Lysosomal Lipid Peroxidation ควบคุมภูมิคุ้มกันของเนื้องอก
Sep 19, 2023
การยับยั้ง Lysosomal ที่เกิดจากสารยับยั้ง palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) เช่น DC661 สามารถสร้างการตายของเซลล์ได้ แต่กลไกของการนี้ยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างสมบูรณ์ วิถีการตายของเซลล์ที่ถูกโปรแกรมไว้ (การกินอัตโนมัติ, อะพอพโทซิส, เนื้อตาย, เฟอร์รอปโทซิส และไพโรปโทซิส) ไม่จำเป็นเพื่อให้ได้ผลที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ DC661 การยับยั้งคาเทซิน หรือคีเลชั่นของธาตุเหล็กหรือแคลเซียม ไม่ได้ช่วยให้เกิดพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC661- ได้ การยับยั้ง PPT1 ทำให้เกิด lysosomal lipid peroxidation (LLP) ซึ่งนำไปสู่การซึมผ่านของเยื่อ lysosomal และการตายของเซลล์ที่สามารถย้อนกลับได้ด้วยสารต้านอนุมูลอิสระ N-acetylcysteine (NAC) แต่ไม่ใช่โดยสารต้านอนุมูลอิสระ lipid peroxidation อื่น ๆ จำเป็นต้องใช้ตัวขนส่งซิสเทอีน lysosomal MFSD12 สำหรับการขนส่ง NAC ทางอินทราโซโซมและช่วยเหลือ LLP การยับยั้ง PPT1 ทำให้เกิดภูมิคุ้มกันภายในเซลล์ด้วยการแสดงออกของแคลเรติคูลินบนพื้นผิวที่สามารถย้อนกลับได้ด้วย NAC เท่านั้น เซลล์ที่ได้รับการบำบัด DC{11}}เตรียมทีเซลล์ไร้เดียงสาและความเป็นพิษที่เป็นสื่อกลางของทีเซลล์ที่ได้รับการปรับปรุง หนูที่ได้รับการฉีดวัคซีนด้วยเซลล์ที่ได้รับ DC661- ทำให้เกิดภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวและการปฏิเสธเนื้องอกในเนื้องอกที่ "ร้อนจากภูมิคุ้มกัน" แต่ไม่ได้อยู่ในเนื้องอกที่ "เย็นจากภูมิคุ้มกัน" การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่า LLP กระตุ้นให้เกิดการตายของเซลล์ไลโซโซม ซึ่งเป็นรูปแบบการตายของเซลล์ที่สร้างภูมิคุ้มกันอันเป็นเอกลักษณ์ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงวิธีการผสมผสานระหว่างการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันและการยับยั้งไลโซโซมอย่างมีเหตุผล ซึ่งสามารถทดสอบได้ในการทดลองทางคลินิก
ประโยชน์ของ cistanche tubulosa-Antitumor
การแนะนำ
ด้วยกิจกรรมที่ส่งเสริมในการทดลองทางคลินิกที่เกี่ยวข้องกับ lysosomal inhibitor hydroxychloroquine (HCQ) (1) การจำแนก palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลของอนุพันธ์ของคลอโรควิน (2) และการเปิดตัวตัวยับยั้ง PPT1 ใหม่เข้าสู่ทางคลินิก การทดลอง (3, 4) จำเป็นต้องเข้าใจกลไกที่สารยับยั้งไลโซโซมกระตุ้นให้เซลล์ตายและผลของการยับยั้งไลโซโซมต่อภูมิคุ้มกันของเนื้องอก กลไกที่เป็นที่ยอมรับของการตายของเซลล์ lysosomal ที่อธิบายไว้สำหรับ HCQ เกี่ยวข้องกับการซึมผ่านของเยื่อ lysosomal (LMP) การรั่วไหลของ cathepsins และการกระตุ้นการตายของเซลล์แบบพึ่ง caspase (5, 6) ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่าตัวยับยั้ง lysosomal DC661 แทรกซึมเซลล์ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอกที่เป็นกรดและจำกัดวงเป็น lysosome ได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่า HCQ (2, 7) DC661 ก่อให้เกิดการตายของเซลล์ที่มีศักยภาพในหลายเซลล์มะเร็ง (2) DC661 จับและยับยั้ง PPT1, ลดความเป็นกรดของไลโซโซม และยับยั้งการกินอัตโนมัติ DC661 ยังชักนำ LMP และเพิ่มระดับของแคสเพสที่แยกออก 3 (2, 7) ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการกำหนดกลไกใหม่ของการตายของเซลล์ที่มีผลกระทบต่อระบบภูมิคุ้มกัน และรวมถึงการตายของเซลล์ เฟอร์โรพโทซิส และไพโรพโทซิส (8) การแสดงการกินอัตโนมัติที่ขึ้นกับไลโซโซมนั้นสามารถลดระดับ MHC คลาส I (9) เช่นเดียวกับส่วนประกอบของอิมมูโนโปรตีน (10) ซึ่งบ่งชี้ว่าการยับยั้งการกินอัตโนมัติสามารถเพิ่มการประมวลผลของแอนติเจนได้ อย่างไรก็ตาม ผลกระทบทางภูมิคุ้มกันของการยับยั้งไลโซโซมและการตายของเซลล์ที่ตามมายังไม่ได้รับการระบุลักษณะอย่างสมบูรณ์ เพื่อแก้ไขช่องว่างความรู้นี้ เราได้ตรวจสอบผลกระทบของ DC661 ต่อกลไกการตายของเซลล์มาตรฐานเพื่อตรวจสอบว่าการตายของเซลล์ไลโซโซมเป็นรูปแบบของการตายของเซลล์หรือเป็นเพียงสารตั้งต้นของกลไกที่จัดตั้งขึ้นอย่างใดอย่างหนึ่ง เราพบว่า HCQ และ DC661 ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในโปรตีนจำนวนเล็กน้อยในโปรตีโอเมลาโนมาและส่วนใหญ่เป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการกินอัตโนมัติและการตายของเซลล์ สารยับยั้งการตายของเซลล์ที่ถูกโปรแกรมไว้ (อะพอพโทซิส, เนื้อตาย, เฟอร์รอปโทซิส และไพโรปโทซิส) ไม่ได้บรรเทาผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์หลังจากการด้อยค่าของไลโซโซมโดย DC661 Lysosomal lipid peroxidation (LLP) เป็นตัวขับเคลื่อนหลักของการตายของเซลล์ที่เกิดจาก LMP ที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกของ calreticulin (CALR) บนพื้นผิวเซลล์ การตายของเซลล์รูปแบบนี้สามารถย้อนกลับได้โดยใช้สารต้านอนุมูลอิสระ N-acetylcysteine (NAC) เท่านั้น กิจกรรมของ NAC ลดลงเนื่องจากการยับยั้งของผู้นำเข้า lysosomal cysteine MFSD12 LLP กระตุ้นฟีโนไทป์ของภูมิคุ้มกันที่ส่งเสริมการฆ่าโดยอาศัยเซลล์ T การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่าการตายของเซลล์ไลโซโซมเป็นรูปแบบเฉพาะของการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกัน
cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน
ผลลัพธ์
การยับยั้ง Lysosomal ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในโปรตีโอมที่เกี่ยวข้องกับการกินอัตโนมัติและการตายของเซลล์ เพื่อสร้างผลกระทบต่อพิษต่อเซลล์ของสารยับยั้งไลโซโซมอล เราได้ประเมินความมีชีวิตของมะเร็งผิวหนังชนิด A375P, มะเร็งลำไส้ใหญ่ RKO และสายพันธุ์เซลล์มะเร็งตับอ่อน MIA PaCa-2 ที่ได้รับการรักษาด้วยแวคิวโอลาร์ H+-สารยับยั้ง ATPase bafilomycin-A1 (1 00 นาโนโมลาร์); ตัวยับยั้ง PPT1 DC661 (3 μM) หรือ HCQ (10 μM หรือ 30 μM); palmitate เลียนแบบ hexadecyl sulfonyl ฟลูออไรด์ (HDSF; 60 μM); สารยับยั้งคาเทซิน เพปสแตติน เอ (PepA; 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร), E64 (PepA; 10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) หรือ PepA+E64; และตัวขัดขวางเมมเบรนไลโซโซม Leu-Leu methyl ester hydrobromide (20 μM) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง มีเพียง bafilomycin-A1 และ DC661 เท่านั้นที่ทำให้ความมีชีวิตของเซลล์ข้ามเซลล์มะเร็งลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1A และรูปที่ 1A เพิ่มเติม วัสดุเสริมที่มีให้ทางออนไลน์พร้อมบทความนี้ https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1) โดยที่ DC661 ผลิต การมีชีวิตของเซลล์ลดลงอย่างลึกซึ้งมากกว่า bafilomycin-A1 จากข้อมูลเหล่านี้และคุณสมบัติคล้ายยาทางเภสัชวิทยาของอนุพันธ์ของคลอโรควิน เรามุ่งเน้นการศึกษาอนุพันธ์ของคลอโรควินในฐานะเครื่องมือในการทำความเข้าใจการตายของเซลล์ไลโซโซม การวิเคราะห์โปรตีโอมทั่วโลกที่เป็นกลางถูกนำไปใช้กับเซลล์มะเร็งผิวหนัง A375P ที่บำบัดด้วย DC661 (3 μM) หรือ HCQ ที่มีศักยภาพน้อยกว่า (10 μM หรือ 30 μM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากโปรตีนเชิงปริมาณที่มีความมั่นใจสูง 4, 264 ตัวมีเพียง 87 และ 55 โปรตีนเท่านั้นที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญด้วย DC661 (3 μM) และ HCQ (30 μM) ตามลำดับ; นอกจากนี้โปรตีน 14 และ 15 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญด้วย DC661 (3 μM) และ HCQ (30 μM) ตามลำดับ (การเปลี่ยนแปลงแบบพับสัมบูรณ์มากกว่า 2; q <0.05) ด้วย DC661 (3 μM) หรือ HCQ (30 μM) ตามลำดับ เมื่อเทียบกับการควบคุมรถ ขนาดยาที่ต่ำกว่าของ HCQ (10 ไมโครโมลาร์) แสดงให้เห็นว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงโปรตีนที่มีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมกระสายยา โปรตีน 50 อันดับแรกที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการรักษาด้วย DC661 ส่วนใหญ่เกี่ยวข้องกับการกินอัตโนมัติและการตายของเซลล์ และสังเกตการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายกันสำหรับปริมาณ HCQ ที่สูงขึ้น (รูปที่ 1B) ด้วยเหตุผลเหล่านี้ เราจึงเลือกที่จะมุ่งเน้นการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับ DC661 ที่มีศักยภาพมากกว่า ตัวอย่างของการเปลี่ยนแปลงโปรตีนที่ใหญ่ที่สุดบางส่วนที่เกี่ยวข้องกับการกินอัตโนมัติและการตายของเซลล์คือโปรตีนที่มีผลผูกพันภาษี1- 1 (TAX1BP1; เพิ่มขึ้น 15- เท่า); BCL2-อันตรกิริยาโปรตีน 3 (BNIP3; เพิ่มขึ้น 6- เท่า); เพื่อนบ้านของโปรตีน BRCA1 ยีน 1 (NBR1; เพิ่มขึ้น 12- เท่า); ซีเควสโตโซม-1 (SQSTM1/p62; เพิ่มขึ้น 5- เท่า); coactivator ตัวรับนิวเคลียร์ 4 (NCOA4; เพิ่มขึ้น 3- เท่า); และ LC3B (MAP1LC3B; เพิ่มขึ้น 3- เท่า) Apolipoprotein B-100 (APOB; เพิ่มขึ้น 66- เท่า) ได้มาจากซีรั่มลูกวัวของทารกในครรภ์และไม่มีการศึกษาเพิ่มเติม Immunoblotting ยืนยันว่าการรักษาด้วย DC661 หรือความเข้มข้นที่สูงกว่าของ HCQ ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในการแสดงออกของตัวรับสินค้า autophagy NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 และ NCOA4 ในลักษณะที่ขึ้นกับขนาดยาและเวลา (รูปที่ 1, B และ C เพิ่มเติม) CRISPR / Cas9 KO ของ PPT1 ในเซลล์ A375P ฟีโนโคปีผลกระทบของ DC661 ต่อโปรตีนเหล่านี้เมื่อเปรียบเทียบกับคู่ WT (รูปที่ 1D เพิ่มเติม) อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของตัวรับคาร์โก้ autophagy และการเพิ่มขึ้นสัมพัทธ์ที่เกิดจากการรักษา DC661 มีความแปรผันในมะเร็งลำไส้ใหญ่ มะเร็งตับอ่อน และเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดอื่น ๆ ซึ่ง DC661 แสดงให้เห็นถึงความเป็นพิษต่อเซลล์ (รูปที่ 1E เพิ่มเติม) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าตัวรับคาร์โก้ autophagy เองแม้ว่าจะเพิ่มขึ้นที่ระดับโปรตีน แต่ก็ไม่น่าจะรับผิดชอบต่อการตายของเซลล์หลังจากการรักษาด้วย DC661 เพื่อยืนยันสิ่งนี้ เรามุ่งเน้นไปที่ตัวรับสินค้า autophagy TAX1BP1 และ BNIP3 เนื่องจากพวกมันรู้จักผลกระทบของ proapoptotic ในเซลล์มะเร็ง (รูปที่ 1C) TAX1BP1 เป็นอะแดปเตอร์ขนส่งสินค้าอัตโนมัติ (11) และยังควบคุมการตายของเซลล์ที่เกิดจากสารยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนหรือสารทำลาย DNA ในเซลล์มะเร็ง (12) การล้มลงของ TAX1BP1 โดย siRNA (รูปที่ 1D) ไม่ส่งผลกระทบต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC661- ในระยะสั้น (รูปที่ 1E) และการทดสอบความมีชีวิตในระยะยาว (รูปที่ 1F) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า TAX1BP1 ไม่ได้มีบทบาทสำคัญใน661-ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เป็นสื่อกลาง DC BNIP3 เป็นโปรตีน proapoptotic ที่ทำให้พลังงานชีวภาพของไมโตคอนเดรียลดลงและควบคุมไมโทฟาจี (13) การล้มลงอย่างมีประสิทธิผลของ BNIP3 (รูปที่ 1G) ไม่ส่งผลต่อ661-ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC (รูปที่ 1, H และ I) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าผลกระทบต่อเซลล์ของ DC661 ไม่ขึ้นอยู่กับการแสดงออกของ BNIP3 ต่อไป เราศึกษาผลของการทำลายเซลล์ของยีน Canonical autophagy ที่จำเป็นสำหรับการผลิต autophagosome ต่อประสิทธิภาพ DC661 โดยการล้ม unc-51 เช่น autophagy activating kinase 1 (ULK1) และ autophagy- related gene 7 (ATG7) การล้มลงอย่างมีประสิทธิภาพของ ULK1 หรือ ATG7 (รูปที่ 2, A และ B เสริม) ยับยั้งการไหลอัตโนมัติ (รูปที่ 2C เสริม) แต่ไม่ส่งผลกระทบต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC 661- (รูปที่ 1, J–M) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการไม่มีกลไกการกินเซลล์หลักที่สำคัญไม่ได้ยกเลิกผลกระทบต่อพิษต่อเซลล์ของ DC661 การยับยั้ง Lysosomal โดย DC661 ทำให้เกิดเส้นทางการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้หลายเส้นทาง มุมมองที่ยอมรับได้คือการตายของเซลล์ไลโซโซมเกิดจากการตายของเซลล์ (5) อิมมูโนล็อตติงเผยให้เห็นว่าการบำบัดด้วย DC661 ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นแคสเปส-3, -7 และ -9 และการแตกแยกของ PARP-1 ซึ่งยืนยันว่า DC661 กระตุ้นการตายของเซลล์ (รูปที่ 2A) ตัวยับยั้ง pan-caspase Z-VAD-FMK ป้องกันการกระตุ้น caspase โดย DC661 แต่ไม่ได้ยับยั้งการสะสมของ LC3B และ p62 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้น apoptosis และการปิดล้อม autophagy สามารถแยกออกได้หลังจากการยับยั้ง lysosomal (รูปที่ 2B) การปิดกั้นการตายของเซลล์ด้วย ZVAD-FMK ไม่ได้เพิ่มหรือจำกัดความเป็นพิษต่อเซลล์ DC661 ซึ่งบ่งชี้ว่าการตายของเซลล์สามารถจ่ายได้สำหรับการตายของเซลล์ไลโซโซม (รูปที่ 2, C และ D) ผลกระทบทางพิษต่อเซลล์ของ DC661 มีความคล้ายคลึงกันในเซลล์ไขกระดูกปฐมภูมิ Bax / Bak double-KO ที่ไม่สามารถเกิดการตายของเซลล์และเซลล์ WT (รูปที่ 2E) การปิดกั้นการตายของเซลล์ไม่ส่งผลกระทบต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC{171}}ในมะเร็งลำไส้ใหญ่และเซลล์มะเร็งตับอ่อนเช่นกัน (รูปที่ 2 เพิ่มเติม, D–F) เนื่องจากเราพบว่าการตายของเซลล์สามารถจ่ายได้สำหรับการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด DC661- เราจึงตรวจสอบว่า DC661 ทำให้เกิดการตายของเซลล์หรือไม่ ซึ่งเป็นอีกรูปแบบหนึ่งของการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ซึ่งควบคุมโดยโปรตีนไคเนสที่ทำปฏิกิริยากับรีเซพเตอร์ (RIPK) และโปรตีนที่คล้ายโดเมนไคเนสที่สืบเชื้อสายผสม ( MLKL) ระดับของฟอสโฟรีเลชั่นและรูปแบบที่เปิดใช้งานของ RIPK และ MLKL เพิ่มขึ้นหลังจากการรักษาด้วย DC661 จาก 0.1–1 μM (รูปที่ 2F) ที่ 3 μM DC661 จะไม่มี RIPK1 ของฟอสโฟรีเลชั่น แต่มี MLKL ฟอสโฟรีเลชั่นแบบถาวร ซึ่งบอกว่าที่ความเข้มข้นที่สูงกว่านี้ การตายของเซลล์รูปแบบเพิ่มเติมอาจเกิดขึ้นได้ การบำบัดล่วงหน้าด้วย RIPK1 inhibitors necrostatin-1 หรือ necrostatin-1s หรือ MLKL inhibitor necrosulfonamide ป้องกันการเกิดฟอสโฟรีเลชั่นของ RIPK1 หลังการรักษา DC661 (1 μM) ในเซลล์มะเร็งผิวหนัง (รูปที่ 2G) แต่ไม่สามารถช่วยชีวิต DC ได้ }}ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ถูกชักนำในเซลล์มะเร็งผิวหนัง (รูปที่ 2H) หรือมะเร็งลำไส้หรือเซลล์มะเร็งตับอ่อน (รูปที่ 2G เสริม) การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่าการตายของเซลล์ถูกกระตุ้นแต่สามารถจ่ายได้สำหรับการตายของเซลล์ที่เป็นสื่อกลาง DC
รูปที่ 1 การยับยั้ง Lysosomal autophagy ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในการตายของเซลล์และโปรตีน autophagy (ก)
ไลโซโซมเป็นหนึ่งในแหล่งเก็บธาตุเหล็กหลัก เมแทบอลิซึมของธาตุเหล็กในเซลล์ที่มีการควบคุมผิดปกติควบคู่กับความสามารถในการรีดิวซ์ที่ลดลงสามารถกระตุ้นให้เซลล์ตายแบบ nonapoptotic ที่เรียกว่าเฟอร์โรปโทซิส จุดเด่นของเฟอร์โรโทซิสคือการควบคุมของพรอสตาแกลนดิน-เอนโดเปอร์ออกไซด์ซินเธส 2 (PTGS2), ตัวควบคุมการขนส่งไอออนบวก 1 (CHAC1) และซิสเตนิล-tRNA synthetase (CARS) (14) เครื่องหมายเฟอร์รอปโทซิสทั้ง 3 ตัวได้รับการควบคุมการถอดรหัสโดยการรักษาด้วย DC661 (รูปที่ 3A) ซึ่งบ่งชี้ว่าการยับยั้งไลโซโซมทำให้เกิดเฟอร์โรโทซิส DC661 ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนซ์ในเซลล์ A375P ที่ได้รับ C11 – BODIPY ซึ่งบ่งชี้การเกิดออกซิเดชันของไขมันซึ่งเป็นลักษณะของเฟอร์โรพโทซิส การเปลี่ยนแปลงที่เหนี่ยวนำด้วย DC661- นี้กลับกันอย่างมีนัยสำคัญเมื่อมีเฟอร์รอปโทซิสยับยั้งเฟอร์โรสแตติน-1 หรือลิปร็อกสแตติน-1 ที่ถูกบริหารที่ความเข้มข้นที่มีประสิทธิผล (รูปที่ 3B และรูปที่ 3A เพิ่มเติม) ซึ่งบ่งชี้เพิ่มเติมว่า DC661 ทำให้เกิดภาวะเฟอร์รอปโทซิส อย่างไรก็ตาม การยับยั้งเฟอร์รอปโตซิสไม่ได้ช่วยให้เกิดพิษต่อเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ DC661 (รูปที่ 3, C และ D) การรักษาเซลล์มะเร็งร่วมกันด้วย iron chelator deferoxamine (DFO) และ DC661 ไม่ได้ช่วยรักษาความเป็นพิษต่อเซลล์ของ DC661 (รูปที่ 3E) การบำบัดด้วยเฟอร์โรสแตติน-1, ลิป ร็อกสแตติน-1 หรือ DFO ไม่ได้ช่วยให้การยับยั้ง DC661 ของการมีชีวิตในระยะสั้นหรือการเจริญเติบโตของโคลนเจนิกในระยะยาวในเซลล์มะเร็งผิวหนังชนิดเมลาโนมา ลำไส้ใหญ่ และมะเร็งตับอ่อน (รูปที่ 3 เพิ่มเติม B –E และรูปที่ 4 เพิ่มเติม, A–D) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเฟอร์รอปโตซิสถูกกระตุ้นแต่สามารถจ่ายได้สำหรับการตายของเซลล์ที่เป็นสื่อกลาง DC661- ไพโรโทซิสเป็นรูปแบบหนึ่งของการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้ซึ่งเกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการอักเสบที่เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นแคสเปสที่ประมวลผลแกสทริน (GSDM) ทำให้เกิดรูพรุนบนพลาสมาเมมเบรน และปล่อยรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับความเสียหายในภายหลัง เช่น ความคล่องตัวสูง กล่องกลุ่ม 1 (HMGB1) การบำบัด DC661 ในเซลล์มะเร็งผิวหนังหลายสายพันธุ์ (A375P, A375, WM35 และ WM793) ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นตัวเริ่มต้นแคสเพส-8 และ -9 และแคสเพสของผู้ดำเนินการ-7 ซึ่งเป็นเรื่องปกติสำหรับไพโรพโทซิส และผลิตได้ การตัดแยกของ GSDME แบบเต็มความยาว คล้ายคลึงกันในขอบเขตกับตัวเหนี่ยวนำไพโรโพซิสที่รู้จัก PLX4720 และ PD0325901 (รูปที่ 5A เพิ่มเติม) DC661 ผลิตการปลดปล่อย HMGB1 ภายนอกเซลล์ที่แข็งแกร่งกว่าตัวเหนี่ยวนำไพโรโทซิสที่รู้จัก, BRAF และการยับยั้ง MEK ใน 1% FBS (15) ซึ่งสะท้อนถึงผลลัพธ์เชิงการทำงานของไพโรพโทซิสที่ถูกกระตุ้น ต่อไป เราทดสอบว่าการยับยั้ง pyroptosis โดย GSDME KO จะช่วยแก้ไขผลกระทบทางพิษต่อเซลล์ของ DC661 หรือไม่ การบำบัดด้วย DC661 ทำให้เกิดการสะสม LC3II และ SQSTM1/ p62 และการกระตุ้นแคสเปส แต่การปล่อย HMGB1 ถูกยกเลิกไปเกือบทั้งหมดในเซลล์มนุษย์ GSDME-KO WM35 ซึ่งแสดงให้เห็นว่าผลการทำงานของการยับยั้งไพโรพโทซิสบรรลุผลสำเร็จ (รูปที่ 3F) อย่างไรก็ตาม การรักษาด้วย DC661 สร้างความเป็นพิษต่อเซลล์เท่ากันใน YUMM1.7 WT, เวกเตอร์เปล่า (EV) และเซลล์ Gsdme KO1 และ KO2 ในเงื่อนไข FBS ทั้ง 10% และ 1% (รูปที่ 3G และรูปที่ 5B เพิ่มเติม) ผลลัพธ์ทั่วไปอย่างหนึ่งของการตายของเซลล์หลายรูปแบบคือการปลดปล่อย LDH DC661 ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการปลดปล่อย LDH และสิ่งนี้ไม่สามารถย้อนกลับได้โดยการตายของเซลล์, เนื้อตาย หรือการยับยั้งเฟอร์รอปโทซิส (รูปที่ 5C เพิ่มเติม) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า DC661 ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์หลายรูปแบบ รวมถึงการตายของเซลล์และไพโรพโทซิส ตลอดจนการตายของเซลล์และเฟอร์โรปโทซิส แต่ไม่จำเป็นต้องใช้รูปแบบการตายของเซลล์เหล่านี้สำหรับการตายของเซลล์ที่ชักนำด้วย DC{73}} การยับยั้ง Cathepsin หรือการขับแคลเซียมไม่ได้ป้องกันการตายของเซลล์จากการซึมผ่านของเยื่อไลโซโซม จากการแสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นแคสเปส (ซึ่งจำเป็นสำหรับการตายของเซลล์และไพโรปโตซิส) สามารถจ่ายได้สำหรับการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด DC{74}} เราตั้งสมมติฐานว่าการปล่อยคาเทซินจากไลโซโซมอาจทำให้เซลล์ตายโดยขึ้นอยู่กับแคสเปส การยับยั้งทางเคมี (DC661) หรือทางพันธุกรรม (PPT1 siRNA [siPPT1]) ของ PPT1 ทำให้เกิดการซึมผ่านของเยื่อไลโซโซม (LMP) ในขณะที่ HDSF ซึ่งเป็นสารยับยั้งที่ไม่สามารถกลับคืนสภาพเดิมได้น้อยกว่าของ PPT1 ซึ่งหมดลงอย่างรวดเร็วในการเพาะเลี้ยงเซลล์ ไม่สามารถกระตุ้น LMP ตามที่วัดได้ โดย galectin-3–positive puncta (รูปที่ 4A) LMP ส่งผลให้เกิดการปล่อย cathepsins และเนื้อหาไลโซโซมอื่น ๆ เข้าสู่ไซโตพลาสซึม และคิดว่าเป็นคุณสมบัติใกล้เคียงที่สำคัญของการตายของเซลล์ที่ใช้ไลโซโซม LMP ที่เกิดจาก DC661 มีความเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกิจกรรมของ cytoplasmic cathepsin-L ซึ่งถูกบล็อกอย่างมีนัยสำคัญด้วยตัวยับยั้งซิสเทอีนโปรตีเอส E64 (รูปที่ 4B) รายงานก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าการปล่อย cathepsin จากไลโซโซมที่แตกหักจะส่งเสริมการกระตุ้นการทำงานของแคสเปส ซึ่งนำไปสู่การตายของเซลล์อะพอพโทติก (16–18) การยับยั้งคาเทซินโดยสมบูรณ์ไม่ได้ป้องกันการแตกแยกของแคสเปส (รูปที่ 4C) และไม่ได้ช่วยเหลือความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC661- ในการทดสอบความมีชีวิตในระยะสั้นและระยะยาวในมะเร็งผิวหนัง (รูปที่ 4, D และ E), มะเร็งลำไส้ใหญ่ และตับอ่อน เซลล์มะเร็ง (รูปที่ 6 เพิ่มเติม, A – C) ผลลัพธ์เหล่านี้สวนทางกับมุมมองที่เป็นที่ยอมรับของการตายของเซลล์ไลโซโซมซึ่งได้รับแรงหนุนจากการตายของเซลล์ที่ใช้สื่อกลางคาเทซิน นอกจากการปล่อย cathepsin จากไลโซโซมที่รั่วแล้ว การปลดปล่อยแคลเซียมจากไลโซโซมยังมีส่วนเกี่ยวข้องกับความผิดปกติของเซลล์เมื่อ PPT1 บกพร่อง (19) การบำบัดด้วย DC661 ส่งผลให้เกิดการปลดปล่อยแคลเซียมอย่างกว้างขวาง ซึ่งถูกยกเลิกโดยการปรับสภาพคีเลเตอร์แคลเซียมถาวร (Ca{101}} ของเซลล์ BAPTA-AM ล่วงหน้า (รูปที่ 4F) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง BAPTA-AM ไม่ได้ป้องกัน LMP ที่เกิดจาก DC661- (รูปที่ 4G) หรือความแตกแยกของแคสเปส (รูปที่ 6, D และ E เสริม) และที่สำคัญที่สุด ไม่ได้ช่วยรักษาความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจาก DC{108}} ( รูปที่ 4H) การค้นพบเหล่านี้ยังถูกสังเกตพบในทั้งเซลล์ RKO และ MIA PaCa-2 ซึ่งไม่มีความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในค่า IC50 ที่ถูกสังเกตด้วย BAPTA-AM และ DC661 (รูปที่ 6F เพิ่มเติม) ซึ่งแนะนำว่าการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ LMP ไม่ขึ้นอยู่กับแคลเซียมหรือคาเทซิน
รูปที่ 2 การตายของเซลล์และการตายของเซลล์ที่เกิดจาก DC661- (ก)
รูปที่ 3 ภาวะเฟอร์โรโทซิสและไพโรโทซิสที่เกิดจาก DC661- (ก)
LLP ขับเคลื่อน LMP หลังจากกำหนดแล้วว่าสารยับยั้งของวิถีการตายของเซลล์หลัก (อะพอพโทซิส, เนื้อตาย, เฟอร์โรโทซิส และไพโรโทซิส), คาเทซิน (PepA และ E64) และคีเลเตอร์ไอออน (BAPTA-AM [Ca2+] และ DFO [Fe{{3} }]) ไม่ได้ป้องกันการตายของเซลล์ด้วย DC661 และการค้นหาหลักฐานของการเกิดเปอร์ออกซิเดชันของไขมันโดย C-11-BODIPY เราทำการวิเคราะห์ไขมันทั่วโลกที่ 2 และ 4 ชั่วโมงหลังการรักษาด้วย DC661 DC661 เหนี่ยวนำให้เกิดการเพิ่มขึ้น 3- ในช่วงต้นและแบบยั่งยืนถึง 10- เท่าในทุกคลาสของไลโซฟอสโฟไลปิด (รูปที่ 5A) ในทางตรงกันข้าม พบการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลยในคลาสฟอสโฟไลปิด ซึ่งรวมถึงฟอสฟาติดิลโคลีน, ฟอสฟาติดิลเอทานอลเอมีน, ฟอสฟาติดิลซีรีน, ฟอสฟาติดิลโนซิทอล, ฟอสฟาติดิลกลีเซอรอล และกรดฟอสฟาติดิก (รูปที่ 7A เพิ่มเติม) Lysophospholipid สามารถสร้างได้โดย ROS ซึ่งจะออกซิไดซ์ห่วงโซ่กรดไขมันอิ่มตัวซึ่งจะถูกแยกออกโดยฟอสโฟไลเปส (20) เพื่อตรวจสอบว่าสารต้านอนุมูลอิสระสามารถป้องกันความเสียหายของไขมันที่เกิดจาก ROS ได้หรือไม่ เราได้ตรวจสอบ661-ความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด DC ต่อหน้า N-acetylcysteine (NAC) ตัวเก็บขยะ pan-ROS (21, 22) และสารยับยั้งการเกิด lipid peroxidation แบบสมมุติ Trolox (23 ) และวิตามินซี (กรดแอสคอร์บิก) (24, 25) ซึ่งแตกต่างจากสารอื่นๆ ที่ทดสอบจนถึงตอนนี้ การบำบัดร่วมกับ NAC ช่วยรักษาความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับ DC661- ข้ามหลายเซลล์ (รูปที่ 5B และรูปที่ 7B เพิ่มเติม) การตรวจวิเคราะห์ CFU ระยะยาวแสดงให้เห็นว่า NAC ซึ่งแตกต่างจากตัวยับยั้งการตายของเซลล์, คีเลเตอร์ไอออน และตัวยับยั้งคาเทซินทั้งหมดที่ทดสอบในที่นี้ ป้องกันผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ของ DC661 ในเซลล์ A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 และ MC38 ( รูปที่ 5C และรูปที่ 7C เพิ่มเติม) สิ่งที่น่าสนใจคือ Trolox และวิตามินซีไม่ได้ช่วยชีวิต DC661 ความเป็นพิษต่อเซลล์ในมะเร็งผิวหนังของมนุษย์, มะเร็งลำไส้ใหญ่, เซลล์มะเร็งตับอ่อน และมะเร็งผิวหนังของ murine และเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ (รูปที่ 5D และรูปที่ 7 เพิ่มเติม, D – H) ความแตกต่างนี้กระตุ้นให้เราทดสอบว่า NAC, Trolox และวิตามินซีส่งผลต่อ LMP หรือไม่ ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า NAC เป็นสารต้านอนุมูลอิสระเพียงชนิดเดียวที่ลด LMP ที่เกิดจาก DC{39}} ได้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5E) เราตั้งสมมติฐานว่า LLP ขับเคลื่อนการผลิต LMP โดย DC661 ซึ่งอาจเปลี่ยนกลับโดย NAC แต่ไม่ใช่โดย Trolox และวิตามินซี เพื่อศึกษากระบวนการของ LLP เราใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ FOAM-LPO (26) ซึ่งแปลเฉพาะตำแหน่งเป็นไลโซโซมและผลิต การเปลี่ยนแปลงสเปกตรัมจาก 586 เป็น 512 นาโนเมตร (สีแดงเป็นสีเขียว) เมื่อสัมผัสกับไขมันเปอร์ออกไซด์ เราพบว่า DC661 เหนี่ยวนำ LLP เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5F) NAC ลดการเกิดออกซิเดชันของไขมันในไลโซโซมของเซลล์มะเร็งผิวหนังที่ได้รับ DC661- ในขณะที่โทรลอกซ์และวิตามินซีไม่สามารถลด LLP ได้ (รูปที่ 5F) NAC, Trolox และวิตามินซีเพียงอย่างเดียวไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อการเกิดออกซิเดชันของไขมัน การล้มลงของ PPT1 (รูปที่ 8A เสริม) หรือการบำบัดด้วยความเข้มข้นสูงของ HCQ (รูปที่ 8B เสริม) ยังเหนี่ยวนำ LMP ที่สามารถย้อนกลับได้โดย NAC ในขณะที่การยับยั้งทางเคมีของ ULK1 ไม่ได้ชักนำ LMP (รูปที่ 8C เสริม) การล้มลงที่สำคัญของ siPPT1 ยังรวมถึง LLP ที่สามารถย้อนกลับได้ด้วย NAC (รูปที่ 8D เพิ่มเติม) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง PPT1 ชักนำ LLP ที่สามารถช่วยชีวิตได้โดย NAC และมีแนวโน้มว่าจะเป็นสาเหตุของ LMP ที่ชักนำให้เกิดการยับยั้ง PPT1- นอกจากนี้การค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า LLP มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการตายของเซลล์ไลโซโซม
สมุนไพรจีน cistanche plant-Antitumor
การนำเข้าซิสเทอีนเข้าสู่ไลโซโซมโดย MFSD12 จะลดการตายของเซลล์ไลโซโซม จากสารยับยั้ง lipid peroxidation 3 ตัว มีเพียง NAC เท่านั้นที่ป้องกัน LLP รายงานล่าสุดแสดงให้เห็นว่าโดเมน superfamily ของผู้อำนวยความสะดวกหลักที่มี 12 (MFSD12) เป็นองค์ประกอบสำคัญของผู้นำเข้าซิสเทอีนสำหรับไลโซโซมและเมลาโนโซม (27) เราให้เหตุผลว่า NAC หรือเมตาบอไลต์ซิสเทอีนของมันถูกขนส่งเข้าสู่ไลโซโซมผ่าน MFSD12 โดยที่ซิสเทอีนจะถูกออกซิไดซ์เป็นไดซัลไฟด์ซึ่งก็คือซิสเทอีน เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เราได้เปรียบเทียบความสามารถของ NAC ในการช่วยเหลือความเป็นพิษต่อเซลล์ DC661 ในเซลล์ siNT และ siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่า NAC ช่วย DC661- กระตุ้น LMP ในเซลล์ siNT แต่ไม่ได้ช่วย LMP ในเซลล์ siMFSD12 (รูปที่ 6A) NAC ลด LLP ของ DC661-ที่บำบัดเซลล์ siNT-A375P แต่ไม่ใช่เซลล์ siMFSD12 เซลล์ siMFSD12 ที่รักษาด้วย DMSO หรือ NAC มี LLP พื้นฐานเพิ่มขึ้น (รูปที่ 6B) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ siNT ในขณะที่ NAC ช่วยรักษาความเป็นพิษต่อเซลล์ DC661 ในเซลล์ siNT ความสามารถของ NAC ในการช่วยเหลือความเป็นพิษต่อเซลล์ DC661 นั้นถูกยกเลิกโดยสิ้นเชิงในเซลล์ siMSFD12 (รูปที่ 6C) สิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าการล้มลงของ MFSD12 ปิดกั้นผลกระทบทางไซโตโปรเทคทีฟของ NAC กับ DC661 NAC ถูกดีอะซิติเลตโดยอะซิเลสในไซโตโซล (28) เพื่อตรวจสอบว่าการรักษาด้วย NAC ทำให้เกิดการสะสมของซิสเทอีนหรือซีสตีนภายในไลโซโซมหรือไม่ เราใช้เทคนิค lysosomal immunoprecipitation (Lyso-IP) (29) เพื่อทำให้ไลโซโซมบริสุทธิ์จาก DMSO และเซลล์ A375P ที่ได้รับ NAC (รูปที่ 6D และรูปที่ 9A เพิ่มเติม) และดำเนินการ เมแทบอลิซึมเป้าหมายเพื่อหาปริมาณ NAC และสารที่เกี่ยวข้อง ตามที่คาดไว้ NAC ถูกตรวจพบใน lysate ทั้งเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย NAC และเศษส่วนที่ไม่ได้ผูกไว้ที่เกี่ยวข้อง ระดับแอล-ซิสเทอีนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญภายในไลโซโซมที่ได้รับ NAC L-cystine สามารถตรวจพบได้ภายในไลโซโซมที่ได้รับ NAC เท่านั้น น่าประหลาดใจที่เราไม่พบการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของกลูตาไธโอน (ลดลง) ในกลุ่มที่ได้รับ NAC (รูปที่ 6E); สิ่งนี้น่าประหลาดใจเพราะเชื่อกันโดยทั่วไปว่าการรักษาด้วย NAC กระตุ้นให้เกิดการผลิตกลูตาไธโอนเพิ่มขึ้น และแก้ไขสมดุลรีดอกซ์ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าซิสเตอีนที่นำเข้าสู่ไลโซโซมผ่านทางผู้นำเข้า MFSD12 นั้นมีความสำคัญอย่างยิ่งในการช่วยชีวิตเซลล์ LLP, LMP และการตายของเซลล์ไลโซโซม LLP เป็นภูมิคุ้มกัน การตายของเซลล์ควบคุมบางรูปแบบที่เกิดจาก DC661 (ไพโรโทซิส, เนื้อตาย, เฟอร์โรพโทซิส) ได้รับการระบุว่าเป็นสารก่อภูมิคุ้มกัน ก่อนหน้านี้ มีการอธิบายการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันสำหรับยาเคมีบำบัดตามลักษณะเฉพาะ ซึ่งรวมถึงการแสดงรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับความเสียหาย รวมถึงการแสดงออกของผิวเซลล์ของ CALR และการปลดปล่อยโปรตีน HMGB1 และ adenosine triphosphate (ATP) (30) CALR ทำหน้าที่เป็นสัญญาณ "eat-me" เมื่อสัมผัสกับพื้นผิวเซลล์ระหว่างความเครียดของเซลล์ การปล่อย HMGB1 และ ATP ภายนอกเซลล์ทำหน้าที่เป็นสัญญาณ "find-me" ที่เซลล์ phagocytic รับรู้ เราเปรียบเทียบสองแบบจำลอง: เซลล์ B16F10 ซึ่งในแบบจำลองเนื้องอกซินจีนิกนั้นแทบจะไม่มีเซลล์เม็ดเลือดขาวที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอกเลย และเซลล์ MC38 ซึ่งในแบบจำลองเนื้องอกซินจีนิกนั้นมีเซลล์เม็ดเลือดขาวที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก อันดับแรก เราแสดงให้เห็นว่าการรักษา DC661 หรือ siPpt1 ทำให้เกิดการแสดงออกของ CALR บนพื้นผิวอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสามารถยกเลิกได้อย่างสมบูรณ์ด้วยการบำบัดด้วย NAC ในเซลล์ MC38 (รูปที่ 7, A และ B) การค้นพบที่คล้ายกันถูกสังเกตพบในเซลล์ B16F10 (รูปที่ 7C) สารยับยั้งวิถีการตายของเซลล์หลัก (อะพอพโทซิส, เนื้อตาย, เฟอร์รอปโทซิส และไพโรปโทซิส) ล้มเหลวในการป้องกันการแสดงออกของพื้นผิวของ CALR (รูปที่ 7D) เพื่อตรวจสอบว่าการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันที่เกิดจาก DC661 เกิดจากการควบคุม MHC คลาส I หรือไม่ เซลล์ B16F10 และ MC38 ได้รับการบำบัดด้วย DC661 (3 μM) หรือ DMSO เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เราพบว่าการรักษาด้วย DC661 ไม่ได้เพิ่มการแสดงออกของ MHC คลาส I และการควบคุมอิมมูโนโปรตีน (รูปที่ 7E และรูปที่ 9 เพิ่มเติม, B และ C)
รูปที่ 4 การยับยั้งคาเทซินหรือการคีเลชันแคลเซียมไม่ได้ป้องกันการตายของเซลล์ที่เกิดจาก DC661- (ก)
เพื่อให้เข้าใจถึงผลกระทบของการยับยั้งการกินอัตโนมัติต่อการเตรียมทีเซลล์ เราได้ทำการทดลองในหลอดทดลองและการเพาะเลี้ยงร่วมกันโดยใช้เซลล์ม้ามของ C57BL6/J ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (31) สำหรับการเตรียมไพรมิง เราได้เปิดเผยเซลล์ม้ามไปยังเซลล์ B16F10 หรือ MC38 ที่บำบัดด้วย DC661- หรือ DMSO ถัดไป เซลล์ม้ามที่ถูกเตรียมไว้เหล่านี้ถูกเพาะเลี้ยงด้วยเซลล์ B16F10 หรือ MC38 ที่มีชีวิต และความเป็นพิษต่อเซลล์ถูกวัด (รูปที่ 8A) เซลล์ม้ามที่เตรียมไว้ด้วยเซลล์ B16F10 ที่ได้รับการบำบัดด้วย DC661- ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน IFN เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ม้ามที่สัมผัสกับเซลล์ B16F10 ที่ได้รับการบำบัดด้วย DMSO การฆ่าโดยอาศัยทีเซลล์ที่ไพรม์ไว้ของเซลล์ B16F10 ที่กำลังเพิ่มจำนวนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ม้ามที่ไพรม์ไว้ DC661- เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ม้ามที่ไพรม์ไว้ด้วย DMSO (รูปที่ 8, B และ C) เซลล์ MC38 ที่บำบัดด้วย DC661 ทำให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ของ IFN- และทีเซลล์ที่เตรียมไว้มากยิ่งขึ้นเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ B16F10 (รูปที่ 8, D และ E) การบำบัดด้วย NAC ด้วย DC661 สามารถยกเลิกการปลดปล่อย IFN จากเซลล์ม้ามและความเป็นพิษต่อเซลล์ของทีเซลล์ที่ไพรม์ทื่อได้อย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 8, F และ G) การล้มลงของแคลเรติคูลินโดย siCalr ในเซลล์ MC38 (รูปที่ 9D เพิ่มเติม) ได้ยกเลิกประสิทธิภาพการรองพื้นของการรักษา DC661 และลดความเป็นพิษต่อเซลล์ของ T-cell ที่เตรียมไว้อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 8, H และ I) เมื่อนำมารวมกัน ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนบทบาทกลไกของการควบคุม CALR ที่เกี่ยวข้องกับ LLP ในการส่งเสริมภูมิคุ้มกันของเซลล์ทีเซลล์ต้านมะเร็ง ต่อไป เราได้ขยายผลการค้นพบ ในหลอดทดลอง เหล่านี้ไปสู่การศึกษาการฉีดวัคซีนต้านเนื้องอก ในสัตว์ทดลอง ในหนูทดลองที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องและภูมิคุ้มกันบกพร่อง สำหรับการทดสอบนี้ เซลล์ B16F10 หรือ MC38 ที่ได้รับการบำบัดด้วยความเย็นจัดในหลอดทดลองหรือ DC661- ถูกฉีด sc บนปีกซ้ายเพื่อปกป้องหนูเมาส์ C57BL/6 หรือ NOD/SCID ที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่องจากการท้าทายซ้ำด้วยเซลล์เนื้องอกที่มีชีวิตชนิดเดียวกันที่ถูกฉีด 7 วันต่อมา เข้าสู่ปีกขวา (รูปที่ 9A) เซลล์ B16F10 ที่ได้รับการบำบัดด้วย DC661- ล้มเหลวในการป้องกันการปฏิเสธเนื้องอกแม้จะมีการตรวจวิเคราะห์ ในหลอดทดลอง โดยเสนอแนะว่า DC661 ชักนำให้เกิดการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันบกพร่อง (รูปที่ 9B และรูปที่ 9E เพิ่มเติม) ในทางตรงกันข้าม การฉีดวัคซีนที่ปีกด้านหนึ่งด้วยเซลล์ MC38 ที่ได้รับการบำบัด DC661- ส่งเสริมการปฏิเสธเซลล์ MC38 ที่มีชีวิตที่ฝังอยู่บนปีกด้านตรงข้ามโดยสมบูรณ์ (รูปที่ 9C และรูปที่ 9F เพิ่มเติม) เพื่อตรวจสอบว่าภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวมีความสำคัญต่อผลของวัคซีนที่ DC661 ดูเหมือนจะเกิดกับเนื้องอก MC38 หรือไม่ เราทำการทดลองซ้ำในหนู NOD/SCID เป็นที่น่าสังเกตว่าเซลล์ MC38 ที่ได้รับ DC661- ไม่ทำให้เกิดการปฏิเสธเนื้องอกที่ท้าทายในหนู NOD/SCID ที่มีภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง (รูปที่ 9D และรูปที่ 9G เสริม) ซึ่งบ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมีภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวสำหรับผลของวัคซีนที่สังเกตได้ เพื่อทดสอบความทนทานของการค้นพบนี้ เราได้เลือกสายพันธุ์เซลล์มะเร็งในหนูที่สร้างภูมิคุ้มกันที่รู้จักกันดีอีกสายหนึ่งคือ CT26 และทำการทดลองฉีดวัคซีนดังที่กล่าวข้างต้น ตามที่คาดไว้ การฝังเซลล์ CT26 ที่ได้รับการบำบัดด้วย DC661- ในปีกข้างหนึ่งของเมาส์ทำให้เกิดผลเหมือนวัคซีน และป้องกันการเจริญเติบโตของเซลล์ CT26 ที่มีชีวิตซึ่งถูกฝังไว้ที่ปีกอีกข้างหนึ่ง (รูปที่ 9E และรูปที่ 9 เพิ่มเติม) การค้นพบของเราชี้ให้เห็นว่า LLP ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วย DC{661- นั้นมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการตายของเซลล์ที่สร้างภูมิคุ้มกันโดยอาศัย LMP ซึ่งกลับกันโดยการนำเข้าซิสเทอีนเข้าสู่ไลโซโซมโดยตัวขนส่งไลโซโซม MFSD12 (รูปที่ 9F)
การอภิปราย
การยับยั้ง Lysosomal ดูเหมือนจะเป็นวิธีการรักษาที่มีแนวโน้มในการศึกษาพรีคลินิก และการทดลองทางคลินิกของ HCQ ก็ได้ให้ผลลัพธ์ที่ให้กำลังใจแต่หลากหลาย (1, 32) PPT1 เป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลของ HCQ และสารยับยั้ง PPT1 ที่มีศักยภาพมากกว่าเช่น DC661 (2) และ GNS561 (3) กระตุ้นให้เซลล์ตายโดยพึ่ง LMP ในหลอดทดลอง กลไกที่แม่นยำของการตายของเซลล์ lysosomal และบทบาทในการสร้างภูมิคุ้มกันของเนื้องอกยังไม่ได้รับการอธิบายอย่างสมบูรณ์ ภูมิคุ้มกันต้านมะเร็งจะเพิ่มขึ้นเมื่อการยับยั้ง autophagy รวมกับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน (9, 10, 31) กลไกที่เสนอสำหรับการสร้างภูมิคุ้มกันภายในเซลล์หลังจากการยับยั้งการกินอัตโนมัติ ได้แก่ MHC คลาส I และการควบคุมอิมมูโนโปรตีน ซึ่งทั้งสองสนับสนุนการประมวลผลและการนำเสนอแอนติเจนที่ได้รับการปรับปรุง นอกจากนี้ การสูญเสียโปรตีน autophagy หรือการยับยั้ง autophagy โดยคลอโรควินเติม CD8+ การตอบสนองของทีเซลล์โดยการเพิ่มระดับพื้นผิวของ MHC คลาส I ในเซลล์เดนไดรต์ (33) ก่อนหน้านี้เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง PPT1 อย่างเป็นระบบสามารถ repolarize macrophages จากฟีโนไทป์ M2 เป็น M1 สารยับยั้ง PPT1 สามารถเพิ่มระดับ STING ซึ่งนำไปสู่การปลดปล่อย IFN และการเพิ่มการฆ่าเซลล์ T ที่เป็นสื่อกลางในแบบจำลองมะเร็งผิวหนัง (31) ที่นี่เราแสดงให้เห็นว่า LLP เองสร้างเซลล์เนื้องอกในรูปแบบภูมิคุ้มกันภายในของการตายของเซลล์ เราพบว่าการยับยั้งไลโซโซมทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโปรตีนน้อยมากในเซลล์มะเร็ง และโปรตีนที่มีการยกระดับอย่างมีนัยสำคัญมากที่สุด ได้แก่ ตัวรับคาร์โก้ autophagy และตัวควบคุมการตายของเซลล์ วิธีการของเราที่มุ่งเป้าไปที่ยีนเหล่านี้บางส่วนในฟังก์ชันต่างๆ แสดงให้เห็นว่าโปรตีนที่เกิดจากยาไม่น่าจะเป็นตัวควบคุมหลักของการตายของเซลล์ การยับยั้งทางพันธุกรรมของ ULK1 หรือ ATG7 ก็ไม่ได้ช่วยให้เกิดพิษต่อเซลล์ DC661 เช่นกัน เราแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งไลโซโซมกระตุ้นการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้หลายรูปแบบ รวมถึงการตายของเซลล์, เนื้อร้าย, เฟอร์รอปโทซิส และไพโรโทซิส แต่แต่ละรูปแบบเหล่านี้สามารถจ่ายได้สำหรับความเป็นพิษต่อเซลล์ที่เกิดจากยา สิ่งที่น่าสังเกตคือ กลไกการตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรมไว้สามารถทับซ้อนกันและการกำหนดเป้าหมายร่วมกันของกลไกการตายของเซลล์หลายตัวสามารถจัดให้มีการป้องกันไซโตโรปจากการตายของเซลล์หลังจากการซึมผ่านของเยื่อไลโซโซม งานของเราได้ตัดกลไกที่ขึ้นกับคาเทปซินและแคลเซียมสำหรับการตายของเซลล์ไลโซโซม และเน้นย้ำถึงความสำคัญของ LLP ในฐานะปัจจัยวิกฤตที่สำคัญของการตายของเซลล์ เราพบหลักฐานของ LLP ที่สามารถย้อนกลับได้ด้วยสารต้านอนุมูลอิสระที่ถูกขนส่งเข้าสู่ไลโซโซม NAC และมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการซึมผ่านของเยื่อไลโซโซมและความเป็นพิษต่อเซลล์ NAC เป็นเพียงสารเดียวที่สามารถบรรเทาหรือย้อนกลับ661-การตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด DC และความสามารถนี้ขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของตัวขนส่งซิสเทอีนไลโซโซมอล MFSD12 การขาดการเจาะไลโซโซมอาจเป็นไปได้ว่าเหตุใดสารยับยั้งการเกิด lipid peroxidation สมมุติอื่นๆ ได้แก่ Trolox และวิตามินซี จึงไม่สามารถป้องกันความเป็นพิษต่อเซลล์ DC661 ได้ NAC จะถูกแปลงเป็นซิสเทอีน ซึ่งถูกนำเข้าไปในไลโซโซมและออกซิไดซ์เป็นซิสทีนในรูปแบบไดซัลไฟด์ ซีสตีนจะถูกส่งออกไปยังไซโตโซลโดยตัวขนส่งไลโซโซมอีกตัวหนึ่ง นั่นคือซิสสติโนซิส ซึ่งจะถูกรีดิวซ์เป็นซิสเทอีนที่ระดมแหล่งสารอาหารภายในอีกครั้ง กระตุ้นเป้าหมายของราปามัยซินคอมเพล็กซ์ 1 อีกครั้ง และส่งเสริมการกินอัตโนมัติ (34) การปั่นจักรยานแบบลดการเกิดออกซิเดชันของซิสเทอีนไปเป็นซีสตีน (ไลโซโซม) และกลับสู่ซีสเตอีน (ไซโตโซล) อาจเป็นกลไกการช่วยเหลือที่เป็นไปได้ของ NAC ต่อความเป็นพิษต่อเซลล์ DC661 หรือการบาดเจ็บของไลโซโซมทั่วไปในบริบทของโรคอื่น ๆ ที่ NAC ได้พิสูจน์แล้วว่ามีประโยชน์ในการรักษา (35) . NAC ไม่เพียงแต่ย้อนกลับ LLP และ LMP ที่เหนี่ยวนำด้วย DC661- แต่ยังแสดงการแสดงออกบนพื้นผิวของแคลเรติคูลินเครื่องหมายการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันอีกด้วย การแสดงออกบนพื้นผิวเซลล์ของโปรตีน CALR เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับความเป็นพิษต่อเซลล์ที่มีสื่อกลางของทีเซลล์ที่ได้รับการปรับปรุงซึ่งเกิดจาก DC661- เซลล์ม้ามที่เตรียมไว้ล่วงหน้า ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งไลโซโซมทำให้เกิดรูปแบบเฉพาะของภูมิคุ้มกันจากภายในเซลล์
ในขณะที่การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าการยับยั้ง lysosomal สามารถเพิ่มฤทธิ์ต้านเนื้องอกของการยับยั้งจุดตรวจภูมิคุ้มกันในเนื้องอกด้านข้างที่จัดตั้งขึ้น (9, 31) การศึกษาของเราเป็นครั้งแรกในความรู้ของเราที่แสดงให้เห็นถึงผลคล้ายวัคซีนสำหรับเนื้องอก MC38 แต่ไม่ใช่เนื้องอก B16 ใน เซลล์เนื้องอกถูกปรับสภาพด้วย DC661 ก่อนการฝัง สิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าการตายของเซลล์ไลโซโซมสามารถกระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกันภายในเซลล์ได้ แต่การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ด้วยตัวเองไม่น่าจะเพียงพอที่จะเปลี่ยนสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก "เย็นภูมิคุ้มกัน" ให้กลายเป็นสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก "ร้อนภูมิคุ้มกัน" การศึกษาก่อนหน้าของเราในแบบจำลองสภาพแวดล้อมเนื้องอกขนาดเล็ก "ภูมิคุ้มกันเย็น" B16 และ BRafCA PtenloxP Tyr: แบบจำลองเมาส์ดัดแปลงพันธุกรรม CreERT2 (31) แสดงให้เห็นว่าการยับยั้งไลโซโซมอย่างเป็นระบบทำให้เกิดผลกระทบต่อมาโครฟาจที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอกและเซลล์ยับยั้งที่ได้มาจากเซลล์ไมอีลอยด์ ซึ่งเพียงพอที่จะเพิ่มประสิทธิภาพ ประสิทธิภาพของการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกัน อาจเป็นกรณีที่ภูมิคุ้มกันภายในเซลล์ยังมีบทบาทในเนื้องอกภูมิคุ้มกันเย็นเหล่านี้ ซึ่งจะตอบสนองต่อ ICD มากขึ้นหลังจากการยับยั้งไลโซโซม ผลที่คล้ายกับวัคซีนของการยับยั้งไลโซโซมที่สังเกตได้ในสภาพแวดล้อมของห้องปฏิบัติการที่มีการควบคุมอาจแปลหรือไม่แปลในคลินิกก็ได้ แต่สามารถอธิบายได้ว่าทำไมผู้ป่วยบางรายที่รักษาด้วย dabrafenib, trametinib และ HCQ ในมะเร็งผิวหนังชนิดกลายพันธุ์ BRAF ที่ได้รับการรักษาก่อนหน้านี้จึงมีความลึกและคงทน ตอบสนองต่อระบบการปกครองนี้ (32) จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อทำความเข้าใจว่าการยับยั้ง PPT1 ก่อให้เกิด ROS ของไลโซโซมและการเกิดออกซิเดชันของไขมันได้อย่างไร การควบคุมที่ขึ้นอยู่กับ PPT1- ของ V-ATPase และการทำให้เป็นกรดของไลโซโซมนั้นไม่ใช่คำอธิบายที่เพียงพอ เนื่องจากบาฟิโลมัยซินยับยั้งการเกิดกรดของไลโซโซมแต่ไม่ได้สร้าง LMP (ไม่ได้แสดงข้อมูล) ความหมายของการค้นพบเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าสารยับยั้งไลโซโซมที่เสริมภูมิคุ้มกันของเซลล์เนื้องอก–ภายในสามารถผสมผสานอย่างมีเหตุผลกับการรักษาที่ส่งเสริมการกระตุ้นการทำงานของทีเซลล์ หรือการแทรกซึมเข้าไปในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก ซึ่งอาจส่งผลให้เกิดผลเสริมฤทธิ์กัน
รูปที่ 5 N-acetyl cysteine ป้องกันการตายของเซลล์ที่เหนี่ยวนำให้เกิด DC661- (ก)
วิธีการ
การเพาะเลี้ยงเซลล์ A375P ของมนุษย์ (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), เส้นเซลล์ A549 (CRM-CCL-185) และเมาส์ B16F10 (CRL-6475) ถูกซื้อจาก ATCC กลุ่ม A375 ของมนุษย์ (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 และเมาส์ YUMM1.7 (WT, Gsdme EV และ Gsdme KO1 และ KO2) ได้รับภายในบริษัท เซลล์ Mouse MC38 และ CT26 จัดทำโดย Andy Minn มหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย FL5.12 และ IL -3 – ขึ้นอยู่กับ Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) เซลล์ไขกระดูกปฐมภูมิได้มาจาก Kathryn E. Wellen, มหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย เส้นเซลล์ Panc-1 ของมนุษย์ (CRL-1469, ATCC) จัดทำโดย Ben Z. Stanger มหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย เซลล์เมาส์ YUMMER 1.7 ได้มาจาก Xiaowei (George) Xu, มหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย เส้นเซลล์ทั้งหมดได้รับการทดสอบสำหรับไมโคพลาสมาปีละสองครั้งโดยศูนย์ของ University of Pennsylvania Core และรับรองความถูกต้องโดยใช้ลายนิ้วมือซ้ำแบบสั้นควบคู่โดย Wistar Institute Genomics core เพาะเลี้ยงเซลล์ A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 และ Bax/ Bak DKO ใน RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); เพาะเลี้ยงเซลล์ A375, MIA PaCa -2, Panc -1, B16F10 และ MC38 ใน DMEM (Invitrogen, 11995); และเซลล์ YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV และ Gsdme KO1 และ KO2) (15) ได้รับการเพาะเลี้ยงใน DMEM/F 12 50/50 (Corning, 10-092- CV) อาหารเลี้ยงเชื้อเสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ 10% (12306C, มิลลิพอร์ซิกมา) และสารละลายต้านเชื้อรายาปฏิชีวนะ 1 × (Gibco, 15140-122) สายเซลล์ FL5.12 และ Bax/Bak DKO ถูกคงรักษาไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI ที่สมบูรณ์ซึ่งเสริมด้วย 50 ไมโครโมลาร์ -เมอร์แคปโตเอทานอล (เทคโนโลยีชีวิต, 21985-023), 10 มิลลิโมลาร์ HEPES (H3537, มิลลิพอร์ซิกมา) และ 0.35 นาโนกรัม/มิลลิลิตรและ 3.5 นาโนกรัม /มล. IL-3 ตามลำดับ เส้นเซลล์ YUMMER1.7 และ YUMM1.7 (WT, Gsdme EV และ Gsdme KO) ได้รับการดูแลในสื่อสมบูรณ์ที่เสริมด้วย 1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050) เซลล์ WM35 และ WM793 ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลาง MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403) ซึ่งมี 10% FBS ในอาหารเลี้ยงเชื้อ 1× Leibovitz L{-15 (Corning, 10-045-CV), 7.5% โดยน้ำหนัก/v โซเดียม ไบคาร์บอเนต ( Corning, 25-035-CI), สารละลายต้านเชื้อราของยาปฏิชีวนะ 1 เท่า (Gibco, 15140-122) และอินซูลิน 5 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร (MilliporeSigma, I0516) เซลล์ถูกทำให้เติบโตที่ 37 องศา โดยมี CO2 5% สารเคมีและรีเอเจนต์ สารเคมีที่ซื้อได้แก่ HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) และ DC661 (Selleckchem, S8808) Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) ถูกนำมาใช้ในการย้อมเซลล์เพื่อหาแคลเซียมตามคำแนะนำของผู้ผลิต รายชื่อแอนติบอดีและสารยับยั้งมีอยู่ในตารางเสริม 1 และตารางเสริม 2
รูปที่ 6 NAC กลับรายการ LLP ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับ MFSD12- (เอ–ซี)
การสกัดโปรตีนและการย่อยสำหรับการวิเคราะห์โครมาโตกราฟีของเหลว–มวลสเปกโตรเมทรีแบบตีคู่สำหรับโปรตีโอมิกส์ {{0}}.7 × 10เซลล์มะเร็งผิวหนัง A375P 6 เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยงขนาด 60 มม. เซลล์ถูกบำบัดด้วย DMSO (กลุ่มควบคุม), DC661 (3 ไมโครโมลาร์), HCQ (10 ไมโครโมลาร์) หรือ HCQ (3{{70}} ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ประมาณ 5{{ 112}}% มาบรรจบกัน เม็ดเซลล์แช่แข็งถูกสลายด้วย 50 มิลลิโมลาร์ ทริส pH 7.4, 1% SDS, 150 มิลลิโมลาร์ NaCl, 1 มิลลิโมลาร์ EDTA, 0.15 มิลลิโมลาร์ PMSF, 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร เปปสแตติน และลิวเพปติน 1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร ไลซีนที่ทำให้กระจ่าง (ตัวละ 1 0 ไมโครกรัม) ถูกอิเล็กโตรโฟเรส 0.5 ซม. ลงในบิส-ทริสเจล ตามด้วยการตรึงและย้อมด้วยคอลลอยด์คูแมสซี เลนเจลแต่ละเลนขนาด 0.5 ซม. ถูกตัดออก กำจัดออก รีดิวซ์ด้วยทริส (2-คาร์บอกซีเอทิล) ฟอสฟีน ทำให้อัลคิลเลตด้วยไอโอโดอะซีทาไมด์ และย่อยด้วยทริปซินตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (36) การแยกย่อย (1 ไมโครกรัม) ถูกวิเคราะห์โดยโครมาโตกราฟีของเหลว–แมสสเปกโตรเมทรีแบบเรียงกัน (LC-MS/MS) บนแมสสเปกโตรมิเตอร์ Q-Exactive Plus (เทอร์โม ฟิชเชอร์ ไซแอนติฟิค) ซึ่งสอดคล้องกับ nanoAQUITY UPLC (น้ำ) การแยกเชิงวิเคราะห์ดำเนินการในคอลัมน์ Peptide BEH C18 ขนาด 1.7 μm × 250 มม. (น้ำ, 186003546) โดยใช้การไล่ระดับ 245- นาทีด้วยกรดฟอร์มิก 0.1% ในน้ำ (เฟสเคลื่อนที่ A) และอะซิโตไนไตรล์ (เฟสเคลื่อนที่ B) ดังต่อไปนี้ : 5%–30% B ตลอด 225 นาที, 30%–80% B ตลอด 5 นาที, 15- นาทีค้างไว้ที่ 80% B และกลับสู่สภาวะเริ่มต้น ได้สเปกตรัม MS เต็มรูปแบบที่ความละเอียด 70,000 โดยมีช่วงการสแกน 400–2,000 m/z เป้าหมายการควบคุมเกนอัตโนมัติที่ 3 × 106 ไอออน และเวลาในการฉีดสูงสุดที่ 50 มิลลิวินาที ได้รับสเปกตรัม MS2 ที่ขึ้นอยู่กับข้อมูลสำหรับไอออนที่มีมากที่สุด 20 อันดับแรกที่ความละเอียด 17,500 โดยมีความกว้างการแยก 1.5 m/z เป้าหมายการควบคุมอัตราขยายอัตโนมัติ 5 × 104 ไอออน และเวลาในการฉีดสูงสุด 50 มิลลิวินาที การจับคู่เปปไทด์ถูกตั้งค่าเป็นที่ต้องการ และไอออนที่ไม่ได้กำหนดและมีประจุเดี่ยวถูกปฏิเสธ (37) ข้อมูล MS แบบดิบได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) พร้อมด้วยฐานข้อมูลลำดับมนุษย์ของ Uniprot (เข้าถึงเมื่อวันที่ 10 ตุลาคม 2019) และฐานข้อมูลสารปนเปื้อนทั่วไป รวมถึงทริปซิน เคราติน โปรตีนจากวัว และไมโคพลาสมา (38) ความจำเพาะของเปปไทด์ทริปติกโดยมีความแตกแยกที่พลาดไปสูงสุด 2 ครั้ง การดัดแปลงคงที่ของซิสเทอีน (คาร์บามิโดเมทิลเลชั่น) และการออกซิเดชันของเมไทโอนีนแบบแปรผันหรืออะซิติเลชั่นที่ปลาย N ถูกนำมาใช้ในการค้นหา (39) การตัดออก 1% FDR ถูกใช้สำหรับเปปไทด์และโปรตีน เปิดใช้งานการจับคู่ระหว่างการวิ่ง โปรตีนถูกหาปริมาณโดยใช้ปริมาณที่ไม่มีฉลาก (40) การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการโดยใช้ Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42) โปรตีนจำเป็นต้องได้รับการระบุด้วยเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกันอย่างน้อย 3 ตัวและมีค่าที่ถูกต้อง 3 ค่า (ปริมาณที่ไม่เป็นศูนย์) ภายในกลุ่มตัวอย่าง และสิ่งปนเปื้อนและโปรตีนย้อนกลับถูกกรองจากชุดข้อมูล ค่าที่หายไปถูกใส่เข้ามาจากการแจกแจงแบบปกติ การเปรียบเทียบแบบคู่กันระหว่างสภาวะถูกดำเนินการที่ระดับโปรตีนโดยใช้การทดสอบแบบ 2- แบบเทลด์ของนักเรียนด้วย FDR ที่มีการเรียงสับเปลี่ยนด้วยการสุ่ม s0=0.1 และ 250 ครั้ง การเปลี่ยนแปลงที่สำคัญถูกกำหนดเป็น FDR น้อยกว่า 5% และการเปลี่ยนแปลงแบบพับสัมบูรณ์มากกว่า 1.5 หรือ 2.0 ตามที่ระบุ ไลโซ-ไอพี เซลล์ A375P ติดไวรัส pLJC5-Tmem192-3xHA lentivirus และเลือกใช้พูโรมัยซิน 1 มก./มล. (MilliporeSigma, P4512) เซลล์ A375P ที่ติดแท็ก HA ประมาณ 3 × 106 ได้รับการบำบัดด้วย NAC 10 mM หรือการควบคุมยานพาหนะทางน้ำเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในสภาวะการเพาะเลี้ยงที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ หลังการบำบัด เซลล์ถูกล้างใน PBS, เก็บเกี่ยวใน KPBS เย็น 0.5 มล. และถูกทำให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างอ่อนโยนโดยใช้ 20 สโตรกในดูนซ์โฮโมจีไนเซอร์ 2 มล. ประมาณ 2.5% ของโฮโมจีเนทถูกสงวนไว้สำหรับการวิเคราะห์ไลเซตทั้งเซลล์ และส่วนที่เหลือถูกปั่นแยกที่ 3,000กรัม เป็นเวลา 2 นาทีที่ 4 องศา เพื่อเอาเศษเยื่อหุ้มเซลล์ออก จากนั้นส่วนลอยเหนือตะกอนที่เป็นโฮโมจีเนตถูกถ่ายโอนไปยังหลอดขนาด 1.5 มิลลิลิตรที่สะอาดและบ่มด้วยเม็ดบีดต้าน HA 50 ไมโครลิตร (เพียร์ซ, 88836) หรือเม็ดบีดต้าน DDK/แฟล็ก (OriGene, TA150042) เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 องศา จากนั้นตัวอย่างจะถูกตกตะกอนโดยการวางหลอดบน DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) และเขย่าเบาๆ เป็นเวลา 2 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ส่วนลอยเหนือตะกอนถูกสงวนไว้สำหรับการวิเคราะห์เศษส่วนที่ไม่ถูกผูกไว้ IP ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย KPBS ที่มี CaCl2 8 มิลลิโมลาร์ Lyso-IP ถูกสกัดใน 80% MeOH สำหรับการวิเคราะห์เมแทบอลิก การสกัดและการวิเคราะห์ไขมันโดยใช้ LC-MS/MS สำหรับไขมันทั่วโลก เซลล์ Melanoma A375P ถูกเพาะในจานขนาด 60 มม. ที่ 0.7 × 106 เซลล์ต่อจาน เมื่อเซลล์อยู่ที่จุดบรรจบกันประมาณ 50% พวกมันถูกบำบัดด้วย DMSO (กลุ่มควบคุม), DC661 (3 ไมโครโมลาร์) หรือ HCQ (30 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ล้างเซลล์ 2 ครั้งด้วย HBSS, ขูดเป็นเมทานอลเย็นน้ำแข็ง และถ่ายโอนไปยังหลอดแก้วเพื่อการสกัดไขมันด้วยคลอโรฟอร์ม/เมทานอล/0.88% NaCl (2:1:1) ที่มีมาตรฐานไขมันภายใน EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids) ตัวอย่างถูกหมุนวน จากนั้นอ่างน้ำก็ถูกคลื่นเสียงเป็นเวลา 5 นาทีบนน้ำแข็ง หลังจากการปั่นแยกที่ 500 กรัม เป็นเวลา 15 นาที ที่ 40 องศา เฟสล่างถูกถ่ายโอนไปยังหลอดแก้วอีกหลอด เฟสบนถูกสกัดซ้ำโดยใช้เฟสล่างสังเคราะห์ หลังจาก sonication และการหมุนเหวี่ยง เฟสล่างถูกรวมเข้ากับคอลเลกชันเฟสล่างครั้งแรก ตัวอย่างถูกทำให้แห้งภายใต้ไนโตรเจน และแขวนลอยใหม่ในคลอโรฟอร์ม 10%/เมทานอล 90% และถ่ายโอนไปยังขวดแก้ว LTQ ตัวอย่างไขมันได้รับการวิเคราะห์บนเครื่องสเปกโตรมิเตอร์ Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X และระบบ Vanquish Horizon UHPLC การแยกเชิงวิเคราะห์ใช้คอลัมน์ Accucore C30 (2.1 มม. × 150 มม., Thermo Fisher Scientific) ที่มีอะซิโตไนไตรล์ 50:50/น้ำ และไอโซโพรพานอล/อะซิโตไนไตรล์/น้ำ 88:10:2 โดยแต่ละคอลัมน์ประกอบด้วยแอมโมเนียมฟอร์เมต 5 มิลลิโมลาร์และกรดฟอร์มิก 0.1% ข้อมูล LC-MS/MS ได้รับมาแยกกันในขั้วบวกและขั้วลบด้วยพารามิเตอร์เครื่องมือต่อไปนี้: MS1 สแกน 120,000 ความละเอียด; MS2 ที่ขึ้นกับข้อมูลบนไอออนที่มีมากที่สุด 20 อันดับแรกที่ความละเอียด 15,000; ความกว้างการแยก 0.4 m/z; และพลังงานการชนแบบขั้นมาตรฐานที่ 20:30:40 (43)
รูปที่ 7 N-acetyl cysteine ป้องกันการแสดงออกของพื้นผิวแคลเรติคูลินที่เหนี่ยวนำให้เกิด DC661- (ก-ง)
ไขมันถูกระบุและหาปริมาณโดยใช้ LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific) สปีชีส์ของไขมันที่ระบุถูกกรองโดยแอดดักท์ที่คาดหวังและระดับการจำแนกตามประเภท พื้นที่พีคถูกทำให้เป็นมาตรฐานตามมาตรฐาน EquiSPLASH สำหรับคลาสที่รองรับและปรับให้เป็นมาตรฐานเพิ่มเติมตามพื้นที่ทั้งหมดสำหรับแต่ละตัวอย่างเพื่อแก้ไขความแปรผันของจำนวนเซลล์ การวิเคราะห์ทางสถิติดำเนินการกับข้อมูลที่แปลงรูปแบบบันทึกโดยใช้ Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42) การสกัดและการวิเคราะห์เมตาโบไลท์โดยใช้ LC-MS/MS สำหรับเมตาบาโลน สารโพลาร์ถูกสกัดจากเซลล์ทั้งหมด, เศษส่วนที่ไม่ถูกผูกไว้ของ Lyso-IP และตัวอย่างที่ถูกผูกไว้ของ Lyso-IP โดยใช้เมทานอล 80% และถูกเก็บไว้ที่ –8{{30}} องศาก่อนโครมาโตกราฟีของเหลว –การวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรี (LC-MS) สารสกัดได้รับการวิเคราะห์โดย LC-MS โดยใช้แมสสเปกโตรมิเตอร์ Thermo Scientific Q-Exactive HF-X พร้อมด้วยโพรบ HESI II ซึ่งสอดคล้องกับระบบ Thermo Vanquish Horizon UHPLC การแยก LC ดำเนินการโดยใช้คอลัมน์ ZIC-HILIC (2.1 มม. × 150 มม., ขนาดอนุภาค 5 μm, มิลลิพอร์ EMD) โดยมีคอลัมน์ป้องกัน ZIC-HILIC (2.1 มม. × 20 มม., EMD มิลลิพอร์) จัดขึ้นที่ 45 องศาด้วยอัตราการไหล 0.2 มล./นาที โครมาโตกราฟีดำเนินการภายใต้สภาวะที่เป็นกรดเพื่อลดปฏิกิริยาของหมู่ไทออล เฟสเคลื่อนที่ A คือน้ำและ B คืออะซีโตไนไตรล์ ทั้งคู่มีกรดฟอร์มิก 0.1% เกรเดียนต์ LC คือ 85% B เป็นเวลา 2 นาที, 85% B ถึง 20% B ตลอด 15 นาที, 20% B ถึง 85% B ตลอด 0.1 นาที และ 85% B เป็นเวลา 8.9 นาที เครื่องเก็บตัวอย่างอัตโนมัติถูกจัดขึ้นที่ 4 องศา และฉีด 4 ไมโครลิตรของแต่ละตัวอย่างต่อการวิเคราะห์ มีการใช้พารามิเตอร์ MS ต่อไปนี้: อัตราการไหลของก๊าซปลอก 40 AU; อัตราการไหลของก๊าซเสริม 10 AU; อัตราการไหลของก๊าซกวาด 2 AU; อุณหภูมิเครื่องทำความร้อนแก๊สเสริม 350 องศา ; แรงดันสเปรย์, 3.75 kV สำหรับโหมดบวก และ 3.5 kV สำหรับโหมดลบ; อุณหภูมิของเส้นเลือดฝอย 375 องศา ; และระดับ RF ของช่องทาง 40% ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดย MS เต็มรูปแบบพร้อมการสลับขั้ว การสแกน MS แบบเต็มได้มาจาก 65 ถึง 975 m/z ที่ความละเอียด 120,000 โดยมีเป้าหมายการควบคุมเกนอัตโนมัติที่ 1 × 106 ไอออน และเวลาในการฉีดสูงสุด 100 มิลลิวินาที ข้อมูลดิบถูกวิเคราะห์โดยใช้ TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific) สารเมตาบอไลต์เป้าหมายถูกระบุด้วยมวลที่แม่นยำและเวลากักเก็บในขั้วที่ต้องการตามมาตรฐานการวิเคราะห์ การตรวจจับพีคใช้อัลกอริธึม ICIS ที่มีค่าปรับให้เรียบที่ 1 การหาปริมาณสัมพัทธ์ดำเนินการโดยใช้พื้นที่พีคแบบรวม และค่าเหล่านี้ได้รับการแก้ไขให้เป็นจำนวนทั้งหมดต่อตัวอย่าง (กำหนดเป็นพื้นที่พีคทั้งหมด) การแก้ไข PPT1-CRISPR/Cas9 A375P PPT1-เซลล์ที่ไม่ใช่เป้าหมายและ KO ได้รับการจัดเตรียมตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (44) pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) เป็นของขวัญจาก Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139) Guide RNA oligos (IDT) ได้รับการอบอ่อน, ฟอสโฟรีเลชั่นแล้วรวมเข้ากับ BbsI ที่ย่อยและพลาสมิด pX459 dephosphorylated ตามโปรโตคอลห้องปฏิบัติการของ Zhang ซึ่งมีให้ผ่าน Addgene พลาสมิดที่ถูกผูกมัดถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์ Stbl3 (Invitrogen) การจัดลำดับของการเตรียมพลาสมิดยืนยันการมีอยู่ของลำดับ RNA นำทางที่ต้องการ เซลล์ A375P ได้รับการทรานส์เฟกโดยใช้ไลโปเฟกตามีน 3000 (Invitrogen, L3000015) ตามด้วยการเลือกพิวโรมัยซิน การตรวจรังวัดยืนยันการแก้ไขยีน PPT1 โดย CRISPR/Cas9 และการล้มลงของ PPT1 ได้รับการยืนยันโดยการซับแบบตะวันตกด้วยแอนติบอดี PPT1 (Origene) ลำดับสำหรับไกด์ RNA โอลิโกสมีดังต่อไปนี้: ตัวนำ RNA ที่ไม่ใช่เป้าหมายไปข้างหน้า (CACCGTAGCGAACGTGTCCGCGGT), ตัวนำ RNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย RNA แบบย้อนกลับ (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ตัวนำ PPT1 ของมนุษย์ RNA 1 ไปข้างหน้า (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), ตัวนำ PPT1 ของมนุษย์ RNA 1 ย้อนกลับ (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), ตัวนำ PPT1 ของมนุษย์ RNA 3 ไปข้างหน้า (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) และ PPT1 ของมนุษย์นำทาง RNA 3 แบบย้อนกลับ (AAACGTATTCGGGCTTGCACGAGGC) โคลนที่เติบโตจากเซลล์เดี่ยวที่ใช้ในบทความนี้มีดังต่อไปนี้: โคลน C8 คือตัวนำทางของมนุษย์ 1 และโคลน B5 คือตัวนำทางของมนุษย์ 3 การอิมมูโนล็อตติง เซลล์หนึ่งล้านเซลล์ถูกชุบในจานขนาด 10 ซม. และให้การรักษาในวันถัดไป เซลล์ถูกรวบรวมโดยการขูด ไลซีนทั้งเซลล์ถูกเตรียมโดยใช้บัฟเฟอร์ไลซิส SDS ความเข้มข้นของโปรตีนถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบโปรตีน Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, 23225) ใช้โปรตีน 30–50 ไมโครกรัมสำหรับ SDS-PAGE และถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF (Bio-Rad, 1620177) เมมเบรนถูกปิดกั้นโดยใช้ 5% BSA หรือนมพร่องมันเนย 5% ตามเงื่อนไขที่เหมาะสมที่สุด และบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิข้ามคืนที่ 4 องศา ล้างเมมเบรน PVDF ด้วย 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องด้วยแอนติบอดีรองที่ผันด้วย HRP เฉพาะสปีชีส์ ต่อมาเมมเบรนถูกล้างและพัฒนาโดยใช้สารตั้งต้นของ Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) และฟิล์มถ่ายภาพอัตโนมัติ (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318) สำหรับการศึกษาไพโรโทซิส โปรตีนไลเซตถูกแยกโดย SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเมมเบรน PVDF หลังจากการปิดกั้นใน 5% BSA, เมมเบรน PVDF จะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่ระบุไว้ข้ามคืนที่ 4 องศา, ล้างใน PBS/Tween และบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ควบคู่กับเปอร์ออกซิเดส ตรวจพบฤทธิ์ทางภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีรองที่ควบด้วย HRP (CalBioTech), สารตั้งต้นเคมีเรืองแสง (Thermo Fisher Scientific) และระบบสร้างภาพ ChemicDoc MP (Bio-Rad) สำหรับการทดลองที่เกี่ยวข้องกับส่วนลอยเหนือตะกอน เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงในตัวกลางที่ปราศจาก FBS เพื่อหลีกเลี่ยงการบิดเบือนของ SDS-PAGE ส่วนลอยเหนือเซลล์ถูกเก็บเกี่ยวและปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 10 นาทีที่ 500 กรัมที่ 4 องศาเพื่อกำจัดเศษเซลล์ออก ส่วนลอยเหนือตะกอนที่เป็นผลลัพธ์ถูกทำให้เข้มข้น 10 เท่าโดยใช้ Amicon Ultra 10K (มิลลิพอร์ซิกมา) โดยการปั่นแยกเป็นเวลา 30 นาทีที่ 4,500 กรัม ที่ 4 องศา สารเข้มข้นถูกผสมกับบัฟเฟอร์ตัวอย่างและวิเคราะห์ผ่านการซับแบบตะวันตกตามที่อธิบายไว้ข้างต้น การย้อมสีโปรตีนเจลทำได้โดยใช้การย้อมสีแดง Ponceau การทดสอบกิจกรรม LMP และ cathepsin L พลาสมิด pEGFP-hGal3 ของมนุษย์เป็นของขวัญจากทาโมทสึ โยชิโมริ (Addgene plasmid, 73080) และถูกใช้เพื่อสร้างกลุ่มผลิตภัณฑ์ A375P-Galectin-3 ซื้อพลาสมิดเวกเตอร์แบ็คโบนควบคุม pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024) พลาสมิดถูกแปลงสภาพ (1 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) เข้าไปในเซลล์ A375P โดยใช้ Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) ตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิต เซลล์ที่ถูกทรานส์เฟกถูกเลือกอย่างเสถียรโดยใช้ G418 (Gibco, 10131035) สำหรับ LMP มีการนับเซลล์ puncta–positive A375P-galectin-3 ทั้งหมด 25 เซลล์ในช่องรูปภาพหลายช่อง เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่มีเครื่องหมายบวก puncta ถูกคำนวณในแต่ละฟิลด์แยกกัน และเปอร์เซ็นต์เฉลี่ยถูกคำนวณสำหรับแต่ละกลุ่ม ชุดทดสอบ Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) ถูกนำมาใช้ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต เซลล์ถูกถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Zeiss Axio Observer 7 ความเข้มรวมแบบดิบของ Magic Red คำนวณโดยใช้ซอฟต์แวร์ฟิจิ - ImageJ (NIH) การทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ MTT (3-[4, 5-ไดเมทิลไทอาซอล-2-อิล]-2, 5 ไดฟีนิล เตตราโซเลียม โบรไมด์) เซลล์ 2,000 เซลล์ถูกชุบเป็นสามชั้นในแต่ละหลุมของเพลตหลุม 96- และการทดสอบ MTT 3- วันดำเนินการโดยใช้ชุดความอยู่รอดของเซลล์ (Roche, 11465007001) ตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิต การบำบัดล่วงหน้าของสารยับยั้งถูกให้เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตามด้วยการบำบัดร่วมของเซลล์ด้วยสารยับยั้งที่มีหรือไม่มี DC661 ใช้วิธีถดถอยแบบไม่เชิงเส้น (พอดีเส้นโค้ง) ในการคำนวณ IC50
cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน
คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity
【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
การทดสอบการก่อตัวของโคโลนี เซลล์ 2,000 เซลล์ต่อหลุมถูกเพาะลงในจานหลุม 6- และถูกบำบัดในวันถัดไป เซลล์ถูกเก็บไว้ภายใต้การบำบัดเป็นเวลาทั้งหมด 8 วัน โคโลนีที่เกิดขึ้นในแต่ละหลุมถูกล้างด้วย PBS ตรึงด้วยเมทานอลเย็นที่ –20 องศาเป็นเวลา 20 นาที และย้อมด้วยสารละลายในน้ำคริสตัลไวโอเล็ต 0.5% (V5265; มิลลิพอร์ซิกมา)
การสอบวิเคราะห์การแยกสีย้อมสีน้ำเงินทริแพน ของผสมปฏิกิริยาสำหรับการทดสอบทริแพนบลูถูกเตรียมโดยการผสม 1 ส่วนของ 0.4% ทริแพนบลู (25- 900-CI, Corning) และ 1 ส่วนของตัวอย่างเซลล์เจือจาง ของผสมถูกบ่มเป็นเวลา 1 นาที และเซลล์ถูกนับบนเซลโลมิเตอร์วิชัน (Nexcelom, วิชัน-310-0208)
รูปที่ 8 การแสดงออกของพื้นผิวแคลเรติคูลินที่เหนี่ยวนำด้วย DC661-ทำให้ไพรม์ทีเซลล์ต่อต้านเซลล์เนื้องอก (ก)
รูปที่ 9 การฉีดวัคซีน DC661- เซลล์ที่บำบัดทำให้เกิดการปฏิเสธเนื้องอกในบริบทเฉพาะ (ก)
โฟม-LPO ศึกษา LLP โดยใช้โพรบฟลูออเรสเซนต์ FOAMLPO FOAM-LPO ถูกสังเคราะห์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (26) เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงบน 8 หลุม μSlide (ibid, 80807) และบำบัดด้วยสารยับยั้งและมีหรือไม่มี DC661 เซลล์ถูกบ่มด้วยตัวกลางที่มี FOAM-LPO (1 โมลาร์) ในบรรยากาศของ 5% CO2 และอากาศ 95% เป็นเวลา 5 นาทีที่ 37 องศา เซลล์ถูกล้างสองครั้งด้วยตัวกลาง จากนั้นสังเกตเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ (กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Zeiss Axio Observer 7) เพื่อตรวจจับการเรืองแสงที่เปลี่ยนจาก 586 เป็น 512 นาโนเมตรเพื่อตอบสนองต่อ LLP qRT-PCR และไพรเมอร์ เพาะเลี้ยงเซลล์ A375P (3 × 105 ) ในจานขนาด 60 มม. และบำบัดด้วย DMSO หรือ DC661 (3 μM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง RNA ทั้งหมดถูกแยกด้วยชุดแยก RNA (QIAGEN, 74134) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต cDNA ถูกสังเคราะห์โดยใช้ชุด iScript Reverse Transcriptase ที่มี RNA บริสุทธิ์ 500 ng ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Thermo Scientific, K1642) ปฏิกิริยา qPCR ถูกตั้งค่าโดยใช้ SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) ที่มี cDNA 1 ไมโครลิตร การวัดทั้งหมดดำเนินการเป็นสามเท่า และ BACTIN ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายในสำหรับการคำนวณ ΔCT การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเสร็จสิ้นโดยใช้ไพรเมอร์ต่อไปนี้: PTGS2/COX-2 ไปข้างหน้า (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 ย้อนกลับ (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS ไปข้างหน้า (CTGGACTACTCCAGCAACACA), CARS ย้อนกลับ (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 ไปข้างหน้า (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), การย้อนกลับของ CHAC1 (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), แบคตินไปข้างหน้า (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) และแบคตินแบบย้อนกลับ (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC)
การเปลี่ยนถ่าย siRNA การศึกษาการล้มลงทางพันธุกรรมสำหรับมนุษย์ ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 และ MFSD12 ดำเนินการในเซลล์ A375P ทำการศึกษาการยับยั้งทางพันธุกรรมของเมาส์ Ppt1 และ Calreticulin ในเซลล์ MC38 siRNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย (sc{{10}}), ULK1 ของมนุษย์ (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), หนูเมาส์ Ppt1/Cln1 (sc-142398) และคาลเรติคูลิน /Calregulin (sc-29895) siRNA ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพซานตาครูซ siRNA เหล่านี้ประกอบด้วยกลุ่มของ siRNA เฉพาะเป้าหมาย 3-5 รายการ โฟลว์ไซโตเมทรี การเหนี่ยวนำเฟอร์รอปโตซิสถูกวัดโดยใช้ C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861) เซลล์ A375P ถูกเพาะใน 6-เพลตหลุมและบำบัดด้วย DMSO, เฟอร์โรสแตติน{{40}} (10 ไมโครโมลาร์), ลิปร็อกสแตติน-1 (2 ไมโครโมลาร์), อีลาสติน (5 ไมโครโมลาร์) ), DC661 (3 ไมโครโมลาร์) หรือรวมกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เก็บเกี่ยวเซลล์โดยการปั่นเหวี่ยงที่ 300 กรัมเป็นเวลา 5 นาที เซลล์ถูกแขวนลอยใหม่ใน 500 ไมโครลิตร 1X HBSS (คอร์นิง, 21-023-CV) ที่มี 1 ไมโครโมลาร์ C11-BODIPY และบ่มที่ 37 องศา เป็นเวลา 15 นาที เซลล์ถูกอัดเป็นก้อนและแขวนลอยใหม่ใน 500 ไมโครลิตร 1X HBSS และความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ถูกวัดบนไซโตมิเตอร์ BD LSRII โดยใช้ 530/30 สีน้ำเงิน (สิ่งอำนวยความสะดวกหลักการไหลของมหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย) ปริมาณของการแสดงออกบนพื้นผิวเซลล์ของแคลเรติคูลินสำหรับการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (45) โดยโฟลไซโตเมทรี เพาะเลี้ยงเซลล์ B16F10 หรือ MC38 และบำบัดด้วย NAC (10 มิลลิโมลาร์) หรือ DC661 (3 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ MC38 ได้รับการบำบัดด้วย siPpt1 หรือ siNT เป็นเวลา 48 ชั่วโมงโดยมีหรือไม่มี NAC 10 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ถูกย้อมด้วยแอนติบอดี CALR (เทคโนโลยีการส่งสัญญาณเซลล์, 12238), แอนติบอดีตัวที่สองต่อต้านกระต่ายของแพะ Alexa Fluor 647 (Invitrogen) และโพรพิเดียม ไอโอไดด์ (PI) (Biolegend, 421301) ตัวอย่างที่ย้อมสีได้มาบนโฟลว์ไซโตมิเตอร์ BD LSRII โดยใช้ 710/50 สีน้ำเงินและ 670/30 สีแดงเพื่อจับ PI และ CALR เรืองแสงตามลำดับ (สิ่งอำนวยความสะดวกของ Flow Core ของมหาวิทยาลัยเพนซิลเวเนีย) และการวิเคราะห์ถูกจำกัดไว้เฉพาะเซลล์ที่เป็นบวก CALR และเซลล์ที่ลบของ PI เพื่อหลีกเลี่ยงเหตุการณ์ผลบวกลวง การเตรียมทีเซลล์และเปอร์เซ็นต์ความเป็นพิษต่อเซลล์ เพาะเลี้ยงเซลล์เนื้องอก B16 หรือ MC38 (5 × 104) และบำบัดด้วย NAC (10 mM) หรือ DC661 (1 μM หรือ 3 μM) ตามลำดับเป็นเวลา 24 ชั่วโมง สำหรับการยับยั้งทางพันธุกรรมของ Calr เซลล์ MC38 ได้รับการบำบัดด้วย Calr siRNA หรือ siRNA ที่ไม่ใช่เป้าหมาย (siNT) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ตามด้วยการบำบัดด้วย DMSO หรือ 3 μM DC661 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเพาะเลี้ยงเซลล์ม้ามด้วย DC661 โดยมีหรือไม่มีเซลล์ B16 หรือ MC38 ต่อหน้า IL{102}} (5 IU/mL) และเพาะเลี้ยงร่วมกันเป็นเวลา 72 ชั่วโมง ไพรมิงได้รับการยืนยันโดย IFN- ELISA (Biolegend, 430815) ของส่วนลอยเหนือตะกอน จากนั้นเซลล์ม้ามที่เตรียมไว้จะถูกเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ B16 หรือ MC38 เพาะเลี้ยงสดที่มีอัตราส่วนเป้าหมายต่อเอฟเฟคเตอร์ (B16 หรือ MC38 ต่อเซลล์ม้าม) ที่ 1:20 และ 1:50 สำหรับเซลล์ B16 และ MC38 ตามลำดับ การปล่อย LDH ที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ B16 หรือ MC38 จากนั้นวัดเปอร์เซ็นต์ความเป็นพิษต่อเซลล์ตามเกณฑ์วิธีของผู้ผลิต (MilliporeSigma, 4744926001) (31) การตรวจฉีดวัคซีนต้านเนื้องอกและการศึกษาเคมีบำบัดด้วยแบบจำลองมะเร็งที่เป็นที่ยอมรับ หนู WT C57BL/6 ตัวเมียอายุหกถึงแปดสัปดาห์, หนู NOD/SCID และหนู BALB/c ได้มาจากห้องปฏิบัติการแจ็คสัน สำหรับการทดลองการฉีดวัคซีนต้านเนื้องอก เซลล์ WT B16F10, MC38 และ CT26 ได้รับการบำบัดด้วย DC661 (3 ไมโครโมลาร์) เป็นเวลา 36 ชั่วโมงในขวดขนาด 175 ซม. 2 จากนั้น ส่วนลอยเหนือตะกอนและเซลล์ที่แยกออกถูกรวบรวมในหลอดเหยี่ยวขนาด 50 มล. เซลล์ถูกปั่นแยกและล้างด้วย PBS เย็นน้ำแข็ง สำหรับการฉีดวัคซีนนั้น การฉีดสารแขวนลอยเซลล์ 150 μLถูกฉีด sc ที่ปีกซ้ายของหนู C57BL / 6 ที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง, หนู NOD / SCID ที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง (เซลล์ 1.8 × 104 B16F10, 1.5 × 106 เซลล์ MC38 ต่อเมาส์) หรือหนู BALB / c แบบซินจีนิก (3.0 × 106 CT26 เซลล์ต่อเมาส์) เซลล์ที่ละลายเยือกแข็งที่แขวนลอยใหม่ใน PBS ถูกฉีดในฐานะกลุ่มควบคุมเชิงลบ หนึ่งสัปดาห์ต่อมา เซลล์มะเร็งที่มีชีวิตประเภทเดียวกัน (เซลล์ 3 × 104 B16F10, เซลล์ 2 × 105 MC38 หรือ 5 × 105 เซลล์ CT26 ต่อเมาส์) โดยมี Matrigel (Corning, 354248) ในปริมาณเท่ากัน ถูกฉีดที่ปีกขวา ของหนูที่ได้รับวัคซีน วัดเนื้องอกโดยใช้คาลิปเปอร์แบบอิเล็กทรอนิกส์ และคำนวณปริมาตรเป็น L × W2 × 0.5 มีการติดตามการเจริญเติบโตของเนื้องอกอย่างสม่ำเสมอในวันต่อมา และการไม่มีเนื้องอกถือเป็นข้อบ่งชี้ของการฉีดวัคซีนต้านเนื้องอกที่มีประสิทธิภาพ มีการศึกษาการฉีดวัคซีน DC661-MC38 ซ้ำในหนู NOD/SCID สถิติ. นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดโดยใช้การทดสอบทีแบบหางคู่ 2- ของนักเรียนเมื่อเปรียบเทียบ 2 กลุ่ม 1-วิธีใช้การทดสอบ ANOVA เมื่อเปรียบเทียบมากกว่า 2 กลุ่ม สมมติฐานว่างถูกปฏิเสธอย่างมีนัยสำคัญหากค่า P น้อยกว่า 0.05 ข้อมูลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± SEM อนุมัติการศึกษา การทดลองในสัตว์ทั้งหมดได้ดำเนินการตามระเบียบการที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัยเพนซิลวาเนีย
สมุนไพรจีน cistanche plant-Antitumor
อ้างอิง
1. Zeh HJ และคณะ การศึกษาก่อนการผ่าตัดแบบสุ่มระยะที่ 2 ของการยับยั้งการกินอัตโนมัติด้วยไฮดรอกซีคลอโรควินขนาดสูงและเจมซิตาไบน์/แนบ-พาคลิทาเซลในผู้ป่วยมะเร็งตับอ่อน คลินิกมะเร็ง Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. รีเบคก้า โฟล์คสวาเกน และคณะ PPT1 ส่งเสริมการเจริญเติบโตของเนื้องอกและเป็นเป้าหมายระดับโมเลกุลของอนุพันธ์ของคลอโรควินในมะเร็ง มะเร็งดิสคอฟ 2019;9(2):220–229.
3. บรัน เอส และคณะ GNS561 สารยับยั้ง autophagy ตัวใหม่ที่ออกฤทธิ์ต่อต้านเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งในมะเร็งเซลล์ตับและการแพร่กระจายของตับจากมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก เจ มะเร็ง. 2021;12(18):5432–5438.
4. บรัน เอส และคณะ GNS561 ซึ่งเป็นสารยับยั้ง PPT1 ในระยะทางคลินิก มีประสิทธิภาพในการต่อต้านมะเร็งเซลล์ตับผ่านการปรับฟังก์ชันไลโซโซม การกินอัตโนมัติ 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C และคณะ การซึมผ่านของเยื่อ Lysosomal และการปล่อย cathepsin เป็นเหตุการณ์ที่ขึ้นกับ Bax/ Bak ซึ่งขยายการเกิดการตายของเซลล์ในไฟโบรบลาสต์และโมโนไซต์ การตายของเซลล์แตกต่างกัน 2010;17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. การซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ Lysosomal ในการตายของเซลล์ อองโคยีน 2008;27(50):6434–6451.
7. รีเบคก้า โฟล์คสวาเกน และคณะ แนวทางที่เป็นหนึ่งเดียวในการกำหนดเป้าหมายบทบาทการส่งสัญญาณความเสื่อมโทรมและการเติบโตของไลโซโซม มะเร็งดิสคอฟ 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R และคณะ Ferroptosis, necroptosis และ pyroptosis ในภูมิคุ้มกันต้านมะเร็ง เจ ฮีมาทอล ออนคอล 2020;13(1):110.
9. ยามาโมโตะ เค และคณะ การกินอัตโนมัติส่งเสริมการหลีกเลี่ยงภูมิคุ้มกันของมะเร็งตับอ่อนโดยการลดระดับ MHCI ธรรมชาติ. 2020;581(7806):100–105.
10. เติ้ง เจ และคณะ การยับยั้ง ULK1 เอาชนะการนำเสนอแอนติเจนที่ถูกบุกรุกและฟื้นฟูภูมิคุ้มกันต่อต้านมะเร็งในมะเร็งปอดกลายพันธุ์ LKB1 แนท กรกฎ. 2021;2(5):503–514.
11. ลาซารู เอ็ม และคณะ ubiquitin kinase PINK1 รับสมัครตัวรับ autophagy เพื่อกระตุ้น mitophagy ธรรมชาติ. 2015;524(7565):309–314.
12. ชเว วายบี และคณะ TAX1BP1 ยับยั้งการตายของเซลล์ที่เกิดจากไวรัสโดยอำนวยความสะดวกในการย่อยสลาย MAVS ของอะแดปเตอร์ไมโตคอนเดรีย โมลเซลล์ไบโอล 2017;37(1):e00422-16.
13. ริกกะ เอส และคณะ Bnip3 บั่นทอนพลังงานชีวภาพของไมโตคอนเดรียและกระตุ้นการหมุนเวียนของไมโตคอนเดรีย การตายของเซลล์แตกต่างกัน 2011;18(4):721–731.
14. หลิว จี และคณะ พื้นฐานทางกลไกสำหรับภาวะเฟอร์รอปโตซิสที่บกพร่องในเซลล์ซึ่งแสดงออกถึงตัวแปร S47 ที่มีแอฟริกันเป็นศูนย์กลางของ p53 Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA และคณะ สารยับยั้ง BRAF และ MEK กลายพันธุ์ควบคุมสภาพแวดล้อมจุลภาคของภูมิคุ้มกันของเนื้องอกผ่านไพโรโทซิส มะเร็งดิสคอฟ 2020;10(2):254–269.
16 Serrano-Puebla A, Boya P. Lysosomal Membrane permeabilization ในการตายของเซลล์: หลักฐานใหม่และผลกระทบต่อสุขภาพและโรค แอน NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.
17. ธีรูซันกู พี และคณะ autophagy ที่เกิดจาก Quinacrine ในมะเร็งรังไข่ทำให้เกิด cathepsin-L ที่เป็นสื่อกลางในการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ lysosomal / mitochondrial และการตายของเซลล์ มะเร็ง (บาเซิล) 2021;13(9):2004.
18. มิชาลเล็ต เอ็มซี และคณะ การตายของเซลล์ที่ขึ้นกับ Cathepsin กระตุ้นโดยการกระตุ้นการทำงานของ T lymphocytes อย่างเหมาะสมที่สุด: กลไกที่เป็นไปได้ของการทนต่อขนาดยาสูง เจ อิมมูนอล. 2004;172(9):5405–5414.
19. มอนดัล เอ และคณะ การขาด Ppt1- จะควบคุมสภาวะสมดุลของไลโซโซม Ca++ อย่างผิดปกติ ซึ่งมีส่วนทำให้เกิดโรคในแบบจำลองเมาส์ของโรค CLN1 J สืบทอด Metab Dis 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM และคณะ ฟอสโฟไลเปสและสายพันธุ์ออกซิเจนที่ทำปฏิกิริยาได้มาจากตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของไขมันในมนุษย์และสัตว์ที่มีสุขภาพดีและเป็นโรค โดยมุ่งเน้นที่ไลโซฟอสฟาทิดิลโคลีน ฟรอนท์ฟิสิออล. 2021;12:732319.
21. Fu R และคณะ ประสิทธิภาพของ N-acetylcysteine ในการยับยั้งฟีโนไทป์ของแบบจำลองเมาส์ของโรค Niemann-Pick ประเภท C1 ฮัม โมล เจเนต. 2013;22(17):3508–3523.
22. โบซ ซี และคณะ N-acetylcysteine ป้องกันความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชันที่เกิดจาก olanzapine ในเซลล์ประสาทไฮโปทาลามัส mHypoA-59 ตัวแทนวิทยาศาสตร์ 2020;10(1):19185.
23. แคร์ เอส และคณะ ASS1 และ ASL ยับยั้งการเจริญเติบโตในมะเร็งเซลล์ไตเซลล์ใสผ่านการเผาผลาญไนโตรเจนที่เปลี่ยนแปลง Metab มะเร็ง 2021;9(1):40.
24. Gęgotek A และคณะ การเปรียบเทียบผลการป้องกันของกรดแอสคอร์บิกต่อปฏิกิริยาระหว่างระบบรีดอกซ์และเอนโดแคนนาบินอยด์ ในไฟโบรบลาสต์ผิวหนังมนุษย์ที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองที่สัมผัสกับรังสียูวีและไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ อาร์ช เดอร์มาทอล เรส 2017;309(4):285–303.
25. เดอ เรดต์ ที และคณะ การใช้ประโยชน์จากช่องโหว่ของเซลล์มะเร็งเพื่อพัฒนาการรักษาแบบผสมผสานสำหรับเนื้องอกที่ขับเคลื่อนด้วย ras เซลล์มะเร็ง. 2011;20(3):400–413.
26. จาง เอ็กซ์ และคณะ การตรวจสอบการเกิดออกซิเดชันของไขมันภายในเซลล์โฟมโดยโพรบแบบกำหนดเป้าหมายไลโซโซมและแบบอัตราส่วน เคมีก้น. 2015;87(16):8292–8300.
27. เหว่ย CY และคณะ การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์เผยให้เห็น MFSD12 ที่ได้รับการยกระดับในฐานะผู้สนับสนุนหลักของการเพิ่มจำนวนเซลล์และเป็นเป้าหมายในการรักษาที่มีศักยภาพในมะเร็งผิวหนัง อองโคยีน 2019;38(11):1876–1891.
28. อัลดินี จี และคณะ N-Acetylcysteine เป็นสารต้านอนุมูลอิสระและสารทำลายซัลไฟด์: สาเหตุ ฟรี Radic Res 2018;52(7):751–762. 29. อบู-เรไมเลห์ เอ็ม และคณะ เมแทบอลิซึมของ Lysosomal เผยการควบคุม V-ATPase- และ mTOR ที่ขึ้นกับของกรดอะมิโนจากไลโซโซม ศาสตร์. 2017;358(6364):807–813.
30. โจว เจ และคณะ การตายของเซลล์ภูมิคุ้มกันในการรักษาโรคมะเร็ง: ตัวเหนี่ยวนำในปัจจุบันและที่เกิดขึ้นใหม่ เจ เซลล์ โมล เมด 2019;23(8):4854–4865. 31. ชาร์มา จี และคณะ การยับยั้ง PPT1 เพิ่มฤทธิ์ต้านเนื้องอกของแอนติบอดีต้าน PD-1 ในมะเร็งผิวหนัง เจซีไอ อินไซท์. 2020;5(17):e133225.
32. เมห์เนิร์ต เจเอ็ม และคณะ BAMM (BRAF autophagy และการยับยั้ง MEK ในมะเร็งผิวหนัง): การทดลองระยะ I/II ของ dabrafenib, trametinib และ hydroxychloroquine ใน BRAFV600- มะเร็งผิวหนังชนิดกลายพันธุ์ขั้นสูง คลินิกมะเร็ง Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. ลอย เอ็ม และคณะ โปรตีน Macroautophagy ควบคุมระดับ MHC คลาส I บนเซลล์เดนไดรติกและสร้างการตอบสนองของทีเซลล์ต้านไวรัส CD8(+) ตัวแทนเซลล์ 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P และคณะ การระดมซิสเตอีนของ Lysosomal ทำให้เกิดการตอบสนองของ TORC1 และการเติบโตของเนื้อเยื่อต่อการอดอาหาร ศาสตร์. 2022;375(6582):eabc4203.
35. ชวาลเฟนเบิร์ก จีเค. N-acetylcysteine: การทบทวนคุณประโยชน์ทางคลินิก (ยาเก่าที่มีเทคนิคใหม่) เจ นูตร เมตาบ. 2021;2021:9949453.
36. เบียร์แอลเอ และคณะ การค้นพบตัวชี้วัดทางชีวภาพในซีรั่มการตั้งครรภ์นอกมดลูกอย่างเป็นระบบโดยใช้ 3- การทำโปรไฟล์โปรตีน D ควบคู่กับการวัดปริมาณแบบไม่มีฉลาก เจ โปรตีโอม เรส 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR และคณะ ผลกระทบหลักต่อโปรตีโอมของมะเร็งเซลล์ใสรังไข่ที่กลายพันธุ์ ARID1A คือการลดลงของทางเดิน mevalonate ในระดับหลังการถอดรหัส โมลเซลล์โปรตีโอมิกส์ 2016;15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant ช่วยให้อัตราการระบุเปปไทด์สูง ความแม่นยำของมวลช่วง ppb ที่เป็นรายบุคคล และการหาปริมาณโปรตีนทั้งโปรตีโอม แนท ไบโอเทคโนล. 2008;26(12):1367–1372.
39. ค็อกซ์เจ และคณะ Andromeda: เครื่องมือค้นหาเปปไทด์ที่รวมอยู่ในสภาพแวดล้อม MaxQuant เจ โปรตีโอม เรส 2011;10(4):1794–1805.
40. ค็อกซ์เจ และคณะ การหาปริมาณที่ไม่มีฉลากทั่วทั้งโปรตีโอมที่แม่นยำโดยการทำให้เป็นมาตรฐานแบบล่าช้าและการสกัดอัตราส่วนเปปไทด์สูงสุด เรียกว่า MaxLFQ โมลเซลล์โปรตีโอมิกส์ 2014;13(9):2513–2526.
41. ทยาโนวา เอส และคณะ แพลตฟอร์มการคำนวณ Perseus สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูล (โปรตีน) omics อย่างครอบคลุม วิธีการแนท 2016;13(9):731–740.
42 Tyanova S, Cox J. Perseus: แพลตฟอร์มชีวสารสนเทศศาสตร์สำหรับการวิเคราะห์เชิงบูรณาการของข้อมูลโปรตีโอมิกส์ในการวิจัยโรคมะเร็ง วิธีการ โมล ไบโอล 2018;1711:133–148.
43. อลิซา จีเอ็ม และคณะ การเปลี่ยนแปลงของการเผาผลาญไขมันในไฟโบรบลาสต์ที่มีอายุมากทำให้เกิดความต้านทานต่อเซลล์มะเร็งผิวหนังที่ขึ้นกับอายุต่อการรักษาแบบกำหนดเป้าหมายผ่านทางตัวขนส่งกรดไขมัน FATP2 มะเร็งดิสคอฟ 2020;10(9):1282–1295.
44. รัน เอฟเอ และคณะ วิศวกรรมจีโนมโดยใช้ระบบ CRISPR-Cas9 แนท โพรทอค. 2013;8(11):2281–2308.
45. หลิว พี และคณะ ปริมาณการสัมผัสแคลเรติคูลินที่เกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ภูมิคุ้มกัน วิธีการใช้เอนไซม์ 2020;632:1–13.
