MicroRNA ที่ได้จากนม Exosome-2478 ยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิสผ่านเส้นทาง Akt-GSK3β

ติดต่อ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

อินซอนแบและซังฮุนคิม

นามธรรม:Exosomes มีส่วนร่วมในการสื่อสารระหว่างเซลล์โดยการถ่ายโอนโมเลกุลจากผู้บริจาค ไปยังเซลล์ผู้รับ Exosomes พบได้ในของเหลวในร่างกายต่าง ๆ รวมถึงเลือดปัสสาวะไขสันหลังอักเสบ ของเหลวและนม นม exosomes มีโมเลกุล microRNA ภายนอกจํานวนมาก ไมโครอาร์เอ็นเอคือ RNA ขนาดเล็กที่ไม่ได้เข้ารหัสและมีบทบาทสําคัญในกระบวนการทางชีวภาพ ทางชีววิทยาที่เฉพาะเจาะจง หน้าที่ของ exosomes นมยังไม่เป็นที่เข้าใจกันดี ในการศึกษานี้เราได้ตรวจสอบผลของนม เอ็กโซโซมในการผลิตเมลานินในเซลล์เนื้องอกและเมลาโนไซต์ เราพบว่าเอ็กโซโซมนมลดลงเนื้อหาเมลานินกิจกรรมไทโรซิเนสและการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเมลาโนเจเนซิสใน เซลล์เนื้องอกและเมลาโนไซต์ miR-2478 เฉพาะวัวใน exosomes ยับยั้งการผลิตเมลานิน เราพบว่า Rap1a เป็นยีนเป้าหมายโดยตรงของ miR-2478 ในเซลล์เนื้องอกและเมลาโนไซต์ MiR-2478 การแสดงออกมากเกินไปทําให้การแสดงออกของ Rap1a ลดลงซึ่งนําไปสู่การผลิตเมลานินที่ควบคุมลดลงและ การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเมลาโนเจเนซิส การยับยั้งการแสดงออกของ Rap1a ลดลงเมลาโนเจเนซิสผ่านทางเดินสัญญาณ Akt-GSK3β ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนบทบาทของ miR-2478 ที่ได้มาจากนม exosomes เป็นตัวควบคุมของเมลาโนเจเนซิสผ่านการกําหนดเป้าหมายโดยตรงของ Rap1a ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า exosomes นมอาจเป็นส่วนผสมที่สัมผัสได้ถึงประโยชน์ในการปรับปรุงขาว.

คำ: เมลาโนเจเนซิส;นม exosome; miR-2478; แร็พ1a

เฮอร์บา cistanchesเป็นส่วนผสมที่ยับยั้งเมลานิน

1. บทนํา

เวชสําอางเป็นคําผสมที่รวมเครื่องสําอางและยาและยาและ หมายถึงเครื่องสําอางที่มีส่วนผสมในการทํางานที่มีผลทางการแพทย์ [1] ในอดีตผิวหนัง ได้รับการปรับปรุงผ่านขั้นตอนผิวหนัง แต่เมื่อเร็ว ๆ นี้ความสนใจในเวชสําอาง ได้รับการเพิ่มขึ้นเนื่องจากความต้องการของผู้บริโภคที่จะได้รับผลกระทบเหล่านี้ผ่านเครื่องสําอาง. อุตสาหกรรมเครื่องสําอางยังได้แสดงความสนใจเพิ่มขึ้นในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมาในการใช้ ส่วนผสมเวชสําอางแบบใหม่ [2] เครื่องสําอางที่ใช้งานได้รวมถึงผลิตภัณฑ์ที่ช่วยให้ผิวขาวกระจ่างใสโดยป้องกันการสะสมของเมลานินบนผิวหนัง

เมลานินซึ่งเป็นองค์ประกอบสําคัญที่กําหนดสีผิวและเส้นผมช่วยปกป้องผิว ผิวหนังจากรังสีอัลตราไวโอเลต [3] อย่างไรก็ตามการก่อตัวของเมลานินมากเกินไปทําให้เกิดความไม่สม่ําเสมอ สีผิว เช่น จุดด่างดําและฝ้ากระ [4] ปัจจัยการถอดความไมโครพทาลเมีย (MITF) เป็นปัจจัยหลัก ตัวควบคุมการพัฒนาเมลาโนไซต์ ไทโรซิเนส (TYR) เป็นเอนไซม์ที่สําคัญที่สุดของ การสังเคราะห์เมลานิน กระบวนการสังเคราะห์เมลานินเกิดจากการเปิดใช้งาน TYR ผ่าน MITF ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่สําคัญที่เกี่ยวข้องในระยะเริ่มต้นของกระบวนการสังเคราะห์เมลานิน และใช้ L-form ของไทโรซีนหรือ DOPA เป็นสารตั้งต้นในการสร้างเมลานิน [5].

MicroRNAs (miRs) เป็น RNA ที่ไม่ได้เข้ารหัสสั้น ๆ ซึ่งมีส่วนร่วมในกระบวนการทางชีวภาพหลายอย่างโดยการควบคุมการแสดงออกของยีนหลังการถอดความ [6] การศึกษายังได้ค้นพบ การควบคุมการสังเคราะห์เมลานินโดย microRNAs ตัวอย่างเช่นมีรายงานว่า miR-143-5p กําหนดเป้าหมายไปที่ยีน Tak1 และลดการแสดงออกของ MITF จึงยับยั้งเมลานิน การสังเคราะห์ [7] MiR-125b ซึ่งเป็นตัวควบคุมเชิงลบของเมลาโนเจเนซิส, ได้รับการแสดงให้เห็น เพื่อควบคุมยีนผิวคล้ํา SH3BP4 [8] และ miR-675 ใน exosomes ที่หลั่งออกมาจาก เคราติโนไซต์ยับยั้งเมลาโนเจเนซิสโดยการกําหนดเป้าหมาย MITF [9]

Exosomes เป็นถุงหุ้มเซลล์ขนาด 30-200 นาโนเมตรและมี DNA, RNA และเปปไทด์ [10] ส่วนประกอบภายในของ exosomes สามารถส่งข้อมูลไปยังเซลล์ที่อยู่ติดกันหรือระยะไกลได้อย่างปลอดภัยโดยไม่ถูกย่อยสลายโดยเอนไซม์ในของเหลวชีวภาพดังนั้น ส่งผลต่อสภาพแวดล้อมขนาดเล็กรอบเซลล์ต่างๆ [11]เอ็กโซโซมนมมาจากนม ถุงนอกเซลล์ที่มีความเสถียรในกระบวนการย่อยอาหารของมนุษย์ [12] เอ็กโซโซมที่สกัดจากนมวัวไม่เพียงแต่มีโปรตีนหลายชนิดเช่นเคซีนและแลคโตโกลบูลิน แต่ยังรวมถึง microRNAs ซึ่งทําหน้าที่เป็นสินค้า [13–15] นมวัวมี microRNAs ที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันเช่น miR-15b, miR-27b, miR-34a และ miR-10 ไมโครอาร์เอ็นเอเหล่านี้โดยเฉพาะอย่างยิ่ง อุดมสมบูรณ์ในน้ํานมเหลือง [16]

การศึกษาบางชิ้นแสดงให้เห็นว่าส่วนประกอบของนมยับยั้งเมลาโนเจเนซิสในเมลาโนไซต์ ตัวอย่างเช่น โปรตีนเช่น β-lactoglobulin และ κ-casein ในนมควบคุมเมลาโนเจเนซิส [17,18] พบสารเหนือธรรมชาติของแลคโตบาซิลลัสเฮลเวติกัส NS8-หมักนม เพื่อยับยั้งความเสียหายจากรังสียูวีและรอยดําในผิวหนัง [19] อย่างไรก็ตามยังไม่มีรายงานว่า microRNAs ในนมวัวเกี่ยวข้องกับผิวหนังหรือไม่ขาวแม้ว่า มีไมโครอาร์เอ็นเอ 79 รายการอยู่ในนม exosomesดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้เราจึงตรวจสอบ ว่า exosomes นมที่มี microRNAs ยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเมาส์และ เซลล์เนื้องอกของมนุษย์และเมลาโนไซต์

2. วัสดุและวิธีการ

2.1 การเพาะเลี้ยงเซลล์

เซลล์เมลาโนมา B16F10 ของเมาส์ได้รับการเพาะเลี้ยงในสื่อ Eagle ดัดแปลงของ Dulbecco (DMEM, ไฮโคลน, โลแกน, ยูทาห์, สหรัฐอเมริกา) เซลล์ MNT-1 ของมะเร็งผิวหนังของมนุษย์เติบโตในสื่อที่จําเป็นขั้นต่ํา (MEM, Hyclone) สื่อทั้งหมดเสริมด้วยทารกในครรภ์ 10% เซรั่มวัว (FBS, ไฮโคลน, สหรัฐอเมริกา) และ 1% ของสารละลายเพนิซิลลิน-สเตรปโตมัยซิน ปกติ เมลาโนไซต์ผิวหนังของมนุษย์ (NHEM, PromoCell, ไฮเดลเบิร์ก, เยอรมนี) ที่ทางเดิน หมายเลข 5 หรือ 6 ยังคงอยู่ในสื่อการเจริญเติบโตของเมลาโนไซต์ (PromoCell) เซลล์เหล่านี้ ถูกบ่มที่ 37 ◦C ในสภาพบรรยากาศที่มีความชื้นสูงซึ่งมี CO2 5%

2.2 การทําให้บริสุทธิ์ของ Exosomes

นมเชิงพาณิชย์ (1 มล.) ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 2000× กรัมเป็นเวลา 10 นาทีจากนั้นก็สุดยอด ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000× กรัมเป็นเวลา 10 นาที นมเหนือธรรมชาติถูกส่งผ่าน ตัวกรอง 0.45 μm และตัวกรอง 0.2 μm สารละลายที่ได้ (300 μL) ผสมกับ น้ําเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS) และ 300 μL ของสารละลายตกตะกอน Exoquick exosome (ชีววิทยาศาสตร์ระบบ, พาโลอัลโต, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) และบ่มเพาะเป็นเวลา 30 นาที ส่วนผสมคือ หมุนเหวี่ยงที่ 10,000× กรัมเป็นเวลา 30 นาทีเพื่อให้ได้เม็ด exosome ซึ่งถูก resuspended ต่อไป ในพีบีเอส การกระจายขนาดของเอ็กโซมถูกกําหนดบน Zetasizer Nano ZS 90 (เครื่องดนตรีมัลเวิร์น, อัลเมโล, ฝรั่งเศส) exosomes ถูกเก็บไว้ที่ −80 ◦C เพื่อการใช้งานต่อไป

2.3 กล้องจุลทรรศน์ไครโอ-อิเล็กตรอน

สารแขวนลอย exosomes สดขนาด 3 μL ถูกดูดซับไปยังแสงที่ปล่อยออกมา ตารางเคลือบคาร์บอนพรุน (2 / 2-3 C-flat; โปรโตชิปส์, มอร์ริสวิลล์, นอร์ทแคโรไลนา, สหรัฐอเมริกา) ซึ่ง ถูก blotted แล้วสําหรับ 3 s ที่ 4 ◦C และกระโดดแช่แข็งโดยใช้ Vitrobot Mark IV (เทอร์โมฟิชเชอร์ วิทยาศาสตร์, ลาฟาแยต, CO, สหรัฐอเมริกา) กริดถูกเก็บไว้ในไนโตรเจนเหลวจากนั้นย้ายไปที่ ผู้ถือตัวอย่าง Cryo Gatan 626 (Gatan, Pleasanton, CA, USA) ตัวอย่างถูกถ่ายภาพ ด้วยกําลังขยายเล็กน้อย 29,000× ในกล้องจุลทรรศน์ไครโออิเล็กตรอน (FEI Tecnai F20 TEM, FEI, Hillsboro, OR, USA) พร้อมกับปืนปล่อยสนามมาตรฐาน (s-FEG) และ K2 กล้องซัมมิท (Gatan) ที่แรงดันไฟฟ้าเร่ง 200 kV

2.4. การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ (การทดสอบ WST)

เซลล์เมลาโนมา (B16F10, MNT-1) และเมลาโนไซต์ของมนุษย์ (NHEM) ถูกเพาะที่ 4 × 103 เซลล์ / หลุมในแผ่น 96 หลุมและรับการรักษาด้วยนม exosomes(20 และ 50 ไมโครกรัม/มล.) หรือไมโครอาร์เอ็นเอเลียนแบบ (โอลิโกนิวคลีโอไทด์สองเส้นของอาร์เอ็นเอ) สําหรับการทดลองแต่ละครั้ง ที่ ระบุจุดเวลาความมีชีวิตของเซลล์ถูกวัดโดยใช้การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ที่เพิ่มขึ้น ชุด EZ-CyTox (บริการ Daeil Lab, โซล, เกาหลี) ตามคําแนะนําของผู้ผลิต การดูดกลืนแสงวัดที่ 450 นาโนเมตรบนเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ไมโครเพลท Vmax (อุปกรณ์โมเลกุล, ซานโฮเซ, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา)

2.5. การวัดปริมาณเมลานิน

เซลล์เมลาโนมาและเมลาโนไซต์ได้รับการรักษาด้วยนม exosomes(20 และ 50 ไมโครกรัม/มล.) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง หลังจากล้างสองครั้งด้วย PBS ที่เย็นยะเยือกเซลล์จะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 2500× กรัมสําหรับ 10 นาที เม็ดเซลล์ถูก resuspended ที่ 90 ◦C เป็นเวลา 30 นาทีใน 1 N NaOH ที่มี 10% ของไดเมทิลซัลฟอกไซด์ วัดปริมาณเมลานินทั้งหมดบนไมโครเพลท Vmax เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (อุปกรณ์โมเลกุล) ที่ 405 นาโนเมตร

2.6. การทดสอบกิจกรรมไทโรซิเนส

เซลล์เมลาโนมาและเมลาโนไซต์ถูกบ่มด้วยนม exosomesเป็นเวลา 48 ชั่วโมง เซลล์ ถูกล้างสองครั้งด้วย PBS และ lysed กับ PBS ที่มี 1% ของ Triton X-100 และ 0.1 mM ฟีนิลเมธาเนซัลโฟนิลฟลูออไรด์ หลังจากการหมุนเหวี่ยงสิ่งเหนือธรรมชาติก็ถูกรวบรวมและ ถ่ายโอนไปยังจาน 96 หลุม หลังจากการเพิ่ม 0.1 M L-3,4-dihydroxyphenylalanine ตัวอย่างถูกบ่มที่ 37 ◦C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง กิจกรรมไทโรซิเนสถูกวัดบนพื้นฐาน ของการดูดซับที่ 475 นาโนเมตรโดยใช้ไมโครเพลทสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ (อุปกรณ์โมเลกุล)

เฮอร์บา cistanches

2.7. เนื้อเยื่อผิวหนังของมนุษย์

เทียบเท่ากับผิวหนังที่มีเมลาโนไซต์ (MelanoDerm, MEL-300B) ได้มาจาก MatTek (Ashland, MA, USA) และได้รับการดูแลใน EPI-100-NMM-113- ปานกลาง เอ็กโซโซมนมถูกนําไปใช้กับเนื้อเยื่อ MelanoDerm ในวันที่ 1, 3, 7, 9 และ 12 PBS ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ เนื้อเยื่อถูกถ่ายภาพในวันที่ 3, 7, 9, 12 และ 14 วัดเม็ดสีโดยการเปรียบเทียบการเปลี่ยนแปลงในค่า L (Adobe Photoshop ซีซี 2015). เนื้อหาเมลานินในเนื้อเยื่อผิวหนังของมนุษย์ถูกวัดในวันที่ 14 โดย Solveable การทดสอบเมลานิน สั้น ๆ เนื้อเยื่อ MelanoDerm ถูกละลายโดยใช้ละลายได้ (Perkin เอลเมอร์, วอลแทม, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) และบ่มเพาะข้ามคืนที่ 60 ◦C. ตัวอย่างถูกกระแสน้ําวนและ จากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 16,500× กรัมเป็นเวลา 5 นาที ผู้ยิ่งใหญ่ถูกโอนเข้าไปในบ่อน้ําของ แผ่น 96 หลุมและอ่านที่ 490 นาโนเมตรโดยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์

3. ผลลัพธ์

3.1 ลักษณะของ Exosomes ที่แยกได้จากนม

ในการตรวจสอบลักษณะของ exosomes ที่สกัดจากนมวัวเราก่อนอื่น วัดขนาดของ exosomes โดยการกระเจิงแสงแบบไดนามิก ส่งผลให้เอ็กโซโซม สกัดจากนมพบว่ามีเส้นผ่านศูนย์กลาง 80–190 นาโนเมตร (รูปที่ 1A) เพื่อนม exosomeการทําให้บริสุทธิ์ส่วนผสม Exoquick-นมเหนือธรรมชาติถูกหมุนเหวี่ยงเพื่อให้ได้มา เม็ดนม exosome การแสดงออกของ CD9, TSG101 และ HSP70 เป็นเครื่องหมาย exosomal ถูกตรวจพบในเม็ด แต่โปรตีนเหล่านี้ไม่มีอยู่ใน supernatant (รูปที่ 1A) นอกจากนี้สัณฐานวิทยาทรงกลมและขนาดของ exosomes ได้รับการยืนยันโดยกล้องจุลทรรศน์ cryo-electron (รูปที่ 1B) พบว่า Exosomes มีรูปร่างกลมจนถึง เส้นผ่านศูนย์กลาง 200 นาโนเมตร ต่อไปเราจะตรวจสอบว่า exosomes ที่สกัดจากนมเป็นหรือไม่ ถ่ายโดยเซลล์ เซลล์ B16F10 ของเมาส์ถูกบ่มด้วยนม exosomesติดป้ายกํากับด้วย สีย้อมเรืองแสง lipophilic PKH26 ด้วยเหตุนี้เราจึงสังเกตเห็นว่า exosomes ที่มีป้ายกํากับนั้น อยู่ภายในเซลล์ (รูปที่ S1)

3.2. กิจกรรมไทโรซิเนสและการผลิตเมลานินที่ยับยั้งโดยเอ็กโซโซมนมในเซลล์ B16F10

ต่อไปเราจะตรวจสอบผลของ exosomes ที่สกัดได้ต่อความมีชีวิตของเซลล์ ดังที่ปรากฎ ในรูปที่ 2A เราเปิดเผยว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสําคัญในความมีชีวิตของเซลล์โดยไม่คํานึงถึง ของความเข้มข้นของ exosome

เพื่อตรวจสอบเซลล์ผิวที่เป็นไปได้-ขาวผลของนม exosomes, เซลล์ถูก รักษาด้วยนม exosomes เราพบว่ากิจกรรมไทโรซิเนสในเซลล์ที่สัมผัสกับนม exosomes ที่ความเข้มข้น 20 หรือ 50 μg / mL ลดลง 43% และ 59% ตามลําดับ (รูปที่ 2B) เนื่องจากการลดการทํางานของเอนไซม์ไทโรซิเนสสามารถยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินได้จึงวัดปริมาณเมลานินหลังการรักษาด้วยนม exosomes เราตั้งข้อสังเกต การยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเซลล์ที่สัมผัสกับนม exosomes(20 หรือ 50 μg/mL) เพิ่มขึ้น 45% และ 55% ตามลําดับ (รูปที่ 2C) นอกจากนี้ การแสดงออกของ MITF mRNA ลดลง เมื่อความเข้มข้นของนม exosomes เพิ่มขึ้น ระดับของ MITF mRNA ลดลงโดย 59% ในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย exosomes 20 μg/mL และ 84% ในเซลล์ที่รับการรักษาด้วย เอ็กโซโซม 50 ไมโครกรัม/มล. ตามลําดับ (รูปที่ 2D) ไทโรซิเนส (TYR) นิพจน์ mRNA ด้วย ลดลง 49% และ 76% ในเซลล์ที่สัมผัสกับความเข้มข้นของ exosomes เหล่านี้ (รูปที่ 2D) ระดับโปรตีน MITF และไทโรซิเนสก็ลดลงเช่นกันเนื่องจากความเข้มข้นของนมเอ็กโซโซมเพิ่มขึ้น (รูปที่ 2E) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า exosomes นมยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิส ในเซลล์ B16F10 ของเมาส์

3.3. miR-2478 เฉพาะวัวจากนม Exosomes ยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิส

เพื่อตรวจสอบว่า miR-2478 มาจากนม exosomesส่งผลโดยตรงต่อการเกิดเมลาโนเจเนซิสสารยับยั้ง miR-2478 ถูกถ่ายทอดเข้าสู่เซลล์ที่สัมผัสกับนม เอ็กโซม (50 ไมโครกรัม/มล.) ในที่ที่มี exosomes นมเซลล์ B16F10 ที่แปลด้วย สารยับยั้ง miR-2478 แสดงกิจกรรมไทโรซิเนสที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสําคัญเมื่อเทียบกับใน ตัวควบคุม (รูปที่ 4A) ปริมาณเมลานินยังสูงกว่าในการบําบัดด้วยสารยับยั้ง miR-2478 เซลล์มากกว่าในเซลล์ควบคุม (รูปที่ 4B) การแสดงออกของ MITF mRNA คือ -2.5 เท่าในเซลล์ที่ผ่านการยับยั้ง miR2478 มากกว่าในเซลล์ควบคุม และการแสดงออกของ TYR mRNA คือ -2 เท่า สูงขึ้นเมื่อ miR-2478 ถูกยับยั้ง (รูปที่ 4C) ระดับของโปรตีน MITF และ TYR ยังกู้คืนในเซลล์ที่สัมผัสกับนม exosomesหลังจากที่เซลล์เหล่านี้ถูกทรานสเฟอร์ด้วย สารยับยั้ง miR-2478 (รูปที่ 4D) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า miR-2478 ได้มาจาก นม exosomes ยับยั้งโดยตรง melanogenesis ในเซลล์เนื้องอกของเมาส์

3.4. เอ็กโซมนมยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิสผ่านทางเดิน Akt-GSK3β

ต่อไปเราจะตรวจสอบวิธีการนม exosomesควบคุมเมลาโนเจเนซิสเพื่อระบุสิ่งที่เกี่ยวข้อง เส้นทางที่ได้รับผลกระทบในเซลล์เนื้องอก แม้ว่าจะไม่ทราบว่า Rap1a โดยตรงหรือไม่ ควบคุมการเกิดเมลาโนเจเนซิสมีรายงานว่า Rap1a ยับยั้งฟอสโฟรีเลชั่น Akt ใน เซลล์มะเร็ง [20] บนพื้นฐานของข้อมูลนี้เราได้ตรวจสอบว่า Rap1a ปรับเปลี่ยนหรือไม่ เส้นทาง Akt เพื่อส่งเสริม

ใน Akt ที่เกี่ยวข้องกับ Aktเมลาโนเจเนซิสทางเดิน เปิดใช้งาน Akt ก่อให้เกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ Gsk3β ที่ Ser9 และทําให้ปิดการใช้งานมัน; นี้ การเปลี่ยนแปลงยับยั้งกิจกรรมการถอดความของ MITF และดาวน์รีกูเลตไทโรซิเนส [21,22] ในการศึกษาปัจจุบันเราประเมินการแสดงออกของ Akt และ GSK3β ในเซลล์ที่รับการรักษาด้วย Rap1a siRNA. ในเซลล์เหล่านี้การกระตุ้นของ Akt phosphorylation เพิ่มขึ้นและปริมาณ ของ pGSK3β ก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน (รูปที่ 7A) GSK3β ถูกปิดการใช้งานโดยการเปิดใช้งานของ Akt ใน a ลักษณะขึ้นอยู่กับความเข้มข้นในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย 20 หรือ 50 μg / mL ของนม exosomes(รูปที่ 7B) ระดับของโปรตีน Akt และ GSK3β ในเซลล์ที่รับการรักษาด้วย miR-2478 การเลียนแบบสอดคล้องกับผลลัพธ์ข้างต้น (รูปที่ 7C) ต่อไปเราทดสอบว่า miR-2478 หรือไม่ จาก exosomes นมมีผลต่อเส้นทาง Akt-GSK3β ในที่ที่มีน้ํานม exosomes ฟอสโฟรีเลชั่นของโปรตีน Akt และ GSK3β ลดลงในเซลล์ที่รับการรักษาด้วย สารยับยั้ง miR-2478 (รูปที่ 7D) นอกจากนี้การรักษาด้วยสารยับยั้ง AKT GSK690693 เพิ่มการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเมลาโนเจเนซิสในนมที่ผ่านการผ่านการบําบัดจาก exosome เซลล์ (รูปที่ 7E) การค้นพบเหล่านี้หมายความว่า miR-2478 ในนม exosomesดาวน์รีกูเลต Rap1a และยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิสผ่านเส้นทาง Akt-GSK3β

ปลากระเบนซิตสแตนเช่ผลไวท์เทนนิ่งบนผิวเพื่อป้องกันการเกิดออกซิเดชัน

3.8. นม Exosomes ยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมลาโนมาของมนุษย์เมลาโนไซต์และ เมลาโนเดิร์มทิชชู่

ระบุว่านม exosomesยับยั้งเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมาส์เราจะพิจารณาต่อไปว่า exosomes นมมีประสิทธิภาพเท่าเทียมกันในเซลล์ของมนุษย์หรือไม่ ประการแรกความมีชีวิตของ เซลล์เมลาโนมาของมนุษย์ MNT-1 และเมลาโนไซต์ของมนุษย์ NHEM ถูกตรวจสอบหลังจากการบ่มด้วย exosomes นม 20 หรือ 50 ไมโครกรัม/ มล. ดังแสดงในรูปที่ 8A ไม่มี ความแตกต่างในความมีชีวิต กิจกรรมไทโรซิเนสถูกยับยั้งโดย 43% และ 85% ตามลําดับใน เซลล์ MNT-1 ที่สัมผัสกับเอ็กโซมนม 20 ไมโครกรัม/มล. หรือ 50 ไมโครกรัม/มล. (รูปที่ 8B) NHEM ก็เช่นกัน ลดลง 34% และ 66% ตามลําดับผ่านการรักษาด้วย 20 μg/mL หรือ 50 μg/mL ของ นม exosomes (รูปที่ 8B) นอกจากนี้ ปริมาณเมลานินยังถูกวัดในเซลล์ MNT-1 และ NHEM สัมผัสกับนม exosomes ส่งผลให้การสังเคราะห์เมลานินในเซลล์ MNT-1 สัมผัสกับ 20 μg/mL หรือ 50 μg/mL ของนม exosomesถูกยับยั้งโดย 37% และ 58% ตามลําดับและในเซลล์ NHEM การรักษา exosome นมขัดขวางการสังเคราะห์เมลานินโดย 36% และ 62% ตามลําดับ (รูปที่ 8C) นอกจากนี้ผลการลดน้ําหนักผิวของนม exosomesได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดยใช้เนื้อเยื่อผิวหนังของมนุษย์ หลังการรักษาด้วยนม exosomes ในเนื้อเยื่อของมนุษย์ญาติขาว พบผลกระทบในวันที่ 3, 9, 12 และ 14 ด้วยเหตุนี้เราจึงพบว่าสีผิวในเนื้อเยื่อที่สัมผัสกับน้ํานม exosome ดูเหมือนจะเป็น สว่างกว่านั้นในเนื้อเยื่อควบคุม (รูปที่ 8D) ระดับของเม็ดสีถูกคํานวณเป็นค่า L ซึ่งเป็นค่าที่แสดงถึงความสว่าง เม็ดสีคล้ําก้าวหน้า ช้ากว่าในเนื้อเยื่อผิวหนังที่ได้รับการรักษาด้วยนม exosome มากกว่าในเนื้อเยื่อผิวหนังควบคุม (รูปที่ 8D) กลุ่มทดลองที่ได้รับการปฏิบัติด้วยนม exosomesพบอนุภาคเมลานินที่เล็กกว่า ขนาดและเม็ดสีเมลานินในปริมาณต่ําเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 8E) จากการวัดปริมาณเมลานินหลังจาก 14 วันของ exosomes นมยับยั้งการสังเคราะห์เมลานินในเนื้อเยื่อของมนุษย์ (รูปที่ 8F) ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่านม สารยับยั้งเมลาโนเจเนซิสในเซลล์และเนื้อเยื่อของมนุษย์

4. การสนทนา

การศึกษาเกี่ยวกับ exosomes ที่ควบคุมเมลาโนเจเนซิสได้รายงานว่า exosomes ที่ได้มา จากเคราติโนไซต์มีผลไวท์เทนนิ่ง เมลาโนไซต์และเคราติโนไซต์โดยรอบ มีการเชื่อมต่อการทํางานเพื่อสร้างหน่วยเมลานินในหนังกําพร้าผิวหนัง [23,24] ปัจจัยที่ละลายน้ําได้จาก Keratinocyte ควบคุมการเกิดเมลาโนเจเนซิสของเมลาโนไซต์ที่อยู่ใกล้เคียง เอ็กโซโซม หลั่งออกมาจากเคราติโนไซต์ปกติส่งเสริมการเกิดเมลาโนเจเนซิสโดยการควบคุมการแสดงออก ของเมลาโนเจเนซิส- โปรตีนที่เกี่ยวข้อง [23–25] นอกจากนี้ในขาวการศึกษาโดยใช้ exosomes ที่สกัดจากเซลล์มีรายงานว่า exosomes ที่สกัดจากมนุษย์เมื่อเร็ว ๆ นี้ เซลล์ต้นกําเนิด/สโตรมาลที่ได้จากเนื้อเยื่อไขมันแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพการกระจ่างใสของผิวหนังในเมาส์ เซลล์เมลาโนมา [26] นอกจากนี้ยังมีรายงานด้วยว่า exosomes ที่สกัดจากพืชมีผลทําให้ผิวขาวขึ้น ถุงนอกเซลล์ที่สกัดจากใบพืช D. morbifera และ ลําต้นแสดงผลต่อต้านเมลาโนเจนต่อเซลล์เมลาโนมาของเมาส์และมนุษย์ที่มีสุขภาพดี ผิว [27] ในการศึกษาของเราผลการฟอกสีฟันของ exosomes ที่ได้จากนมถูกตรวจสอบ

เมื่อเทียบกับ exosomes ที่สกัดจากพลาสมาในเลือดหรือของเหลวเพาะเลี้ยง exosomes ที่ได้จากนมมีข้อดีไม่เพียง แต่มี exosomes จํานวนมากที่สามารถ ถูกสกัดต่อหน่วยของปริมาณ แต่ยังมีราคาต่ํา [26,27] เพราะนม exosomesมี องค์ประกอบทางเคมีคล้ายกับเยื่อหุ้มเซลล์พวกเขาแสดงภูมิคุ้มกันที่ต่ํากว่า และความเป็นพิษต่อเซลล์และมีความเข้ากันได้ทางชีวภาพสูง [28,29] เมื่อเร็ว ๆ นี้เมื่อนม exosomes ถูกป้อนเข้าสู่ DSS (เกลือโซเดียมเดกซ์ทรานซัลเฟต) - หนูแบบจําลองลําไส้ใหญ่บวมที่เกิดจากการแสดงออกของ ไซโตไคน์ proinflammatory IL-6 และ TNFα ลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จึงช่วยลดการอักเสบและปรับปรุงลําไส้อักเสบเนื้อร้าย [30,31] นอกจากนี้ การกลืนกิน exosomes นมในรูปแบบเมาส์ของโรคโรคกระดูกพรุนโรคข้ออักเสบดีขึ้น โดยการเพิ่มความหนาแน่นของกระดูกและลดไซโตไคน์โปรอักเสบ [32,33] จนถึงตอนนี้ ผลกระทบของ exosomes นมได้รับการมุ่งเน้นไปที่ปรากฏการณ์ทางภูมิคุ้มกันที่ลด ไซโตไคน์ proinflammatory และในการพัฒนากระดูกเช่นการบรรเทาลําไส้อักเสบและ การปรับปรุงโรคกระดูกพรุน ในการศึกษาครั้งนี้นอกเหนือจากวิธีการถ่ายนม exosomesมัน ได้รับการยืนยันว่าเมื่อนําไปใช้กับผิว, มันมีประสิทธิภาพในผิวขาว. สิ่งนี้บ่งชี้ว่ามันสามารถนําไปใช้กับการรักษาโรคต่าง ๆ โดยการเพิ่มทางสรีรวิทยา กิจกรรมโดยใช้ exosomes นมในอนาคต

แม้ว่าการศึกษาครั้งนี้ชี้ให้เห็นว่านม exosomesยับยั้งเมลาโนเจเนซิสมีอยู่แล้ว เป็นที่ทราบกันดีว่าเวย์โปรตีนเช่นเคซีนβแลคโตโกลบูลินและαแลคตัลบูมินมีฤทธิ์ฟอกสีฟัน β-lactoglobulin ลดกิจกรรมไทโรซิเนสในเมลาโนไซต์ของมนุษย์ [18] และ k-casein ยับยั้งการเกิดเมลาโนเจเนซิสในเซลล์เมลาโนมาของเมาส์ B16 [17] ที่น่าสนใจคือ ส่วนประกอบเหล่านี้จํานวนมากยังมีอยู่ในนม exosomes ตามโปรตีโอม ผลของนม exosomes, เคซีน, βแลคโตโกลบูลิน, และαแลคตัลบูมินมีการกระจายใน เอ็กโซโซม [15,34,35] นม exosomes มี microRNAs เช่นเดียวกับโปรตีน อันเป็นผลมาจาก ไมโครอาร์เอ็นเอไมอาร์เอ็นเอที่ใช้เอ็กโซโซมนมโดยอิซุมิและเพื่อนร่วมงาน, miR-2478, miR-1777b, miR-1777a, let-7b และ miR-1224 มีการกระจายอย่างมากใน exosomes นม [13] ในการนี้ การศึกษายกเว้น miR-2478 ในบรรดา microRNAs เหล่านี้ miR-1777b, miR-1777a, let-7b และ miR-1224 ไม่แสดงความแตกต่างในกิจกรรมไทโรซิเนสจากกลุ่มควบคุม (รูปที่ S2) miR-2478 มีมากที่สุดในนม exosomesและไทโรซิเนสลดลง กิจกรรม อย่างไรก็ตามการแสดงออกของยีน MITF และ TYR ที่เกี่ยวข้องกับการฟอกสีฟันลดลง มากขึ้นในเซลล์ที่รับการรักษาด้วยนม exosomesกว่าในเซลล์ที่รักษาด้วย miR-2478 เลียนแบบเพียงอย่างเดียว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าส่วนประกอบหลายอย่างรวมถึง microRNA ในนม exosomes มีส่วนร่วมในขาวการเคลื่อนไหว

microRNAs ส่วนใหญ่ใน exosomes นมออกแรงทํางานทางชีวภาพโดยการยับยั้ง การแสดงออกของยีนเป้าหมายในเซลล์ผู้รับ ในการศึกษานี้ miR-2478 ยังยับยั้ง การสังเคราะห์เมลานินโดยกําหนดเป้าหมาย Rap1a เป็นยีนเป้าหมาย แม้ว่าจะไม่ใช่ microRNA ที่ได้จากนม แต่ microRNA ที่ควบคุมการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการฟอกสีฟัน ได้รับรายงานแล้ว เมื่อมนุษย์เลียนแบบ miR-27a-3p ถูกนําไปใช้กับเมาส์ เมลาโนไซต์มันยับยั้งการแสดงออกของ Wnt3a และยับยั้งการสังเคราะห์เมลานิน [36] และนอกมดลูก miR-218 ยับยั้งการทํางานของ TYR โดยการลดการแสดงออกของ MITF ในเมลาโนมาเมลาโนไซต์ murine [37] miR-203 ส่งเสริมเมลาโนเจเนซิสผ่าน CREB1/MITF/Rab27a เส้นทางโดยการกําหนดเป้าหมาย Kif5b ในเนื้องอก [38] มี 79 microRNAs ใน exosomes นม

ไมโครอาร์เอ็นเอในนม exosomesได้มาจากวัว [13] ดังนั้นการวิจัยเพิ่มเติมเกี่ยวกับ กิจกรรมทางสรีรวิทยาของ exosomes นมเป็นสิ่งจําเป็น

5. ข้อสรุป

ผลการวิจัยของเราชี้ให้เห็นว่านม exosomesเป็นผู้สมัครสําหรับตัวแทนต่อต้านเมลาโนเจน ที่ลดเม็ดสีโดยการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับเมลานิน (รูป 10). ในเซลล์เนื้องอกและเมลาโนไซต์ exosomes นมแสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง TYR และการลดปริมาณเมลานินเมื่อเทียบกับการควบคุมเชิงลบ นอกจากนี้ผลกระทบเหล่านี้คือ ไกล่เกลี่ยโดย miR-2478 จากนม exosomes. ดังนั้น exosomes นมอาจเป็นประโยชน์สําหรับ การพัฒนาการทํางานขาวเครื่องสําอางที่มีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ํา

cistancheผลไวท์เทนนิ่งบนผิวเพื่อป้องกันการเกิดออกซิเดชัน