การทำโปรไฟล์เมตาโบไลต์และฤทธิ์ต้านความชราของข้าวโคจิที่หมักด้วยเชื้อรา Aspergillus Oryzae และ Aspergillus Cristatus: การศึกษาเปรียบเทียบ Ⅱ

3. การอภิปราย

ส่วนต่างๆ ของข้าว เช่น แกลบ รำ เอ็มบริโอ และเอนโดสเปิร์ม จากผิวถึงด้านใน มีองค์ประกอบทางเคมีต่างกัน (26) โดยเฉพาะในรำข้าวมีส่วนประกอบต่างๆกรดฟีนอลและฟลาโวนอยด์ซึ่งเป็นที่รู้จักในการจัดแสดงฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระนอกจากนี้ ผนังเซลล์ของข้าวยังประกอบด้วยโครงสร้างอะราบิน็อกซีแลนซึ่งประกอบด้วยไซโลส อะราบิโนส กรดเฟรูลิก และกรดเฟรูลิก (27] โดยทั่วไปแล้วผนังเซลล์ของข้าวจะเจาะทะลุได้ยาก และโคจิของข้าวมีข้อได้เปรียบในการซึมผ่านได้ง่ายของ ผนังเซลล์ข้าวโดยเอ็นไซม์ต่างๆ เช่น โปรตีเอสและกลูโคซิเดสจากหัวเชื้อจุลินทรีย์ (24. ดังนั้นข้าวโคอิจึงแสดงระดับที่สูงขึ้นของกิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสและกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระมากกว่าวัตถุดิบเพราะมีสารประกอบที่อุดมด้วยคุณค่า (28.

คลิกที่นี่เพื่อรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระของ Cistanche

เราปฏิบัติตามแนวทางเมแทบอโลมิกส์ของข้าวโคจิที่หมักด้วยราเส้นใยที่แตกต่างกันสองชนิด ซึ่งอธิบายความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของเอนไซม์ การผลิตสารเมแทบอไลต์ และฤทธิ์ทางชีวภาพ กิจกรรมของเอ็นไซม์ต่างๆ เช่น a-amylase, &glucosidase และ -glucosidase ที่ผลิตโดย A. cristatus และ A. oryzae ที่ได้รับการฉีดวัคซีนเพิ่มขึ้นตามเวลาที่หมัก (รูปที่ 3) เนื่องจากเอนไซม์เหล่านี้ทำลายโครงสร้าง arabinoxylan กรดฟีนอลหลายชนิดจึงถูกแยกออกจากผนังเซลล์ข้าวในทั้งสองตัวอย่างดังแสดงในรูปที่ 2 กรดฟีนอลิกเหล่านี้เป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพซึ่งช่วยลดความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่น 291 ดังนั้นกิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระและการทดสอบ TPC จึงเพิ่มขึ้นด้วย เพิ่มเวลาการหมักเนื่องจากปริมาณกรดฟีนอลเพิ่มขึ้น (รูปที่ 2 และ 4) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง RAC มีปริมาณฟลาโวนอยด์สูงกว่า RAO เนื่องจากมีระดับของ -กลูโคซิเดสที่สูงกว่า ซึ่งจะไฮโดรไลซ์การเชื่อมโยง -ไกลโคซิดิกจากผนังเซลล์ข้าวระหว่าง การเจริญเติบโตของ A. cristatus ในข้าวโคจิ นอกจากจะแยกออกจากผนังเซลล์ข้าวแล้ว - กลูโคซิเดสยังไฮโดรไลซ์รูปแบบฟลาโวนอยด์กลูโคไซด์ให้เป็นรูปแบบอะไกลคอนที่มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระสูงกว่า 30] รูปแบบฟลาโวนอยด์กลูโคไซด์และรูปแบบ aglycon ที่เพิ่มขึ้นจะเพิ่มกิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระ เช่น ABTS, DPPH FRAP และ TFC ซึ่งอาจส่งผลต่อฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของ RAC ดังที่แสดงในแผนผังเครือข่ายความสัมพันธ์ (รูปที่ 4) ปรากฏการณ์นี้ยังพบในการศึกษาก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพของกลูโคไซด์ไอโซฟลาโวนเป็นอะไกลโคนและรูปแบบที่เพิ่มขึ้นของฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระตามเวลาที่กล่าวถึงในถั่วเหลืองที่หมักด้วย คริสตัส [311.

RAO มีกิจกรรม a-glucosidase ในระดับที่สูงขึ้นซึ่งจะตัดการเชื่อมต่อ a-glycosidic และสร้างกลูโคสในปริมาณที่สูงขึ้นโดยอัตโนมัติ นอกจากข้อเท็จจริงที่ว่ากลูโคสเป็นแหล่งคาร์บอนหลักสำหรับเชื้อราแล้ว ใน RAC ระดับกลูโคสจะลดลงหลังการหมักเพราะมันถูกใช้สำหรับการสังเคราะห์สารทุติยภูมิ เช่น อนุพันธ์ของออโรกเลาซิน ซึ่งเป็นสารประกอบสีที่โดดเด่นซึ่งผลิตโดย A. cristatus ไม่ใช่ A .ออริซเน่. การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่าอนุพันธ์ของ auroglaucin มีฤทธิ์ใน DPPH และถือว่าเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีศักยภาพ [32] นอกจากนี้ ผนังเซลล์ข้าวที่ยุบตัวอาจทำให้เอ็นไซม์ซึมเข้าสู่ส่วนในสุดของข้าวได้ [24] ดังนั้นจึงสามารถสกัดสารเมแทบอไลต์ได้มากขึ้นอย่างอิสระโดยไม่ถูกรบกวนจากผนังด้านนอกของข้าว

ในแผนผังเครือข่ายความสัมพันธ์ระหว่างฤทธิ์ทางชีวภาพและสารเมแทบอไลต์ของทั้ง RAO และ RAC (รูปที่ 4) แนวโน้มทั่วไปคือฟลาโวนอยด์ กรดอินทรีย์ อนุพันธ์ของน้ำตาล และกรดไขมันได้รับการเสนอแนะว่าเป็นปัจจัยสนับสนุนในการออกฤทธิ์ทางชีวภาพ ฟลาโวนอยด์และกรดฟีนอลเป็นสารต้านอนุมูลอิสระที่มีชื่อเสียงและมีข้อดีมากมายเกี่ยวกับหน้าที่ต่างๆ เนื่องจากความสามารถในการบรรเทาความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชัน จึงถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มคุณภาพอาหารและชะลอความชราของผิว [33] นอกจากนี้ การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รายงานว่ากรดไขมันและสารต้านอนุมูลอิสระสามารถสร้างผลเสริมฤทธิ์กันในการป้องกันและจัดการกับความชราของผิว [34]

ในทางกลับกัน auroglaucin และอนุพันธ์ของ lysophospholipid ทำหน้าที่เป็นผู้สนับสนุนเพิ่มเติมให้กับสารเมตาโบไลต์ใน RAC [35] อนุพันธ์ของ auroglaucin มีฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระตามที่ระบุไว้ข้างต้น ดังนั้นเราจึงสันนิษฐานว่าอนุพันธ์ของ auroglaucin มีศักยภาพในการยุติปฏิกิริยาลูกโซ่ของอนุมูลอิสระเพื่อบรรเทาความเครียดของผิวหนัง ยาฮากิและคณะ แสดงให้เห็นว่า lysophospholipids สามารถรักษาความชุ่มชื้นของผิวโดยการเพิ่มการแสดงออกของปัจจัยที่เกี่ยวข้องกับเกราะป้องกันผิวและการทำงานของความชุ่มชื้นในผิวหนัง [36] ความชุ่มชื้นเป็นปัจจัยสำคัญสำหรับผิวที่มีสุขภาพดี เพราะความแห้งกร้านก่อให้เกิดการเสื่อมสภาพของผิว ซึ่งมีลักษณะเป็นความหยาบกร้าน ผิวเป็นขุย และริ้วรอยเล็กๆ [37,38] เราประมาณการว่า auroglaucin และ lysophospholipids มีฤทธิ์ในการต่อต้านริ้วรอยของผิวหนังในขั้นตอนสุดท้ายของการหมักใน RAC ได้ดีกว่าใน RAO Zhao และคณะ แสดงให้เห็นว่าชาอิฐ Fuzhuan ซึ่งมีเชื้อรา A. cristatus ที่โดดเด่นสามารถยับยั้งการถ่ายภาพผ่านการดับ ROS และกระตุ้นการส่งสัญญาณ Nrf2 ที่ลดหลั่น [21] ดังนั้นเราจึงสันนิษฐานว่า RAC มีศักยภาพในการต่อต้านริ้วรอยที่สูงกว่า RAO โดยทำหน้าที่ผ่านทางอ้อม เช่น การปรับสภาพผิวให้ดีขึ้นเพื่อให้มีความชุ่มชื้นและบรรเทาความเครียดจากอนุมูลอิสระ.

โดยรวมแล้ว เราเชื่อว่ากรดไขมันที่เพิ่มขึ้น กรดฟีโนลิก ฟลาโวนอยด์ ไลโซฟอสโฟลิพิด และไฮโดรควิโนนอาจเพิ่มกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระและปรับปรุงการแสดงออกของ RNA ของอีลาสตินและคอลลาเจน รวมทั้งยับยั้งการแสดงออกของ RNA ของ MMP-1 ในตอนท้ายของ การหมัก สารประกอบเหล่านี้แสดงรูปแบบการเปลี่ยนแปลงที่แตกต่างกันในเมแทบอไลต์ตามหัวเชื้อของเชื้อราและส่งผลต่อฤทธิ์ทางชีวภาพต่างๆ การศึกษานี้อธิบายความแตกต่างของเมแทบอลิซึมโดยรวมระหว่างสปีชีส์ต่างๆ ของสกุล Aspergillus เดียวกัน โดยใช้วิธีเมแทบอโลมิกส์ นอกจากนี้ กิจกรรมของเอนไซม์ที่แตกต่างกันมีอิทธิพลต่อการผลิตสารเมแทบอไลต์ที่แตกต่างกัน และกระตุ้นให้เกิดการออกฤทธิ์ทางชีวภาพที่แตกต่างกันใน RAO และ RAC

4. วัสดุและวิธีการ

4.1. เคมีภัณฑ์และรีเอเจนต์

4.2. การเตรียมตัวอย่างและการสกัด

แม่พิมพ์โคจิ A. oryzae KCCM 11372 (ศูนย์วัฒนธรรมจุลินทรีย์แห่งเกาหลี, KCCM; สาธารณรัฐเกาหลี) และ A. cristatus (Aspergillus cristatus Cosmax-GF จากศูนย์ Cosmax BTI R&I; Seongnam, เกาหลี) ถูกนำมาใช้ในการหมักข้าวและฉีดวัคซีนแยกต่างหาก . จุลินทรีย์แต่ละตัวได้รับการบำรุงรักษาบนวุ้นสกัดมอลต์ (สารสกัดจากมอลต์ 20 กรัม กลูโคส 20 กรัม เปปโทน 1 กรัม วุ้น 20 กรัม/ลิตร) ที่ 28 ◦ซ กระบวนการทางชีวภาพของขั้นตอนการหมักสำหรับการผลิตโคจิดัดแปลงมาจาก Lee และคณะ [11]. ตัวอย่างโคจิข้าวที่หมักด้วย A. oryzae และ A. cristatus เก็บเกี่ยวทุก 2 วัน (ตั้งแต่วันที่ 0 ถึงวันที่ 8) และเก็บไว้ที่สภาวะเยือกแข็งลึก (−80 ◦C) จนกว่าจะวิเคราะห์เพิ่มเติม ตัวอย่างทั้งหมดถูกเตรียมด้วยการจำลองแบบทางชีวภาพสองครั้ง

วิธีการสกัดตัวอย่างโคจิจากข้าวดัดแปลงมาจาก Lee และคณะ มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย [11] โดยสังเขป ตัวอย่างข้าวโคจิแห้งบดบด (5 กรัม) ถูกสกัดโดยการเติมเอทานอลในน้ำ 80 เปอร์เซ็นต์ (40 มล.) และกวนบนเครื่องเขย่าแบบโคจร (200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 24 ชั่วโมง) ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการปั่นแยกตัวอย่างที่ 10,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีที่ 4 ◦C ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกกรองด้วยตัวกรอง Millex GP 0.22 µm (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) สารสกัดตัวอย่างที่ผ่านการกรองถูกทำให้แห้งโดยใช้หัวเร่งสุญญากาศ (ฮานิล โซล เกาหลี) และวัดน้ำหนักแห้งเพื่อประเมินผลผลิตการสกัด

4.3. การวิเคราะห์ GC–TOF–MS

ขั้นตอนการแปรรูปของตัวอย่างข้าวโคจิที่สกัดได้อธิบายโดย Lee และคณะ [11]. การวิเคราะห์ GC–TOF–MS ดำเนินการบน Agilent 7890ระบบ GC (ซานตาคลารา แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) กับ Pegasus HT TOF-MS (Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA) ก๊าซตัวพา (ฮีเลียม) ใช้กับ RTx-5MS (ความยาว 30 ม. × เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.25 มม., J&W Scientific, Folsom, CA, USA) ที่อัตราการไหลคงที่ 1.5 มล./นาที อุณหภูมิของหัวฉีดและแหล่งกำเนิดไอออนถูกรักษาไว้ที่ 250 และ 230 ◦C ตามลำดับ อุณหภูมิเตาอบถูกคงไว้ที่ 75 ◦C เป็นเวลา 2 นาที จากนั้นเพิ่มเป็น 300 ◦C ที่ 15 ◦C/นาที ซึ่งคงไว้เป็นเวลา 3 นาที จากนั้น ฉีดตัวอย่าง 1 µL ด้วยช่วงการสแกนมวล m/z 50–800 การวิเคราะห์ตัวอย่างทั้งหมดดำเนินการด้วยการวิเคราะห์ซ้ำสามชุด

4.4. UHPLC–LTQ–Orbitrap–การวิเคราะห์ MS

ตัวอย่างโคจิจากข้าวที่สกัดได้วิเคราะห์หาสารทุติยภูมิโดยใช้โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ linear trap quadrupole orbitrap tandem Mass spectrometry (UHPLC–LTQ–Orbitrap–MS/MS) โดยใช้โปรโตคอลที่อธิบายโดย Kwon และคณะ [39]. แต่ละตัวอย่างถูกแยกโดยใช้คอลัมน์ Phenomenex KINETEX® C18 (ขนาดอนุภาค 100 มม. 2.1 มม. 1.7 ม. Torrance, CA, USA) ช่วงแมสสเปกตรัมและโฟโตไดโอดในโหมดไอออนบวกและลบได้รับการปรับสำหรับ m/z 100−1000 และ 200−600 nm ตามลำดับ

4.5. การประมวลผลข้อมูลและการวิเคราะห์ทางสถิติ

ข้อมูลดิบ GC–TOF–MS และ UHPLC–LTQ–Orbitrap–MS/MS ถูกแปลงเป็นรูปแบบ netCDF (*.cdf) โดยใช้ซอฟต์แวร์ Leco ChromaTOF และ Thermo Xcalibur ตามลำดับ ไฟล์ net CDF (*.cdf) ที่เกี่ยวข้องอยู่ภายใต้ MetAlign (เข้าถึงเมื่อวันที่ 13 กรกฎาคม 2021)) การประมวลผลข้อมูลโดยใช้ซอฟต์แวร์โดยใช้โปรโตคอลที่อธิบายโดย Lee และคณะ [11,24]. ข้อมูลแมสสเปกโตรเมตริกซึ่งเป็นตัวแทนของมวลพีคที่เหมาะสม (m/z) เวลากักเก็บ (นาที) และข้อมูลพื้นที่พีคเป็นตัวแปร ได้รับการประเมินโดยใช้ซอฟต์แวร์ SIMCA-P บวก 120 (Umetrics, Umea, สวีเดน) สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติหลายตัวแปร ก่อนการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) การวิเคราะห์จำแนกกำลังสองน้อยที่สุดบางส่วน (PLS-DA) และการวิเคราะห์จำแนกกำลังสองน้อยที่สุดในมุมฉาก (OPLS-DA) ชุดข้อมูลถูกแปลงรูปแบบล็อก และความแปรปรวนหน่วยถูกปรับขนาดเพื่อเปรียบเทียบโคจิข้าว หมักด้วยเชื้อราชนิดต่างๆ PASW Statistics 18 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) ใช้เพื่อทดสอบความแตกต่างที่มีนัยสำคัญ (p-value ของ < 0.05) โดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวและเพื่อคำนวณค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ สำหรับแผนที่ความสัมพันธ์ แผนที่เครือข่ายความสัมพันธ์ระหว่างเมแทบอไลต์ที่มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สันสูงกว่า 0.5 และฤทธิ์ทางชีวภาพถูกสร้างขึ้นด้วยซอฟต์แวร์ Cytoscape (https://www.cytoscape.org/ (เข้าถึงเมื่อ 13 กรกฎาคม 2021)) การระบุสารเมแทบอไลต์เบื้องต้นดำเนินการโดยการจับคู่น้ำหนักโมเลกุลและองค์ประกอบของโมเลกุล เวลากักเก็บ ชิ้นส่วนมวล

รูปแบบและการดูดกลืนแสงของข้อมูลรังสีอัลตราไวโอเลต (UV) จากวรรณกรรมและห้องสมุดภายในบริษัทของเรา

4.6. การกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์

การทดสอบกิจกรรมของเอนไซม์สำหรับ -amylase, -glucosidase และ -glucosidase ได้ดำเนินการตามการศึกษาก่อนหน้านี้ [25,40,41] ตัวอย่างโคจิข้าวแต่ละตัวอย่างปริมาณ 10 กรัมถูกสกัดในน้ำ 90 มล. โดยการเขย่าบนเครื่องเขย่าแบบโคจรที่เวลา 120 น. และ 25 ◦ซ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากกรองตัวอย่างแล้ว สารแขวนลอยจะถูกนำมาใช้เพื่อประเมินกิจกรรมของเอนไซม์

4.7. การกำหนดกิจกรรมต้านอนุมูลอิสระและปริมาณฟีนอลิกและฟลาโวนอยด์ทั้งหมด

เพื่อตรวจสอบฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างข้าวโคจิ ABTS, DPPH, ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระเฟอริกรีดิวซ์ (FRAP), ปริมาณฟีนอลิกทั้งหมด (TPC) และปริมาณฟลาโวนอยด์ทั้งหมด (TFC) ได้ดำเนินการเพิ่มขึ้นสามเท่า

การทดสอบ ABTS และ FRAP ดำเนินการโดยใช้วิธีการที่อธิบายโดย Lee และคณะ [24]. โดยสังเขป สารละลายสต็อก ABTS เจือจางด้วยน้ำกลั่นเพื่อให้ได้การดูดซับขั้นสุดท้ายที่ 0.7 ± 0.02 ที่ 750 นาโนเมตร (180 µL) คือ เติมลงในสารสกัดแต่ละตัวอย่าง (20 µL) ใน 96-จานหลุม ปฏิกิริยาถูกปล่อยให้เกิดขึ้นเป็นเวลา 6 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 750 นาโนเมตรโดยใช้สเปกโตรโฟโตมิเตอร์ สำหรับการทดสอบ FRAP ส่วนผสมของ 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 20 mM iron (III) chloride และ 10 mM 2,4,6-สารละลาย tripyridyl-S-triazine (TPTZ) ใน 40 mM HCl (10:1:1, v/v/v) ถูกเตรียมไว้ ตัวอย่าง (10 µL) ผสมกับ FRAP reagent 300 µL และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6 นาที วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 570 นาโนเมตร การทดสอบ DPPH ดำเนินการตามวิธีที่ดัดแปลงมาจาก Won et al [42] โดยนำสารละลายสต็อก DPPH 180 µL (0.2 mM ในเอทานอล) ผสมกับโคจิข้าว 20 µL กับสารสกัดจากเชื้อราสองชนิดใน 96-แผ่นหลุม และปล่อยให้ทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ในที่มืด. วัดค่าการดูดกลืนอนุมูลอิสระโดย DPPH ที่ 515 นาโนเมตร ผลลัพธ์ของ ABTS, FRAP และ DPPH แสดงเป็นความเข้มข้นของความสามารถในการต้านอนุมูลอิสระเทียบเท่าของ Trolox (TEAC) (mM) ต่อมิลลิกรัมของโคจิ เส้นโค้งความเข้มข้นมาตรฐานอยู่ในช่วงตั้งแต่ 0.0078 mM ถึง 1 mM TEAC

สำหรับการทดสอบ TFC และ TPC เป็นวิธีการที่ Lee และคณะใช้ [25] ตามมา สำหรับการทดสอบ TFC 20 µL ของตัวอย่างข้าวโคจิแต่ละตัวอย่างผสมกับ 20 µL ของ 1 N NaOH และ 180 µL ของ 90 เปอร์เซ็นต์ไดเอทิลีนไกลคอลใน 96-จานหลุม หลังจากการบ่มของผสมเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตร TFC แสดงเป็นความเข้มข้นเทียบเท่า naringin (NE) (mM) ต่อมิลลิกรัมของโคจิ เส้นโค้งความเข้มข้นมาตรฐานเป็นเส้นตรงระหว่าง 0.0027 และ 0.3445 mM NE สำหรับการวิเคราะห์การทดสอบ TPC 20 µL ของแต่ละตัวอย่างถูกบ่มด้วย 100 µL ของ 0.2 N Folin–Ciocalteu reagent ใน96-จานหลุมที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 6 นาที จากนั้น 80 µL ของสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต (Na2CO3) 7.5 เปอร์เซ็นต์ถูกเติมลงในของผสมและปล่อยให้ทำปฏิกิริยาเป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิห้อง สุดท้าย ค่าการดูดกลืนแสงถูกประเมินที่ 750 นาโนเมตร ผลลัพธ์จะแสดงเป็นความเข้มข้นเทียบเท่ากรดแกลลิก (GE) (mM) ต่อมิลลิกรัมของโคจิในช่วงความเข้มข้นมาตรฐาน 0.0230–2.9391 mM GE

4.8. การเพาะเลี้ยงเซลล์

4.9. ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสตามเวลาจริง

ในการแยกและหาปริมาณ RNA ทั้งหมดจากเม็ดเซลล์ มีการใช้ Trizol reagent และทำการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ การสังเคราะห์ cDNA ดำเนินการในปริมาตรปฏิกิริยาทั้งหมด 20 µL; ของผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 2 ไมโครกรัมของ RNA ทั้งหมด, โอลิโก (dT) และพรีมิกซ์การถอดรหัสแบบย้อนกลับภายใต้สภาวะปฏิกิริยาต่อไปนี้: 45 ◦ซ เป็นเวลา 45 นาที, ที่ตามด้วย 95 ◦ซ เป็นเวลา 5 นาที RT-PCR ใช้สำหรับหาปริมาณของการแสดงออกของยีน และผลลัพธ์ได้รับการวิเคราะห์ในภายหลังโดยใช้ซอฟต์แวร์ระบบ StepOne PlusTM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) การขยายสัญญาณ RT-PCR ดำเนินการโดยใช้ SYBR Green PCR Master Mix กับ ROX แบบผสมล่วงหน้า (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) และไพรเมอร์ (Bioneer, Daejeon, Korea) ในเครื่องมือ ABI 7300 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต สภาวะการเกิดปฏิกิริยามีดังนี้: การเริ่มต้นที่ 95 ◦C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วยสภาวะการหมุนเวียนที่ 95 ◦C เป็นเวลา 15 วินาที 60 ◦C เป็นเวลา 30 วินาที และ 72 ◦C เป็นเวลา 30 วินาที เป็นเวลา 40 รอบ - แอคตินถูกใช้เป็นตัวควบคุมภายใน

โดยสรุป โคจิจากข้าวแสดงการผลิตสารเมแทบอไลต์และฤทธิ์ทางชีวภาพที่แตกต่างกันตามสายพันธุ์เชื้อรา Aspergillus ที่ใช้ ระดับที่สูงขึ้นของฟลาโวนอยด์และอนุพันธ์ของ auroglaucin ใน RAC มีค่าสูงขึ้นฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระมากกว่าใน RAO นอกจากนี้ยังเสริมฤทธิ์กันของกรดไขมันและสารต้านอนุมูลอิสระที่พบในโคจิทั้งสองมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของ RNA ของปัจจัยต่อต้านริ้วรอยของผิว. อนุพันธ์ของ Auroglaucin และ lysophospholipids ที่พบใน RAC ก็เป็นตัวเลือกที่อาจเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ RNA ของปัจจัยต่อต้านริ้วรอยของผิวหนัง. ดังนั้น แม้ว่าข้าวโคจิจะหมักโดยใช้พืชสกุลเดียวกัน (Aspergillus) แต่ก็มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของเอนไซม์และสารเมแทบอไลต์สำหรับแต่ละสายพันธุ์ และส่งผลต่อฤทธิ์ทางชีวภาพเช่นสารต้านอนุมูลอิสระและกิจกรรมต่อต้านริ้วรอย. ดังนั้น การศึกษานี้จึงให้ข้อมูลเชิงลึกที่ครอบคลุม ตลอดจนตรรกะสำหรับการเลือกจุลินทรีย์ที่ปลูกเชื้ออย่างมีเหตุผล ในส่วนที่เกี่ยวกับ

เมแทบอโลมิกส์เพื่อปรับปรุงคุณภาพการผลิตโคจิในเชิงพาณิชย์

วัสดุเสริม:ข้อมูลต่อไปนี้มีอยู่ทางออนไลน์ที่ รูปที่ S1: พล็อตคะแนน PLS-DA (A,B) และ OPLS-DA (C) สำหรับข้าวโคจิหมักด้วยเชื้อรา Aspergillus cristatusหรือก. oryzaeได้มาจาก UHPLC–LTQ–Orbitrap MS/MS (A,C) และ GC–TOF–MS (B), ตารางที่ S1: รายชื่อสารเมแทบอไลต์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจากข้าวโคจิด้วยความแตกต่างเชื้อราแอสเปอร์จิลลัส. ระหว่างการหมักที่ระบุโดย UHPLC–LTQ–Orbitrap-MS/MS, ตารางที่ S2: รายชื่อสารเมแทบอไลต์ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญจากข้าวโคจิด้วยความแตกต่างเชื้อราแอสเปอร์จิลลัส. ระหว่างการหมักที่ระบุโดย GC-TOF-MS รูปที่ S2: แผนที่ความสัมพันธ์ของฤทธิ์ทางชีวภาพ (ฤทธิ์ของเซลล์ผิวหนังและฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระ) และข้าวโคจิหมักด้วยเชื้อรา Aspergillus cristatusหรือก. oryzaeสารเมแทบอไลต์ตามค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน แต่ละตารางระบุค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน (r)

ผลงานของผู้เขียน:การสร้างแนวคิด CL และ SL; วิธีการ HL, SL, SK (Seoyeon Kyung) และ JR; การตรวจสอบ HL, SL และ SK (ซอยอน คยอง); การวิเคราะห์อย่างเป็นทางการ HL และ SK (Seoyeon Kyung); การสืบสวน HL และ SL; ทรัพยากร, JR, SK (ซึงฮยอนคัง) และ MP; การเขียน—การเตรียมร่างต้นฉบับ HL; การเขียน—ตรวจทานและแก้ไข HL และ SL; การสร้างภาพ HL; การกำกับดูแล SL และ CL; การบริหารโครงการ SK (คังซึงฮยอน) MP และ CL; การจัดหาเงินทุน CL ผู้เขียนทั้งหมดได้อ่านและตกลงที่จะตีพิมพ์รุ่นของต้นฉบับ

เงินทุน:งานนี้ได้รับการสนับสนุนโดย Korea Institute of Planning and Evaluation for Technology in Food, Agriculture and Forestry (IPET) ผ่านโครงการ Agricultural Microbiome R&D Program (The Strategic Initiative for Microbiomes in Agriculture and Food) ซึ่งได้รับทุนสนับสนุนจากกระทรวงเกษตร อาหาร และชนบท กิจการ (MAFRA) (หมายเลขอนุญาต 918011-04-3-HD020) นอกจากนี้ งานนี้ได้รับการสนับสนุนจากสถาบันการวางแผนและประเมินเทคโนโลยีด้านอาหาร การเกษตร ป่าไม้ของเกาหลี (IPET) ผ่านโครงการพัฒนาเทคโนโลยีอาหารที่มีมูลค่าเพิ่มสูง ซึ่งได้รับทุนสนับสนุนจากกระทรวงเกษตร อาหาร และกิจการชนบท (MAFRA) (หมายเลขสิทธิ์ 318027-04-3-HD030)

คำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล:ข้อมูลที่นำเสนอในการศึกษานี้สามารถขอได้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้อง

กิตติกรรมประกาศ:งานวิจัยนี้ได้รับการสนับสนุนโดยกองทุนนักวิจัยมหาวิทยาลัยคอนกุกใน2020.

อ้างอิง

1. ซานเลียร์ เอ็น.; โกคเซน, บีบี; Sezgin, AC ประโยชน์ต่อสุขภาพของอาหารหมักดอง คริ. รายได้ วิทย์อาหาร. นัท 2019, 59, 506–527. [ครอสรีฟ]

2. ยู, K.-W.; ลี, เอส-อี.; ชอย, H.-S.; ซูห์, เอชเจ; รา, แคนซัส; ชอย เจดับบลิว; ฮวาง เจ.-เอช. การเพิ่มประสิทธิภาพสำหรับการเตรียมข้าวโคจิโดยใช้ Aspergillus oryzae CJCM-4 ที่แยกได้จาก meju แบบดั้งเดิมของเกาหลี วิทย์อาหาร. เทคโนโลยีชีวภาพ 2012, 21, 129–135. [ครอสรีฟ]

3. หยาง วาย; เซีย, วาย.; หลิน เอ็กซ์; วัง, G.; จาง เอช; ซีออง, ซี; ยู, เอช.; ยู, เจ; Ai, L. การปรับปรุงรูปแบบรสชาติในไวน์ข้าวของจีนโดยการสร้างยีสต์หมักที่มีความทนทานต่อเอธานอลและกิจกรรมการหมักที่เหนือกว่า ความละเอียดของอาหาร ภายใน 2018, 108, 83–92. [ครอสรีฟ] [PubMed]

4. อิชิคาวะ อี.; ฮิราตะ เอส; ฮาตะ, ย.; ยาซาวะ เอช; ทามูระ, เอช; กนก, ม.; อิวาชิตะ, พ.; Hirata, D. ผลกระทบของสารตั้งต้นโคจิต่อสารเมแทบอไลต์ในเหล้าสาเกญี่ปุ่นที่ทำจากข้าวสาเก Koshitanrei ชีววิทยาศาสตร์ เทคโนโลยีชีวภาพ ชีวเคมี 2020, 84, 1714–1723. [ครอสรีฟ]

5. เพชรพรไพศาล ป.; ป. ทิพยวัฒน์; เจ, ม.; สุทธินุช รำข้าวดำพันธุ์ท้องถิ่นของไทย: แหล่งของสารประกอบเชิงหน้าที่ในการปรับภูมิคุ้มกัน การมีชีวิตของเซลล์และการสังเคราะห์คอลลาเจน และยับยั้งเมทริกซ์เมทัลโลโปรตีนเนส-2 และ-9 เจ. ฟังก์ชัน. อาหาร 2014, 7, 650–661 [ครอสรีฟ]

6. คิม เอเจ; ชอย, เจเอ็น; คิม เจ; คิม, ฮโย; ปาร์ค, เอสบี; ยอ, SH; ชอย, JH; หลิว เคเอช ; Lee, CH การทำโปรไฟล์ Metabolite และฤทธิ์ทางชีวภาพของข้าวโคจิที่หมักโดยสายพันธุ์ Aspergillus เจ.ไมโครไบโอล. เทคโนโลยีชีวภาพ 2555, 22, 100–106. [ครอสรีฟ] [PubMed]

7. เอมส์ บีเอ็น; ชิเกนางะ, เอ็มเค ; ฮาเก้น TM Oxidants สารต้านอนุมูลอิสระและโรคความเสื่อมแห่งวัย โพรซี นัทล. อคาเดมี วิทย์ สหรัฐอเมริกา 2536, 90, 7915–7922 [ครอสรีฟ] [PubMed]

8. วัลโก ม.; ไลบ์ฟริตซ์, ดี.; มองโกล เจ; โครนิน, มอนแทนา; มาซูร์ ม.; Telser, J. อนุมูลอิสระและสารต้านอนุมูลอิสระในการทำงานทางสรีรวิทยาตามปกติและโรคในมนุษย์ ภายใน เจ. ไบโอเคม. เซลล์ไบโอล 2550, 39, 44–84. [ครอสรีฟ]

9. อุตตรา, บี; ซิงห์ เอวี; ซัมโบนี พี; Mahajan, RT ความเครียดออกซิเดชันและโรคเกี่ยวกับความเสื่อมของระบบประสาท: การทบทวนทางเลือกในการบำบัดด้วยสารต้านอนุมูลอิสระต้นน้ำและปลายน้ำ สกุลเงิน นิวโรฟาร์มาคอล. 2552, 7, 65–74. [ครอสรีฟ]

10. เยน, G.-C.; ช้าง, ย.-ค.; สุ, ส.-ว. ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและสารออกฤทธิ์ของข้าวโคจิที่หมักด้วยเชื้อรา Aspergillus candidus เคมีอาหาร. 2546, 83, 49–54. [ครอสรีฟ]

11. ลี, เยอรมนี; ลี เอส; ซิงห์, ด.; จาง ES; ชิน, เอชดับเบิลยู; พระจันทร์ ว.บ.; Lee, CH ได้ทำการแก้ไขเมตาโบโลมเปรียบเทียบตามเวลาสำหรับการหมักโคจิกับข้าวกล้อง ข้าวขาว และข้าวเอ็มบริโอยักษ์ เคมีอาหาร. 2017, 231, 258–266. [ครอสรีฟ] [PubMed]

12. จาร์ราร์ ม.; เบห์ล เอส; ชาฮีน น.; ฟาติมา, อ.; Nasab, R. ผลการต่อต้านริ้วรอยของเรตินอลและกรดอัลฟ่าไฮดรอกซีต่อเส้นใยอีลาสตินของเส้นเซลล์ไฟโบรบลาสต์ผิวหนังของมนุษย์ที่มีอายุด้วยภาพถ่าย ภายใน เจ เมด เฮลท์ ไบโอเมด ฟาร์มา อังกฤษ 2015, 7, 328.

13. บอลลา, อาร์เอส; อัล-ซูไบ, AM; อัล-จินดาน, RY ; Balakrishna, JP; ราวี, พีเค; วีระราฆวัน รองประธาน; พิไล, เอเอ ; กอลลาปาลลี, SSR; โจเซฟ เจพี; Surapaneni, KM ความสามารถในการรักษาบาดแผลในหลอดทดลองของสารสกัดจากใบเมทานอลิกของ Aristolochia saccata อาจเกิดจากผลการกระตุ้นต่อการแสดงออกของคอลลาเจน-1 เฮลิยอน 2019, 5, e01648. [ครอสรีฟ] [PubMed]

14. ไมน์เก้ เอ็มซี; นาวบารี ซีเค; แชนเซอร์ เอส; โวลเลิร์ต, เอช.; Lademann เจ; Darvin, ME อิทธิพลของสารสกัดจากผักคะน้าที่อุดมด้วยแคโรทีนอยด์ทางปากต่อดัชนีคอลลาเจน I/อีลาสตินของผิวหนัง สารอาหาร 2017, 9, 775. [CrossRef] [PubMed]

15. มาจีด ม.; บาท, บี; อานันท์ ส.; ศิวะกุมาร อ.; ปาลิวาล ป.; Geetha, KG การยับยั้ง ROS ที่เกิดจากรังสี UV และการทำลายคอลลาเจนโดยสารสกัด Phyllanthus emblica ในไฟโบรบลาสต์ผิวหนังของมนุษย์ปกติ เจ.คอสเมท. วิทย์ 2554, 62, 49–56. [ผับเมด]

16. ม.มาสุดา; มูราตะ, เค; นารูโตะ, เอส; อุวายา, อ.; อิซามิ เอฟ; Matsuda, H. Matrix metalloproteinase-1 กิจกรรมการยับยั้งของสารสกัดจากเมล็ด Morinda citrifolia และองค์ประกอบในไฟโบรบลาสต์ผิวหนังของมนุษย์ที่ฉายรังสี UVA ไบโอล ฟาร์มา วัว. 2555, 35, 210–215. [ครอสรีฟ] [PubMed]

17. ซอ, วาย.-เค.; จุง, S.-H.; เพลง, K.-Y.; ปาร์ค, เจ.-เค.; พาร์ค, ซี.-เอส. ฤทธิ์ต้านการเกิดแสงของสารสกัดจากรำข้าวหมักต่อไฟโบรบลาสต์ในผิวหนังปกติที่เกิดจากรังสียูวี เออ ความละเอียดของอาหาร เทคโนโลยี 2553, 231, 163–169. [ครอสรีฟ]

18. กูโฟ พี; Trindade, H. สารต้านอนุมูลอิสระในข้าว: กรดฟีโนลิก, ฟลาโวนอยด์, แอนโธไซยานิน, โปรแอนโธไซยานิดิน, โทโคฟีรอล, โทโคไตรอีนอล, -โอรีซานอล และกรดไฟติก วิทย์อาหาร. นัท 2014, 2, 75–104. [ครอสรีฟ]

19. เบคแมน อ.; ฟิลลิปส์, RD; Chen, J. การเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติทางกายภาพที่เลือกและกิจกรรมของเอนไซม์ของข้าวและข้าวบาร์เลย์โคจิระหว่างการหมักและการเก็บรักษา อาหารเจ. วิทย์ 2012, 77, M318–M322. [ครอสรีฟ]

20. คัง ด.; สุ, ม.; ลำดวน, ย.; Huang, Y. Eurotium cristatum เชื้อราโปรไบโอติกที่มีศักยภาพจากชาอิฐ Fuzhuan ลดความอ้วนในหนูโดยการปรับจุลินทรีย์ในลำไส้ ฟังก์ชั่นอาหาร 2019, 10, 5032–5045. [ครอสรีฟ]

21. Zhao พี; อลัม เอ็มบี ; Lee, SH การป้องกันรังสี UVB-Induced Photoaging โดย Fuzhuan-Brick Tea Aqueous Extract via MAPKs/Nrf2- Mediated Down-Regulation of MMP-1 สารอาหาร 2018, 11, 60. [CrossRef] [PubMed]

22.เฮอร์ เอสเจ; ลี ซิส ; คิม, วายซี; ชอย ฉัน; Kim, GB ผลของการหมักต่อฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระในอาหารจากพืช เคมีอาหาร. 2557, 160, 346–356. [ครอสรีฟ] [PubMed]

23. Zhou, S.-D.; Xu, X.; ลิน, ย.-ฉ.; เซีย, H.-Y.; หวาง, ล.; ต๋อง ม.-ส. การคัดกรองออนไลน์และการระบุสารกำจัดอนุมูลอิสระในดอกดาฮูริกาที่หมักด้วย Eurotium cristatum โดยใช้ระบบ HPLC-PDA-Triple-TOF-MS/MS-ABTS เคมีอาหาร. 2019, 272, 670–678. [ครอสรีฟ] [PubMed]

24. ลี เอส; ลี เดอ ; ซิงห์, ด.; Lee, CH Metabolomics เผยกระบวนการเตรียมเมล็ดข้าวที่เหมาะสมที่สุด (การสี) ไปสู่การหมักข้าวโคจิ เจ. อกริก. เคมีอาหาร. 2561, 66, 2694–2703. [ครอสรีฟ]

สอบถามเพิ่มเติม:

อีเมล:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: บวก 86 15292862950