็นธรรมชาติที่ยอดเยี่ยมเสมอสารต้านอนุมูลอิสระด้วยความสามารถในการขับอนุมูลอิสระและยับยั้งการเกิด lipid peroxidation

ปัจจุบันได้รับความสนใจมากขึ้นเรื่อย ๆ กับสารประกอบประเภทนี้เนื่องจากผลประโยชน์ต่อสุขภาพของมนุษย์ สารฟลาโวนอยด์แสดงให้เห็นว่ามีฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาที่หลากหลาย เช่น ฤทธิ์ต้านการอักเสบ ต้านโนซิเซ็ปทีฟ และป้องกันระบบประสาท เป็นต้น ซึ่งทั้งหมดนี้อาจมีสาเหตุมาจากฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของฟลาโวนอยด์ [15] การศึกษาจำนวนมากระบุว่าฟลาโวนอยด์มีผลป้องกันที่ดีเยี่ยมต่อความล้มเหลวที่เกิดจากการขาดออกซิเจน ตัวอย่างเช่น รูตินมีผลป้องกันระบบประสาทอย่างรุนแรงต่อการตายของเซลล์ปมประสาทเรตินอลที่เกิดจากการขาดออกซิเจน [16] การศึกษาล่าสุดยังแสดงให้เห็นว่ารูตินสามารถบรรเทาความเสียหายจากการขาดออกซิเจนที่เกิดจากโคบอลต์คลอไรด์ได้โดยการยับยั้งความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์ในเซลล์ H9c2 [17] นอกจากนี้ Liu et al แนะนำว่า nobiletin (3′,4′,5,6, 7,8-hexamethoxy flavone) ช่วยลดอาการบาดเจ็บของ I/R ของกล้ามเนื้อหัวใจด้วยการเปิดใช้งานวิถี Akt/GSK-3 ในเซลล์ H9c2 [18]. นอกจากนี้ อะคาซิตินยังสามารถปกป้องคาร์ดิโอไมโอไซต์ของหนูและคาร์ดิโอไมโอบลาสต์ H9C2 จากการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจน/ออกซิเจนอีกครั้งผ่านการกระตุ้นด้วย AMPK ของเส้นทางการส่งสัญญาณ Nrf2 [19]

Norwogonin (5,7,8-trihydroxy flavone, รูปที่ 1) เป็นฟลาโวนที่ออกฤทธิ์ทางเภสัชวิทยาที่แยกออกจากรากของ Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" ในภาษาจีน) ซึ่งเป็นสมุนไพรจีนโบราณที่ใช้รักษาโรคไข้หวัดใหญ่และมะเร็ง [20, 21]. อย่างไรก็ตาม มีรายงานการศึกษาที่จำกัดเกี่ยวกับกิจกรรมทางชีววิทยาของนอร์โวโกนิน เนื่องจากมีระดับต่ำในพืชธรรมชาติ เพื่อแก้ไขปัญหานี้ มีการรายงานวิธีการสังเคราะห์นอร์โวโกนินหลายวิธี [22, 23]

การศึกษาก่อนหน้านี้ของเรายังได้กำหนดวิธีง่ายๆ ในการรับนอร์โวโกนินจากไครซินในสี่ขั้นตอน [24] งานวิจัยเหล่านี้มีผลในเชิงบวกต่อการประเมินกิจกรรมทางชีววิทยาของ norwogonin ต่อไป จากการศึกษาพบว่า norwogonin มีสารต้านอนุมูลอิสระ [25] ต้านมะเร็ง [26, 27] ต้านไวรัส [28] และกิจกรรมต้านจุลชีพ [29] รวมทั้งยับยั้งการผลิตไซยาไนด์ที่กระตุ้นด้วย ROS [30] อย่างไรก็ตาม ไม่ว่า norwogonin จะมีความสามารถในการป้องกันการบาดเจ็บที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจนหรือไม่ จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือเพื่อตรวจสอบผลการป้องกันของนอร์โวโกนินต่อความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันและการตายของเซลล์ PC12 ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน

วิธีการ

วัสดุและรีเอเจนต์

Norwogonin (ความบริสุทธิ์ มากกว่าหรือเท่ากับ 98 เปอร์เซ็นต์ ) ถูกสังเคราะห์ตามวิธีการที่เรารายงานไว้ก่อนหน้านี้ [24] Rutin (ความบริสุทธิ์ มากกว่าหรือเท่ากับ 96 เปอร์เซ็นต์ ) ซื้อมาจาก Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (ซีอาน ชานซี ประเทศจีน) Norwogonin และรูตินถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ปลอดเชื้อ (DMSO) เก็บไว้ที่ -20 องศา และเจือจางในตัวกลางสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ทันทีก่อนใช้งาน สื่อโฆษณา Eagle's modified (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin และ penicillin ของ Dulbecco ซื้อมาจาก Solarbio co., Ltd. (ปักกิ่ง ประเทศจีน)

ชุดเครื่องมือของมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA), แลคเตทดีไฮโดรจีเนส (LDH), ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเตส (SOD), คาตาเลส (CAT) และกลูตาไธโอนเปอร์ออกซิเดส (GPx) ได้รับจากสถาบัน Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (มณฑลเจียงซู ประเทศจีน) 2′,7′-ไดคลอไรด์-ไฮโดรฟลูออเรสซีน ไดอะซีเตต (DCFH-DA) และ (3-(4,5-ไดเมทิลไธอะซอล-2-อิล)-2,5- ไดฟีนิลเตตราโซเลียม bromide) tetrazolium (MTT) ได้มาจาก Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA) แอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน-1 (HIF-1 ), ปัจจัยการเจริญเติบโตของบุผนังหลอดเลือดในหลอดเลือด (VEGF), มะเร็งต่อมน้ำเหลืองบีเซลล์-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} โปรตีน X ที่เกี่ยวข้อง (Bax), Caspase-3, Cytochrome C และ -actin ทั้งหมดถูกซื้อจาก Abcam (Cambridge, UK) ได้รับแอนติบอดีทุติยภูมิจากบริษัท ZsBio (ปักกิ่ง ประเทศจีน)

ชุดวิเคราะห์การตายของเซลล์ได้มาจากสถาบันเทคโนโลยีชีวภาพ Beyotime (มณฑลเจียงซู ประเทศจีน) สารเคมีและตัวทำละลายทั้งหมดมีระดับการวิเคราะห์และได้มาจากซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์ในประเทศจีน การเพาะเลี้ยงเซลล์ เซลล์ PC12 ถูกซื้อจาก Cell Bank ของ Chinese Academy of Sciences (TCR 9, Shanghai, China) และคงสภาพใน DMEM โดยมี FBS 10 เปอร์เซ็นต์ (v/v), 100 U/ mL penicillin และ 100 U/mL streptomycins ที่ 37 องศาในตู้อบที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เพื่อประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์ของนอร์โวโกนิน เซลล์ PC12 (ตอน 4 ~ 6) ถูกฟักไข่ล่วงหน้าด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (10− 8 , 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 โมล/ลิตร) ของหรือโวโกนินสำหรับ 1 ชม. แล้วเลี้ยง 24 ชม. การสัมผัสกับภาวะขาดออกซิเจน เพื่อกระตุ้นรูปแบบการบาดเจ็บของเซลล์ขาดออกซิเจน เซลล์ PC12 ต้องอยู่ภายใต้สภาพแวดล้อมที่ขาดออกซิเจน (1 เปอร์เซ็นต์ O2, 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 และ 94 เปอร์เซ็นต์ N2) ที่ 37 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในห้องที่มีความชื้น เซลล์ควบคุมนอร์ม็อกซิกถูกเพาะเลี้ยงที่ 37 องศาในตู้บ่ม CO2 5 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง

เพื่อประเมินผลการป้องกันของนอร์โวโกนินต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจน เซลล์ PC12 ถูกบ่มล่วงหน้าด้วยความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 โมล/ L) นอร์โวโกนินเป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนการรักษาภาวะขาดออกซิเจน ความมีชีวิตของเซลล์ ความมีชีวิตของเซลล์ถูกวัดโดยการทดสอบ MTT ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [31] โดยสรุป เซลล์ PC12 (1 × 105 เซลล์/ มล.) ถูกเพาะในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุม จากนั้นจึงเติมนอร์โวโกนินความเข้มข้นต่างๆ ลงในบ่อ เพิ่มปริมาตรที่เท่ากันของ DMSO ลงในหลุมควบคุม ความเข้มข้นสุดท้ายของ DMSO ในอาหารเลี้ยงเซลล์คือ 0.1 เปอร์เซ็นต์ หลังจากการฟักไข่ที่สภาวะปกติหรือภาวะขาดออกซิเจน MTT 10 ไมโครลิตร (5.0 มก./มล.) ถูกเติมในแต่ละหลุม ตามด้วยการบ่มที่ 37 องศาเป็นเวลา 4 ชั่วโมง จากนั้น นำส่วนลอยเหนือตะกอนที่มี MTT ออกและผลิตภัณฑ์ฟอร์มาซานถูกละลายใน 100 ไมโครลิตร DMSO วัดค่าการดูดกลืนแสงบนเครื่องอ่านไมโครเพลท SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) ที่ 570 nm ผลลัพธ์แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์สัมพัทธ์ของกลุ่มควบคุม เซลล์ PC12 ที่ย้อมด้วยฮีมาทอกซิลินและอีโอซิน (HE) ที่เพาะบนฝาครอบแก้วถูกบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนที่พวกมันจะถูกบำบัดด้วยนอร์โวโกนินในลักษณะเดียวกับที่อธิบายไว้ข้างต้น

นำสื่อออกและล้างฝาครอบแก้วด้วย PBS เย็น ตามด้วยตรึงด้วยเมทานอลเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างด้วย PBS เย็น 3 ครั้งเป็นเวลา 5 นาที ในที่สุด เซลล์ถูกย้อมตามโปรโตคอลการย้อมสี HE [32] การวิเคราะห์เซลล์ดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ OLYMPUS IX73 (100×) เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ ได้ภาพดิจิทัลโดยใช้กล้องดิจิตอล DXM 1200 C (Nikon) ที่เกี่ยวข้องกับกล้องจุลทรรศน์ เนื้อหา ROS ระดับ ROS ภายในเซลล์ในเซลล์ PC12 ถูกกำหนดหาโดยใช้การทดสอบ DCFH-DA [33] โดยย่อ เซลล์ PC12 (1 × 105 เซลล์/มล.) ถูกเพาะในเพลต 6-หลุม หลังการบำบัดภาวะขาดออกซิเจน เซลล์ PC12 ถูกล้างด้วย PBS จากนั้นจึงฟักตัวในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี DCFH-DA 10 ไมโครเมตร เป็นเวลา 30 นาทีในความมืดที่ 37 องศา เซลล์ถูกสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงแบบกลับหัวของโอลิมปัส (โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) และได้รับการวิเคราะห์โดยเครื่องวัดการไหลของไซโตมิเตอร์ FACScan Bec ton Dickinson (BD Biosciences, CA, USA) ที่มีความยาวคลื่นกระตุ้น 488 นาโนเมตร และความยาวคลื่นการปล่อย 525 นาโนเมตร ระดับ ROS แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์สัมพัทธ์ของการควบคุม การรั่วไหลของ LDH, ปริมาณ MDA และการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ PC12 เซลล์ (1 × 105 เซลล์/มล.) ถูกเพาะในจานขนาด 90 มม. หลังจากการบำบัดภาวะขาดออกซิเจนตามที่อธิบายไว้ข้างต้น จะมีการเก็บรวบรวมส่วนลอยเหนือตะกอนของวัฒนธรรม 50 ไมโครลิตรจากแต่ละจาน และตรวจพบกิจกรรมของ LDH ในอาหารโดยใช้ชุดทดสอบเชิงพาณิชย์ (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China) และแสดงเป็น U/mL เซลล์ PC12 ถูกเก็บเกี่ยวและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันหลังจากล้างสองครั้งด้วย PBS เย็น ความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดวัดโดยชุดทดสอบโปรตีน BCA ปริมาณ MDA และกิจกรรมของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระถูกกำหนดโดยใช้ชุดทดสอบเชิงพาณิชย์ (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, China)

เนื้อหาของ MDA ถูกนำเสนอเป็นโปรตีน nmol/mg กิจกรรมของ SOD, CAT และ GPx ถูกนำเสนอเป็นโปรตีน U/mg การตายของเซลล์ (การย้อมสี Annexin-V/PI) หลังจากการบำบัดภาวะขาดออกซิเจน เซลล์ PC12 จะถูกเก็บเกี่ยว ล้างสองครั้งด้วย PBS เย็น จากนั้นแขวนไว้ด้วยบัฟเฟอร์การยึดเกาะ เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยโซลูชัน Annexin V-FITC และ PI ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Beyotime, Shanghai, China) เก็บรวบรวมข้อมูลโดยใช้เครื่องวัดอัตราการไหล FACScan ของ Becton Dickinson (BD Biosciences, CA, USA) การวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ RNA ทั้งหมดของเซลล์ PC12 ถูกสกัดโดยใช้รีเอเจนต์ Trizol (Takara, Dalian, China) และแปลงเป็น cDNA โดยใช้ PrimeScript TM RT reagent Kit (AK4301,

ทาการะ ต้าเหลียน ประเทศจีน) ยีนซึ่งเข้ารหัส cDNA HIF-1 , VEGF, Bcl-2, Bax, caspase-3, cytochrome C และ glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนส (GAPDH) ถูกขยายโดยจำนวนจริงเชิงปริมาณ time PCR โดยใช้ระบบตรวจจับแบบเรียลไทม์ 7300 (Applied Biosystems, CA, USA) ไพรเมอร์ที่ใช้แสดงในตารางที่ 1 สภาพการปั่นจักรยาน PCR คือ 95 องศาเป็นเวลา 30 วินาที ตามด้วย 40 รอบที่ 95 องศาเป็นเวลา 5 วินาที และ 60 องศาเป็นเวลา 31 วินาที ระดับ mRNA คำนวณโดยใช้วิธี 2-ΔΔCt และปรับให้เป็นมาตรฐานเป็น GAPDH ซึ่งเป็นยีนอ้างอิง เซลล์ Western blot PC12 ถูกเก็บเกี่ยวและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในสาร RIPA ความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดถูกหาปริมาณโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน BCA ตัวอย่าง 30 ไมโครกรัมได้รับการแก้ไขบนอิเล็กโตรโฟรีซิส SDS-PAGE 12 เปอร์เซ็นต์ จากนั้นถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA)

เยื่อหุ้มถูกปิดกั้นด้วยนมแห้งที่ไม่มีไขมัน 5 เปอร์เซ็นต์ในบัฟเฟอร์ TBST เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ: แอนติ-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, สหราชอาณาจักร), ต่อต้าน VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, สหราชอาณาจักร), ต่อต้าน Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, สหราชอาณาจักร), ต่อต้าน Bax (1:500, ab32503, Abcam, สหราชอาณาจักร), แอนติ caspase-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), แอนติ cytochrome C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) และสารต้าน- -actin (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) ที่ 4 องศาในชั่วข้ามคืน จากนั้น เยื่อหุ้มถูกล้างและบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (1:2000, ZsBio, Beijing, China;) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง แถบอิมมูโนปฏิกิริยาได้รับการแสดงภาพโดยใช้รีเอเจนต์เคมีลูมิเนสเซนส์ที่ได้รับการปรับปรุง (ECL) ความเข้มสัมพัทธ์ของแถบความถี่ถูกปรับให้เป็นมาตรฐานสำหรับการควบคุมภายใน -actin และวิเคราะห์โดยใช้ Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA)

การวิเคราะห์ทางสถิติ

ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นค่าเฉลี่ย± SD ที่ได้มาจากการทดลองอิสระอย่างน้อยสามครั้ง วิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบหลังเฉพาะกิจของ Student–Newman– Keuls ค่า P ที่ < 0.05="">

ผลลัพธ์

Norwogonin ป้องกันเซลล์ PC12 จากการบาดเจ็บที่เกิดจากการขาดออกซิเจน

อย่างแรก เพื่อขัดขวางการงอกขยายของนอร์โวโกนิน ความเป็นพิษต่อเซลล์ของมันบนเซลล์ PC12 ปกติถูกกำหนดหาโดยใช้การสอบวิเคราะห์ MTT ดังที่เห็นในรูปที่ 2a การเพิ่มจำนวนเซลล์ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญหลังการรักษาด้วยนอร์โวโกนินที่ความเข้มข้น 1 × 10− 8 -1 × 10− 5 โมล/ลิตร (P > 0.05 ). อย่างไรก็ตาม ความมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อความเข้มข้นของนอร์โวโกนินเพิ่มขึ้นเป็น 1 × 10− 4 โมล/ลิตร (P < 0.05)="" ผลการวิจัยพบว่า="" norwogonin="" ไม่แสดงความเป็นพิษหรือมีฤทธิ์ในการงอกขยายของเซลล์="" pc12="" ที่ความเข้มข้น="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

จากนั้นเราตรวจสอบผลการป้องกันของ norwogonin ต่อการบาดเจ็บของเซลล์ PC12 ที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน ดังแสดงในรูปที่ 2b เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ความมีชีวิตของเซลล์ในกลุ่มที่ขาดออกซิเจนลดลงเหลือ 58.71 เปอร์เซ็นต์ (P < 0.01)="" เมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาภาวะขาดออกซิเจน="" ก่อนการบำบัดด้วย="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" ,="" และ="" 1="" ×="" 10−="" 6="" โมล/ลิตร="" norwogonin="" ที่ได้รับการป้องกันแบบขึ้นกับขนาดยา="" pc12="" เซลล์ต่อการบาดเจ็บที่เกิดจากภาวะขาดออกซิเจน="" ฟื้นความมีชีวิตของเซลล์จาก="" 58.71="" เป็น="" 62.79="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.05),="" 66.68="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.01)="" และ="" 69.88="" เปอร์เซ็นต์="" (p="">< 0.01)="" ตามลำดับ="" การปรับสภาพด้วยรูติน="" 1="" ×="" 10−="" 6="" โมล/ลิตร="" ยังแสดงผลในการป้องกัน="" โดยเพิ่มความมีชีวิตของเซลล์เป็น="" 63.78="" เปอร์เซ็นต์="" เมื่อเทียบกับการรักษาภาวะขาดออกซิเจน="" ความมีชีวิตที่บำบัดด้วยนอร์โวโกนิน="" 1="" ×="" 10−="" 5="" โมล/ลิตร="" ลดลงเหลือ="" 63.43="" เปอร์เซ็นต์="" ซึ่งยังคงสูงกว่าในกลุ่มที่ขาดออกซิเจนอย่างมีนัยสำคัญ="" (p="">< 0.05)="" ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่านอร์โวโกนินแสดง="" cytoprotection="" อย่างมีนัยสำคัญที่ความเข้มข้น="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" โมล/ลิตร="" และความเข้มข้นที่มีประสิทธิผลมากที่สุดคือ="" 1="" ×="" 10−="" 6="" โมล/ลิตร="">

ความสามารถในการป้องกันของนอร์โวโกนินยังได้รับการยืนยันโดยการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยา ดังแสดงในรูปที่ 2c เซลล์ PC12 ที่ไม่มีการรักษาภาวะขาดออกซิเจนเติบโตได้ดีด้วยรูปร่างปกติ (fusiform) ขนาดสม่ำเสมอ หลังจากได้รับภาวะขาดออกซิเจน เซลล์ PC12 มีการหดตัว รูปร่างโค้งมน ลอกออก และความหนาแน่นของเซลล์ลดลง เซลล์ที่ปรับสภาพด้วยนอร์โวโกนินหรือรูตินก่อนได้รับออกซิเจนในเลือดจะดีขึ้น จำนวนเซลล์ที่ลอกออกลดลง และรูปร่างของเซลล์ฟื้นตัวตามปกติ นอกจากนี้ ความสามารถในการป้องกันของนอร์โวโกนินยังได้รับการยืนยันโดยการรั่วไหลของ LDH ซึ่งสัมพันธ์กับการสูญเสียความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ ดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 2d การมีฤทธิ์ของ LDH ในอาหารเลี้ยงเชื้อเพิ่มขึ้นอย่างเด่นชัดหลังการได้รับออกซิเจน (P <>

การปรับสภาพด้วยนอร์โวโกนินหรือรูตินช่วยลดการรั่วไหลของ LDH ได้อย่างมาก ซึ่งบ่งชี้ว่านอร์โวโกนินและรูตินช่วยฟื้นฟูความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ Norwogonin ยับยั้งความเครียดของสารออกซิแดนท์ที่เกิดจากการขาดออกซิเจนในเซลล์ PC12 ROS และ MDA เป็นตัวชี้วัดที่สำคัญสองประการของความเครียดจากการเกิดออกซิเดชันของเซลล์ที่เกิดจากการขาดออกซิเจน ดังที่แสดงในรูปที่ 3a และ b พบว่ามีเนื้อหาเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ ROS และ MDA ในเซลล์ PC12 หลังการสัมผัสขาดออกซิเจน Norwogonin หรือการปรับสภาพรูตินยับยั้งการผลิต ROS และ MDA อย่างมีนัยสำคัญ

เอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เช่น SOD, CAT และ GPx ถือเป็นระบบป้องกันหลักจากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันในเซลล์ ดังที่แสดงในรูปที่ 3c-e การได้รับออกซิเจนจากออกซิเจนยับยั้งกิจกรรมของ SOD, CAT และ GPx ในเซลล์ PC12 อย่างมีนัยสำคัญ การรักษาด้วยนอร์โวโกนินหรือรูตินช่วยพลิกการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้และฟื้นฟูการทำงานของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ ผลลัพธ์ทั้งหมดเหล่านี้บ่งชี้ว่า norwogonin ปกป้องเซลล์ PC12 จากความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจากการขาดออกซิเจน