มอร์ทาลิน/โปรตีนควบคุมกลูโคส 75 ส่งเสริมการต้านทานซิสพลาตินของมะเร็งกระเพาะอาหาร

โปรดติดต่อoscar.xiao@wecistanche.comสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม

เชิงนามธรรม

การรักษาด้วยยาแพลตตินัมเป็นหนึ่งในกลยุทธ์ทางเคมีบำบัดที่โดดเด่นที่สุดสำหรับผู้ป่วยมะเร็งกระเพาะอาหาร (GC) อย่างไรก็ตาม ผลการรักษามีน้อยกว่าที่น่าพอใจ ส่วนใหญ่มาจากการดื้อยาที่ได้รับจากแพลตตินั่ม ดังนั้น ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับกลไกพื้นฐานสามารถปรับปรุงประสิทธิภาพการรักษาของ GC ได้อย่างมาก ในการศึกษานี้ เรามีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบการทำงาน/กลไกที่เกี่ยวข้องกับการต้านทานเคมีและความสำคัญทางคลินิกของโปรตีนควบคุมกลูโคส 75 (GRP75) ใน GC ในที่นี้ ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่าเมื่อเทียบกับเซลล์ SGC7901 การแสดงออกของ GRP75 มีความต้านทานซิสพลาตินสูงกว่าอย่างเห็นได้ชัด (เซลล์ (SGC7901 *) การล้มลงของ GRP75 ได้ยกเลิกการบำรุงรักษาศักยภาพของเมมเบรนยล (MP) และยับยั้งปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์{{ 10}}ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (NRF2), phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B (Pl3K/AKT), ปัจจัยที่ทำให้เกิดภาวะขาดออกซิเจน 1a (HIF-1a) และ c-myc ซึ่งส่งผลให้ขัดขวางการเปิดใช้งานของ เป้าหมายปลายน้ำของพวกเขา กระบวนการเหล่านี้ลดทอนความสามารถในการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน/อะพอพโทซิสและเปลี่ยนแปลงการโปรแกรมเมตาบอลิซึมซ้ำในเซลล์ "SGC7901" ซึ่งทำให้เซลล์เหล่านี้ไวต่อปฏิกิริยากับซิสพลาตินอีกครั้ง อย่างไรก็ตาม การแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP75 ในเซลล์ SGC7901 ทำให้เกิดผลตรงกันข้าม ยืนยันผลลัพธ์ข้างต้น ในผู้ป่วย GC ที่ได้รับเคมีบำบัดระดับแพลตตินัมและการวิเคราะห์เมตา ระดับ GRP75 ในระดับสูงมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับลักษณะก้าวร้าวและการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีรวมถึงแต่ไม่จำกัดเฉพาะโรคกระเพาะ มะเร็งลำไส้และเป็นตัวทำนายที่เป็นอิสระสำหรับการอยู่รอดโดยรวม โดยรวมแล้ว การศึกษาของเราระบุว่า GRP75 เกี่ยวข้องกับการดื้อต่อซิสพลาตินของ GC และ GRP75 อาจเป็นเป้าหมายการรักษาที่มีศักยภาพในการฟื้นฟูการตอบสนองต่อยาในเซลล์ที่ต้านทานต่อทองคำขาวและเครื่องมือพยากรณ์โรคเสริมที่เป็นประโยชน์ในการชี้แนะการจัดการทางคลินิกของผู้ป่วย GC

กรุณาคลิกที่นี่เพื่อทราบข้อมูลเพิ่มเติม

บทนำ

มะเร็งกระเพาะอาหาร (GC) เป็นอุบัติการณ์ชั้นนำครั้งแรกและการเสียชีวิตอันดับสองของโรคมะเร็งระบบย่อยอาหารในประเทศจีน การรักษาในปัจจุบันสำหรับ GC ขั้นสูงเป็นการผ่าตัดร่วมกับการให้เคมีบำบัดที่เป็นระบบ แต่อัตราการรอดชีวิตในระยะยาวน้อยกว่าที่น่าพอใจเนื่องจากมีการกลับเป็นซ้ำหลังการผ่าตัดสูง2.ในการปฏิบัติทางคลินิก ยาแพลตตินัมเป็นหนึ่งในยาทางเลือกแรกสำหรับการรักษาขั้นสูง GC เคมีบำบัด3. อย่างไรก็ตาม การดื้อยาที่เกิดขึ้นมักจะเกิดขึ้นหลังจากการรักษาโดยใช้แพลตตินัมหลายรอบ และบ่งชี้ว่ามีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีcistanchดังนั้นการให้ความกระจ่างถึงกลไกที่เป็นไปได้และการระบุกลยุทธ์การรักษาแบบใหม่เพื่อเอาชนะการดื้อยาแพลตตินัมในผู้ป่วย GC จึงมีความจำเป็นเร่งด่วน

Cistanche สามารถต่อต้านริ้วรอย

โปรตีนควบคุมกลูโคส 75 (GRP75) เป็นโมเลกุลพี่เลี้ยงที่เหนี่ยวนำให้เกิดความเครียดซึ่งเป็นของแฟมิลีโปรตีนช็อตด้วยความร้อน4 การแสดงออกมากเกินไปของ GRP75 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับความก้าวหน้าของเนื้องอกในมะเร็งต่างๆ ของมนุษย์5-7 ที่นี่ จากการสำรวจการวิเคราะห์เมตา เราพบว่า GRP75 ในระดับสูงบ่งชี้ว่าการพยากรณ์โรคที่ไม่ดีอย่างมีนัยสำคัญในมะเร็งระบบย่อยอาหารหลายชนิด (มะเร็งลำไส้ใหญ่ มะเร็งท่อน้ำดี และมะเร็งตับอ่อน) สำหรับการดื้อยา การยับยั้ง GRP75 ทำให้เกิดการย้อนกลับของการดื้อต่อซิสพลาตินและโดโซรูบิซินในมะเร็งตับและมะเร็งรังไข่ " GRP75 แยก p53 ในไซโตพลาสซึมแบบคลาสสิก นำไปสู่การหยุดการทำงานของฟังก์ชัน p53 และยับยั้งแอป-โทซิส10 การศึกษาก่อนหน้านี้รายงานว่า GRP75 เนื้องอกในเชิงบวกมีการพยากรณ์โรคที่แย่กว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเนื้องอกเชิงลบของ GRP75 ใน GC ที่มีการทำงานของ p53 ปกติ อย่างไรก็ตาม p53 เป็นหนึ่งในยีนที่กลายพันธุ์บ่อยที่สุดใน GC (ซึ่งส่งผลต่อผู้ป่วยมากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์) ล2-15 ดังนั้นเราจึงตั้งสมมติฐาน ที่นอกเหนือจากการปราบปรามแบบคลาสสิกของกิจกรรม p53 แล้ว GRP75 อาจเกี่ยวข้องกับการชักนำ/รักษาการต้านทานยาแพลตตินั่มใน GC โดยใช้ลักษณะที่เป็นอิสระของ ap53-

ในการศึกษานี้ การแสดงออกที่สูงขึ้นของ GRP75 มีส่วนทำให้เกิดการดื้อต่อซิสพลาตินในเซลล์ SGC7901 และในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ ในทางกลไก GRP75 ชักนำ/รักษาความต้านทานของซิสพลาตินผ่านการควบคุมความสามารถในการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน/อะพอพโทติคและคุณสมบัติการโปรแกรมเมตาบอลิซึมซ้ำcistanche ออสเตรเลียในผู้ป่วย GC การแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP75 มีส่วนทำให้เกิดลักษณะก้าวร้าวและการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี ผลลัพธ์ของเราระบุว่า GRP75 ส่งเสริมการดื้อต่อซิสพลาตินใน GC และอาจเป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับทำนายการตอบสนองต่อการรักษาด้วยยาแพลตตินัมประโยชน์ของซิสแทนเช่การกำหนดเป้าหมาย GRP75 อาจให้ความเข้าใจใหม่เกี่ยวกับเคมีบำบัดแบบระบบ GC

ผลลัพธ์

ผลของ GRP75 ต่อความต้านทานซิสพลาตินในการสอบวิเคราะห์ความมีชีวิตของเซลล์ GC ถูกใช้เพื่อตรวจสอบความต้านทานของเซลล์ SGC7901~, Ipsos (uM) ของซิสพลาตินสำหรับเซลล์ SGC7901 และ SGC7901CR คือ: 5.518 เทียบกับ 72.46 (รูปที่ 1A) จากฐานข้อมูล KM-Plotter การแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ GRP75 บ่งชี้ว่ามีการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี (รูปที่ 1B) นอกจากนี้ การแสดงออกของ GRP75 ที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในเซลล์ SGC7901CR เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ SGC7901 ต้นกำเนิด (รูปที่ 1C) ซึ่งบ่งชี้ว่า GRP75 อาจมีส่วนทำให้เกิดการต้านทานซิสพลาติน เพื่อตรวจสอบสมมติฐานนี้ เซลล์ SGC7901~ ถูกทรานส์เฟกโดย scramble- หรือ GRP75 siRNA และ IC50s (uM) ของซิสพลาตินสำหรับเซลล์ SGC7901CK ที่ทรานส์เฟก- หรือ GRP75 siRNA คือ: 50.83 เทียบกับ 2086 ตามลำดับ (รูปที่ . 1D). ในทางตรงกันข้าม,

การแสดงออกมากเกินไปของ GRP75 โดยการเปลี่ยนถ่ายพลาสมิด GRP75 ไปเป็นเซลล์ SGC7901 แสดงให้เห็นว่า IC50 ของซิสพลาตินสำหรับพลาสมิดช่วงชิงหรือ GRP75 ที่ทรานส์เฟกเซลล์ SGC7901 มีค่าเท่ากับ 3.825 เทียบกับ 6.98 (รูปที่ 1E) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้เปิดเผยว่า GRP75 มีบทบาทสำคัญในการรักษา/กระตุ้นการต้านทานซิสพลาตินใน GC แต่กลไกยังคงมีการตรวจสอบเพิ่มเติม

กลไกที่เป็นไปได้ที่อยู่เบื้องหลัง GRP75 ทำให้เกิดการต้านทานซิสพลาติน

เราดาวน์โหลดชุดข้อมูล microarray GSE122130 (SGC7901CR เทียบกับ SGC7901) และ GSE14209 (เนื้อเยื่อ ทนต่อซิสพลาตินและไวต่อซิสพลาติน) จาก GEO จากนั้นจึงดำเนินการตามกระบวนการ GO-Biological และการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะ KEGG-Pathway ตาม DAVID และ 10 อันดับแรก ผลลัพธ์ถูกแสดงในรูปที่ 2A-D ความแตกต่างที่สำคัญของกระบวนการทางชีววิทยาระหว่างเซลล์ SGC7901C* และเซลล์ SGC7901 ได้แก่ การลดการเกิดออกซิเดชัน กระบวนการ apoptotic (รูปที่ 2A) การวิเคราะห์การเพิ่มสมรรถนะของ KEGG-Pathway พบว่าชุด DEG มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับวิถีการเผาผลาญ และ phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B ทางเดิน (PI3K/AKT) (รูปที่ 2B) การตอบสนองต่อยารวมอยู่ในความแตกต่างที่สำคัญของกระบวนการทางชีววิทยาระหว่างเนื้อเยื่อเนื้องอกที่ดื้อต่อซิสพลาตินและที่ไวต่อซิสพลาตินและวิถีทางเมแทบอลิซึมยังเป็นจุดเชื่อมโยงหลักในการวิเคราะห์การเสริมสมรรถนะ KEGG-Pathway (รูปที่ 2C, D) นอกจากนี้ เครือข่ายของโปรตีน 60 ตัวที่มีปฏิสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับ GRP75 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ฐานข้อมูลสตริง จากนั้นการวิเคราะห์ KEGG-Pathway ต่อรูปแบบว่าเส้นทางการเผาผลาญมีบทบาทสำคัญในระหว่าง GRP75 และผู้โต้ตอบ (รูปที่ 2E) จากผลลัพธ์เหล่านี้ เราคาดการณ์ว่าการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน/อะพอพโทซิสและการสร้างโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่อาจส่งเสริมการอยู่รอดและการเติบโตของ GC ซึ่งนำไปสู่การต้านทานซิสพลาติน อย่างไรก็ตาม กลไกของการมีส่วนร่วมของ GRP75 ในกฎระเบียบจำเป็นต้องศึกษาเพิ่มเติม (รูปที่ 2F)

ผลของ GRP75 ต่อการต่อต้านการเกิดออกซิเดชันและการต่อต้านการตายของเซลล์ ในที่นี้ ระดับ ROS ภายในเซลล์นั้นสูงขึ้นในเซลล์ SGC7901CR เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ต้นกำเนิด (รูปที่ 3A) ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ SGC7901Ck ต้องเผชิญกับสภาวะความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่ค่อนข้างสูง การศึกษาก่อนหน้านี้เปิดเผยว่า GRP75 เกี่ยวข้องกับการรักษาเสถียรภาพของ MMP ซึ่งเป็นแหล่งสำคัญของการสร้าง ROS ที่นี่ การล้มลงของ GRP75 ได้ยกเลิกการบำรุงรักษา MMP ในเซลล์ SGC7901CK ที่เกิดจากซิสพลาติน และการแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP75 มีผลตรงกันข้ามในเซลล์ SGC7901 (รูปที่ 3B)ซิสแทนเช่ โคเลสเตอรอลจากนั้น เราตรวจสอบความสัมพันธ์ระหว่าง GRP75 และการต่อต้านการเกิดออกซิเดชันและการต่อต้านการตายของเซลล์ ดังแสดงในรูปที่ 3C การทำให้ล้มลงของ GRP75 ลดระดับของปัจจัยนิวเคลียร์อีรีทรอยด์-2-ปัจจัยที่เกี่ยวข้อง 2 (NRF2) และยีนเป้าหมายปลายน้ำ (HO-1 และ NQO-1) ใน SGC7901 ~ เซลล์ และการแสดงออกมากเกินไปของ GRP75 แสดงผลตรงกันข้ามในเซลล์ SGC7901 ยิ่งกว่านั้น การล้มลงของ GRP75 หรือ NRF2 ในเซลล์ SGC7901CR ช่วยเพิ่มการสร้าง ROS ภายในเซลล์, อะพอพโทซิส (รูปที่ 3D) และแคสเปส-3 (รูปที่ S1) เสริมที่เกิดจากซิสพลาติน ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP75 ในเซลล์ SGC7901 ได้ลดทอนการสร้าง ROS ที่เกิดจากซิสพลาตินอย่างมีนัยสำคัญ กิจกรรมการตายของเซลล์ (รูปที่ 3E) และแคสเปส-3 (รูปที่ S1) เพิ่มเติม ผลลัพธ์เหล่านี้เปิดเผยว่า GRP75 รักษา/เหนี่ยวนำการต้านทานซิสพลาตินอาจเกิดจากการเหนี่ยวนำการต้านออกซิเดชันและการต้านอะพอพโทซิสในเซลล์ GC

ผลของ GRP75 ต่อการตั้งโปรแกรมเมแทบอลิซึมใหม่ ต่อไปเราตรวจสอบเพิ่มเติมโดยที่ GRP75 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโปรแกรมเมตาบอลิ หลักฐานที่เพิ่มขึ้นแสดงให้เห็นว่าเมแทบอลิซึมของเซลล์เนื้องอกไม่ใช่การเปลี่ยนแปลงที่ผิดปกติในวิถีเมแทบอลิซึมเดียว แต่เป็นการตั้งโปรแกรมใหม่ของเครือข่ายเมแทบอลิซึมของเซลล์ทั้งหมด7 เนื้องอกหรือเส้นทางการส่งสัญญาณแบบคลาสสิกจำนวนมากเกี่ยวข้องโดยตรงหรือโดยอ้อมในการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ เช่น PI3K/AKT, ปัจจัยกระตุ้นการขาดออกซิเจน la (HIF-la), c-myc และอื่นๆ"''819 ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่า GRP75 เป็น เกี่ยวข้องกับการสร้างโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ของเซลล์ GC ดังแสดงในรูปที่ 4A เราสังเกตเห็นการเพิ่มระดับ p-AKT, HIF-la และ c-myc ในเซลล์ SGC7901CR เมื่อเทียบกับเซลล์ SGC7901 ของผู้ปกครอง นอกจากนี้ ในเซลล์ SGC7901CR การล้มลงของ GRP75 ลดระดับโปรตีน p-AKT, HIF-la และ c-Myc ที่เหนี่ยวนำโดยซิสพลาติน และเป้าหมายปลายน้ำของพวกมันที่เกี่ยวข้องกับไกลโคไลซิส (HK2: hexokinase 2; PDK1: pyruvate dehydrogenase kinase l; และ LDHA: lactate dehydrogenase A chain) ในทางตรงกันข้าม การแสดงออกมากเกินไปของ GRP75 ในเซลล์ SGC7901 แสดงผลตรงกันข้าม (รูปที่ 4B, C) นอกจากนี้ การล้มลงของ GRP75 หรือ AKT ในเซลล์ SGC7901CR แสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญในการดูดซึมกลูโคสและความมีชีวิต/การเจริญเติบโตของเซลล์ที่เกิดจากซิสพลาติน อย่างไรก็ตาม การแสดงออกมากเกินไปของ GRP75 ในเซลล์ SGC7901 อย่างชัดเจน เพิ่มความสามารถในการดูดซึมกลูโคสและความมีชีวิต/การเจริญเติบโตของเซลล์ที่เกิดจากซิสพลาติน (รูปที่ 4D-F). โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า GRP75 รักษา/เหนี่ยวนำการต้านทานซิสพลาตินในเซลล์ GC อาจเกิดจากการเข้าร่วมในโปรแกรมเมตาบอลิซึมของ p-AKT, HIF-la และ c-myc ที่เป็นสื่อกลาง

การยืนยันข้อมูลในหลอดทดลองในแบบจำลองการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์ จากนั้นเราตรวจสอบความเกี่ยวข้องทางคลินิกที่อาจเกิดขึ้นของ GRP75 ในร่างกาย ข้อมูลการปลูกถ่ายวิวิธพันธุ์แสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วยซิสพลาตินเพียงอย่างเดียวหรือการล้มลงของ GRP75 เพียงอย่างเดียวสามารถยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกได้ อย่างไรก็ตาม การรักษาด้วยซิสพลาตินร่วมกับการล้มลงของ GRP75 ช่วยอำนวยความสะดวกในการยับยั้งการเติบโตของเนื้องอกที่เกิดจากซิสพลาตินอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5A) นอกจากนี้ การทดสอบ IHC และ qPCR พบว่า cisplatin บวก GRP75 siRNA ลดการแสดงออกของ Ki67, GRP75, NRF2, p-AKT และเป้าหมายปลายน้ำอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับการรักษาด้วยซิสพลาตินเพียงอย่างเดียว แต่เพิ่มการตายของเซลล์ (ตามที่กำหนดโดยการย้อมสี TUNEL, รูปที่ 5B , ค). โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า โดยการควบคุมความสามารถในการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน/การต่อต้านอะพอพโทซิสและการตั้งโปรแกรมการเผาผลาญใหม่ GRP75 ได้กระตุ้นการอยู่รอดและการเจริญเติบโตในร่างกาย ซึ่งนำไปสู่การต้านทานซิสพลาตินของ GC

การระบุ GRP75 เป็นปัจจัยส่งเสริมมะเร็งที่มีลักษณะเฉพาะและความสำคัญทางคลินิกของ GRP75 ใน GC

จากนั้นเราประเมินนิพจน์ GRP75 ในส่วนที่ต่อเนื่องกันของตัวอย่าง GC ดังที่แสดงในรูปที่ 6A เมื่อเปรียบเทียบกับเนื้อเยื่อในกระเพาะอาหารที่ไม่ใช่เนื้องอกที่อยู่ติดกัน พบว่าการแสดงออกของ GRP75 สูงขึ้นมากในเนื้อเยื่อ GC การแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP75 ถูกแสดงให้เห็นในเนื้อเยื่อ GC โดยคะแนนความเข้มของ IHC (รูปที่ 6B) การย้อมสีที่เข้มขึ้นสำหรับ GRP75 ยังถูกสังเกตด้วยการเพิ่มการจำแนก TNM ของระยะเนื้องอกที่เป็นมะเร็ง (รูปที่ 6C, D) จากนั้น เราแบ่งตัวอย่าง GC 116 ชิ้นออกเป็นสองกลุ่ม ("GRP75 ต่ำ" กับ " GRP75 สูง" ตามความเข้มของ IHC, รูปที่ 6E) เส้นผ่านศูนย์กลางตามขวางของเนื้องอกในกลุ่ม "GRP75 สูง" มีขนาดใหญ่กว่าในกลุ่ม "GRP75 ต่ำ" อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 6F) เราได้ตรวจสอบการพยากรณ์โรคทางคลินิกของ GRP75 ใน GC เพิ่มเติม การวิเคราะห์การอยู่รอดของ Kaplan-Meier ยังแสดงให้เห็นว่าผู้ป่วย GC ในกลุ่ม "GRP75 สูง" มีอัตราการรอดชีวิตโดยรวมที่แย่กว่าในกลุ่ม "GRP75 ต่ำ" (รูปที่ 6G)

การวิเคราะห์หลายตัวแปรระบุว่า GRP75 เป็นตัวทำนายอิสระสำหรับการอยู่รอดโดยรวม (ตารางที่ 1)ผลข้างเคียงของ cistanche deserticola,โดยสรุป ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า GRP75 มีบทบาทเฉพาะในความก้าวหน้าของ GC ชั้นนำ การดื้อยาซิสพลาติน และการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี การวิเคราะห์เมตาของ GRP75 ในระดับสูงด้วยแผนภาพโฟลว์การพยากรณ์โรคของการค้นหาและคัดเลือกวรรณกรรมและการวิเคราะห์เมตาแสดงในรูปที่ S2 เพิ่มเติม แบบจำลองสุ่มเอฟเฟกต์และแบบจำลองเอฟเฟกต์คงที่ถูกใช้ในการคำนวณและวิเคราะห์ค่า HR ซึ่งทั้งคู่พบว่า GRP75 ในระดับสูงมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับผลลัพธ์ของผู้ป่วยที่ไม่ดี HR ที่รวมกลุ่มคือ 1.91 (95 เปอร์เซ็นต์ CI 1.62 ถึง 2.25) โดยมี heterogeneity(I'=0.0 เปอร์เซ็นต์ ,p =0.559)(รูปที่ 7A) จากนั้นเราทำการวิเคราะห์กลุ่มย่อย ซึ่งแสดงให้เห็นว่าระดับการแสดงออกของ GRP75 ในมะเร็งทางเดินอาหาร (HR ที่รวบรวมไว้คือ 1.99,95 เปอร์เซ็นต์ CI 1.64 ถึง 2.43) มีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับการพยากรณ์โรคของการรอดชีวิตที่ไม่ดี แน่นอนว่า ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันยังพบในเนื้องอกอื่นๆ (ค่า HR ที่รวบรวมไว้คือ 1.74,95 เปอร์เซ็นต์ CI 1.29 ถึง 2.33) (รูปที่ 7B) ทั้งคู่

แผนภาพช่องทางของ Begg และการทดสอบของ Egger ใช้เพื่อประเมินอคติในการตีพิมพ์ที่เป็นไปได้ของการศึกษาที่รวบรวมมา ในการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่าง GRP75 และ OS ค่า p ของการทดสอบของ Begg และการทดสอบของ Egger คือ 0076 และ 0.024 ตามลำดับ (รูปที่ 7C และ D) อย่างไรก็ตาม การทดสอบของ Egger มีความไวสูงกว่าในการประเมินอคติของสิ่งพิมพ์ ดังนั้นวิธีการตัดแต่งและเติมจึงถูกนำมาใช้เพื่อให้ผลลัพธ์ของเราน่าเชื่อถือยิ่งขึ้น ดังแสดงในรูปที่ 7E ค่า HR ที่ปรับแล้วในแบบจำลองเอฟเฟกต์คงที่คือ 1.785 (95 เปอร์เซ็นต์ CI 1.530 ถึง 2.081, p<0.001), and="" in="" the="" random="" effect="" model="" was="" 1.792="" (95%="" ci="" 1.515="" to=""><0.001), which="" was="" not="" significantly="" different="" from="" overall="" hr.="" in="" our="" analysis,="" a="" high="" level="" of="" grp75="" showed="" a="" poor="" prognosis="" including="" but="" not="" limited="" to="" gastrointestinal="" cancer,="" which="" was="" highly="" consistent="" with="" our="">

การอภิปราย

ในการศึกษานี้ เราใช้สารเคมีบำบัดอันดับหนึ่งสำหรับผู้ป่วย GC ซึ่งเป็นยาแพลตตินัม ยาแพลตตินั่มสามารถจับกับกัวนีนบนสายโซ่ DNA ได้อย่างโควาเลนต์ ดังนั้นจึงขัดขวางการจำลองแบบและการถอดรหัสของ DNA2 อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการดื้อยาและผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ การระบุกลยุทธ์การรักษาแบบใหม่เพื่อย้อนกลับการดื้อยาในผู้ป่วย GC จึงมีความจำเป็นเร่งด่วน นอกจากนี้ ผู้ป่วย GC พัฒนาการดื้อยาหลังจากได้รับ cisplatin หลายหลักสูตร และผลลัพธ์ของเราพบว่าเซลล์ SGC7901~ มีความต้านทานต่อซิสพลาตินอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ SGC7901

GRP75 (mortalin/mot-2/HSPA9) มีบทบาทสำคัญในการควบคุมการเริ่มต้นและความก้าวหน้าของมะเร็งในมนุษย์-7 เมื่อไม่นานมานี้ เป็นที่ชัดเจนว่า GRP75 ยังมีบทบาทสำคัญในการดื้อยาเคมีบำบัด "นอกจาก GRP75 แล้ว โปรตีนช็อกจากความร้อนอื่นๆ ยังมีบทบาทสำคัญในการดื้อยาซิสพลาตินผ่าน PI3K/AKT/NF-KB และวิถีทางอื่นๆ21-24 อย่างไรก็ตาม ไม่ค่อยรายงานกลไกระดับโมเลกุลของ GRP75 และความต้านทาน cisplatin ในที่นี้ การศึกษาของเราเปิดเผยว่า GRP75 ส่งเสริมความสามารถในการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน/การตายของเซลล์และปรับเปลี่ยนโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ซึ่งนำไปสู่การดื้อต่อซิสพลาตินในเซลล์ GC นอกจากนี้เรายังพบว่า GRP75 ได้รับการควบคุมใน เซลล์ SGC7901~ และในตัวอย่างเนื้อเยื่อจากผู้ป่วย และมีความสัมพันธ์กับการดื้อยา การรอดชีวิต การเติบโต และผลลัพธ์ที่ไม่ดี ในขณะเดียวกัน การวิเคราะห์หลายตัวแปรระบุว่า GRP75 เป็นตัวทำนายอิสระสำหรับการอยู่รอดโดยรวม นอกจากนี้ การวิเคราะห์เมตายังระบุว่า ระดับสูงของ GRP75 แสดงให้เห็นการพยากรณ์โรคที่ไม่ดี ซึ่งรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง GC ซึ่งสอดคล้องกับการวิจัยของเราอย่างมาก ผลลัพธ์ทั้งหมดข้างต้นยืนยันว่าการกำหนดเป้าหมาย GRP75 สามารถทำได้ คาดว่าจะกลายเป็นแนวทางใหม่ในการย้อนกลับการดื้อยาซิสพลาตินและปรับปรุงการพยากรณ์โรคของผู้ป่วย GC

ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยา เซลล์ต้องสัมผัสกับ ROS อย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้จากปัจจัยภายนอกและเมแทบอลิซึมของแอโรบิกภายในเซลล์ ในฐานะที่เป็นดาบสองคม ROS ที่เหมาะสมเป็นโมเลกุลสัญญาณที่สำคัญที่ควบคุมการทำงานปกติของเซลล์ ในขณะที่ ROS ที่มากเกินไปทำให้เกิดการตายของเซลล์ ดังนั้นจึงมีระบบควบคุมสารต้านอนุมูลอิสระที่แม่นยำในร่างกายเพื่อรักษาสมดุลของรีดอกซ์และกระบวนการ apoptotic 20 อย่างไรก็ตาม ระดับ ROS ของเนื้องอกโดยทั่วไปสูงกว่าการควบคุมปกติของต้นกำเนิดเนื้อเยื่อเดียวกันอย่างมีนัยสำคัญ ระบบต่อต้านอนุมูลอิสระในเซลล์เนื้องอก โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับเซลล์เนื้องอกที่ดื้อยา27-29 ผลลัพธ์ของเรายืนยันว่าเซลล์ SGC7901CR แสดงระดับ ROS ที่ค่อนข้างสูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ SGC7901 และ GRP75 ยกระดับความสามารถในการต้านออกซิเดชัน/การตายของเซลล์ เซลล์เนื้องอกมีประวัติความผิดปกติของการเผาผลาญมายาวนาน ในช่วงต้นทศวรรษที่ 1930 อ็อตโต วาร์เบิร์ก ค้นพบว่าเซลล์เนื้องอกชอบไกลโคไลซิส แม้ภายใต้สภาวะที่เพียงพอต่อออกซิเจน เซลล์เนื้องอกยังคงรักษาอัตราไกลโคไลซิสในระดับสูงสำหรับการสร้าง ATP รูปแบบการเผาผลาญที่ผิดปกตินี้เรียกว่า "เอฟเฟกต์ Warburg" 3031 การเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมที่นำโดยผลของ Warburg เพิ่งถูกเรียกว่าการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ และการศึกษาการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ได้ให้ความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับเมแทบอลิซึมของเซลล์ GC มีการแสดงให้เห็นว่าเซลล์ GC และเซลล์ปกติมีความแตกต่างในการเผาผลาญไม่เพียงแต่ในการเผาผลาญกลูโคสเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการเผาผลาญของไขมันและกรดอะมิโน³2-35 ในงานวิจัยนี้ เราพบว่าการเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญกลูโคสเป็นหนึ่งในแกนหลัก เชื่อมโยงการรักษาการเติบโตของเซลล์ ในที่สุดก็นำไปสู่ความต้านทานต่อ GC cisplatin

ดังที่เราได้กล่าวไปแล้ว เนื้องอกแบบคลาสสิกและวิถีการส่งสัญญาณ เช่น PI3K/AKT, HIF-la และ c-myc เกี่ยวข้องโดยตรงหรือโดยอ้อมในการเขียนโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ การเปิดใช้งานเส้นทาง PI3K/AKT ในเซลล์เนื้องอกช่วยเพิ่มกิจกรรมการเผาผลาญจำนวนมาก ประการแรก เซลล์ยอมให้เซลล์รับกลูโคส กรดอะมิโน และสารอาหารอื่นๆ ประการที่สอง AKT เพิ่มไกลโคไลซิสและการผลิตแลคเตทผ่านผลกระทบต่อการแสดงออกของยีนและกิจกรรมของเอนไซม์ และเพียงพอที่จะทำให้เกิดผล War-burg ในเซลล์มะเร็ง ประการที่สาม การกระตุ้นวิถีทางนี้ช่วยเพิ่มการสังเคราะห์ทางชีวโมเลกุลของโมเลกุลขนาดใหญ่ และกระตุ้นการแสดงออกของยีน lipogenic และการสังเคราะห์ไขมัน'7 นอกจากนี้ GRP75-กระตุ้น AKT และไคเนสโปรตีนควบคุมสัญญาณภายนอกเซลล์ 1 และ 2 ยับยั้งการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของ Bax และการตายของเซลล์ 8 เซลล์เนื้องอกที่ปรับให้เข้ากับภาวะขาดออกซิเจนที่เกี่ยวข้องกับการโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ผ่านการปรับยีนเป้าหมาย HIF-la เพื่อกระตุ้นการดูดซึมกลูโคส ไกลโคไลซิส การผลิตและการหลั่งกรดแลคติก การจัดเก็บไกลโคเจน กลูตามีน cat-abolism³ และส่งเสริมการสะสมของไตรกลีเซอไรด์ในหยดไขมัน³ เมื่อไม่นานมานี้ เป็นที่ชัดเจนว่า GRP75 สามารถจับกับ HIF-la โดยเฉพาะและกำหนดเป้าหมายเยื่อหุ้มไมโตคอนเดรียภายนอกที่เกี่ยวข้องกับ VDAC1 และ HK2 ซึ่งป้องกันการตายของเซลล์ C-myc สามารถไกล่เกลี่ยการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ได้หลายวิธี และโปรแกรมเมตาบอลิซึมที่อาศัย c-myc ส่วนใหญ่ประสบความสำเร็จโดยส่งผลกระทบต่อไมโตคอนเดรีย ในอีกด้านหนึ่ง c-myc ยังส่งเสริม glycolysis โดยควบคุมการแสดงออกของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับ glycolytic โดยตรง รวมถึง LDHA, HK2 และ PDK11938 ในทางกลับกัน c-myc กระตุ้นเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญของกลูตามีนผ่านการถอดรหัสส่งเสริมการใช้ กลูตามีนโดยไมโทคอนเดรียในเซลล์เนื้องอก ผลกระทบนี้เรียกว่า "glutaminolysis" นอกจากนี้ GRP75-overexpression ลด Cyclin-B1 และปรับ Cyclin-D1 และ c-myc เพื่อส่งเสริมการเติบโตของเซลล์มะเร็งรังไข่* จากผลลัพธ์ของเราในปัจจุบัน เราได้ให้ความเข้าใจใหม่เกี่ยวกับการดื้อต่อ GC cisplatin ผ่าน GRP75 ว่าเป็นลิงค์ที่มีความสำคัญในการควบคุมเครือข่ายการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมของเนื้องอก

บทสรุป

โดยสรุป เราแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกที่มากเกินไปของ GRP75 สามารถส่งเสริมการอยู่รอด/การเจริญเติบโตในเซลล์ GC โดยการควบคุมการต่อต้านการเกิดออกซิเดชัน/การตายของเซลล์ และเครือข่ายการตั้งโปรแกรมเมตาบอลิซึมใหม่ ซึ่งทำให้เกิดความต้านทานซิสพลาติน

วัสดุและวิธีการ

เซลล์ รีเอเจนต์ และสภาวะการเพาะเลี้ยง

GC cell lines, SGC7901 cells (mutant-type of p53), and cisplatin-resistance cells (SGC7901CB) were obtained from and STR identified by KeyGENE Bio Co. Ltd (Nanjing, China). Cisplatin(Pt(NH3)2Clz, >ความบริสุทธิ์ 99.0 เปอร์เซ็นต์) ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) เพาะเลี้ยงเซลล์ใน RPMI-1640ขนาดกลาง (Gibco, Grand Island, NY, USA), เสริมด้วย 10 เปอร์เซ็นต์ของ fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin (Gibco) และบ่ม ใน 5 เปอร์เซ็นต์ CO2 ที่ 37 องศา สำหรับการบำรุงรักษาฟีโนไทป์ที่ต้านทานซิสพลาติน เซลล์ SGC7901CR ถูกบ่มในตัวกลางที่มีซิสพลาติน (5μM)

Xenografts และการรักษา

การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง และสัตว์ได้รับการปฏิบัติอย่างมีมนุษยธรรมและเกี่ยวกับการบรรเทาความทุกข์ทรมาน หนูเปลือย BALB/c ได้มาจากศูนย์สัตว์ทดลองของ SLRC (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) และเก็บรักษาตามอัตภาพดังที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้*l สำหรับการศึกษาการปลูกถ่ายวิวิธวิสัย เซลล์ SGC7901CK ขนาด 2×10 องศาใน 100ul matrigel ถูกฉีดเข้าใต้ผิวหนังที่ด้านข้างของหนูเมาส์เป็นเวลา 5 สัปดาห์ เพื่อตรวจสอบผลกระทบของ GRP75 ต่อความต้านทานซิสพลาตินของ GC เราทำการทดสอบการฉีดในเนื้องอกและเยื่อบุช่องท้อง โดยสังเขป หนูถูกสุ่มแบ่งออกเป็น 4 กลุ่ม (หนู 5 ตัวต่อกลุ่ม):(1)MOCK,(2)GRP75KD,(3)MOCK＋cisplatin และ （4) GRP75 KD＋cisplatin 100ul ของ siRNA (si-Con หรือ si-GRP75, 100nM) ถูกฉีดเข้าเนื้องอกทุกๆ 3 วัน กลุ่มที่ได้รับการบำบัดด้วยซิสพลาติน (5 มก./กก.) ถูกฉีดเข้าช่องท้อง 3 ครั้งต่อสัปดาห์ และกลุ่มอื่น ๆ ถูกทำให้ผสมด้วยน้ำเกลือในปริมาณที่เท่ากัน วัดเนื้องอกทุกสัปดาห์และคำนวณปริมาตรโดยใช้สูตร: V=Y (ความกว้าง2) หลังจากผ่านไป 5 สัปดาห์ หนูถูกสังเวย และเนื้อเยื่อเนื้องอกถูกนำออกเพื่อทำการตรวจสอบต่อไป

ผู้ป่วยและตัวอย่างเนื้อเยื่อ

การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมทางการแพทย์ของโรงพยาบาลในเครือแห่งที่สอง มหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง และโรงพยาบาลในเครือฉางโจวหมายเลข 2 ของมหาวิทยาลัยการแพทย์หนานจิง และได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้ป่วยแต่ละราย ข้อมูลทางคลินิก - พยาธิวิทยาถูกระบุไว้ในตารางเสริม S1 microarray เนื้อเยื่อถูกสร้างขึ้นโดย Zhuoli Biotechnology Co.Ltd (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน) ตามที่เราอธิบายไว้ก่อนหน้านี้*

การถ่ายเซลล์

สำหรับการถ่ายสำเนา สัญญาณรบกวนและ pcDNA-3.1-GRP75-ธงถูกสังเคราะห์โดย General Biotech (เซี่ยงไฮ้ ประเทศจีน); ในขณะที่ siRNAs ถูกระบุไว้ในตารางเสริม S2 เซลล์ถูกทรานส์เฟกชั่วคราวผ่านทางรีเอเจนต์ lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยย่อ เซลล์ถูกเคลือบบนเพลต 6-หลุมที่ความหนาแน่นของเซลล์ 1×10 องศาในตัวกลาง RPMI 1640 ที่มี FBS 10 เปอร์เซ็นต์โดยไม่มียาปฏิชีวนะ หลังจากการฟักตัวเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกทรานส์เฟกชั่วคราวด้วยสัญญาณรบกวน 5 นาโนกรัม/มิลลิลิตรหรือ GRP{12}}แฟล็ก หรือ 20 นาโนโมลาร์ si-Con หรือ si-GRP75 เป็นเวลา 12 ชั่วโมง หลังจากการทรานส์เฟกชัน เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารสดที่เสริมด้วย FBS 10 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลาอีก 24 ชั่วโมงก่อนที่จะถูกใช้สำหรับการทดลองอื่นๆ

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ (qPCR)ไพรเมอร์ที่ใช้แสดงอยู่ในตารางเสริม S3 การแยก RNA ทั้งหมด การถอดรหัส RNA เป็น cDNA และประสิทธิภาพของ qRT-PCR ด้วยเครื่อง Applied Biosystems 7300HT เป็นไปตามการศึกษาก่อนหน้านี้ 2 -actin ได้รับการขยายเพื่อให้แน่ใจว่า cDNA มีความสมบูรณ์และทำให้การแสดงออกเป็นปกติ การเปลี่ยนแปลงแบบพับในการแสดงออกของแต่ละยีนคำนวณโดยวิธีรอบขีดจำกัดเปรียบเทียบ (Ct) โดยใช้สูตร 2- (4ACt)

บทความนี้คัดลอกมาจาก Dai et al. การค้นพบเซลล์ตาย (2021) 7:140 https://doi.org/10.1038/s41420-021-00517-w