Natalenamides A–C, Cyclic Tripeptides จาก Actinomadura Sp. ที่เกี่ยวข้องกับปลวก อาร์บี99
Mar 22, 2023
เชิงนามธรรม:
ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา การตรวจสอบทางชีวเคมีของแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับแมลงได้เพิ่มมากขึ้น เมื่อรวมกับกระบวนการแยกการทำซ้ำเชิงวิเคราะห์ การศึกษาเหล่านี้ให้กลยุทธ์ที่มีประสิทธิภาพในการระบุสารประกอบเชิงโครงสร้างและ/หรือทางชีววิทยา ไซคลิกเปปไทด์ที่สังเคราะห์ขึ้นโดยไรโบโซมมีสเปกตรัมการออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่กว้างและมีศักยภาพในการรักษาโรคสูง
ที่นี่ เรารายงานการค้นพบไซคลิกไตรเปปไทด์ใหม่สามชนิด ได้แก่ นาทาเลนาไมด์ A–C (สารประกอบ 1–3) สารประกอบเหล่านี้ถูกระบุจากน้ำซุปเพาะเลี้ยงของ Actinomadura sp. ที่เกี่ยวข้องกับปลวกที่กำลังเติบโตของเชื้อรา RB99 โดยใช้โครมาโตกราฟีแบบของเหลว (LC)/อัลตราไวโอเลต (UV)/แมสสเปกโตรเมทรี (MS) ซึ่งเป็นวิธีการจำลองแบบโดยอาศัย โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบใหม่ (1–3) ถูกสร้างขึ้นโดยการวิเคราะห์วิธีการทางสเปกโทรสโกปีแบบครอบคลุม รวมถึงหนึ่งมิติ (1H และ 13C) และสองมิติ (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) แม่เหล็กนิวเคลียร์ เรโซแนนซ์สเปกโทรสโกปี (NMR) ร่วมกับข้อมูลแมสสเปกโตรเมตรีอิออนอิออไนเซชันความละเอียดสูง (HR-ESIMS) การกำหนดค่าสัมบูรณ์ของสารประกอบใหม่ได้รับการอธิบายโดยใช้การวิเคราะห์ของ Marfey จากการทดสอบฤทธิ์ทางชีวภาพหลายครั้งสำหรับไตรเปปไทด์ เราพบว่าสารประกอบ 3 แสดงผลการยับยั้งอย่างมีนัยสำคัญต่อ 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) ที่สร้างเมลานิน ผลของสารประกอบ 3 นั้นคล้ายคลึงกับกรดโคจิก ซึ่งเป็นสารประกอบที่ใช้อย่างกว้างขวางเป็นวัสดุเครื่องสำอางที่มีผลทำให้ผิวขาว
ผิวที่เนียนเรียบและละเอียดอ่อนเป็นเป้าหมายของผู้หญิงตะวันออกมาโดยตลอด การวิจัยและพัฒนาสารไวท์เทนนิ่งสำหรับผลิตภัณฑ์ดูแลผิวนั้นอาศัยการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสเป็นหลัก
สารประกอบที่ประกอบด้วยวงแหวนเบนซีนหรือโครงสร้างฟีนอลไฮดรอกซิลมีผลทำให้ผิวขาว เช่น สารทำให้ผิวขาวอย่างอาร์บูตินที่ใช้กันทั่วไปในปัจจุบัน ซึ่งสามารถให้ผลทำให้ขาวขึ้นได้โดยการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนส
และเราพบว่า Cistanche Deserticola มีผลทำให้ผิวขาวขึ้น สารออกฤทธิ์หลักของ Cistanche Deserticola คือ phenylethanoid glycosides เป็นสารประกอบไกลโคไซด์ตามธรรมชาติชนิดหนึ่ง การศึกษาพบว่า phenylethanoid glycosides สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ไทโรซิเนสและการผลิตเมลานินในเซลล์ผิวหนังชั้นนอกของมนุษย์ และมีผลทำให้ผิวขาวขึ้น ประสิทธิภาพของตัวแทน
คำสำคัญ:
ปลวกเติบโตเชื้อรา; แอคติโนมาดูรา sp.; ไตรเปปไทด์; นาทาเลนาไมด์ A–C; ผลการทำให้ผิวขาวขึ้น
1. บทนำ
การวิเคราะห์ทางเคมีของแบคทีเรียที่มีลักษณะคล้ายแบคทีเรียป้องกันแมลงในฟาร์มได้ดึงดูดความสนใจอย่างมากในหมู่นักเคมีของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา [1–5] การค้นพบนี้ใช้กระบวนการจำลองแบบด้วยคลื่นสนามแม่เหล็กนิวเคลียร์ (NMR)/แมสสเปกโทรเมทรี (MS) ที่ล้ำสมัยและชุดวิเคราะห์ทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับระบบนิเวศน์ จำนวนที่น่าประทับใจของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่น่าสนใจทางโครงสร้าง รวมถึงเปปไทด์ไซคลิกที่ไม่ได้สังเคราะห์ขึ้นจากไรโบโซมหลายตัวได้รับการเปิดเผย จากสัญลักษณ์ของจุลินทรีย์ [6] ตัวอย่างที่โดดเด่นที่สุด ได้แก่ antifungal dentigerumycin ซึ่งเป็น cyclic desipeptide ที่แยกได้จากเชื้อรา Pseudonocardia sp. [7] และเจอรูมัยซิน A–C, ไซคลิกเดปซิเปปไทด์ที่มีกรดพิเพอราซิกที่มีกรดพิเพอราซิกซึ่งพบได้จากเชื้อ Pseudonocardia sp. [8].
Cyclic peptides ได้รับการแสดงกิจกรรมทางชีวภาพที่หลากหลาย ส่งเสริมแนวทางการสังเคราะห์หลายวิธีต่อโครงสร้างที่มีแนวโน้มทางเภสัชวิทยาเหล่านี้ [9–12] ปัจจุบัน ยา cyclic peptide กว่า 40 ชนิดวางตลาดและใช้กันอย่างแพร่หลายในสภาพแวดล้อมทางคลินิก และยา cyclic peptide ใหม่ประมาณหนึ่งตัวเข้าสู่ตลาดทุกปี โดยเฉลี่ย [13]
ในฐานะส่วนหนึ่งของความพยายามอย่างต่อเนื่องของเราในการระบุสารทุติยภูมิที่มีโครงสร้างใหม่และ/หรือสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับปลวก [14–17] เรามุ่งเน้นไปที่ Actinomadura sp. ที่เกี่ยวข้องกับปลวก RB99 ที่แยกได้จากปลวกที่เติบโตจากเชื้อรา Macrotermes natalensis กลยุทธ์การลดการทำซ้ำด้วยโครมาโตกราฟีแบบของเหลว (LC)/อัลตราไวโอเลต (UV)/แมสสเปกโตรเมตรี (MS) ของเราทำให้ได้ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่แปลกใหม่ ในการศึกษานี้ เรารายงานการแยกตัวและการจำแนกทางเคมีของไซคลิกไตรเปปไทด์ใหม่สามชนิด ได้แก่ นาทาเลนาไมด์ A–C (สารประกอบ 1–3 รูปที่ 1) โดยใช้วิธีการดีเรพลิเคชันที่ใช้ LC/UV/MS รวมถึงการประเมินทางชีวภาพสำหรับพิษต่อเซลล์ ฤทธิ์ต้านการอักเสบและการทำให้ผิวขาว
2. ผลลัพธ์และการอภิปราย
2.1. โครมาโตกราฟีแบบของเหลว (LC)/อัลตราไวโอเลต (UV)/แมสสเปกโตรเมทรี (MS)-การแยกสารประกอบ 1–3 โดยอาศัยพื้นฐาน
แอคติโนมาดูรา sp. RB99 แยกได้จากพื้นผิวของปลวกงาน (M. natalensis) การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของลำดับกรดไรโบนิวคลีอิก 16S เกือบสมบูรณ์ (rRNA) บ่งชี้ว่าสายพันธุ์ RB99 อยู่ในสกุล Actinomadura โดยมี Actinomadura nitritigenes เพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุด NBRC 15918T การวิเคราะห์ด้วย LC/UV/MS ภายหลังของสารสกัดจากวัฒนธรรมที่อุดมด้วยเผยให้เห็นชุดของการดูดกลืนรังสียูวีที่มีลักษณะเฉพาะพร้อมยอดไอออนโมเลกุลพิเศษที่มีอะตอมของไนโตรเจน
ในการระบุเมแทบอไลต์ที่เกี่ยวข้องและตรวจสอบกิจกรรมของพวกมัน การหมักขนาดใหญ่โดยใช้สภาวะการเจริญเติบโตที่เหมาะสม (จานวุ้น 100 แผ่นจากวุ้น 2 ลิตร ISP2, pH 6, 10 วันที่ 30 ◦ซ) และขั้นตอนการทำงานและการทำให้บริสุทธิ์ที่กำหนดไว้ นำไปใช้ [17]. การแยกส่วนด้วย LC-UV/MS ที่ตามมาและโครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงกึ่งเตรียมกึ่งเตรียม (HPLC) ซ้ำๆ ทำให้เกิดการแยกสารสามชนิดด้วยรูปแบบ NMR/MS ที่ไม่ซ้ำใคร เราทำการศึกษาการเติบโตและสื่อโดยใช้เกลือที่แตกต่างกัน (NaCl, KBr 1–3 เปอร์เซ็นต์ ) และองค์ประกอบของสื่อ (สื่อ ISP1-6) เพื่อเลียนแบบสภาพแวดล้อมทางธรรมชาติและกระตุ้นการผลิตสารเมแทบอไลต์ ซึ่งนำไปสู่การปรากฏของสารใหม่ทั้งสามชนิด สารเมแทบอไลต์ (ดูรูปเพิ่มเติม S19)
2.2. การอธิบายโครงสร้างของสารประกอบ
Natalenamide A (1) ได้มาเป็นผงอสัณฐาน สูตรโมเลกุล 1 ถูกกำหนดให้เป็น C19H25N3O5 จากไอออนโมเลกุลที่เติมด้วยโซเดียมที่ m/z 398.1691 [M บวก Na] บวก (คำนวณสำหรับ C19H25N3O5Na, 398.1692) โดยใช้โหมดไอออนบวก สเปกโตรเมทรีมวลสารอิออไนเซชันที่มีความละเอียดสูง (HR- ข้อมูล ESIMS) สเปกตรัมอินฟราเรด (IR) แสดงแถบการดูดกลืนที่แข็งแกร่งที่ 1670 cm−1 ซึ่งบ่งบอกว่ามีหมู่เอไมด์อยู่ในโมเลกุล การวิเคราะห์โดยละเอียดของข้อมูล 1H NMR ของตารางที่ 1 (ตารางที่ 1) บ่งชี้สัญญาณทั่วไปของโครงกระดูกเปปไทด์ โดยแสดงสัญญาณเมทิลสองตัว (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) และ 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)) สามสัญญาณเมทิลีน (δH 1.95 (1H, ม., H-7a), 2.27 (1H, ม., H-8a), 2.36 (1H, ม., H-8b), 2.48 (1H , ม., H{{50}}b), 2.97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a) และ 3.20 (1H, dd, J=14.0, 5.0 Hz, H-12b)), สัญญาณเมทีนสี่สัญญาณ (δH 2.02 (1H , ม., ส-2), 4.16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4.5 Hz, H-6) และ 4.63 (1H, dd, J=8.0, 5.0 Hz, H-11)) และโปรตอนอะโรมาติกที่ทับซ้อนกันห้าตัว (δH 7.18 (1H, ม., ส-16), 7.23 (2H, ม., H-14/18) และ 7.24 (2H, ม., H-15/17))
สเปกตรัม 13C NMR (ตารางที่ 1) ด้วยความช่วยเหลือจากสเปกตรัม HSQC และ HMBC แสดงคาร์บอนเรโซแนนซ์ทั้งหมด 19 รายการที่รับผิดชอบต่อสัญญาณเมทิลสองสัญญาณ (δC 18.9 และ 19.9) สัญญาณเมทิลีนสามสัญญาณ (δC 27.0 30.6 และ 38.8), สัญญาณมีทีนเก้าตัว (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) และ 130.6 (×2)) รวมถึงคาร์บอนอะโรมาติกห้าตัว คาร์บอนโอเลฟินิกหนึ่งตัว สัญญาณ (δ C 138.8) และสัญญาณคาร์บอนิลคาร์บอนสี่ตัว (δ C 173.2, 173.3, 174.8 และ 181.3) เมื่อรวมกับข้อมูลสเปกโทรสโกปีข้างต้น การตรวจสอบโดยละเอียดของการทดลอง NMR แบบสองมิติ (2 มิติ) (1H-1H COSY, HSQC และ HMBC) เผยให้เห็นการมีอยู่ของกรดอะมิโนสามชนิดใน 1: กลูตาเมต (Glu), ฟีนิลอะลานีน ( เพ) และวาลีน (วาล) (รูปที่ 2) การเชื่อมต่อของกรดอะมิโนเหล่านี้ถูกกำหนดโดยสหสัมพันธ์ HMBC ของ H-1/C-5 และ C-19, H-11/C-10 และ C{ {50}} และ H-6/C-5 และ C-10 (รูปที่ 2)
เพื่อระบุการกำหนดค่าสัมบูรณ์ของ 1 วิธีของ Marfey ถูกนำไปใช้เพื่อหาสเตอริโอเคมีของ -H ทวีคูณ (C-1, C-6 และ C-11) กรดไฮโดรไลเสตของ 1 และกรดอะมิโนมาตรฐาน (L/D-Glu, Phe และ Val) ได้รับอนุพันธ์ด้วย 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine เอไมด์ (L-FDAA) ตามลำดับ, ของผสมที่เป็นอนุพันธ์ของ 1 และกรดอะมิโนมาตรฐานถูกวิเคราะห์โดย LC/MS เพื่อตรวจสอบเวลาการเก็บรักษาของพวกมัน การกำหนดค่าสัมบูรณ์ของมอยอิตี Glu, Phe และ Val ทั้งหมดถูกกำหนดให้เป็นรูปแบบ L โดยขึ้นอยู่กับเวลาการคงอยู่ของอนุพันธ์ L-FDAA ที่ 1 เมื่อเปรียบเทียบกับกรดอะมิโนมาตรฐาน ดังนั้น โครงสร้างของ 1 จึงถูกอธิบายออกมาเป็นไซคลิกไตรเปปไทด์ที่แสดงในรูปที่ 1
Natalenamide B (2) แยกได้เป็นผงอสัณฐาน สูตรโมเลกุลของมัน (C20H27N3O5) อนุมานได้จากยอดโมเลกุลไอออนของไฮโดรเจนและโซเดียมที่เติมด้วยโซเดียมที่ 390.2032 [M บวก H] บวก (คำนวณสำหรับ C20H28N3O5, 390.2029) และ 412.1849 [M บวก Na] บวก (คำนวณสำหรับ C20H27N3O5Na, 412.1848) ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับสูตรโมเลกุลและข้อมูลสเปกตรัม NMR ที่ 1 สารประกอบ 2 ดูเหมือนจะมีกลุ่ม CH2 เพิ่มเติมในโครงกระดูกเปปไทด์ การตรวจสอบอย่างครอบคลุมของสเปกตรัมหนึ่งมิติ (1D) (1H และ 13C NMR) และ 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC และ HMBC) ของ 2 เผยให้เห็นการมีอยู่ของกรดอะมิโนสามชนิด: Glu, Phe และ Leu (ลิวซีน). ลำดับของกรดอะมิโนเหล่านี้สร้างขึ้นจากความสัมพันธ์ HMBC ของ H-1/C-6 และ C-20, H-12/C-11 และ C -20 และ H-7/C-6 และ C-11 (รูปที่ 2) เพื่อกำหนดโครงแบบสัมบูรณ์ของ 2 ได้ทำการอนุพันธ์ของสารตกค้าง Glu, Phe และ Leu ด้วย L-FDAA แล้ววิเคราะห์โดย LC/MS ในข้อมูล LC/MS ตรวจพบ L-Glu, L-Phe และ L-Leu โดยการเปรียบเทียบเวลาการกักเก็บสำหรับอนุพันธ์ L-FDAA 2 ชนิดกับกรดอะมิโนมาตรฐาน ดังนั้น โครงสร้างทางเคมีของ 2 จึงถูกสร้างขึ้นเป็นไซคลิกไตรเปปไทด์ที่แสดงในรูปที่ 1
ข้อมูล HR-ESIMS ในโหมดบวกของนาทาเลนาไมด์ C (3) แสดงไอออนของโมเลกุลที่เติมไฮโดรเจนและโซเดียมที่ 424.1870 [M บวก H] บวก (คำนวณสำหรับ C23H26N3O5, 424.1872) และ 446.1694 [M บวก Na] บวก (คำนวณสำหรับ C23H25N3O5Na 424.1692). สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าสูตรโมเลกุลของมันคือ C23H25N3O5 การวิเคราะห์โดยละเอียดของสเปกตรัม NMR 1 มิติและ 2 มิติของ 3 ระบุว่าโครงสร้างทางเคมีของมันคล้ายกับของ 2 ยกเว้น Leu ถูกแทนที่ด้วย Phe ใน 3 การเชื่อมต่อของกรดอะมิโนที่ระบุทั้งสามใน 3 ได้รับการตรวจสอบโดยใช้สหสัมพันธ์ HMBC ของ H-1/C-9 และ C-23, H-15/C-14 และ C-23 และ H-10/ C-9 และ C-14 (รูปที่ 2) เมื่อใช้วิธีการของ Marfey กับสารประกอบ 3 การกำหนดค่าสัมบูรณ์ของ -H ทวีคูณ (C-1, C-10 และ C-15) ได้รับการอธิบายว่าเป็น L-Glu หนึ่งตัวและ L สองตัว -เพียมอยส์. ดังนั้นจะได้โครงสร้างที่สมบูรณ์ของ 3 ดังแสดงในรูปที่ 1
Natalenamides A–C เป็นเปปไทด์ไตรไซคลิก ซึ่งสันนิษฐานว่าไม่ได้มาจากไรโบโซม ปัจจุบัน ทริปเปปไทด์แบบวัฏจักรที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิดมีลักษณะเป็นผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ: ไตรเปปไทด์แบบวัฏจักรที่เป็นพิษต่อเซลล์ 17-สมาชิก (เช่น OF4949 I–IV) ที่แยกได้จาก Penicillium rugulose [18]; sclerotomies ต้านเชื้อรา A−K ระบุจากน้ำซุปหมักของแบคทีเรียที่ทนต่อสารก่อมะเร็ง [10]; และ psychrophilic E ที่ต้านการเพิ่มจำนวนซึ่งแยกได้จากวัฒนธรรมผสมของสายพันธุ์เชื้อรา Aspergillus จากทะเลสองสายพันธุ์ [19]
2.3. กิจกรรมทางชีวภาพของสารประกอบ 1-3
เนื่องจากมีรายงานว่าเปปไทด์แบบไซคลิกแสดงฤทธิ์ทางชีวภาพที่หลากหลาย ผลกระทบทางชีวภาพของไซคลิกไตรเปปไทด์ที่แยกได้ ({{0}}) ได้รับการประเมินโดยใช้ฤทธิ์ทางชีวภาพสามชนิด ความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารประกอบ 1-3 ถูกตรวจสอบกับเซลล์มะเร็งสี่สาย (เซลล์มะเร็งเต้านม MCE7, เซลล์มะเร็งปากมดลูก HeLa, เซลล์มะเร็งปอดมนุษย์ A549 และเซลล์มะเร็งตับ HepG2) ที่ความเข้มข้นต่างกัน (0, 6.25 , 12.5, 25, 50 และ 100 uM) สารประกอบ 1 ไม่ส่งผลต่อความมีชีวิตของเซลล์ MCF-7, HeLa หรือเซลล์ A549 อย่างไรก็ตาม การรักษาเซลล์ HepG2 ด้วย 100 M ของสารประกอบ 1 ทำให้เซลล์มีชีวิตรอดลดลงเหลือ 78.5 บวก 3.2 เปอร์เซ็นต์ (รูปที่ 3) สารประกอบ 2 ลดความมีชีวิตของเซลล์ของเซลล์ HeLa และ A549 เป็น 82.9 2.1 เปอร์เซ็นต์ และ 73.5=3.0 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ แต่ไม่ส่งผลต่อความมีชีวิตของ MCF-7 หรือ เซลล์ HepG2 (รูปที่ 3) สารประกอบ 3 ไม่ส่งผลกระทบต่อความมีชีวิตของสายเซลล์ใดๆ (รูปที่ 3)
ถัดไป ใช้มาโครฟาจ RAW264.7 เพื่อตรวจสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบของสารประกอบที่แยกได้ เพื่อกำจัดข้อผิดพลาดในการผลิต NO ที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงอัตราการรอดชีวิตของเซลล์ จึงมีการตรวจสอบความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษของสารประกอบแต่ละชนิด ดังที่แสดงในรูปที่ 4 สารประกอบ 1–3 มีผลที่เป็นพิษต่อเซลล์เพียงเล็กน้อยในเซลล์ RAW264.7 (รูปที่ 4A–C) และไม่มีผลยับยั้งต่อการผลิต NO ในเซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้น lipopolysaccharide (LPS) (รูปที่ 4D–F) .
ผลการยับยั้งของสารประกอบ 1–3 ต่อปริมาณเมลานินในเซลล์ B16F10 ได้รับการตรวจสอบเป็นหลักฐานของกิจกรรมที่ทำให้ผิวขาว (รูปที่ 5) เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงความมีชีวิตของเซลล์ทำให้เกิดข้อผิดพลาดในการผลิตและการวัดค่าเมลานิน เราจึงตรวจสอบผลกระทบของสารประกอบ 1–3 ต่อการอยู่รอดของเซลล์ B16F10 ก่อน สารประกอบ 1–3 ไม่แสดงฤทธิ์ที่เป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ B16F10 ที่ความเข้มข้นใดๆ ที่ใช้ (รูปที่ 5A–C) จากนั้นเราประเมินผลการยับยั้งของสารประกอบต่อ 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) ที่เหนี่ยวนำให้เกิดการผลิตเมลานินในเซลล์ B16F10 (รูปที่ 5D–F) IBMX ซึ่งเป็นตัวกระตุ้นที่รู้จักกันดีของการสร้างเมลาโนเจเนซิส กระตุ้นให้มีการผลิตเมลานินเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาเพียงครั้งเดียวในเซลล์มะเร็งผิวหนัง ในบรรดาสารประกอบที่ประเมิน สารประกอบ 3 (ที่ 5–100 µM) แสดงผลการยับยั้งที่มีนัยสำคัญต่อการสังเคราะห์เมลานินที่อาศัย IBMX ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา กรดโคจิกซึ่งเป็นสารควบคุมในเชิงบวกของเรา ถูกนำมาใช้อย่างกว้างขวางในฐานะเครื่องสำอางที่มีผลทำให้ผิวขาว [20] ผลการยับยั้งของสารประกอบ 3 ต่อการผลิตเมลานินที่เหนี่ยวนำโดย IBMX นั้นคล้ายคลึงกับผลของกรดโคจิก (รูปที่ 5F) ซึ่งบ่งชี้ว่าสารประกอบ 3 ทำหน้าที่เป็นตัวยับยั้งที่มีศักยภาพของการผลิตเมลานินที่เหนี่ยวนำโดย IBMX ในเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิด B16F10
นอกจากนี้ สารประกอบ 3 ถูกปนเปื้อนด้วยสิ่งเจือปนจำนวนเล็กน้อย ซึ่งถูกกำหนดให้เป็นแอนะล็อกของกรดไขมันโดยการตีความข้อมูลสเปกโทรสโกปี NMR และการวิเคราะห์ LC/MS (วัสดุเสริม รูปที่ S11–S15 และ S23) ในการระบุกิจกรรมของสิ่งเจือปน ได้ทำการทดลองเพิ่มเติมกับอะนาลอกของกรดไขมันสำหรับผลการยับยั้งการผลิตเมลานินที่เหนี่ยวนำโดย IBMX ในเซลล์ B16F10 ซึ่งเผยให้เห็นว่าสารประกอบที่ทดสอบไม่มีผลทำให้ผิวขาว (วัสดุเสริม รูปที่ S24) ดังนั้น แม้ว่าเราจะแยกไม่ออกว่าสิ่งเจือปนในสารประกอบ 3 มีส่วนรับผิดชอบต่อผลยับยั้งการผลิตเมลานินที่เกิดจาก IBMX แต่ก็ไม่น่าเป็นไปได้
3. วัสดุและวิธีการ
3.1. ขั้นตอนการทดลองทั่วไป
สเปกตรัมอินฟราเรดได้มาจากสเปกโตรมิเตอร์ Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA) อิเล็กโตรสเปรย์ไอออไนเซชันและสเปกตรัม HR-ESIMS ถูกวัดบน SI-2/LCQ DecaXP ลิควิดโครมาโตกราฟี (LC) -mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) สเปกตรัม NMR รวมถึงการทดลอง 1H–1H COSY, HSQC และ HMBC ดำเนินการโดยใช้เครื่องสเปกโตรมิเตอร์ Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, USA) ที่ความถี่ 800 MHz (1H) และ 200 MHz (13C) โดยมี การเปลี่ยนแปลงทางเคมีที่กำหนดเป็น ppm (δ) การเตรียม HPLC ใช้ปั๊ม Waters 1525 Binary HPLC กับ Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, USA) ซิลิกาเจล 60 (230–400 เมช, เมอร์ค, เคนิลเวิร์ธ, นิวเจอร์ซีย์, สหรัฐอเมริกา) และซิลิกาเจล RP-C18 (230–400 เมช, เมอร์ค, ใช้สำหรับโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ HPLC แบบกึ่งเตรียมใช้ระบบ HPLC Shimadzu Prominence พร้อม SPD{ {22}}เครื่องตรวจจับ A/20AV ซีรีส์ Prominence HPLC อัลตราไวโอเลต-มองเห็นได้ (UV-Vis) (ชิมะสุ โตเกียว ญี่ปุ่น) การวิเคราะห์ LC/MS ดำเนินการบนระบบ HPLC ซีรีส์ Agilent 1200 (เทคโนโลยี Agilent, ซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ติดตั้งเครื่องตรวจจับไดโอดอาร์เรย์และแมสสเปกโตรมิเตอร์รุ่น 6130 ESI พร้อมไคเนเท็กซ์เชิงวิเคราะห์ (4.6 × 100 มม., 3.5 µm) แผ่นซิลิกาเจล F254 ที่เคลือบล่วงหน้าของ Merck และแผ่น F254 ของ RP-18 ใช้สำหรับบาง โครมาโตกราฟีแบบเลเยอร์ (TLC) ตรวจพบจุดบน TLC ภายใต้แสง UV หรือโดยการให้ความร้อนหลังจากฉีดพ่นด้วยสารละลายกรดอะนิซัลดีไฮด์-ซัลฟิวริก
3.2. วัสดุจุลินทรีย์
แอคติโนมาดูรา sp. RB99 แยกได้จากพื้นผิวของปลวกงานในสกุล M. natalensis (อาณานิคม Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) ในวันที่ 2 มกราคม{ {13}}10 วัสดุชีวภาพถูกบรรจุลงในถุงพลาสติกที่สะอาดและดำเนินการภายในหนึ่งวันหลังจากเก็บรวบรวม กำจัดปลวกในน้ำปราศจากไอออนและแบคทีเรียถูกแยกออกโดยการชุบสารแขวนลอยที่เกิดขึ้นบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสารอาหารต่ำด้วยไคติน (ต่อลิตร: ไคติน 4 กรัม, 0.7 กรัม K2HPO4, 0.3 กรัม KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.001 g ZnSO4, 0.001 g MnCl2 และ 20 g agar) [21] เชื้อที่แยกได้ซึ่งมีสัณฐานวิทยาคล้ายแอคติโนแบคทีเรียถูกถ่ายโอนไปยังวุ้น ISP2 (ต่อลิตร: สารสกัดมอลต์ 10 กรัม, สารสกัดจากยีสต์ 4 กรัม, กลูโคส 4 กรัม และวุ้น 20 กรัม) และเพาะเลี้ยงย่อยจนได้เชื้อที่แยกได้บริสุทธิ์
3.3. การสกัดดีเอ็นเอและการขยายปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส
แอคติโนมาดูรา sp. RB99 ปลูกใน ISP2 อาหารเหลวที่อุดมด้วยสารอาหารเป็นเวลาห้าถึงเจ็ดวันที่ 30 ◦C เก็บเกี่ยวเซลล์และสกัด DNA จีโนมโดยใช้ชุด GenJet genomic DNA purification (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตพร้อมการเปลี่ยนแปลงต่อไปนี้: (a) การบำบัดด้วยไลโซไซม์ขยายเป็น 40 นาที และ (b) การรักษาโปรตีเนส K ขยายเป็น 40 นาที DNA ถูกวัดปริมาณด้วยแสงโดยใช้ Nanodrop Lite สเปกโตรมิเตอร์ (Thermo Scientific)
สำหรับการศึกษาสายวิวัฒนาการ ยีน 16S rRNA ถูกขยายโดยใช้ชุดไพรเมอร์ 1492R/27F แต่ละปฏิกิริยาการขยายถูกเตรียมในปริมาตรปฏิกิริยาสุดท้าย 25 µL ที่ประกอบด้วยน้ำกลั่น 7.25 µL, บัฟเฟอร์ HF 5 µL, 5 µL ของแต่ละไพรเมอร์ (2.5 µM), {{10}}.5 µL ของ dNTPs (10 µM), 0.25 µL ของ Phusion High-Fidelity DNA polymerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) และ 2 µL ของ DNA ที่สกัดแล้ว (แม่แบบ) ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ถูกดำเนินการภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 98 ◦C เป็นเวลา 38 วินาที; 32 รอบ 98 ◦ เป็นเวลา 30 วินาที, 52 ◦C เป็นเวลา 45 วินาที, 72 ◦C เป็นเวลา 1 นาที 20 วินาที; และขยายครั้งสุดท้ายที่ 72 ◦C เป็นเวลา 8 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR มองเห็นได้ด้วย agarose gel electrophoresis และปฏิกิริยา PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ชุด PCR purification (Thermo Scientific) ชิ้นส่วน DNA ถูกจัดลำดับที่ GATC (Konstanz, Germany)
3.4. การจัดลำดับและการจำแนกชนิด
ลำดับได้รับการประเมินความบริสุทธิ์และไม่ตรงกันโดยใช้ BioEdit [22] ลำดับไปข้างหน้าและย้อนกลับที่ได้รับสำหรับแต่ละสายพันธุ์ถูกรวบรวมด้วย BioEdit และทดสอบหาไคเมราโดยใช้ DECIPHER (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html) ลำดับผลลัพธ์ถูกฝากไว้ใน GenBank (หมายเลขภาคยานุวัติ: KY558684) การวิเคราะห์การระเบิดด้วยลำดับ 16S rRNA ที่เกือบสมบูรณ์ (1368 bp) ได้ดำเนินการโดยใช้ฐานข้อมูลศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) (ลำดับ RNA อ้างอิง) ผลลัพธ์บ่งชี้ว่าสายพันธุ์ RB99 เป็นสมาชิกของสกุล Actinomadura ลำดับของ Hit 10 ครั้งแรกถูกดาวน์โหลดจากฐานข้อมูล NCBI และสอดคล้องกับลำดับ 16S rRNA ของ Actinomadura sp. RB99 โดยใช้บริการการจัดตำแหน่งลำดับ Sina [23] ต้นไม้สายวิวัฒนาการที่แตกต่างกันสองต้นถูกสร้างขึ้นใหม่ด้วยอัลกอริทึมการรวมเพื่อนบ้านหรือความเป็นไปได้สูงสุดโดยใช้ซอฟต์แวร์ MEGA เวอร์ชัน 7.0.26 [24–26] แบบจำลองระยะทางวิวัฒนาการของทามูระและเนอิถูกใช้เพื่อสร้างเมทริกซ์ระยะทางวิวัฒนาการสำหรับอัลกอริธึมความเป็นไปได้สูงสุดและเพื่อนบ้านที่เข้าร่วม โดยลบช่องว่างทั้งหมดและข้อมูลที่ขาดหายไป [27] สำหรับอัลกอริทึมความเป็นไปได้สูงสุด จะใช้การแจกแจงแกมมาแบบไม่ต่อเนื่อง (บวก G) และแบบจำลองการแปรผันของอัตราอนุญาตให้ไซต์บางแห่งไม่แปรเปลี่ยนตามวิวัฒนาการ (บวก I) สำหรับอัลกอริทึมการรวมเพื่อนบ้าน ความแปรผันของอัตราระหว่างไซต์ถูกสร้างแบบจำลองด้วยการแจกแจงแบบแกมมา (บวก G) ค่าความเชื่อมั่นของโหนดได้รับการประเมินโดยการวิเคราะห์บูตสแตรปตามขั้นตอนการสุ่มตัวอย่าง 1,000 ครั้ง [28]
3.5. การสกัดและการแยก
แอคติโนมาดูรา sp. RB99 ปลูกในน้ำซุป ISP2 ขนาด 50 มล. เป็นเวลาเจ็ดวันที่ 30 ◦C (ก่อนเพาะเลี้ยง) และใช้ในการเพาะเลี้ยงจานวุ้น ISP2 100 แผ่น เพลตถูกบ่มเป็นเวลา 10 วันที่ 30 ◦ซ, ตัดเป็นชิ้นเล็กๆ, รวมเข้าด้วยกันและแช่ค้างคืนใน MeOH เฟส MeOH ถูกกรองและระเหยภายใต้ความดันที่ลดลง สารสกัด MeOH (20 ก.) ถูกละลายในน้ำกลั่น (700 มล.) จากนั้นแบ่งตัวทำละลายด้วย EtOAc (700 มล.) สามครั้ง จนได้กาก 1.1 ก. เศษส่วนที่สามารถละลายได้ของ EtOAc (1.1 ก.) จากสารสกัด MeOH ถูกบรรจุลงในคอลัมน์ซิลิกาเจล (230–400 เมช) สำหรับโครมาโตกราฟี และชะด้วยระบบตัวทำละลายไล่ระดับของ CH2Cl2-MeOH (100:1 ถึง 1: 1, v/v). สิ่งนี้ให้เศษส่วนหกส่วน (A–F) ซึ่งอยู่ภายใต้การวิเคราะห์โดยใช้ LC-UV/MS การวิเคราะห์การทำซ้ำโดยใช้คลังสเปกตรัมรังสียูวีภายในบริษัทชี้ให้เห็นถึงการมีอยู่ของอะนาล็อกเปปไทด์เล็กน้อยในเศษส่วน E สิ่งเหล่านี้แสดงรูปแบบรังสียูวีอย่างง่ายที่ประมาณ 220 นาโนเมตรและยอดไอออนสูตรโมเลกุลเฉพาะที่มีอะตอมไนโตรเจน เศษส่วนขั้ว E (233 มก.) ถูกแยกส่วนโดย HPLC แบบกลับเฟสที่เตรียมการ (ฟีโนมีเน็กซ์ Luna C18, 250 × 21.2 มม. id, 5 µm, ทอร์รันซ์, CA, สหรัฐอเมริกา) โดยใช้ CH3CN/H2O (1:9 ถึง 9:1, v /v, ระบบไล่ระดับสี, อัตราการไหล: 5 มล./นาที) เพื่อให้ได้เศษส่วนย่อยห้าส่วน (E1–E5) เศษส่วนย่อย E2 (27 มก.) ถูกทำให้บริสุทธิ์โดย HPLC แบบกลับเฟสกึ่งเตรียม (ฟีโนมีเน็กซ์ Luna C18, 250 × 10.0 มม. id, 5 µm) ด้วย 33 เปอร์เซ็นต์ MeOH/H2O (ระบบไอโซคราติก, อัตราการไหล: 2 มล./นาที ) เพื่อให้ผลผลิตสารประกอบ 1 (5.8 มก., tR=57.0 นาที) สารประกอบ 2 (1.6 มก., tR=42.0 นาที) และ 3 (1.5 มก., tR=55.0 นาที) ถูกแยกออกจากเศษส่วนย่อย E3 (15 มก.) โดยเฟสย้อนกลับกึ่งเตรียม HPLC ชะ 43 เปอร์เซ็นต์ MeOH/H2O (ระบบไอโซเครติก, อัตราการไหล: 2 มล./นาที)
3.5.1. นาทาเลนาไมด์ เอ (1)
3.5.2. นาทาเลนาไมด์ บี (2)
3.5.3. นาทาเลนาไมด์ ซี (3)
3.6. การไฮโดรไลซิสด้วยกรดของสารประกอบ 1–3
ปริมาณรวม 0.4 มก. ของสารประกอบแต่ละชนิด (1–3) ถูกไฮโดรไลซ์ด้วย 6 N HCl (500 µL) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 110 ◦ซ หลังจากทำให้เย็นลงจนถึงอุณหภูมิห้อง ไฮโดรไลเสตของ 1–3 จะถูกระเหยเพื่อกำจัดร่องรอยของ HCl น้ำกลั่น (500 µL) ถูกเติมลงในของผสมไฮโดรไลเสตแล้วระเหยเพื่อกำจัดร่องรอยของ HCl; กระบวนการนี้ดำเนินการสามครั้ง
3.7. การกำหนดค่าสัมบูรณ์ของกรดอะมิโนในข้อ 1–3
ของผสมไฮโดรไลเสต (1–3) รวมทั้งกรดอะมิโนมาตรฐาน (L/D-Leu, Glu, Phe และ Val) ถูกละลายใน 1 N NaHCO3 (100 µL) แล้วบำบัด ด้วย L-FDAA 50 µL (10 มก./มล. ในอะซิโตน) ตามลำดับ แต่ละไฮโดรไลเสตถูกทำให้ร้อนเป็นเวลา 10 นาทีที่ 80 ◦ซ ของผสมแต่ละชนิดถูกทำให้เย็นลงทันทีด้วย 2 N HCl (50 ไมโครลิตร) และทำให้เข้มข้นในสุญญากาศ ส่วนที่เหลือถูกละลายใน 300 ไมโครลิตรของ MeOH แต่ละส่วนลงตัว (5 µL) ที่ได้มาจากของผสมไฮโดรไลเสตถูกฉีดโดยตรงไปยัง LC/MS (ฟีโนมีเน็กซ์ Luna C18, 4.6 × 100 มม., 3.5 µm, อัตราการไหล 0.3 มล./นาที) และการสแกนแบบเต็มในเชิงบวกและเชิงลบ โหมดไอออน (ช่วงการสแกนตั้งแต่ m/z 100 ถึง 1,000) ถูกนำไปใช้เพื่อระบุเวลาการกักเก็บของกรดอะมิโนที่อนุพันธ์ L-FDAA
เฟสเคลื่อนที่ซึ่งประกอบด้วยกรดฟอร์มิกในน้ำกลั่น ({{0}}.1 เปอร์เซ็นต์ v/v) (A) และ acetonitrile (B) ถูกดำเนินการด้วยระบบตัวทำละลายไล่ระดับดังนี้: 20–40 เปอร์เซ็นต์ (B) เป็นเวลา 10 นาที 100 เปอร์เซ็นต์ (B) ไอโซเครติกเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น 20 เปอร์เซ็นต์ (B) ไอโซเครติกเป็นเวลา 5 นาที เพื่อดำเนินการตามขั้นตอนการล้างหลังการทำงานสำหรับคอลัมน์ เวลาคงอยู่ของกรดอะมิโนที่อนุพันธ์ของ L-FDAA ซึ่งใช้เป็นมาตรฐานคือ 16.7 นาที (L-Glu, m/z 400 [M บวก H] บวก ), 18.2 นาที (D-Glu, m/z 400 [M บวก H] บวก ), 22.1 นาที (L-Val, m/z 370 [M บวก H] บวก ), 25.1 นาที (D-Val, m/z 370 [M บวก H] บวก ), 25.6 นาที (L-เพ, m/ z 418 [M บวก H] บวก ), 27.0 นาที (D-เพ, m/z 418 [M บวก H] บวก ), 25.5 นาที (L-Leu, m/z 384 [M บวก H] บวก ) และ 28.2 นาที (D-Leu, m/z 384 [M บวก H] บวก ) เวลาคงอยู่ของไฮโดรไลเสตอนุพันธ์ของ 1–3 คือ L-Glu (16.9 นาที), L-Phe (25.7 นาที) และ L-Val (22.5 นาที) จาก 1; L-Glu (16.7 นาที), L-Phe (25.7 นาที) และ L-Leu (25.6 นาที) จาก 2; และแอล-กลู (16.9 นาที) และแอล-เพ (25.7 นาที) จาก 3.
3.8. การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์โดยใช้เซลล์มะเร็ง
ซื้อเซลล์ MCF7, HeLa และ A549 จาก American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) ซื้อเซลล์ HepG2 จากธนาคารเซลล์เกาหลี (โซล เกาหลี) เซลล์ MCF7 ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ที่เสริมด้วยซีรั่มวัวทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ HeLa และ A549 ได้รับการเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่จำเป็นน้อยที่สุดของ Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) เสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ เพาะเลี้ยงเซลล์ HepG2 ในอาหารเลี้ยงเชื้อขั้นต่ำที่จำเป็นเสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10 เปอร์เซ็นต์ สภาวะการเพาะเลี้ยงถูกคงไว้ที่อุณหภูมิ 37 ◦C ในบรรยากาศที่มีความชื้นซึ่งมี CO2 5 เปอร์เซ็นต์ ความเป็นพิษต่อเซลล์ได้รับการทดสอบในเซลล์มนุษย์ทั้งสี่สายพันธุ์ (MCF7, HeLa, A549 และ HepG2) โดยใช้ชุดทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) โดยสังเขป 5 × 103 เซลล์/หลุมถูกเพาะในเพลต 96-หลุม หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยสารประกอบที่ความเข้มข้นที่ระบุ หลังจากการบ่ม 72 ชั่วโมง ชุดทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ EZ-CyTox ถูกนำมาใช้ หลังจากการบ่ม 2 ชั่วโมง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรโดยมีค่าอ้างอิงที่ 620 นาโนเมตร ความมีชีวิตของเซลล์คำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของการควบคุม
3.9. ฤทธิ์ต้านการอักเสบ
สายเซลล์ RAW264.7 มาโครฟาจของเมาส์ถูกซื้อจาก American Type Culture Collection เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS), 100 หน่วย/มล. เพนิซิลลิน และ 100 ไมโครกรัม/มล. สเตรปโตมัยซิน และบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦ซ ในบรรยากาศที่มีความชื้นด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ วัดความมีชีวิตของเซลล์โดยใช้ชุดตรวจจับความมีชีวิตของเซลล์ Ez-Cytox เซลล์ถูกบ่มใน 96-เพลตหลุมที่ความเข้มข้น 2,500 เซลล์ต่อหลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และบำบัดด้วยความเข้มข้นที่ระบุของสารประกอบ 1–3 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้น น้ำยา Ez-Cytox ถูกเติมลงในแต่ละหลุม วัดความหนาแน่นของแสงที่ 450 นาโนเมตรหลังจากผ่านไป 1 ชั่วโมงโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) เพื่อประเมินความมีชีวิตของเซลล์ ในการทดลองที่แยกต่างหาก เซลล์ RAW264.7 ถูกบ่มใน 96-เพลตหลุมที่ความเข้มข้น 30,000 เซลล์ต่อหลุมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากการอดน้ำในซีรั่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมง เซลล์ได้รับการปรับสภาพด้วยสารประกอบ 1–3 เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นกระตุ้นด้วย LPS 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตรเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ค่าการดูดกลืนแสงของอาหารเลี้ยงเชื้อในปฏิกิริยา Griess ถูกวัดที่ 540 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท PowerWave XS เพื่อประเมินระดับ NO
3.10. การวัดปริมาณเมลานิน
สายเซลล์เมลาโนมาของหนูเมาส์ B16F10 ถูกซื้อจาก American Type Culture Collection เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์, เพนิซิลลิน 100 ยูนิต/มล. และสเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มล. และบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦ซ ในบรรยากาศที่มีความชื้นด้วย CO2 5 เปอร์เซ็นต์ เซลล์ B16F10 ถูกบ่มในจานเพาะเลี้ยงขนาด 6 ซม. ที่ 250,{12}} เซลล์ต่อหลุมใน DMEM ที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์ สเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร และเพนิซิลลิน 100 U/มิลลิลิตร เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) จากนั้นกระตุ้นด้วย IBMX และบ่มด้วยสารประกอบ 1–3 หรือกรดโคจิกที่มีความเข้มข้นต่างกัน (สารควบคุมที่เป็นบวก) ในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI ที่ปราศจากฟีนอลแดงที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์ จำนวน 100 หน่วย /มล.เพนิซิลลิน และสเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มล.เป็นเวลา 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมง วัดค่าการดูดกลืนแสงของอาหารเลี้ยงเชื้อที่ 405 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท PowerWave XS เพื่อประเมินปริมาณเมลานิน ผลลัพธ์จะแสดงเป็นการเปลี่ยนแปลงแบบพับเมื่อเทียบกับการควบคุม (เซลล์ไม่ได้ถูกกระตุ้นโดย IBMX)
3.11. การวิเคราะห์ทางสถิติ
ข้อมูลทั้งหมดรวมถึงความมีชีวิตของเซลล์ NO และการผลิตเมลานินถูกนำเสนอเป็นค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) การทดสอบทั้งหมดทำขึ้นเป็นสามเท่าและทำซ้ำอย่างน้อยสามครั้ง ในการศึกษานี้ มีการทำซ้ำเพียงไม่กี่จำนวนของการทดลองแต่ละเซลล์ ดังนั้นวิธีการวิเคราะห์แบบไม่ใช้พารามิเตอร์จึงถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ทางสถิติ การทดสอบ Kruskall–Wallis ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติของแต่ละตัวแปร แพคเกจสถิติ SPSS ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทั้งหมด (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS สถิติเวอร์ชัน 21, Boston, MA, USA) นัยสำคัญทางสถิติได้รับการพิจารณาที่ค่า p ต่ำกว่า 0.05
4. ข้อสรุป
รายงานของเราแสดงการวิเคราะห์ทางเคมีของจุลินทรีย์ที่แยกได้จากปลวกที่เติบโตจากเชื้อรา ทริปเปปไทด์แบบวัฏจักรใหม่สามชนิด ได้แก่ นาทาเลนาไมด์ A–C (1–3) ถูกแยกออกและแสดงลักษณะทางโครงสร้างจากน้ำซุปเพาะเลี้ยงของ Actinomadura sp. ที่เติบโตจากเชื้อรา RB99 โดยใช้วิธีการยกเลิกการจำลองแบบโดยใช้ LC-UV/MS สารประกอบที่แยกได้ทั้งหมดได้รับการประเมินสำหรับกิจกรรมทางชีวภาพโดยใช้การตรวจวิเคราะห์จากเซลล์ สารประกอบ 1 และ 2 แสดงความเป็นพิษต่อเซลล์อย่างอ่อนต่อเซลล์ HepG2 และ HeLa/A549 ตามลำดับ ไม่มีสารประกอบที่แยกได้แสดงผลการยับยั้งที่มีนัยสำคัญต่อการผลิต NO ในเซลล์ RAW264.7 ที่กระตุ้นด้วย LPS สารประกอบ 3 แสดงผลการยับยั้งที่มีนัยสำคัญต่อการสังเคราะห์เมลานินที่อาศัย IBMX ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยา ผลกระทบคล้ายกับกรดโคจิกซึ่งใช้เป็นวัสดุเครื่องสำอางที่มีผลทำให้ผิวขาวขึ้น
กิตติกรรมประกาศ:
เราขอขอบคุณ Michael Thomas-Poulsen (ภาควิชาชีววิทยา มหาวิทยาลัยโคเปนเฮเกน ประเทศเดนมาร์ก) อย่างสุดซึ้งที่สนับสนุนงานภาคสนามของเรา
ผลประโยชน์ทับซ้อน:
ผู้เขียนประกาศว่าไม่มีความขัดแย้งทางผลประโยชน์
อ้างอิง
1. นิวแมน ดีเจ; Cragg ผลิตภัณฑ์ GM Natural เป็นแหล่งที่มาของยาใหม่ตั้งแต่ปี 1981 ถึง 2014 J. Nat แยง. 2559, 79, 629–661. [ครอสรีฟ] [PubMed]
2. มิชรา บีบี; Tiwari, VK Natural products: บทบาทที่พัฒนาขึ้นในการค้นคว้ายาในอนาคต เออ เจ เมด เคมี 2554, 46, 4769–4807. [ครอสรีฟ] [PubMed]
3. บีเมลมันน์, ซี.; กู, เอช.; ริเชอร์ ม.; Poulsen, M. ผลิตภัณฑ์ธรรมชาติจากจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับแมลง Beilstein J. Org. เคมี 2016, 12, 314–327. [ครอสรีฟ] [PubMed]
4. รามาธาร์, TR; บีเมลมันน์, ซี; กะหรี่ CR; Clardy, J. ลักษณะร่วมของแบคทีเรียในระบบเกษตรเป็นแหล่งเชิงกลยุทธ์สำหรับการค้นพบยาปฏิชีวนะ เจ. ยาปฏิชีวนะ. 2557, 67, 53–58. [ครอสรีฟ] [PubMed]
5. ฮาร์วีย์ อัล; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ การเกิดขึ้นใหม่ของผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเพื่อการค้นคว้ายาในยุคจีโนมิกส์ ณัฐ. ศว.บช.น. 2015, 14, 111–129. [ครอสรีฟ] [PubMed]
6. เรียบร้อย ES; ฟิชบัคบ์, แมสซาชูเซตส์; Walsh, CT การสังเคราะห์ทางชีวภาพทั้งหมด: การสร้างใหม่ในหลอดทดลองของทางเดินพอลิคีไทด์และเปปไทด์ที่ไม่ใช่ไรโบโซม ณัฐ. แยง. ตัวแทน 2008, 25, 757–793 [ครอสรีฟ] [PubMed]
7. โอ ด.; สกอตต์, เจเจ; กะหรี่ CR; Clardy, J. Mycangimycin, polyene peroxide จาก Streptomyces sp. องค์กร เล็ต 2009, 11, 633–636. [ครอสรีฟ] [PubMed]
8. นั่ง ซีเอส; รุซซินี, เอซี ; ฟาน อาร์นัม, EB; รามาธาร์, TR; กะหรี่ CR; Clardy, J. สถาปัตยกรรมทางพันธุกรรมที่แปรผันได้ผลิตโมเลกุลที่เหมือนกันในแบคทีเรียที่มีลักษณะคล้ายมดที่เติบโตจากเชื้อรา โพรซี นัทล. อคาเดมี วิทย์ สหรัฐอเมริกา 2558 112 13150–13154 [ครอสรีฟ] [PubMed]
9. ต่ำ KE; เลอร์ เอส; เฉิน เคเจ ; แคมป์เบลล์ RL; ฮิกกี้, JL; ตาล เจ; สกัลลี, CCG; เดวีส์ RL; ยูดิน, เอเค ; Zaretsky, S. การออกแบบเชิงเหตุผลของสารยับยั้ง Calpain โดยอิงจาก Calpastatin peptidomimetics เจ เมด เคมี 2559, 59, 5403–5415. [ครอสรีฟ] [PubMed]
10. เจิ้งเจ; Xu, Z.; วัง ย.; ฮง, เค; หลิว พี; Zhu, W. Cyclic Tripeptides จากเชื้อรา Aspergillus sclerotiorum PT06-1 เจ แนท แยง. 2010, 73, 1133–1137. [ครอสรีฟ] [PubMed]
11. ด.ญ.วีรคโค ดี; มอสนิโควา, อ.; เอล-เซย์ด, NS; อโดไคท์, RC; สเลย์โบห์, จี; โกลิจานิน เจ; ทิวารี อาร์เค ; Andreev, โอเอ; Parang, K.; Reshetnyak, YK Novel เปปไทด์ไซคลิกที่ไวต่อค่า pH วิทย์ ตัวแทน 2016, 6, 31322 [CrossRef] [PubMed]
12. Zhao ม.; หลิน HC; Tang, Y. การสังเคราะห์ทางชีวภาพของ cyclic tripeptide psychrophilic ที่มีไนโตร เจ. ยาปฏิชีวนะ. 2559, 69, 571–573. [ครอสรีฟ] [PubMed]
13. ซอร์ซี อ.; เดล เค.; Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: อดีต ปัจจุบัน และอนาคต สกุลเงิน ความคิดเห็น เคมี ไบโอล 2017, 38, 24–29. [ครอสรีฟ] [PubMed]
14. คิม เคเอช; รามาธาร์, TR; บีเมลมันน์, ซี; เฉา เอส; โพลเซ่น ม.; กะหรี่ CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin จาก Streptomyces sp. ที่เกี่ยวข้องกับปลวก เคมี วิทย์ 2557, 5, 4333–4338. [ครอสรีฟ] [PubMed]
15. คัง ฝ่ายบุคคล; ลี, ด.; Benndorf, ร.; จุง ดับบลิวเอช; บีเมลมันน์, ซี; คัง แคนซัส ; Kim, KH Termisoflavones A–C, isoflavonoid glycosides จาก Streptomyces sp. ที่เกี่ยวข้องกับปลวก อาร์บี1. เจ แนท แยง. 2016, 79, 3072–3078. [ครอสรีฟ] [PubMed]
16. บีเมลมันน์ ซี; รามาธาร์, TR; คิม, เคเอช; คลาสเซ่น, เจแอล ; เฉา เอส; ไวช์, TP; โฮ, ย.; โพลเซ่น ม.; บูกินี่, ทีเอส; กะหรี่ CR; และอื่น ๆ Macrotermycins A–D, glycosylated macrolactams จาก Amycolatopsis sp. ที่เกี่ยวข้องกับปลวก เอ็ม39. องค์กร เล็ต 2017, 19, 1000–1003. [ครอสรีฟ] [PubMed]
17. กั่ว เอช; Benndorf, ร.; ไลชนิทซ์, ดี.; คลาสเซ่น, เจแอล ; โวลเมอร์ส, เจ; เกิร์ลส์, เอช.; Steinacker, ม.; ไวเกล ซี; Dahse, หือ; แคสเตอร์ อลาสก้า ; เดอเบียร์ ZW; และอื่น ๆ การแยก การสังเคราะห์ทางชีวภาพ และการดัดแปลงทางเคมีของ rubterolones A–F: tropolone alkaloids ที่หาได้ยากจาก Actinomadura sp. 5–2. เคมี เออ จ. 2017, 23, 9338–9345. [ครอสรีฟ] [PubMed]
18. เสนาะ ส.; อิไค, เค; คาตายามะ, เค; ทาเคซาโกะ, เค; นากามูระ, ที.; โอบายาชิ อ.; เอซัวร์ วาย.; Enomoto, H. OF4949, ตัวยับยั้งใหม่ของ aminopeptidase B. II การอธิบายโครงสร้าง เจ. ยาปฏิชีวนะ. 1986, 39, 1685–1696. [ครอสรีฟ] [PubMed]
19. เซียซุลโล แอล; คาซาปูลโล, อ.; คูติญาโน, อ.; Bifulco, G.; เดบิตัส ซี; ฮูเปอร์ เจ; โกเมซ-ปาโลมา, แอล; Riccio, R. Renieramide, tripeptide วงจรจากฟองน้ำวานูอาตู Reniera n. sp. เจ แนท แยง. 2545, 65, 407–410. [ครอสรีฟ] [PubMed]
20. โซลาโน เอฟ.; บริกันติ เอส; ปีคาร์โด ม.; Ghanem, GH Hypopigmenting agents: การทบทวนล่าสุดเกี่ยวกับแง่มุมทางชีววิทยา เคมี และทางคลินิก พิกม์. เซลล์เมลาโนมาเรส 2549, 19, 550–571. [ครอสรีฟ] [PubMed]
21. วิสเซอร์, เอเอ; โนเบร, ท.; กะหรี่ CR; อานัน, ดี.เค.; Poulsen, M. สำรวจศักยภาพของแอคติโนแบคทีเรียในฐานะซิมเบียนต์ป้องกันในปลวกที่เติบโตจากเชื้อรา จุลินทรีย์ อีคอล. 2555, 63, 975–985. [ครอสรีฟ] [PubMed]
22. Hall, TA BioEdit: โปรแกรมแก้ไขและวิเคราะห์การจัดตำแหน่งลำดับทางชีวภาพที่ใช้งานง่ายสำหรับ Windows 95/98/NT อาการกรดนิวคลีอิก เซอร์ 2542, 41, 95–98.
23. พรูส อี.; เปปลี่ส์ เจ; Glöckner, FO SINA: การจัดตำแหน่งหลายลำดับของยีนไรโบโซม RNA ที่แม่นยำสูง ชีวสารสนเทศ 2012, 28, 1823–1829 [ครอสรีฟ] [PubMed].
24. ไซโถ, N.; Nei, M. วิธีการรวมเพื่อนบ้าน: วิธีการใหม่สำหรับการสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการขึ้นใหม่ โมล ไบโอล อีโวล. 2530, 4, 406–425. [ผับเมด]
25 Felsenstein, J. ต้นไม้วิวัฒนาการจากลำดับดีเอ็นเอ: แนวทางความเป็นไปได้สูงสุด เจ โมล อีโวล. 2524, 17, 368–376. [ครอสรีฟ] [PubMed]
26. มาร์, ส.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: การวิเคราะห์พันธุศาสตร์วิวัฒนาการระดับโมเลกุล เวอร์ชัน 70 สำหรับชุดข้อมูลที่ใหญ่กว่า โมล ไบโอล อีโวล. 2016, 33, 1870–1874. [ครอสรีฟ] [PubMed]
27. ทามูระ, เค; Nei, M. การประมาณจำนวนของการแทนที่นิวคลีโอไทด์ในพื้นที่ควบคุมของไมโตคอนเดรียลดีเอ็นเอในมนุษย์และลิงชิมแปนซี โมล ไบโอล อีโวล. 2536, 10, 512–526. [ผับเมด]
28 Felsenstein, J. Confidence limits on phylogenies: วิธีการใช้ bootstrap วิวัฒนาการ 1985, 39, 783–791 [ครอสรีฟ] [PubMed]
ความพร้อมตัวอย่าง:
ผู้เขียนไม่มีตัวอย่างสารประกอบ
For more information:1950477648nn@gmail.com
