การทำโปรไฟล์ภูมิคุ้มกันตามยาวเผยให้เห็นเอพิโทปที่โดดเด่นซึ่งเป็นสื่อกลางในการสร้างภูมิคุ้มกันทางร่างกายในระยะยาวในบุคคลช่วงพักฟื้นช่วงโควิด-19

พื้นหลัง: กลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง โคโรนาไวรัส 2 (SARS-CoV-2) เป็นโคโรนาไวรัสที่ทำให้เกิดโรคและติดต่อได้ง่ายมาก ซึ่งทำให้เกิดการระบาดใหญ่ทั่วโลก โดยมีผู้เสียชีวิตถึง 5.2 ล้านคนจนถึงปัจจุบัน คำถามเกี่ยวกับลักษณะทางซีรัมวิทยาของภูมิคุ้มกันในระยะยาว โดยเฉพาะอย่างยิ่งเอพิโทปที่โดดเด่นซึ่งเป็นสื่อกลางในการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทนทานหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ยังคงต้องได้รับการชี้แจง

วัตถุประสงค์: เรามุ่งเป้าที่จะวิเคราะห์จลนพลศาสตร์และอายุยืนยาวของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในผู้ป่วยโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (โควิด-19) รวมถึงเอพิโทปที่รับผิดชอบในการสร้างภูมิคุ้มกันทางร่างกายต่อโรค SARS-CoV ในระยะยาวอย่างยั่งยืน-2

วิธีการ: เราประเมินไดนามิกของภูมิคุ้มกัน SARS-CoV-2 นานสูงสุด 180 ถึง 220 วันหลังจากเริ่มมีอาการในบุคคล 31 รายที่มีอาการส่วนใหญ่ของโควิดในระดับปานกลาง-19 จากนั้นจึงทำการรวบรวมโปรไฟล์ของเอพิโทปที่โดดเด่นทั่วทั้งโปรตีโอมที่รับผิดชอบ การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันทางร่างกายอย่างต่อเนื่อง

ผลลัพธ์: การวิเคราะห์ตามยาวเผยให้เห็นแอนติบอดีจำเพาะโปรตีนที่ขัดขวางการทำงานของ SARS-CoV-2 และแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในผู้ป่วยโรคโควิด-19 อย่างต่อเนื่อง พร้อมด้วยการกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์ในระยะแรกหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 เอพิโทปที่มีปฏิกิริยาสูงซึ่งสามารถเป็นสื่อกลางการตอบสนองของแอนติบอดีในระยะยาวแสดงให้เห็นว่าอยู่ที่ส่วนขัดขวางและโปรตีน ORF1ab เอพิโทปสำคัญของโปรตีนสไปค์ SARS-CoV-2 ถูกแมปกับโดเมนปลาย N ของหน่วยย่อย S1 และหน่วยย่อย S2 โดยมีระดับความคล้ายคลึงกันของลำดับที่แตกต่างกันในหมู่โคโรนาไวรัสเฉพาะถิ่นของมนุษย์ และเอกลักษณ์ของลำดับสูงระหว่างโรคซาร์สระยะแรก CoV-2 (หวู่ฮั่น-หู- 1) และรูปแบบการหมุนเวียนในปัจจุบัน

ประโยชน์ของอาหารเสริม Cistanche-วิธีเสริมสร้างระบบภูมิคุ้มกัน

บทสรุป: การติดเชื้อ SARS-CoV-2 กระตุ้นให้เกิดภูมิคุ้มกันทางร่างกายอย่างต่อเนื่องในผู้ที่อยู่ในช่วงพักฟื้นด้วยโรคโควิด-19 โดยการกำหนดเป้าหมายเอพิโทปที่โดดเด่นซึ่งอยู่ที่จุดสูงสุดและโปรตีน ORF1ab ที่เป็นสื่อกลางในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในระยะยาว การค้นพบของเราเป็นแนวทางในการช่วยออกแบบวัคซีนและการพัฒนาการวินิจฉัยอย่างมีเหตุผล (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

คำสำคัญ:

SARS-CoV-2, โควิด-19, การตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในระยะยาว, ภูมิคุ้มกันของร่างกาย, ไมโครอาร์เรย์เปปไทด์ทั้งโปรตีโอม, เอพิโทปที่โดดเด่น

กลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง โคโรนาไวรัส 2 (SARS-CoV- 2) ซึ่งเป็นสาเหตุของการแพร่ระบาดของโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (COVID{4}}) ที่กำลังดำเนินอยู่ อยู่ในสกุล Betacoronavirus ซึ่งรวมถึงมนุษย์ที่ทำให้เกิดโรคสูงอีก 2 คน โคโรนาไวรัส: กลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (ซาร์ส) และกลุ่มอาการทางเดินหายใจตะวันออกกลาง (เมอร์ส) โคโรนาไวรัส1 นับตั้งแต่เริ่มมีการบันทึกผู้ป่วยรายแรกในช่วงปลายเดือนธันวาคม 2562 การติดเชื้อ SARS-CoV-2 ส่งผลให้มีผู้เสียชีวิตแล้วมากกว่า 263 ล้านคน ข้อมูลผู้ป่วยที่ได้รับการยืนยันและการเสียชีวิต 5.2 ล้านคนทั่วโลก ณ เดือนพฤศจิกายน 2564 ส่งผลกระทบต่อ 220 ประเทศและภูมิภาคใน 5 ทวีป2 หลังการติดเชื้อ อาการทางคลินิกพบได้อย่างกว้างขวาง รวมถึงการติดเชื้อที่ไม่มีอาการ อาการไม่รุนแรงหรือปานกลาง หรือแม้แต่โรคปอดบวมรุนแรงที่คุกคามถึงชีวิต3 แม้จะมี ความพร้อมของแนวทางการใช้วัคซีนหลายประเภท หลายประเทศยังคงดิ้นรนเพื่อควบคุมการติดเชื้อระลอกใหม่ โดยมีไวรัสสายพันธุ์ต่างๆ ปรากฏขึ้นที่ดูเหมือนจะแสดงความสามารถในการแพร่เชื้อและการต้านทานต่อการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของไวรัสได้มากขึ้น การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายที่มีประสิทธิผลโดยอาศัยแอนติบอดีที่เป็นกลางควรมีภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวที่ทรงพลังและขาดไม่ได้ เพื่อป้องกันการติดเชื้อและกำจัดเชื้อโรคจากไวรัส หลังจากการติดเชื้อ SARS-CoV-2 อัตราการเปลี่ยนแปลงของซีโรคอนเวอร์ชันที่รุนแรงในผู้ติดเชื้อจะสูง (มากกว่า 90%) ที่ 7 ถึง 14 วันหลังจากเริ่มมีอาการ4-6 การผลิต IgA ที่จำเพาะต่อแอนติเจน IgG และ IgM ที่รับรู้ถึงโปรตีนขัดขวาง (S) และโปรตีนนิวคลีโอแคปซิด (N) ของ SARS-CoV-2 สามารถตรวจพบได้ในระหว่างระยะเฉียบพลันของโรคและระยะเริ่มแรกของการพักฟื้น4,5,7 ขนาดของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางปรากฏว่า สัมพันธ์กับอายุ อาการของการติดเชื้อ และความรุนแรงของโรค ผู้ป่วยสูงอายุและบุคคลที่แสดงอาการโควิดอย่างรุนแรง-19 มีแนวโน้มที่จะพัฒนาแอนติบอดีที่เป็นกลางในระดับที่สูงขึ้น4,8-10 การศึกษาหลายชิ้นที่เกี่ยวข้องกับการมีอายุยืนยาวของการตอบสนองของแอนติบอดีได้เปิดเผยว่าแม้จะสูญเสียปฏิกิริยาของซีรั่ม/พลาสมาต่อไวรัส แอนติเจนและไทเทอร์ของแอนติบอดีที่เป็นกลางที่ลดลงเมื่อเวลาผ่านไปในบางกรณีที่มีอาการของเชื้อโควิด-19 โดยจะสังเกตระดับภูมิคุ้มกันโดยรวมในระยะยาวที่ยั่งยืนได้นานถึง 8 ถึง 12 เดือนหลังการติดเชื้อในผู้ที่เข้ารับการพักฟื้นของเชื้อโควิด-19 .10-13 นอกจากนี้ จำนวนเซลล์ B ในหน่วยความจำจำเพาะแอนติเจน SARS-CoV-2 ยังคงคงที่เป็นเวลาอย่างน้อย 6 ถึง 12 เดือน12,13 พร้อมกับการคัดเลือกและการสะสมอย่างต่อเนื่องของโคลน B-cell ที่แสดงออก การทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง12,14 บ่งชี้ถึงการรักษาภูมิคุ้มกันของร่างกายอย่างต่อเนื่องหลังการติดเชื้อ SARSCoV-2

คุณประโยชน์อาหารเสริม cistanche - เพิ่มภูมิคุ้มกัน

การทำให้แอนติบอดีเป็นกลางมีบทบาทสำคัญในการป้องกันโฮสต์จากการติดเชื้อไวรัส มีการระบุกลุ่มโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มีศักยภาพสูงของ SARS-CoV-2 โดย15-17 โดยมีเป้าหมายหลักคือเอพิโทปที่อยู่ในโดเมนการจับตัวรับของโปรตีน S ซึ่งประกอบกันเป็นไตรเมอร์บนพื้นผิวของไวรัสและอำนวยความสะดวกในการเข้าสู่ไวรัส และการหลอมรวมในการดึงดูดเอนไซม์ที่แปลงแอนจิโอเทนซิน 2 ตัวรับ18 บริเวณอื่นๆ ของเอสโปรตีน รวมถึงโดเมนที่ปลาย N (NTD) ของหน่วยย่อย S1 และหน่วยย่อย S2 ยังมีเอพิโทปที่สร้างภูมิคุ้มกันที่สามารถกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางได้ ,19,20 นอกจากการทำให้เป็นกลางแล้ว แอนติบอดีของ SARS-CoV-2 อาจให้การป้องกัน ภายในร่างกาย ผ่านฟังก์ชันเอฟเฟกเตอร์ที่ใช้ Fc เป็นสื่อกลาง เช่น ฟาโกไซโตซิสที่ขึ้นกับแอนติบอดีที่ถูกกระตุ้นโดยเซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ และความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ขึ้นกับแอนติบอดีโดยโมโนไซต์หรือมาโครฟาจ 21,22 นอกเหนือจากการต่อสู้กับการติดเชื้อไวรัสแล้ว แอนติบอดีที่เกิดจากการติดเชื้อตามธรรมชาติหรือการฉีดวัคซีนอาจเอื้อต่อการเกิดไวรัสได้ ไม่ว่าจะโดยการกระตุ้นการอักเสบที่เพิ่มขึ้นหรือการติดเชื้อไวรัสที่เพิ่มขึ้นผ่านการสร้างภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อนของแอนติเจน/แอนติบอดี หรือโดยการทำงานที่ขึ้นกับ Fc23-25 แม้ว่าการติดเชื้อไวรัสที่เพิ่มขึ้นจะไม่ได้รับการสังเกตในบริบทของ SARS-CoV-2 ในร่างกาย บทบาทที่แตกต่างกันของการตอบสนองของแอนติบอดีจำเป็นต้องมีการกำหนดลักษณะเฉพาะของอีพิโทป SARSCoV-2 อย่างเป็นระบบ เช่นเดียวกับคุณสมบัติของแอนติบอดีที่มีอายุยืนยาวโดยมุ่งเป้าไปที่อีพิโทปที่ทำให้เป็นกลางหรือไม่ทำให้เป็นกลาง แม้ว่าล่าสุดจะมีความก้าวหน้าในด้านจลนศาสตร์และระยะเวลาของการตอบสนองของแอนติบอดีหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 แต่การวิเคราะห์ตามยาวเกี่ยวกับเอพิโทปที่โดดเด่นซึ่งคงไว้ซึ่งการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในระยะยาวยังคงมีจำกัด การศึกษาก่อนหน้านี้ได้รวบรวมประวัติของอีพิโทปของการตอบสนองของแอนติบอดีในบุคคลที่ติดเชื้อ COVID-19 โดยส่วนใหญ่ใช้การตรวจวิเคราะห์โดยใช้ ELISA วิธีที่ใช้ฟาจหรือการแสดงผลด้วยแบคทีเรีย 26,27 วิธี28-31 และเทคโนโลยีที่ใช้ไมโครอาร์เรย์ 30,{{ 38}} มีการระบุเอพิโทปภูมิคุ้มกันของโปรตีน SARS-CoV-2 S หลายตัว; บริเวณที่ตรวจพบบ่อยที่สุดถูกแมปไว้ใกล้หรือขยายฟิวชันเปปไทด์ (FP) ของหน่วยย่อย S2, เฮปทัดที่สองทำซ้ำภายในหน่วยย่อย S2 และบนโดเมนเทอร์มินัล C ของหน่วยย่อย S1.26,28-30, 32,33 นอกจากนี้ การตรวจคัดกรองทางซีรัมวิทยายังเผยให้เห็นเอพิโทปที่อยู่ที่โปรตีนอื่นๆ ทั่วโปรตีโอมของ SARS-CoV-2 ซึ่งรวมถึงโปรตีน N, โปรตีนเมมเบรน (M) และ ORF1ab, ORF3a และ ORF7a28-30 34,35 แม้ว่าการศึกษาก่อนหน้านี้ได้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับเอพิโทปของแอนติเจน แต่การศึกษาเหล่านี้มุ่งเน้นไปที่การสร้างโปรไฟล์เอพิโทปของผู้ป่วยโควิด{57}} ในระยะพักฟื้นระยะแรก อีพิโทปที่แน่นอนซึ่งเป็นสื่อกลางการตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะต่อ SARS-CoV-2 ที่ทนทานตลอดจนการเปลี่ยนแปลงของการจดจำอีพิโทปยังคงต้องมีการอธิบายให้ชัดเจน เพื่อให้ได้ความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับจลนพลศาสตร์และการมีอายุยืนยาวของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในผู้ป่วยโควิด-19 โดยเฉพาะอย่างยิ่งเอพิโทปที่รับผิดชอบในการสร้างภูมิคุ้มกันต่อโรคซาร์ส-CoV ในระยะยาวอย่างยั่งยืน-2 เราได้ดำเนินการวิเคราะห์ตามยาวที่ครอบคลุม ของการสร้างโปรไฟล์ภูมิคุ้มกันในผู้ป่วยโรคโควิด-19 31 ราย ภายใน 180 ถึง 220 วันหลังจากเริ่มแสดงอาการ จากการประเมินแอนติบอดีที่จับกับแอนติเจนและการทำให้เป็นกลางตลอดจนระดับไซโตไคน์ในซีรัม เราได้ระบุเพิ่มเติมด้วยแผงของอีพิโทปที่อยู่ที่โปรตีน ORF1ab, S และ N ของ SARSCoV-2 ที่เป็นสื่อกลางในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายอย่างต่อเนื่องโดยใช้เปปไทด์ ไมโครอาร์เรย์ซึ่งครอบคลุมโปรตีโอมที่สมบูรณ์ของ SARS-CoV-2 ผลลัพธ์ของเราให้ความกระจ่างเกี่ยวกับคุณสมบัติของภูมิคุ้มกันในระยะยาวเพื่อเอาชนะการติดเชื้อไวรัส และจะช่วยแจ้งการออกแบบวัคซีนที่สมเหตุสมผลและการพัฒนาเครื่องมือวินิจฉัยทางซีโรโลยีที่ได้รับการปรับปรุง

วิธีการ

ผู้เข้าร่วมการศึกษาและการเก็บตัวอย่าง

เพื่อประเมินจลนพลศาสตร์ของการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกันแบบกำหนดทิศทางของ SARS-CoV-2 ในระยะยาว จึงได้เก็บตัวอย่างซีรั่ม 101 ตัวอย่างจากผู้ติดเชื้อ SARS-CoV-2 จำนวน 31 รายที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาล Nantong Third Hospital ในเครือมหาวิทยาลัย Nantong (Nantong ประเทศจีน) ระหว่างเดือนมกราคมถึงมีนาคม 2020 ผู้ป่วยทั้งหมดได้รับการวินิจฉัยว่าติดเชื้อ SARS-CoV-2 ที่ได้รับการยืนยันแล้ว โดยผ่านการทดสอบ PCR เชิงปริมาณด้วยการถอดรหัสแบบย้อนกลับ ความรุนแรงของโรคถูกกำหนดให้เป็นโควิดระดับเล็กน้อยถึงปานกลาง (ไม่รุนแรง) หรือรุนแรง-19 ตามเวอร์ชัน 7 ของโปรโตคอลการวินิจฉัยและการรักษาสำหรับโรคปอดอักเสบจากเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (Novel Corona Virus Pneumonia) ที่เผยแพร่โดยคณะกรรมการสุขภาพแห่งชาติของสาธารณรัฐประชาชนจีน36 มีการติดตามผู้ป่วย ขึ้นตามยาวเป็นเวลา 4 ถึง 8 เดือนหลังจากหายจากการติดเชื้อเฉียบพลัน เก็บตัวอย่างเลือดในลักษณะตามยาวตั้งแต่ 4 ถึง 219 วันหลังจากเริ่มมีอาการสำหรับผู้ป่วย 20 รายจากผู้เข้าร่วมการศึกษา 31 ราย (ค่ามัธยฐาน 4.5 ตัวอย่างต่อราย ตั้งแต่ 2 ถึง 8 ราย) ในขณะที่ดำเนินการสุ่มตัวอย่างแบบจุดเดียวสำหรับแต่ละรายการ บุคคลอีก 11 รายที่อยู่ในระยะพักฟื้นระยะปลาย (วันที่ 122 ถึง 214 หลังจากเริ่มมีอาการ) ดังนั้น ซีรั่ม (n 5 20) จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีซึ่งจับคู่อายุและเพศจึงถูกรวมเป็นกลุ่มควบคุมด้วย ไม่มีผู้เข้าร่วมการศึกษาที่มีเอกสารบันทึกการติดเชื้อ SARS หรือ MERS มาก่อน

การศึกษาได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาล Nantong Third ในเครือมหาวิทยาลัย Nantong (อนุมัติ EL2020006) ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากผู้เข้าร่วมการศึกษาแต่ละคน เซรั่มถูกแยกออกจากเลือดส่วนปลายในหลอดเจลเซรั่มโดยการหมุนเหวี่ยง, ก่อรูปเป็นชิ้นส่วนและเก็บไว้ที่ 2808C ก่อนการใช้งาน

เส้นเซลล์

เพาะเลี้ยงเซลล์ HEK293T และ Huh7 ในอาหารเลี้ยงเชื้อ Eagle ดัดแปลง Dulbecco (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) เสริมด้วยซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ที่ถูกทำให้หมดฤทธิ์ด้วยความร้อน 10% (Gibco), 100 U/mL เพนิซิลลิน (Gibco) และ 100 มก./ มล. สเตรปโตมัยซิน (Gibco) ที่ 378C พร้อม CO2 5%

ประโยชน์ของซิสตานช์สำหรับระบบภูมิคุ้มกันของผู้ชาย

คลิกที่นี่เพื่อดูผลิตภัณฑ์ Cistanche Enhance Immunity

【สอบถามเพิ่มเติม】 อีเมล:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

การตรวจหาแอนติบอดี IgG โดย ELISA

ระดับของแอนติบอดี IgG ที่จับกับแอนติเจนในตัวอย่างซีรัมของมนุษย์ถูกกำหนดโดย ELISA เพลต ELISA เก้าสิบหกหลุม (Corning, Corning, NY) ถูกเคลือบล่วงหน้าด้วยโปรตีนนิวคลีโอแคปซิด SARS-CoV-2 (Sino Biological, ปักกิ่ง, จีน, แค็ตตาล็อกหมายเลข 40588-V08B , 50 นาโนกรัมต่อหลุม) หรือโปรตีนขัดขวาง (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng ต่อหลุม), โปรตีนขัดขวาง SARS-CoV (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng ต่อหลุม ดี) หรือโปรตีนขัดขวาง MERS-CoV (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng ต่อหลุม) ข้ามคืนที่ 48C หลังจากบล็อกด้วยนมไม่มีไขมัน 5% ในน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) ที่มี Tween 20 (PBS-T) 0.05% เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 378C แล้ว 3-พับตัวอย่างซีรัมที่ยับยั้งความร้อนแบบเจือจางแบบอนุกรมที่การเจือจางเริ่มต้นที่ 1 :200 ถูกเติมลงในเพลตเคลือบสำเร็จรูปเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 378C หลุมถูกล้าง 3 ครั้งระหว่างแต่ละขั้นตอนด้วย PBS-T ปฏิกิริยาถูกมองเห็นได้โดยการฟักตัวด้วยแอนติบอดีต่อต้าน IgG ของมนุษย์ด้วยฮอสราดิช เปอร์ออกซิเดส–คอนจูเกต (Abcam, Cambridge, United Kingdom, 1:100,000 การเจือจาง) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 378C ตามด้วยการเติมซับสเตรตเตตระเมทิลเบนซิดีน (Life Technologies, Carlsbad ,แคลิฟอร์เนีย) ปฏิกิริยาที่กำลังพัฒนาถูกหยุดด้วย 2 โมล H2SO4 และวัดการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตร โดยตั้งค่าความยาวคลื่นแก้ไขไว้ที่ 630 นาโนเมตร (OD450 2 OD630) สำหรับการคำนวณไทเทอร์จุดสิ้นสุดของแอนติบอดีที่ใช้จับ ข้อมูลถูกทำให้เป็นเส้นตรงโดยการพล็อต log10 ของการเจือจางในซีรัมเทียบกับค่าความหนาแน่นเชิงแสง (OD) ที่ถูกแก้ไข (OD450 2 OD630) ภายในส่วนเชิงเส้นตรงของเส้นโค้ง (y 5 kx 1 b , r2 > 0.99) และการเจือจางในซีรัมซึ่งค่า OD ที่ปรับแล้ว (OD450 2 OD630) 5 0 ถูกคำนวณเพื่อให้เครื่องไตเตรทจุดสิ้นสุด แอนติบอดี IgG ที่จำเพาะต่อแอนติเจนในหนูเมาส์ที่ถูกสร้างภูมิคุ้มกันด้วยเปปไทด์ถูกประเมินโดย ELISA ที่มีเปปไทด์เป็นพื้นฐาน โดยสรุป เพลต ELISA ของหลุม 96- (เทอร์โม ฟิชเชอร์ ไซแอนทิฟิค) ถูกเคลือบด้วย 1 มิลลิกรัมต่อหลุมของเปปไทด์ผสม 4 ชนิด (เปปไทด์ 318, 356, 510 และ 530) ในบัฟเฟอร์คาร์บอเนต (pH 9.6) ข้ามคืนที่ 48C หลังจากการปิดกั้นด้วย PBS-T ที่มีนมไม่มีไขมัน 5% หลุมถูกบ่มด้วยตัวอย่างซีรัมที่ถูกเจือจางที่ 1:40 เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 378ซ ต่อจากนั้น เพลตถูกล้างและบ่มด้วยแอนติบอดี IgG ที่ต้านเมาส์ของฮอสราดิช เปอร์ออกซิเดส–คอนจูเกต (Abcam) ปฏิกิริยาถูกมองเห็นด้วยซับสเตรตเตตระเมทิลเบนซิดีน (Life Technologies) และการดูดกลืนแสงที่ 450 นาโนเมตรถูกวัดหลังจากการหยุดปฏิกิริยาด้วย 2 โมล H2SO4

การผลิตและการไตเตรทของไวรัสหลอก

ยีนที่ปรับให้เหมาะสมด้วยโคดอนซึ่งเข้ารหัส SARS-CoV-2 (NC_045512) หรือ SARS-CoV (AY291315.1) สไปค์โปรตีนที่มีการลบออกที่ปลาย C 19 aa หรือ MERS-CoV (JX{{10 }}) สไปค์โปรตีนที่ถูกตัดทอนด้วยปลาย C 16 aa ถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์ pcDNA3.1(1) ตามลำดับ เซลล์ HEK 293T ที่เพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 100 มม. ถูกแปลงสภาพร่วมกับโปรตีนขัดขวางที่เข้ารหัสพลาสมิด 1 มก. และ 15 มก. ของกระดูกสันหลังที่แสดงออกถึงลูซิเฟอเรสที่ขาด env (pNL 4-3.luc.RE) โดยใช้โพลีเอทิลีนอิมีน (โพลีไซแอนซ์ , วอร์ริงตัน, พ่อ). ส่วนลอยเหนือตะกอนของการเพาะเลี้ยงเซลล์ที่มีซูโดไวรัสถูกรวบรวมที่ 48 ชั่วโมงหลังจากการทรานส์เฟกชัน, กรองและเก็บไว้ที่ 2808ซ ในส่วนลงตัว สำหรับการกำหนดไทเตอร์ของไวรัส (ปริมาณการติดเชื้อในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 50%) การเจือจางแบบอนุกรมของไวรัสหลอกถูกเติมลงในเซลล์ 1 3 104 Huh7 ที่เตรียมไว้ล่วงหน้าในเพลตหลุม 96- หลังจากการติดเชื้อเป็นเวลา 12 ชั่วโมง อาหารที่มีไวรัสจะถูกแทนที่ด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อที่สดใหม่ และเซลล์จะถูกเพาะเลี้ยงต่อไปอีก 48 ชั่วโมง กิจกรรมของลูซิเฟอเรสของการสลายเซลล์ถูกวัดด้วยระบบ Steady-Glo Luciferase Assay (Promega, Madison, Wisc) โดยใช้เครื่องอ่านไมโครเพลท (BioTek Instruments, Winooski, Vt) และหลุมที่สร้างหน่วยการเรืองแสงสัมพัทธ์สูงกว่า 10 เท่าของค่าพื้นหลังโดยเฉลี่ยที่ได้รับการพิจารณา เชิงบวก.

ซูโดวีการทดสอบการวางตัวเป็นกลางของ rus

ตัวอย่างซีรัมที่ทำให้ความร้อนหมดฤทธิ์จากผู้ป่วยโควิด-19 หรือผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีถูกทำให้เจือจางแบบอนุกรม 2- เท่าและบ่มด้วยไวรัสหลอก 200 ตัวที่ปริมาณการติดเชื้อในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ 50% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 378C จากนั้น ของผสมถูกนำไปใช้กับเซลล์ Huh7 ที่เพาะไว้ล่วงหน้าในเพลตหลุม 96- ซ้ำกัน เวลส์ถูกเติมด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อสดที่ 12 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ และกิจกรรมของลูซิเฟอเรสของเซลล์ถูกกำหนดหาใน 48 ชั่วโมงต่อมา การไตเตรทการทำให้เป็นกลาง 50% (NT50) เทียบกับไวรัสหลอก SARS-CoV -2 และ SARS-CoV pseudoviruses คำนวณโดยการถดถอยแบบไม่เชิงเส้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 8.0 (ซอฟต์แวร์ GraphPad, La Jolla, Calif); และ NT50 ของไวรัสหลอก MERS-CoV ถูกกำหนดให้เป็นการเจือจางสูงสุดของซีรั่ม ซึ่งส่งผลให้หน่วยการเรืองแสงสัมพัทธ์ลดลง 50% เมื่อเทียบกับการควบคุมไวรัสโดยไม่ต้องใช้ตัวอย่างซีรั่ม

การตรวจหาไซโตไคน์ที่ใช้โปรตีนไมโครอาร์เรย์

การวัดเชิงปริมาณของไซโตไคน์หลายชนิด (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL -13, MCP -1, IFN-g และ TNF-a) ในตัวอย่างซีรั่มดำเนินการโดยใช้อาร์เรย์ ELISA แบบมัลติเพล็กซ์ (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยสรุป สไลด์แก้วที่เคลือบล่วงหน้าด้วยแอนติบอดีที่จำเพาะต่อไซโตไคน์ถูกปิดกั้นด้วยสารเจือจางตัวอย่างที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที ตามด้วยการเติมตัวอย่างซีรัมเจือจาง 2- เท่าหรือการเจือจางมาตรฐานของไซโตไคน์ หลังจากการบ่มข้ามคืนที่ 48ซ, สไลด์ถูกล้าง 5 ครั้งและย้อมด้วยค็อกเทลแอนติบอดีการตรวจจับที่ถูกเติมไบโอติน 80 มิลลิลิตร และจากนั้นสเตรปตะวิดินที่ถูกคอนจูเกตด้วยสีย้อมที่เทียบเท่ากับ Cy3 ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ตรวจพบความเข้มของแสงเรืองแสงโดยเครื่องสแกนไมโครเรย์ InnoScan 300 (Innopsys, Chicago, Ill) ที่ 532 นาโนเมตร และวิเคราะห์ข้อมูลโดยซอฟต์แวร์ Q-Analyzer (RayBiotech)

การสังเคราะห์เปปไทด์และการผันกับซีรั่มอัลบูมินของวัว

เปปไทด์ทั้งหมด 515 ตัว (ความยาว 15 aa ทับซ้อนกัน 11 aa) ที่ครอบคลุมโปรตีโอม SARS-CoV-2 ถูกสังเคราะห์โดย GL Biochem (เซี่ยงไฮ้ จีน) บนพื้นฐานของลำดับกรดอะมิโนของ SARS-CoV -2 สายพันธุ์หวู่ฮั่น-หู-1 เปปไทด์ถูกคอนจูเกตกับซีรั่มอัลบูมินของวัว (BSA) โดยใช้ตัวเชื่อมขวาง Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุป ซัลโฟ-SMCC ถูกเติมที่ 30-ส่วนที่เกินจากฟันกรามของ BSA ตามด้วยการฟอกไตไปยัง PBS ต่อจากนั้น เปปไทด์ที่มีซิสเทอีนถูกเติมในอัตราส่วน 1:1 (น้ำหนัก/น้ำหนัก) บ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง และฟอกไตเพิ่มเติมด้วย PBS เพื่อกำจัดเพปไทด์อิสระ

การผลิตไมโครอาร์เรย์เปปไทด์

เพื่อเตรียมเปปไทด์ไมโครอาร์เรย์ เปปไทด์ของ SARS-CoV-2 รวมถึงกลุ่มควบคุมเชิงลบ (BSA) และกลุ่มควบคุมเชิงบวก (แอนติบอดีต่อต้าน IgG ของมนุษย์และแอนติบอดีต่อต้าน IgM ของมนุษย์; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) ถูกตรึงบนสไลด์วัสดุพิมพ์ PATH (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) ในสามเท่าโดยใช้เครื่องพิมพ์ Super Marathon (Arrayjet, Edinburgh, Scotland, United Kingdom) จากนั้นเปปไทด์ไมโครอาร์เรย์ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 2808C เพื่อการใช้งานต่อไป

cistanche tubulosa-ปรับปรุงระบบภูมิคุ้มกัน

การทำแผนที่อีพิโทปที่ใช้ไมโครอาร์เรย์

การวิเคราะห์ซีรั่มที่ใช้ไมโครเรย์ดำเนินการในฐานะ Li และคณะ โดยมีการดัดแปลงเล็กน้อย เพื่อสร้างห้องแต่ละห้องสำหรับอาร์เรย์ย่อยที่เหมือนกัน 14-ปะเก็นยางห้องถูกติดตั้งไว้บนสไลด์ไมโครอาร์เรย์เปปไทด์แต่ละอัน สไลด์อาร์เรย์ถูกทำให้อุ่นจนถึงอุณหภูมิห้องก่อนใช้งาน จากนั้นปิดกั้นด้วย 3% BSA ใน PBS-T เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ตัวอย่างซีรัมจากผู้ป่วย COVID-19 หรือซีรั่มรวมจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 20 ราย (กลุ่มควบคุม) ถูกเจือจางที่ 1:200 ใน PBS-T สำหรับตัวอย่างส่วนใหญ่ จากนั้นบ่มด้วยแต่ละอาร์เรย์ย่อยเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 48ซ. อาเรย์ถูกล้างด้วย PBS-T และบ่มด้วย IgG ของแพะที่คอนจูเกตด้วย Cy3- และ Alexa Fluor 647– คอนจูเกตของแอนติ-ฮิวแมน IgM ของลาที่คอนจูเกต (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) ที่การเจือจาง 1:1000 ครั้งละ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการบ่ม อาเรย์จะถูกล้างด้วย PBS-T และจากนั้นทำให้แห้งอย่างสมบูรณ์โดยการปั่นแยกที่อุณหภูมิห้อง ต่อจากนั้นอาเรย์จะถูกสแกนโดยใช้เครื่องสแกน microarray LuxScan 10K-A (CapitalBio, ปักกิ่ง, จีน) และข้อมูลความเข้มของฟลูออเรสเซนต์ FL ได้รับและวิเคราะห์โดยซอฟต์แวร์ GenePix Pro 6.0 (อุปกรณ์โมเลกุล, ซันนี่เวล, แคลิฟอร์เนีย)

รูปที่ 1. พลวัตตามยาวของการตอบสนองของแอนติบอดีในผู้ป่วยโควิด-19 แผนผังการออกแบบการศึกษา มีผู้ติดเชื้อ SARS–CoV–2 ทั้งหมด 31 ราย และผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 20 รายเข้าร่วมในการศึกษานี้ การเก็บตัวอย่างซีรั่มดำเนินการตามยาว ณ จุดเวลาต่างๆ สำหรับผู้ป่วย 20 ราย ในกลุ่มบุคคลที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2 31 ราย ในขณะที่ทำการสุ่มตัวอย่าง ณ จุดเวลาเดียวสำหรับผู้ป่วยอีก 11 ราย มีการแสดงรายการจำนวนผู้เข้าร่วมและตัวอย่างซีรั่มที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์ต่างๆ B และ C ตัวอย่างซีรั่มทั้งหมด 101 ตัวอย่างจากผู้ป่วยโควิด-19 จำนวน 31 รายได้รับการทดสอบโดย ELISA สำหรับแอนติบอดีต่อโปรตีน SARS-CoV-2 N (B) และ S โปรตีน (C) ซึ่งจับกับ IgG แอนติบอดีที่จุดเวลาต่างกัน หลังจากเริ่มมีอาการ (วัน 1-30, n 5 37; วัน 31-61, n 5 18; วัน 100-150, n 5 21; วัน {{21 }}, น 5 25) ตัวอย่างเซรั่มจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 20 รายถูกรวมไว้เป็นกลุ่มควบคุม D, NT50 เทียบกับไวรัสหลอก SARS-CoV-2 เมื่อเวลาผ่านไปคำนวณโดยการถดถอยแบบไม่เชิงเส้น E, การกระจายของกิจกรรมการทำให้เป็นกลางในซีรั่มในผู้ป่วยโควิด-19 ณ จุดเวลาที่ระบุหลังจากแสดงอาการ ตัวอย่างที่มีไทเทอร์ NT50 ต่ำกว่า 20 ถูกกำหนดว่าไม่มีการทำให้เป็นกลาง

การวิเคราะห์ข้อมูลไมโครอาร์เรย์เปปไทด์

ข้อมูล IgG และ IgM ได้รับการวิเคราะห์ตามลำดับ ความเข้มของสัญญาณของแต่ละจุดถูกกำหนดให้เป็นพื้นหน้าลบด้วยพื้นหลัง และเฉลี่ยจุดสามจุดสำหรับเปปไทด์แต่ละตัว ค่าจุดตัดสำหรับการตอบสนองเปปไทด์ที่เป็นบวกของตัวอย่าง COVID-19 ถูกตั้งค่าเป็นสองเท่าของความเข้มของสัญญาณของกลุ่มควบคุมผู้ให้ที่มีสุขภาพดี เปปไทด์ที่มีอัตราบวกมากกว่า 80% ในกลุ่มตัวอย่างที่ทดสอบที่จุดเวลาการสุ่มตัวอย่างทั้ง 3 จุด (วัน 10-60, 100-150 และ 180-220 หลังการโจมตีของโรค) ถูกกำหนดให้เป็นเปปไทด์และเปปไทด์ที่โดดเด่นและคงอยู่ด้วย ความถี่การตอบสนองเชิงบวกที่สูงกว่า 60% ในทุกจุดเวลา 3- ถือเป็นความถี่รองและต่อเนื่อง คำนวณความเข้มของสัญญาณเฉลี่ยของแต่ละเปปไทด์ในกลุ่มจุดเวลาสุ่มตัวอย่าง 3 กลุ่ม เปปไทด์ที่แสดงความเข้มของสัญญาณสูง (สูงกว่าค่าเฉลี่ย 1 SD ของความเข้มของสัญญาณของตัวอย่างที่ทดสอบทั้งหมด) ก็ถูกเลือกเช่นกัน การประมวลผลและการวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยซอฟต์แวร์ R v3.6.3 (https://www.r-project.org/) และการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณที่มีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มจุดเวลาการสุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกันได้รับการประเมินโดยอิงจาก Limma ความแตกต่างกับ P < .05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ

การสร้างภูมิคุ้มกันให้กับหนู

หนู BALB/c ตัวเมียอายุ 6 ถึง 8 สัปดาห์ถูกซื้อจากเทคโนโลยีชีวภาพ Beijing Vitalstar (ปักกิ่ง, จีน) หนูทุกตัวถูกเก็บไว้ในสิ่งอำนวยความสะดวกปลอดเชื้อโรคโดยเฉพาะ และการศึกษาในสัตว์ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลและการใช้สัตว์ประจำสถาบันของมหาวิทยาลัยแพทย์เทียนจิน (เทียนจิน ประเทศจีน) สำหรับการสร้างภูมิคุ้มกัน กลุ่มของหนู (n 5 5) ถูกฉีดเข้ากล้ามด้วย 25 มก. ต่อโดสของเปปไทด์แต่ละตัว (เปปไทด์ 318, 356, 510 และ 530 ตามลำดับ) ผสมกับสารส้ม 50 มก. (InvivoGen, ซานดิเอโก, แคลิฟอร์เนีย) และสารเสริม CpG 10 มก. และเพิ่มขึ้นสองครั้งด้วยเปปไทด์ 50 มก. ต่อโดสเมื่อมีสารเสริมทุก ๆ 2- สัปดาห์ การฉีดวัคซีนด้วยสารเสริมเพียงอย่างเดียวทำหน้าที่เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ ซีรั่มถูกรวบรวมจากหนูที่ได้รับภูมิคุ้มกันในวันที่ 10 หรือวันที่ 14 หลังจากการฉีดวัคซีนครั้งที่สองและสาม

การวิเคราะห์ทางสถิติและโครงสร้าง

กราฟทั้งหมดถูกพล็อตโดย GraphPad Prism การเปรียบเทียบทางสถิติระหว่างกลุ่มในรูปที่ 1, 2 และ 4 ดำเนินการโดย 1- วิธี ANOVA ด้วยการเปรียบเทียบแบบพหุคูณของ Tukey ความสัมพันธ์ที่แสดงในรูปที่ 1 รูปที่ E9 และรูปที่ E10 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์ที่ www.jacionline.org ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของเพียร์สัน ความแตกต่างกับ P < .05 ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติ โครงสร้างของสไปค์โปรตีน SARS-CoV-2 (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX และ PDB ID: 6ZGI) และโดเมนการลดขนาดของ SARS-CoV{{ 13}} โปรตีนนิวคลีโอแคปซิด (PDB ID: 6YUN) ถูกนำมาใช้เพื่อวิเคราะห์รายละเอียดเชิงโครงสร้างของอีพิโทปที่ระบุซึ่งตั้งอยู่บนโปรตีนสไปค์และโดเมนไดเมอไรเซชันของโปรตีนนิวคลีโอแคปซิด การจัดตำแหน่งและการวิเคราะห์ที่คล้ายคลึงกันระหว่างไวรัสโคโรนาของมนุษย์ต่างๆ ดำเนินการโดยอัลกอริทึม Clustal W ในซอฟต์แวร์ MEGA v10.1.6

ผลลัพธ์

การติดเชื้อ SARS-CoV-2 กระตุ้นให้เกิดการจับกับแอนติเจนที่จำเพาะและแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางอย่างยั่งยืน

เพื่อประเมินการตอบสนองของแอนติบอดีในระยะยาวหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 มีการเก็บตัวอย่างซีรั่ม 101 ตัวอย่างจากบุคคล 31 รายที่ติดเชื้อ SARS-CoV ที่ยืนยันด้วย PCR-2 (รูปที่ 1, A) ผู้เข้าร่วมการศึกษาประกอบด้วยผู้ป่วยโรคโควิดระดับปานกลาง-19 26 ราย 1 รายไม่มีอาการ 2 รายมีอาการเล็กน้อย และ 2 รายมีอาการรุนแรง (ดูตาราง E1 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์ที่ www.jacionline.org) ผู้ป่วยที่ลงทะเบียนในการศึกษานี้มีอายุระหว่าง 17 ถึง 66 ปี (อายุมัธยฐาน 45 ปี) โดยมีการกระจายตัวของเพศชาย (51.6%) และเพศหญิง (48.4%) ที่เท่ากันโดยประมาณ อาการที่พบบ่อยที่สุดในผู้เข้าร่วมการศึกษา ได้แก่ มีไข้ (83.9%) ไอ (67.7%) ปวดกล้ามเนื้อ (22.6%) และหนาวสั่น (22.6%) โดยมีระยะเวลาการเจ็บป่วยเฉลี่ย 15 วัน ตัวอย่างซีรั่มทั้งหมด 90 ตัวอย่างจากผู้ป่วยโควิด-19 จำนวน 20 รายถูกเก็บระหว่างการรักษาในโรงพยาบาลและการจำหน่ายหลังการฟื้นตัวที่หลายช่วงเวลาจนถึง 219 วันหลังจากเริ่มมีอาการ (รูปที่ 1, A และดูตาราง E2 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์) การสุ่มตัวอย่างจากผู้เข้าร่วมอีก 11 คนดำเนินการที่จุดเวลาเดียวระหว่างการพักฟื้นช่วงปลาย (วันที่ 122 ถึง 214 หลังจากเริ่มมีอาการ) นอกจากนี้ ตัวอย่างจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 20 รายซึ่งมีอายุและการกระจายเพศตรงกันถูกรวมไว้เป็นกลุ่มควบคุม (ตาราง E1) แอนติบอดี IgG ที่จำเพาะต่อแอนติเจนในตัวอย่างซีรัมถูกหาปริมาณโดย ELISA ที่เคลือบล่วงหน้าด้วยโปรตีน N หรือ S โปรตีน SARS-CoV-2 เมื่อเปรียบเทียบกับผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี ทั้งแอนติบอดีต่อต้าน N และต่อต้าน S IgG ได้รับการพัฒนาในผู้ป่วยโควิด-19 ภายใน 30 วันหลังจากเริ่มมีอาการ โดยมีไทเทอร์จุดสิ้นสุดเฉลี่ยทางเรขาคณิตที่ 4.10 (log10 anti-N IgG) และ 4.20 (log10 anti-S IgG) (รูปที่ 1, B และ C; และดูตาราง E3 ใน Online Repository ที่ www. jacionline.org; รูปที่ E1, A และ B; และรูปที่ E2) ซึ่งสอดคล้องกับข้อสังเกตก่อนหน้านี้ว่า seroconversion เกิดขึ้นที่ 1 ถึง 2 สัปดาห์หลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 5,38 หลังจากนั้น ระดับไทเตอร์ของแอนติบอดีที่จับกับแอนติเจนจะลดลงจนถึงระดับที่แตกต่างกันเมื่อเวลาผ่านไป ระดับแอนติบอดีต่อต้าน N IgG ที่ลดลงอย่างรวดเร็วและอย่างมากถูกพบในผู้ป่วยโควิด-19 ในขณะที่ระดับแอนติบอดีต่อต้าน S IgG ที่สูงขึ้นจะถูกคงไว้จนถึง 180 ถึง 220 วันหลังจากเริ่มมีอาการ เมื่อเปรียบเทียบกับผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี (รูปที่ 1, B และ ค) การวิเคราะห์สหสัมพันธ์เผยให้เห็นความสัมพันธ์ที่สำคัญระหว่างไทเทอร์แอนติ-N IgG ของ log10 และไทเทอร์แอนติ-S IgG (r 5 0.50 และ P < .001; รูปที่ 1, F) นอกเหนือจากการหาปริมาณแอนติบอดีที่มีผลผูกพันแล้ว พลวัตของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในการทำงานของบุคคลที่มีเชื้อโควิด-19 ยังถูกกำหนดเพิ่มเติมโดยใช้ SARS-CoV เทียม-2 ตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยมากกว่า 95% (35/37) ที่เก็บระหว่าง 4 ถึง 30 วันหลังจากเริ่มแสดงอาการ มีฤทธิ์ต่อต้านโรค SARS-CoV{89}} ที่รุนแรง และตัวอย่างจำนวนมากแสดงอาการปานกลาง (NT50 80-320 ) ถึงฤทธิ์การทำให้เป็นกลางอย่างเข้มข้น (NT50 > 320) (รูปที่ 1, D และ E) สิ่งที่น่าสังเกตคือ ตัวอย่าง 2 ตัวอย่างที่ไม่มีหรือมีค่าไทเทอร์เป็นกลางต่ำ (NT50 ที่การเจือจางในซีรั่มขั้นต่ำ 1:20) จะถูกรวบรวมในช่วงแรกหลังการติดเชื้อไวรัส (ในวันที่ 4 และวันที่ 11 หลังจากเริ่มมีอาการ) ก่อนที่จะกระตุ้นแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง (รูปที่ 1, D และรูปที่ E1, C) แม้ว่าระดับแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของ SARS-CoV{103}} ในผู้ป่วยโควิด{104}} จะลดลงเมื่อเวลาผ่านไป แต่ตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยส่วนใหญ่ (24/25) ที่ได้รับในช่วง 180 ถึง 220 วันหลังจากเริ่มแสดงอาการ ยังคงมีผลบวกอย่างต่อเนื่องสำหรับการวางตัวเป็นกลางต่อโรคซาร์ส- CoV-2 โดยมีค่าเฉลี่ยไตเตอร์ NT50 ลดลง 2.8- เท่า (รูปที่ 1, D และ E; ตาราง E3; รูปที่ E3) ตามที่คาดไว้ เมื่อเปรียบเทียบกับแอนติบอดีต่อต้าน N IgG มีการระบุความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งยิ่งขึ้นระหว่างไทเทอร์ IgG ที่จับกับ SARS-CoV-2 และไทเทอร์แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลาง (r 5 0.61 และ P < .001; รูปที่ 1 , G และ H) ซึ่งสอดคล้องกับการค้นพบว่าโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 เป็นเป้าหมายหลักของการทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง S โปรตีนของ SARS-CoV-2 มีความคล้ายคลึงกันในลำดับสูงร่วมกับ SARS-CoV ที่มีความรุนแรงสูง (เอกลักษณ์ของลำดับ 76%) และแสดงให้เห็นลำดับที่คล้ายคลึงกันกับ MERS-CoV (เอกลักษณ์ของลำดับ 34%) มีรายงานปฏิกิริยาข้ามทางซีโรโลจิกในโคโรนาไวรัส 8,10,28,29 อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับการประเมินติดตามผลระยะยาวของปฏิกิริยาข้ามของแอนติบอดีต่อ SARS-CoV-2 ต่อโคโรนาไวรัสอื่นๆ ยังมีจำกัด เราพิจารณาแอนติบอดีที่มีผลผูกพันและเป็นกลางข้ามในซีรั่มตามยาวจากบุคคลที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2 ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่ามากกว่า 80% ของตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยจับกับ S โปรตีนของ SARS-CoV และ/หรือ MERS-CoV ภายใน 1 เดือนหลังจากเริ่มมีอาการ โดย 27% ของตัวอย่างแสดงปฏิกิริยาข้ามคู่ (รูปที่ 1, I) ปฏิกิริยาต่อโปรตีน SARS-CoV S มีสัดส่วนที่มากกว่า (73%) มากกว่า MERS-CoV (35%) ในกลุ่มตัวอย่างที่ทดสอบในช่วงแรกๆ (1-30 วันหลังจากเริ่มมีอาการ) (รูปที่ 1, I) แอนติบอดีที่จับข้ามคู่และแอนติบอดีที่จับข้าม SARS-CoV แสดงการลดลงอย่างค่อยเป็นค่อยไปเมื่อเวลาผ่านไป โดยมีเพียง 8% ของการจับข้ามคู่และ 20% ของการจับข้ามเดียวของ SARS-CoV ที่ 180 ถึง 220 วันหลังจากเริ่มมีอาการ (รูปที่ 1) , I; ใน Online Repository ที่ www.jasionline.org โปรดดูรูปที่ E4, A; รูปที่ E5, A; และรูปที่ E6 ใน Online Repository ของบทความนี้ที่ www.jacionline.org) น่าประหลาดใจที่ผลบวกของแอนติบอดีต่อโปรตีน MERS-CoV S ยังคงค่อนข้างคงที่เมื่อเวลาผ่านไป (รูปที่ 1, I) แตกต่างจากความสามารถในการจับข้ามที่สูง มีเพียงตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยจำนวนเล็กน้อยที่เป็นกลางระหว่าง SARS-CoV และ/หรือ MERS-CoV pseudoviruses (รูปที่ 1, I; รูปที่ E4, B; รูปที่ E5, B; และดูรูปที่ E7 ใน พื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์) ประมาณ 27% ของกลุ่มตัวอย่างที่เก็บที่ 1 ถึง 30 วันหลังจากเริ่มมีอาการ มีฤทธิ์ทำให้เป็นกลาง และจำนวนนี้ลดลงเหลือ 20% ที่ 180 ถึง 220 วัน โดยมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมากในกิจกรรมการทำให้เป็นกลางข้ามของ SARS-CoV (รูปที่ 1, I ). สัดส่วนที่สูงกว่าของตัวอย่าง SARSCoV ที่ผ่านการทำให้เป็นกลางข้ามมากกว่า MERS-CoV ภายใน 30 วันหลังจากเริ่มมีอาการ เป็นที่น่าสังเกตว่าแม้จะมีสัดส่วนที่ใกล้เคียงกันของตัวอย่างที่แสดงการทำให้เป็นกลางข้าม SARS-CoV และ MERS-CoV แต่ค่า NT50 สำหรับ MERS-CoV นั้นต่ำกว่าค่าของ SARSCoV มากในกลุ่มตัวอย่างซีรั่มที่เป็นผลบวกต่อการทำให้เป็นกลางข้าม (รูปที่ E4, B; รูปที่ E5, B; รูปที่ E7)

cistanche พืชเพิ่มระบบภูมิคุ้มกัน

การติดเชื้อ SARS-CoV-2 ส่งผลให้เกิดการกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์

เพื่อระบุลักษณะการเปลี่ยนแปลงทางภูมิคุ้มกันอย่างครอบคลุมหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 เราได้ประเมินการเปลี่ยนแปลงของไดนามิกของระดับไซโตไคน์ในซีรั่มของผู้ป่วยโควิด-19 เพิ่มเติม ตัวอย่างซีรั่มตามยาวจำนวนห้าสิบห้าตัวอย่างที่ถูกเก็บภายใน 2 เดือนแรกของการเริ่มแสดงอาการ ถูกนำมาใช้ในการตรวจหาการผลิตไซโตไคน์โดยไมโครอาร์เรย์ที่ใช้โปรตีน มีการสังเกตระดับซีรั่มที่เพิ่มขึ้นของไซโตไคน์หลายชนิดในช่วงเดือนแรกของการเจ็บป่วย รวมถึง IL-1a (การอักเสบที่รุนแรง), IL-6 (การอักเสบที่รุนแรง) และ IL-10 (การต้านการอักเสบ) ) ซึ่งเชื่อมโยงกับกลุ่มอาการการปล่อยไซโตไคน์ในกรณีโควิด-19 ที่รุนแรง 39,40 เช่นเดียวกับ IFN-g (ประเภท TH1) และ IL-4 (ประเภท TH2) (รูปที่ 2, A, และรูปที่ E8 ใน Online Repository มีอยู่ที่ www.jasionline.org) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ระดับซีรั่มของ IL-6, IL-10 และ IFN-g เพิ่มขึ้นภายใน 15 วันหลังจากเริ่มมีอาการในผู้ป่วย และลดลงในระยะต่อมา ในขณะที่มีการปลดปล่อย IL-1 a และ IL-4 แสดงให้เห็นว่าเพิ่มขึ้นอย่างน่าทึ่งในช่วง 16 ถึง 30 วันนับจากวันที่เริ่มมีอาการ และลดลงอย่างรวดเร็วสู่ภาวะปกติหลังจากนั้น (รูปที่ 2, A) การวิเคราะห์ความสัมพันธ์บ่งชี้ความสัมพันธ์เชิงเส้นที่อ่อนแอหรือไม่มีเลยระหว่างการตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะต่อแอนติเจนและการผลิตไซโตไคน์หลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 แม้ว่าจะมีการสังเกตนัยสำคัญทางสถิติระหว่างระดับของ IL-10 และ SARS-CoV{{ 34}} แอนติบอดีในการจับโปรตีน N (r 5 0.321 และ P < .05) ระหว่างการผลิต IL-1b และแอนติบอดีในการจับโปรตีน S (r 5 20.335 และ P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

การทำแผนที่เอพิโทปทั่วทั้งโปรตีโอมระบุเอพิโทปที่โดดเด่นซึ่งเป็นสื่อกลางในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายอย่างต่อเนื่องในผู้ป่วยโควิด-19

เพื่อให้ระบุคุณลักษณะที่แตกต่างของภูมิคุ้มกันทางร่างกายต่อ SARS-CoV-2 ได้ดีขึ้น เมื่อเวลาผ่านไป เราได้ใช้การทำแผนที่เอพิโทปทั้งโปรตีโอมโดยใช้ไมโครอาร์เรย์ที่มีเปปไทด์เป็นพื้นฐาน คลังเปปไทด์ที่ครอบคลุมโปรตีโอม SARS-CoV-2 ถูกสร้างขึ้นและตรึงไว้บนสไลด์ โดยแต่ละเปปไทด์มีความยาว 15 aa โดยมีการทับซ้อนกัน 11 aa ตัวอย่างซีรั่มตามยาวทั้งหมด 51 ตัวอย่างจากผู้ป่วย 19 รายที่ไม่มีอาการ (n 5 1) หรือไม่รุนแรง (n 5 2) ถึงปานกลาง (n 5 15) หรือรุนแรง (n 5 1 ) การทดสอบการติดเชื้อ SARS-CoV-2 (ตารางที่ 1) เพื่อให้ได้จำนวนตัวอย่าง ช่วงเวลา และจุดเวลาที่ค่อนข้างสมดุล ตัวอย่างจะถูกเก็บตามลำดับที่ 2 หรือ 3 จุดเวลาจากผู้เข้าร่วม COVID-19 แต่ละคน ในช่วงตั้งแต่ 16 ถึง 219 วันหลังจากเริ่มมีอาการ ผู้ป่วยส่วนใหญ่ (18/19) สร้างแอนติบอดีที่เป็นกลางหลังการติดเชื้อไวรัส ยกเว้นบุคคลเดี่ยวที่ไม่มีอาการติดเชื้อ (ตารางที่ 1) ตามจุดเวลาการสุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกัน ตัวอย่างถูกแบ่งออกเป็น 3 กลุ่ม: วัน 10-60 (n 5 18), วัน 100-150 (n 5 18) และวัน {{28 }} (น 5 15) การประเมินระยะยาวของโปรไฟล์อีพิโทปของไวรัสในผู้ป่วยโควิด-19 ดำเนินการสำหรับแอนติบอดี IgG และ IgM ในซีรั่ม โดยมีซีรั่มรวมจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 20 รายที่ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ การใช้โปรตีโอมไมโครอาร์เรย์ของ SARS-CoV-2 จลนพลศาสตร์ของการตอบสนองของแอนติบอดีที่จับเปปไทด์ถูกกำหนดและวิเคราะห์สำหรับ (1) ความเข้มของสัญญาณการจับ และ (2) เปอร์เซ็นต์ของตัวอย่างที่มีปฏิกิริยาเชิงบวก (อัตราที่เป็นบวก) สำหรับเพปไทด์แต่ละตัว . ตามค่าจุดตัดสำหรับการตอบสนองการจับเปปไทด์เชิงบวก ซึ่งตั้งค่าเป็นสองเท่าของความเข้มของสัญญาณของการควบคุมเชิงลบ เราระบุเปปไทด์เชิงบวกทั้งหมด 460 รายการสำหรับ IgG และเปปไทด์เชิงบวก 479 รายการสำหรับ IgM ที่มีปฏิกิริยากับผู้ป่วยอย่างน้อย 1 ราย ตัวอย่างเซรั่ม จำนวนเปปไทด์ที่เป็นบวกและการกระจายของการตอบสนองในกรอบการอ่านแบบเปิด (ORF) ที่แตกต่างกันของ SARS-CoV-2 ค่อนข้างคงที่ในกลุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกัน โดยมีแนวโน้มที่จำนวนเปปไทด์เชิงบวกจะลดลงเล็กน้อยเมื่อเวลาผ่านไป (รูปที่ 3, ก) ปฏิกิริยาส่วนใหญ่ถูกระบุในโพลีโปรตีนแบบจำลอง ORF1ab ซึ่งเป็น ORF ที่ใหญ่ที่สุด ซึ่งครอบคลุมมากกว่าสองในสามของจีโนมทั้งหมด (รูปที่ 3, A) สิ่งที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นความสัมพันธ์ในระดับปานกลางถึงสูงระหว่างการตอบสนองที่มีผลผูกพันกับเปปไทด์เชิงบวกและระดับไซโตไคน์ในซีรั่มในช่วงต้นหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 (วัน 10-60 หลังจากเริ่มมีอาการ ดูรูปที่ E10 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์ที่ www.jasionline.org) จำนวนของเปปไทด์ที่มีผลผูกพันเชิงบวกสำหรับ IgM แสดงให้เห็นว่าสัมพันธ์กับระดับซีรั่มของ IL-6 และ IL-10; ในทำนองเดียวกัน ความเข้มของสัญญาณโดยเฉลี่ยของเปปไทด์ที่มีปฏิกิริยาทั้งหมดและของเปปไทด์ที่มีผลผูกพันกับ ORF1ab สำหรับ IgM นำเสนอความสัมพันธ์เชิงบวกกับการผลิต IL -6 และ IFN-g ในตัวอย่างซีรั่ม ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงของระดับไซโตไคน์หลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 อาจส่งผลต่อขนาดและความกว้างของอีพิโทปที่รับรู้โดยการตอบสนองทางร่างกายที่จำเพาะต่อแอนติเจน จากการระบุอีพิโทปที่เป็นบวก เรายังเลือกอีพิโทปที่พบบ่อยที่สุดที่ยังคงมีปฏิกิริยาอย่างต่อเนื่องในตัวอย่างมากกว่า 80% ของ COVID-19 ในกลุ่มตัวอย่างแต่ละกลุ่มจาก 3 กลุ่ม (เรียกว่าอีพิโทปที่โดดเด่นและถาวร) ผลลัพธ์เปิดเผยว่าเอพิโทปที่โดดเด่นอย่างมากเหล่านี้สามารถเป็นสื่อกลางในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในระยะยาวอยู่ที่โพลีโปรตีนและ S โปรตีน SARS-CoV-2 ORF1ab และ S โปรตีน โดยมีอีพิโทปจำนวนมากที่จดจำโดยแอนติบอดี IgM (n 5 33) มากกว่า แอนติบอดี IgG (n 5 10) (รูปที่ 3, B และตาราง II; ดูรูปที่ E11 และรูปที่ E12 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์ที่ www.jacionline.org) โพลีโปรตีน ORF1ab มีจำนวนอีพิโทปที่โดดเด่นสูงสุดซึ่งเป็นสื่อกลางการตอบสนองระยะยาว และอีพิโทปถูกกระจายอย่างกว้างในบริเวณของโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้าง (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14 และ nbsp 16 (ตารางที่ 2) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราได้ระบุเอพิโทปที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง 1 ชนิดคือ 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815) ที่สามารถรับรู้ได้โดยแอนติบอดี IgG และ IgM จากผู้ป่วยโรคโควิด 100%-19 โดยไม่คำนึงถึงจุดเวลาการเก็บตัวอย่างซีรัม (รูปที่ 3, B และตาราง II ดูรูปที่ E13 และรูปที่ E14 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์) เปปไทด์ที่มีปฏิกิริยาสูงนี้ตั้งอยู่ภายในบริเวณเฮลิเคส (nsp 13) ของโพลีโปรตีน ORF1ab ซึ่งจำเป็นสำหรับการคลี่คลายเทมเพลต RNA ที่มีเกลียวคู่ระหว่างการจำลองแบบ SARS-CoV-2 41 ในบรรดาเปปไทด์ที่เลือกของ ORF1ab มีเปปไทด์ที่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง 2 ชนิด ที่มีความเข้มของสัญญาณเฉลี่ยสูงสุดที่แอนติบอดี IgG รับรู้ หมายเลข 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) และหมายเลข 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815) ทั้งคู่อยู่ที่ nsp 13 สำหรับการตอบสนองของ IgM เปปไทด์ 685 (ORF1ab, aa {249-263) บน nsp 2 และเปปไทด์ 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) บน nsp 13 นำเสนอความเข้มในการจับที่แข็งแกร่งที่สุด (รูปที่ 3, B) เมื่อพิจารณาถึงความแปรผันของสัญญาณพื้นฐาน (ซีรั่มรวมจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี) สำหรับเปปไทด์ที่แตกต่างกัน (รูปที่ 3, B) เราได้คำนวณการเปลี่ยนแปลงความเข้มของสัญญาณเพิ่มเติมเกี่ยวกับเปปไทด์คีย์แต่ละตัวซึ่งสัมพันธ์กับกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ 2073 (การจับ IgG) และเปปไทด์ 1985 (การจับ IgM) ที่ตั้งอยู่บนบริเวณ nsp 13 คงไว้ซึ่งความเข้มในการจับเปปไทด์สูงสุด (การเปลี่ยนแปลงแบบพับ) ในซีรั่มของผู้ป่วยที่รวบรวมได้นานถึง 180 ถึง 220 วัน (รูปที่ E13 และรูปที่ E14)

รูปที่ 2 จลนศาสตร์ของการผลิตไซโตไคน์ในผู้ป่วยโควิด-19 ตอบ ระดับการผลิตไซโตไคน์ในตัวอย่างซีรัม 55 ตัวอย่างที่รวบรวมจากผู้ป่วยโควิด-19 16 รายในระหว่างระยะเฉียบพลันและระยะเริ่มแรกของการพักฟื้นถูกตรวจพบโดย ELISA ที่ใช้โปรตีน-ไมโครอาร์เรย์ (วัน 1-15, n 5 11; วัน 16-30, n 5 26; วัน 31-61, n 5 18; ผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี n 5 20) แต่ละจุดแสดงถึงตัวอย่างซีรั่มแต่ละตัว เส้นประแสดงถึงขีดจำกัดของการตรวจจับ นัยสำคัญทางสถิติถูกกำหนดโดย 1- วิธีการวิเคราะห์ความแปรปรวนด้วยการเปรียบเทียบหลายรายการของทูคีย์ *P < .05, **P < .01 และ ****P < .0001 B, การเปลี่ยนแปลงระดับการผลิตไซโตไคน์แต่ละระดับในผู้ป่วยโควิด-19 ที่แสดงใน (A) เทียบกับค่าเฉลี่ยของตัวอย่าง 20 ตัวอย่างจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี แต่ละคอลัมน์ระบุตัวอย่างซีรัมที่แตกต่างกันซึ่งรวบรวมจากจุดเวลาที่ระบุหลังจากเริ่มมีอาการ แต่ละแถวแสดงถึงไซโตไคน์ 1 ตัวที่ทดสอบ

ตารางที่ 1 ลักษณะเฉพาะของผู้ป่วยโควิด-19 และกลุ่มตัวอย่างในการทำแผนที่อีพิโทป

รูปที่ 3 การจดจำ IgM และ IgG ของอีพิโทปที่โดดเด่นซึ่งมีส่วนทำให้เกิดการตอบสนองของแอนติบอดีในระยะยาวในบุคคลที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2 การวิเคราะห์ระยะยาวของการจดจำซีรั่มของอีพิโทปในผู้ติดเชื้อโควิด 19 ราย-19 โดยใช้เปปไทด์ไมโครอาร์เรย์ที่ปกคลุมโปรตีโอมของ SARS-CoV-2 ค่าจุดตัดสำหรับการตอบสนองเชิงบวกของการจับเปปไทด์ในตัวอย่างผู้ป่วย (n 5 51) ​​ถูกตั้งค่าเป็นสองเท่าของความเข้มของสัญญาณของซีรั่มที่รวมกลุ่มจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี 20 ราย A, การนับเปปไทด์และการกระจายของเปปไทด์การจับเชิงบวกที่สามารถตรวจพบได้ในตัวอย่าง 1 ตัวหรือมากกว่าที่รวบรวมที่ 10-60 วัน (n 5 18), 100-150 วัน (n 5 18) และ 180- 220 วัน (n 5 15) หลังจากเริ่มเป็นโรค ตัวเลขบ่งชี้ IgG และ IgM อีพิโทปที่ระบุทั้งหมดจาก ORF แต่ละตัว B, ความเข้มของสัญญาณของ IgG และ IgM อีพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่ (แกน x) ซึ่งมีปฏิกิริยาอย่างยั่งยืนในตัวอย่างมากกว่า 80% ภายในจุดเวลาสุ่มตัวอย่างทั้ง 3 จุด แต่ละจุดบ่งบอกถึงซีรั่มรวมจากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี (ด้านบน) หรือตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยที่แตกต่างกันซึ่งรวบรวมจากจุดเวลาที่ระบุหลังจากเริ่มมีอาการ E, โปรตีนเอนเวโลป

TABLE II. Epitopes with >อัตราบวก 80% ที่จุดเวลาสุ่มตัวอย่างทั้ง 3 จุด

เอพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่ของโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 อยู่ที่หน่วยย่อย NTD และ S2

มีการระบุเอพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่ทั้งหมด 4 รายการจากโปรตีน S ของ SARSCoV-2: เปปไทด์ 318 (S, aa 45-59) และเปปไทด์ 356 (S, aa 197-211) ซึ่งอยู่ ภายในภูมิภาค NTD เปปไทด์ 510 (S, aa 813-827) ซึ่งครอบคลุมตำแหน่งการตัดแยกของ S2 และส่วนของ FP ของหน่วยย่อย S2 และเปปไทด์ 530 (S, aa 893-907) ซึ่งตั้งอยู่ที่บริเวณที่เชื่อมต่อกัน ระหว่าง FP และขอบเขตการทำซ้ำ heptad แรกของหน่วยย่อย S2 (รูปที่ 3, B และตาราง II) ในบรรดาเปปไทด์หลักเหล่านี้ของโปรตีน S ที่เราเลือก เปปไทด์ 318 ซึ่งอยู่ที่ NTD ของโปรตีน S มีความเข้มข้นในการยึดเกาะที่แข็งแกร่งที่สุด (การเปลี่ยนแปลงของรอยพับสัมพันธ์กับส่วนควบคุม; รูปที่ E13 และรูปที่ E14) การวิเคราะห์โครงสร้างเปิดเผยว่าเอพิโทปเหล่านี้ถูกสัมผัสอย่างเต็มที่บนพื้นผิวของโปรตีนโมโนเมอร์ S; อย่างไรก็ตาม epitopes ที่ตกค้างบางส่วนสำหรับเปปไทด์ 318, 356 และ 530 ถูกซ่อนอยู่ใต้พื้นผิวของโปรตีน trimeric S (รูปที่ 4, A และ B) แสดงให้เห็นว่าทั้งโครงสร้าง S monomer และ trimer ได้รับการยอมรับอย่างมีประสิทธิภาพโดยระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ภายใต้เงื่อนไขบางประการ สถานการณ์. โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เปปไทด์ 318 ห่วง 2 ส่วน (aa 45-46 และ aa 56-59) ถูกเปิดเผยบนโปรตีน trimeric S โดยมี b-strand ตรงกลางฝังอยู่ข้างใน และสารตกค้างของเปปไทด์ 356 ส่วนใหญ่สามารถเข้าถึงได้บนพื้นผิว รวมถึงแกน b-strand (aa 203-209) และส่วนของลูป (aa 210-211) เปปไทด์ 510 มีจุดแตกแยก S2' และเกลียวกลางของ FP ซึ่งทั้งสองจุดปรากฏอย่างสมบูรณ์บนพื้นผิวของโปรตีน S; สิ่งตกค้างของเปปไทด์ 530 ส่วนใหญ่จะเป็นความลับ โดยมีเพียงส่วนเล็กๆ ของลูป (aa 893-895) ที่สัมผัสกับโปรตีน Trimeric S (รูปที่ 4, C) การวิเคราะห์ลำดับที่คล้ายคลึงกันในหมู่โคโรนาไวรัสของมนุษย์ทั่วไป 7 ชนิดเปิดเผยว่าเอพิโทป 2 ตัวที่อยู่ในหน่วยย่อย S2 (เปปไทด์ 510 และ 530) แบ่งปันเอกลักษณ์ลำดับสูงกับโคโรนาไวรัสอื่นๆ โดยเสนอแนะปฏิกิริยาข้ามทางซีรั่มวิทยาที่กำหนดเป้าหมายเอพิโทปเหล่านี้ท่ามกลางโคโรนาไวรัสของมนุษย์ (รูปที่ 4, D) ลำดับของเปปไทด์ 318 มีความคล้ายคลึงกันสูงกับ SARSCoV ในขณะที่ลำดับที่คล้ายคลึงกันสำหรับเปปไทด์ 356 ในระดับต่ำนั้นแสดงในหมู่โคโรนาไวรัส ซึ่งบ่งชี้ถึงการตอบสนองของแอนติบอดีจำเพาะของ SARS-CoV-2 ที่กำหนดเป้าหมายบริเวณนี้ (รูปที่ 4, D) เมื่อพิจารณาถึงสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ที่เกิดขึ้นใหม่และการหมุนเวียนทั่วโลก เราได้ดำเนินการจัดลำดับเพิ่มเติมโดยคำนึงถึงเอพิโทปที่สำคัญของโปรตีน S ระหว่างสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ในระยะเริ่มแรก (หวู่ฮั่น-หู{{52} }) และ 5 ตัวแปรที่น่ากังวล (Alpha, Beta, Gamma, Delta และ Omicron) รวมถึง 2 ตัวแปรที่น่าสนใจ (Lambda และ Mu) ตามการจำแนกประเภทไวรัสขององค์การอนามัยโลก (อัปเดตเมื่อวันที่ 30 พฤศจิกายน 2021 ). ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าลำดับของเอพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่เหล่านี้เกือบจะเหมือนกันในบรรดาตัวแปรที่วิเคราะห์ ยกเว้นการกลายพันธุ์ N211I เดี่ยวที่ระบุในตัวแปร Omicron ใหม่ (รูปที่ 4, E) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่าแอนติบอดีที่สร้างโดยสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ในระยะเริ่มแรกอาจจดจำตัวแปรที่หมุนเวียนในปัจจุบันได้อย่างสม่ำเสมอ และอีพิโทปที่โดดเด่นเหล่านี้อาจเป็นสื่อกลางในการตอบสนองของแอนติบอดีในระยะยาวที่ยั่งยืนต่อการติดเชื้อของ SARS-CoV-2 ตัวแปร เพื่อกำหนดลักษณะทางภูมิคุ้มกันของเอพิโทปที่ระบุเพิ่มเติมบนโปรตีน S และเพื่อตรวจสอบเพิ่มเติมถึงมูลค่าที่เป็นไปได้ของเอพิโทป S-โปรตีนเหล่านี้ในฐานะผู้สมัครรับวัคซีนเปปไทด์ เราทำการศึกษาการสร้างภูมิคุ้มกันของหนูโดยใช้เปปไทด์ที่เลือก หนู BALB/c ได้รับการฉีดวัคซีน 3 ครั้งด้วยเปปไทด์แต่ละตัวต่อหน้าสารส้มและสารเสริม CpG (รูปที่ 4, F) ในบรรดาเปปไทด์ 4 ชนิดที่เลือก การฉีดวัคซีนด้วยเปปไทด์ 356 กระตุ้นแอนติบอดีจำเพาะแอนติเจนหลังจากโดสที่สองและสาม (รูปที่ 4, G) ผลลัพธ์ของการทดสอบการทำให้เป็นกลางในซีรัมเผยให้เห็นว่าการสร้างภูมิคุ้มกันด้วยเพปไทด์เชิงเส้นไม่ได้สร้างแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต่อ SARS-CoV-2 ในระดับที่มีนัยสำคัญ (รูปที่ 4, H) แสดงให้เห็นว่าเปปไทด์เชิงเส้นเหล่านี้ทำงานได้ไม่ดีในการกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่แข็งแกร่ง

โปรตีน N ของ SARS-CoV-2 ขาดเอพิโทปที่เกิดปฏิกิริยาส่วนใหญ่ซึ่งเป็นสื่อกลางในการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทนทานหลังการติดเชื้อไวรัส

การศึกษาจำนวนหนึ่งได้ชี้แจงถึงแอนติเจนที่มีศักยภาพของโปรตีน N ของ SARS-CoV-2 อย่างไรก็ตาม เราไม่สามารถระบุเอพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่ซึ่งอยู่ที่โปรตีน N บนพื้นฐานของเกณฑ์การคัดเลือกในปัจจุบัน (อัตราบวกสูงกว่า 80% ที่จุดเวลาสุ่มตัวอย่างทั้ง 3 จุด) สำหรับการประเมินโปรไฟล์อีพิโทปตามยาวของโปรตีน N ในบุคคลที่มีเชื้อ COVID-19 เราได้ดำเนินการคัดกรองอีพิโทปรอบที่สองซึ่งอิงตามข้อมูลที่ได้รับจากไมโครอาร์เรย์ของเปปไทด์สำหรับการเลือกอีพิโทปที่อยู่รองที่ยังคงมีปฏิกิริยาเชิงบวกอย่างต่อเนื่อง ในตัวอย่างมากกว่า 60% ของ COVID-19 สำหรับแต่ละจุดเวลาการสุ่มตัวอย่าง 3 จุด (เรียกว่าอีพิโทปแบบซับโดมิแนนต์และแบบถาวร) มีการระบุเอพิโทปย่อยและถาวรทั้งหมด 4 รายการของโปรตีน N ของ SARS-CoV-2 โดยในจำนวนนี้เปปไทด์ 2455 (N, aa 213-227) แสดงปฏิกิริยาต่อทั้งแอนติบอดี IgG และ IgM ใน COVID{{16 }} ผู้ป่วย โดยมีระดับความเข้มของสัญญาณค่อนข้างสูงกว่า (รูปที่ 5, A และ B และดูตารางที่ E4 ในพื้นที่เก็บข้อมูลออนไลน์ที่ www.jacionline.org) เปปไทด์ 2 ชนิดที่ทับซ้อนกัน ได้แก่ เปปไทด์ 2455 (N, aa 213-227) และเปปไทด์ 2456 (N, aa 217-231) อยู่ที่บริเวณตัวเชื่อมโยง Ser/Arg-rich ระหว่างโดเมนการจับ RNA ของเทอร์มินัล N และโดเมนการลดขนาดเทอร์มินัล C ของโปรตีน N เปปไทด์ 2482 (N, aa 321-335) และเปปไทด์ 2491 (N, aa 357-371) มีตำแหน่งทั้งหมดหรือบางส่วนภายในโดเมนไดเมอไรเซชันของโปรตีน N (ตาราง E4) เนื่องจากขาดโครงสร้าง 3- D ที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้างที่สมบูรณ์ของโปรตีน N เราจึงทำการวิเคราะห์เชิงโครงสร้างของอีพิโทปที่ระบุ 2 ตัวบนโครงสร้างไดเมอริกของโดเมนไดเมอไรเซชันที่ปลาย C สารตกค้างของเปปไทด์ 2482 ก่อตัวเป็นเกลียว b 2 เส้นซึ่งจัดเรียงในลักษณะตรงกันข้ามกันในส่วนต่อประสานการลดขนาด ในขณะที่ aa 357-364 ของเปปไทด์ 2491 ก่อตัวเป็นโครงสร้างแบบเกลียวซึ่งตั้งอยู่ที่ปลายตรงข้ามของไดเมอร์ (รูปที่ 5, C) . การจัดเรียงลำดับระหว่าง SARS-CoV-2 ในระยะเริ่มแรก (สายพันธุ์หวู่ฮั่น-Hu-1) และสายพันธุ์ที่เกิดขึ้นใหม่ 7 ชนิดเผยให้เห็นเพิ่มเติมว่าลำดับของเอพิโทปย่อยและแบบถาวรในโปรตีน N เกือบจะเหมือนกันในบรรดาตัวแปรที่หมุนเวียนอยู่ในปัจจุบัน โดยมี การแทนที่ G215C เดี่ยวของเปปไทด์ 2455 ที่เกิดขึ้นในตัวแปรเดลต้าและการกลายพันธุ์ G214C เดี่ยวของเปปไทด์ 2455 ที่ระบุในตัวแปรแลมบ์ดา ซึ่งเสนอแนะว่าแอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมายเปปไทด์เหล่านี้อาจจดจำแอนติเจนของสายพันธุ์ SARS-CoV-2 ที่เกิดขึ้นใหม่ (รูปที่ 5, D ).

รูปที่ 4 เอพิโทปที่โดดเด่นของโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ในแง่ของการเป็นสื่อกลางในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายที่คงทน A และ B ตำแหน่งของอีพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่บน 3- โครงสร้าง D ของโปรตีน S ที่เป็นมอนอเมอร์ (A) และไตรเมอริก (B) (PDB ID: 6VXX) อีพิโทปถูกเน้นด้วยสีเขียว (เปปไทด์ 356, aa 197-211), สีแดง (เปปไทด์ 318, aa 45-59), สีน้ำเงิน (เปปไทด์ 510, aa 813-827) และสีม่วง (เปปไทด์ 530, aa 893-907) ตามลำดับ โมโนเมอร์ S ทั้งสามตัวในรูปแบบปิดแสดงเป็นสีเทา ชมพู และฟ้า ตามลำดับ C, การวิเคราะห์โครงสร้างโดยละเอียดของอีพิโทปที่โดดเด่นในโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 บนสถานะปิดของ S ไตรเมอร์ (PDB ID: 6VXX) D การจัดเรียงลำดับของเอพิโทปที่ระบุในหมู่โคโรนาไวรัสของมนุษย์ทั่วไป สารตกค้างของอีพิโทปที่ได้รับการอนุรักษ์ระหว่าง SARS-CoV-2 และไวรัสโคโรนาอื่นๆ ของมนุษย์จะถูกแรเงาเป็นสีเทา E, การวิเคราะห์การอนุรักษ์อีพิโทปของ SARS-CoV-2 ในระยะเริ่มแรก (สายพันธุ์หวู่ฮั่น-หู-1) และ 7 สายพันธุ์ที่เกิดขึ้นใหม่ จุดสีดำแสดงถึงสิ่งตกค้างที่เหมือนกันระหว่างสายพันธุ์หวู่ฮั่น-หู-1 และสายพันธุ์ที่ระบุ

รูปที่ 5 อีพิโทปรองที่อยู่ที่โปรตีนนิวคลีโอแคปซิด SARS-CoV-2 มีความสามารถในการเป็นสื่อกลางการตอบสนองของแอนติบอดีที่คงอยู่ ความถี่การจดจำ A, IgG และ IgM ของเปปไทด์ย่อย (ปฏิกิริยาที่ทนทานในตัวอย่างมากกว่า 60%) ในกลุ่มตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยที่รวบรวม ณ จุดเวลาต่างๆ หลังจากเริ่มมีอาการ B, จลนพลศาสตร์ความเข้มของสัญญาณของเอพิโทปย่อยที่โดดเด่นที่ระบุเมื่อเวลาผ่านไป แต่ละจุดแสดงถึงตัวอย่างซีรั่มผู้ป่วยที่แตกต่างกันซึ่งได้รับจากผู้ป่วยโควิด-19 ณ จุดเวลาที่ระบุหลังจากเริ่มมีอาการ เส้นประแนวนอนบ่งบอกถึงค่าจุดตัดของการตอบสนองเชิงบวกสำหรับเปปไทด์แต่ละตัว C, การวิเคราะห์โครงสร้างโดยละเอียดของอีพิโทปบนโดเมนการลดขนาดที่ปลาย C ของโปรตีน N (PDB ID: 6YUN) อีพิโทปมีป้ายกำกับเป็นสีน้ำเงิน (เปปไทด์ 2482, aa 321-335) ​​และสีน้ำตาล (เปปไทด์ 2491, aa 357-364) โครงสร้างโมโนเมอร์ 2 โครงสร้างแสดงเป็นสีเทาและสีฟ้าตามลำดับ D, การวิเคราะห์การจัดตำแหน่งตามลำดับของเอพิโทป N-โปรตีนที่ระบุระหว่าง SARS-CoV-2 ในระยะเริ่มแรก (สายพันธุ์หวู่ฮั่น-Hu-1) และ 7 สายพันธุ์ที่เกิดขึ้นใหม่ จุดสีดำแสดงถึงลำดับที่เหมือนกันระหว่างสายพันธุ์หวู่ฮั่น-หู-1 และตัวแปรที่ระบุ การเปลี่ยนแปลงลำดับกรดอะมิโนจะถูกเน้นด้วยสีแดง

รูปที่ 6 ไลเนอร์เอพิโทปที่มีความเข้มข้นในการจับสูงและความถี่ปฏิกิริยาลดลงเมื่อเวลาผ่านไป ซึ่งตรวจพบโดยบุคคลที่ติดเชื้อ SARS-CoV-2 A และ B การวิเคราะห์ตามยาวและการกระจายของเปปไทด์ที่ระบุซึ่งมีความเข้มของสัญญาณการจับสูง (สูงกว่าค่าเฉลี่ย 1 SD ของความเข้มของสัญญาณของตัวอย่างที่ทดสอบทั้งหมด) แต่อัตราบวกลดลงเมื่อเวลาผ่านไป ความถี่การจดจำ (A) และความเข้มของสัญญาณ (B) ของอีพิโทปถูกพล็อตด้วยจุดเวลาการสุ่มตัวอย่าง 3 จุดหลังจากเริ่มแสดงอาการ แต่ละจุดใน (B) หมายถึงตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยแต่ละรายที่รวบรวม ณ จุดเวลาที่ระบุหลังจากเริ่มมีอาการ เส้นประแนวนอนบ่งบอกถึงค่าจุดตัดของค่าบวกสำหรับเปปไทด์แต่ละตัว การวิเคราะห์นัยสำคัญทางสถิติดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Limma ของ R v3.6.3 *P < .05 และ **P < .01 C, การเปรียบเทียบตำแหน่งและลำดับของอีพิโทป 2 อันที่อยู่ติดกัน, เปปไทด์ 510 (เด่นและคงอยู่) และเปปไทด์ 511 (ความเข้มของสัญญาณสูงและภาวะเชิงบวกลดลงเมื่อเวลาผ่านไป) บนโครงสร้างโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 (PDB ID: 6ZGI) . บริเวณที่ทับซ้อนกันระหว่าง 2 เอพิโทปจะถูกเน้นด้วยสีเขียว ลำดับที่ไม่ซ้ำจะมีป้ายกำกับเป็นสีแดงและสีน้ำเงิน

การวิเคราะห์ทางเซรุ่มวิทยาตามยาวระบุอีพิโทปที่มีความเข้มของสัญญาณสูงแต่ปฏิกิริยาลดลงเมื่อเวลาผ่านไป

นอกเหนือจากอีพิโทปที่มีปฏิกิริยาสูงที่เลือกไว้ซึ่งรับผิดชอบการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายอย่างยั่งยืนที่กล่าวถึงข้างต้น เรายังระบุและแสดงคุณลักษณะเพิ่มเติมของกลุ่มเปปไทด์เชิงบวก 9 ตัวที่แสดงความเข้มในการจับที่แข็งแกร่ง (สูงกว่าค่าเฉลี่ย 1 SD ของความเข้มของสัญญาณของตัวอย่างที่ทดสอบทั้งหมด) ด้วย แนวโน้มของการเกิดปฏิกิริยาที่ลดลง (การเปลี่ยนแปลงอัตราบวกที่สูงกว่า 20%) ในกลุ่มตัวอย่างซีรั่มจากผู้ป่วยโควิด-19 เมื่อเวลาผ่านไป ซึ่งสอดคล้องกับแนวโน้มทั่วไปของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายที่ลดลง อีพิโทปเหล่านี้อยู่ในตำแหน่งภายในแอนติเจนที่โดดเด่น 3 ชนิด: โปรตีน ORF1ab, S และ N (รูปที่ 6, A; และดูตาราง E5 ใน Online Repository ที่ www.jacionline.org) นอกจากนี้ การลดลงอย่างมีนัยสำคัญในความเข้มของสัญญาณของเปปไทด์ 4 ตัวจากโปรตีน ORF1ab (เปปไทด์ 784-IgG, 1617-IgM และ 1986-IgM) และ N (เปปไทด์ 2457-IgG) ถูกสังเกตพบ ระหว่างตัวอย่างจากช่วงแรกของจุดเวลาสุ่มตัวอย่าง (วัน 10-60 หลังจากเริ่มมีอาการ) และระยะหลังของจุดเวลาสุ่มตัวอย่าง (วัน 180-220 หลังจากเริ่มมีอาการ) (รูปที่ 6 , บี) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง แม้จะทับซ้อนกันเป็นส่วนใหญ่ แต่เปปไทด์ 2 ตัวของ S โปรตีนเปปไทด์ 510 (โดดเด่นและคงอยู่; รูปที่ 3, B) และเปปไทด์ 511 (ความเข้มของสัญญาณสูงและอัตราบวกลดลงเมื่อเวลาผ่านไป รูปที่ 6, A) แสดงรูปแบบที่แตกต่างกันของ ปฏิกิริยาระหว่างตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยในช่วงเวลาหนึ่ง การวิเคราะห์ลำดับและตำแหน่งบ่งชี้ว่าเปปไทด์ 510 มีตำแหน่งแตกแยกของ S2 และกรดอะมิโนเพิ่มเติมของ 813-SKRS-816 ในขณะที่เปปไทด์ 511 อยู่ภายใน FP โดยสมบูรณ์โดยมี 828-LADA{{29 ที่ขยายออกไป }} สารตกค้างที่ถูกเปิดเผยจนหมดบนพื้นผิวของโปรตีนไตรเมอร์ริก เอส (รูปที่ 6, C) ผลลัพธ์เหล่านี้เผยให้เห็นคุณลักษณะใหม่ๆ ของเอพิโทปที่อาจส่งผลให้ภูมิคุ้มกันทางร่างกายต่อโรค SARS-CoV แข็งแกร่งขึ้นและยาวนานขึ้นในที่สุด-2

การอภิปราย

การแสดงลักษณะเฉพาะอย่างเป็นระบบของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในระยะยาวต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการพัฒนาการวินิจฉัยที่ดีขึ้น การบำบัดรักษาที่มีประสิทธิผล และวัคซีน ในการศึกษาปัจจุบัน เราทำการวิเคราะห์ระยะยาวที่ครอบคลุมของผู้ป่วยโควิด-19 ในการติดตามผลเป็นเวลา 180 ถึง 220 วัน ซึ่งแสดงให้เห็นการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายอย่างต่อเนื่อง และการกระตุ้นการผลิตไซโตไคน์หลังการติดเชื้อไวรัส

อย่างมีนัยสำคัญ ด้วยการใช้ประโยชน์จากไมโครอาร์เรย์ที่มีเปปไทด์ซึ่งครอบคลุมโปรตีโอมของ SARS-CoV-2 เราได้เปิดเผยจลนศาสตร์ของการจดจำอีพิโทปเพิ่มเติม และระบุแผงของอีพิโทปที่โดดเด่นซึ่งสามารถเป็นสื่อกลางภูมิคุ้มกันของร่างกายในระยะยาว การค้นพบที่เรารายงานที่นี่เกี่ยวกับการมีอายุยืนยาวของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายหลังการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ยืนยันข้อมูลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้บางส่วน5,10,12,13,42 แต่ขยายออกไปโดยดำเนินการโปรไฟล์ทางเซรุ่มวิทยาเชิงลึกและการตรวจคัดกรองอีพิโทปโดยใช้ตัวอย่างซีรั่มตามยาว จากบุคคลที่เป็นโรคโควิด-19 ผ่านแนวทางไมโครอาร์เรย์ทั่วทั้งโปรตีโอม ในการศึกษานี้ เราได้ระบุเอพิโทปที่โดดเด่น 4 ชนิด (เปปไทด์ 318, 356, 510 และ 530) ภายในโปรตีน S ของ SARS-CoV-2 ซึ่งสามารถทำปฏิกิริยาอย่างต่อเนื่องกับผู้ป่วยโควิดมากกว่า 80%-19 ตัวอย่างที่ได้รับการทดสอบ สูงสุด 180 ถึง 220 วันหลังจากเริ่มมีอาการ เปปไทด์ 510 (S, aa {813-827) ซึ่งประกอบรวมด้วยตำแหน่งที่แตกแยก S2 และ FP ของหน่วยย่อย S2 ได้รับการระบุโดยทั่วไปในการศึกษาก่อนหน้าของกลุ่มอื่นๆ26,28,32-34 การวิเคราะห์เชิงหน้าที่บ่งชี้แอนติบอดี การกำหนดเป้าหมายภูมิภาคนี้อาจแสดงความสามารถในการวางตัวเป็นกลางต่อ SARS-CoV ที่จำกัด-22633 แม้ว่าจะถูกเปิดเผยอย่างมากบนพื้นผิวของโปรตีน S (รูปที่ 4, AC) ในกรณีของเปปไทด์ 530 (S, aa 893-907) ซึ่งวางตำแหน่งระหว่าง FP และบริเวณทำซ้ำ heptad แรกของหน่วยย่อย S2 โดยทั่วไปสารตกค้างจะถูกฝังอยู่ภายในโครงสร้างไตรเมอริกของโปรตีน S ซึ่งทำให้ เข้าถึงได้ยากผ่านทางแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต่อโรค SARS-CoV-2 (รูปที่ 4, AC) นอกจากนี้ ยังเลือกเปปไทด์ที่ควบคุมโดย S1-NTD 2 ตัวที่สามารถเป็นสื่อกลางในการตอบสนองของแอนติบอดีในระยะยาวของ SARS-CoV-2 ได้อีกด้วย การวิเคราะห์ที่เกี่ยวข้องกับลำดับและตำแหน่งของเปปไทด์บ่งชี้ว่าสิ่งตกค้างของเปปไทด์ 2 ชนิดนี้—เปปไทด์ 318 (S, aa 45-59) และเปปไทด์ 356 (S, aa 197-211)—อยู่ใกล้กับอีพิโทปที่รายงานที่รู้จัก โดยแอนติบอดีที่ช่วยเพิ่มการติดเชื้อ แต่นอกเหนือจากจุดสำคัญของแอนติบอดีที่เป็นกลางที่มีศักยภาพสูงซึ่งกำหนดเป้าหมาย NTD ของหน่วยย่อย S1 แล้ว 16,19,43 ยังแนะนำความเป็นไปได้ของการรับรู้ epitope โดยแอนติบอดีที่ไม่ทำให้เป็นกลางต่อเปปไทด์ที่ระบุ 2 ชนิดนี้ นอกเหนือจากรายละเอียดที่กล่าวถึงข้างต้น การสร้างภูมิคุ้มกันของหนูเมาส์ด้วยเปปไทด์ที่เลือกยังระบุเพิ่มเติมถึงประสิทธิภาพต่ำของเปปไทด์เชิงเส้นของโดเมนที่ไม่ใช่การจับตัวรับเหล่านี้ในการกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่แข็งแกร่ง (รูปที่ 4, G) โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอีพิโทปเชิงเส้นที่โดดเด่นซึ่งเป็นสื่อกลางในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายในระยะยาวต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 อาจชักนำแอนติบอดีที่ไม่มีหรือมีประสิทธิภาพในการทำให้เป็นกลางที่จำกัด ความเข้าใจที่สมบูรณ์ยิ่งขึ้นเกี่ยวกับภูมิทัศน์ของอีพิโทปของแอนติบอดีต่อเชื้อ SARS-CoV-2 โดยเฉพาะเอพิโทปที่ควบคุมด้วยโปรตีน S ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับการแยกส่วนการทำงานของแอนติบอดี ซึ่งช่วยส่งเสริมการออกแบบวัคซีนที่เป็นนวัตกรรมและมีเหตุผลเพิ่มเติม แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางจะให้การป้องกันเพื่อกำจัดการติดเชื้อไวรัส ในขณะที่แอนติบอดีที่ไม่ทำให้เป็นกลางอาจมีบทบาทที่เป็นประโยชน์ เป็นกลาง หรือแม้แต่เป็นอันตรายในระหว่างการกวาดล้างไวรัส แอนติบอดีที่ไม่ทำให้เป็นกลางจัดให้มีการป้องกันเพิ่มเติม ภายในร่างกาย ผ่านทางช่วงของการทำงานของเอฟเฟกเตอร์ที่มี Fc เป็นสื่อกลางในบริบทของฟาโกไซโตซิสที่ขึ้นกับแอนติบอดีและความเป็นพิษต่อเซลล์ที่ขึ้นกับแอนติบอดี ในทางตรงกันข้าม การศึกษาบางชิ้นได้เสนอถึงความเป็นไปได้ของบทบาทที่ทำให้เกิดโรคของแอนติบอดีที่ไม่ทำให้เป็นกลางในการติดเชื้อโคโรนาไวรัส การศึกษาก่อนหน้านี้โดยใช้ตัวเลือกวัคซีนหลายประเภทสำหรับ SARS-CoV และ MERS-CoV พบว่าภูมิคุ้มกันบกพร่องดีขึ้นในสัตว์ขนาดเล็กและไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์ที่ได้รับการฉีดวัคซีนหลังความท้าทายของไวรัส24,44-50 เมื่อเร็ว ๆ นี้ การศึกษาของ 2 กลุ่มรายงานว่าการทำให้เป็นกลาง แอนติบอดีที่กำหนดเป้าหมาย NTD ของโปรตีน SARS-CoV-2 S มีความสามารถในการเพิ่มการติดเชื้อไวรัส ในหลอดทดลอง ผ่านกลไกที่ไม่ขึ้นกับตัวรับ Fcg23,25 แม้ว่าแอนติบอดีที่เสริมการติดเชื้อที่ได้รับการบริหารแบบพาสซีฟในแบบจำลองสัตว์แสดงให้เห็นว่าสามารถป้องกันโรคซาร์สได้ -การติดเชื้อ CoV-2 ในร่างกาย เมื่อพิจารณาถึงบทบาทที่เป็นข้อขัดแย้งของแอนติบอดีระหว่างการติดเชื้อโคโรนาไวรัส จำเป็นต้องมีการตรวจสอบเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบความถูกต้องของบทบาทที่เป็นไปได้ของแอนติบอดีในการรับรู้เอพิโทปที่โดดเด่นและคงอยู่เหล่านี้ในการต่อสู้กับการติดเชื้อไวรัส ในร่างกาย ขั้นต่อไปของการออกแบบวัคซีนที่สมเหตุสมผลสำหรับ SARS-CoV-2 สามารถเกิดขึ้นได้โดยการกระตุ้นแอนติบอดีที่เป็นกลางที่มีศักยภาพสูงและแอนติบอดีที่ไม่ทำให้เป็นกลางในการป้องกัน พร้อมกับการลดการนำเสนอของเอพิโทปที่ส่งเสริมการติดเชื้อหรือเอพิโทปที่กระตุ้นภูมิคุ้มกันที่ไม่มี ผลประโยชน์ แม้ว่าการศึกษาก่อนหน้านี้จำนวนหนึ่งจะมุ่งเน้นไปที่โปรตีน S ของ SARS-CoV-2 ที่มีจุดมุ่งหมายเพื่อแยกแยะการทำงานของแอนติบอดีเกี่ยวกับการทำให้เป็นกลาง แต่เราได้ทำการแมปอีพิโทปทั่วทั้งโปรตีโอมที่ครอบคลุม และระบุแผงของอีพิโทปภายในโพลีโปรตีน ORF1ab ที่ ได้รับการยอมรับอย่างต่อเนื่องจากตัวอย่างซีรั่มของผู้ป่วยในสัดส่วนที่สูงเมื่อเวลาผ่านไป แม้ว่าเปปไทด์ที่ควบคุมโดย ORF1ab เหล่านี้กระจายอยู่บนโปรตีนที่ไม่ใช่โครงสร้างหลายชนิดอาจไม่กระตุ้นแอนติบอดีที่ทำหน้าที่มุ่งเป้าไปที่ไวรัส SARS-CoV-2 แต่ก็สามารถใช้เป็นเครื่องมือในการวินิจฉัยเพื่อช่วยแยกแยะการติดเชื้อตามธรรมชาติจากการฉีดวัคซีนได้ ด้วยจำนวนผู้รับวัคซีนที่เพิ่มขึ้นทั่วโลก การทดสอบทางซีรัมวิทยาในปัจจุบันโดยใช้ S โปรตีนและโปรตีน N กำลังเผชิญกับความท้าทายในฐานะแนวทางที่มีประสิทธิภาพในการช่วยทดสอบระดับโมเลกุลในการตรวจหาการติดเชื้อ SARS-CoV-2 และสำหรับ การกำหนดสถานะภูมิคุ้มกันหลังการติดเชื้อไวรัส ด้วยการใช้ประโยชน์จากเปปไทด์ที่มีปฏิกิริยาต่อเนื่องและพบบ่อยที่สุดภายใน ORF1ab ในหมู่บุคคลที่ติดเชื้อโควิด{101}} การวินิจฉัยทางซีรัมวิทยาของการติดเชื้อตามธรรมชาติจะดำเนินการโดยไม่คำนึงถึงสถานะการฉีดวัคซีนที่เกี่ยวข้องกับ S โปรตีนที่อิงโดเมนตัวรับ แนวทางวัคซีนที่ใช้ไวรัสเป็นหลักและชนิดเชื้อตาย จำเป็นต้องมีการศึกษาในอนาคตเพื่อประเมินปฏิกิริยา ความไว และความจำเพาะของเปปไทด์ ORF1ab ที่ระบุในกลุ่มประชากรขนาดใหญ่ที่ประกอบด้วยบุคคลที่ติดเชื้อ SARSCoV–2 และผู้รับวัคซีน นอกจากนี้ จำเป็นต้องมีการประเมินประสิทธิภาพการตรวจจับเพิ่มเติมผ่านกลยุทธ์การผสมผสานเปปไทด์หลายรูปแบบ เพื่อเอาชนะความไวของเปปไทด์ที่ต่ำกว่า เมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนแบบเต็มความยาวคลื่น และปฏิกิริยาข้ามที่เป็นไปได้ระหว่างไวรัสโคโรนาในมนุษย์ทั่วไป ข้อจำกัดที่สำคัญของการศึกษาของเราคือตัวอย่างค่อนข้างน้อยที่ได้มาจากกลุ่มผู้ป่วยขนาดเล็ก และผู้เข้าร่วมส่วนใหญ่ประสบกับโรคโควิด{106}} ที่ไม่รุนแรง สิ่งเหล่านี้อาจจำกัดข้อสรุปบางประการของเราเกี่ยวกับความถี่ในการตอบสนองเชิงบวกและขนาดของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ซึ่งอาจแตกต่างกันไปตามความรุนแรงของโรค อย่างไรก็ตาม ข้อมูลที่นำเสนอในการศึกษานี้ให้ข้อมูลเชิงลึกที่มีคุณค่าเกี่ยวกับจลนศาสตร์ของการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในช่วงเวลาหนึ่งหลังการติดเชื้อ SARS-CoV{108}} และคุณลักษณะของอีพิโทปที่โดดเด่นซึ่งสามารถเป็นสื่อกลางในการสร้างภูมิคุ้มกันทางร่างกายอย่างยั่งยืนในผู้ที่เป็นโรคโควิด-19 การค้นพบนี้นำเสนอความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับการมีอายุยืนยาวของภูมิคุ้มกันตามธรรมชาติที่เกิดจากการติดเชื้อไวรัส และมีผลกระทบในวงกว้างต่อกลยุทธ์การฉีดวัคซีนที่เป็นนวัตกรรมใหม่และแนวทางการวินิจฉัยที่ดีขึ้น

ข้อมูลอ้างอิง

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H และคณะ ลักษณะทางพันธุกรรมและระบาดวิทยาของเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ 2019: ผลกระทบต่อต้นกำเนิดของไวรัสและการจับตัวรับ มีดหมอ 2020;395:565-74.

2. องค์การอนามัยโลก (WHO) แดชบอร์ด WHO coronavirus (COVID-19) ปี 2021 ดูได้ที่: https://COVID19.who.int/ เข้าถึงเมื่อวันที่ 30 พฤศจิกายน 2021.

3. วู ซี, แมคกูแกน เจเอ็ม ลักษณะและบทเรียนสำคัญจากการระบาดของโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (โควิด-19) ในประเทศจีน: สรุปรายงานผู้ป่วย 72,314 รายจากศูนย์ควบคุมและป้องกันโรคของจีน จามา 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D และอื่นๆ ภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวที่จำเพาะต่อแอนติเจนต่อ SARS-CoV-2 ในโรคโควิดแบบเฉียบพลัน-19 และความสัมพันธ์กับอายุและความรุนแรงของโรค เซลล์ 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S และอื่นๆ การติดเชื้อ SARS-CoV-2 ทำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของร่างกายอย่างยั่งยืนในผู้ป่วยพักฟื้นภายหลังจากมีอาการของโควิด-19 ชุมชนแนท 2021;12:1813.

6. ลอง QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK และคณะ การตอบสนองของแอนติบอดีต่อ SARS-CoV-2 ในผู้ป่วยโรคโควิด-19 แนท เมด 2020;26:845-8.

7. สเตอร์ลิน ดี, มาเธียน เอ, มิยารา เอ็ม, โมห์ร เอ, แอนนา เอฟ, แคลร์ แอล และคณะ IgA ครอบงำการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางตั้งแต่เนิ่นๆ ต่อ SARS-CoV-2 วิทย์แปล Med 2021;13: eabd2223

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y และคณะ เซลล์ตัวช่วย T follicular ที่หมุนเวียนจำเพาะต่อ Spike และการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางข้ามในผู้ป่วยโรคโควิด-19– ที่กำลังพักฟื้น แนท ไมโครไบโอล 2021;6:51-8

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q และอื่น ๆ การตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของ SARS-CoV-2 จะมีประสิทธิภาพมากกว่าในผู้ป่วยที่เป็นโรคร้ายแรง จุลินทรีย์อุบัติใหม่ติดเชื้อในปี 2020;9:2091-3

10. วานชิลลา เค, ดิ คริสตันเซียโน่ วี, ไคลพาส เอฟ, เดวัลด์ เอฟ, ชอมเมอร์ส พี, กีเซลมันน์ แอล, และคณะ จลนศาสตร์และความสัมพันธ์ของการตอบสนองของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต่อการติดเชื้อ SARSCoV-2 ในมนุษย์ จุลินทรีย์ในโฮสต์ของเซลล์ 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H และอื่นๆ ระดับที่ลดลงของแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางต่อ SARS-CoV-2 ในผู้ป่วยโรคโควิดระยะพักฟื้น-19 ที่หนึ่งปีหลังเริ่มมีอาการ อิมมูโนลด้านหน้า 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, และคณะ ความกว้างในการทำให้เป็นกลางที่ได้รับการปรับปรุงตามธรรมชาติเพื่อต้าน SARS-CoV-2 หนึ่งปีหลังการติดเชื้อ ธรรมชาติ 2021;595:426-31

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE และคณะ ประเมินความจำทางภูมิคุ้มกันต่อ SARS-CoV-2 นานถึง 8 เดือนหลังการติดเชื้อ วิทยาศาสตร์ 2021;371:eabf4063.

14. โซคัล เอ, แชปเพิร์ต พี, บาร์บา-สปาเอธ จี, โรเซอร์ เอ, ฟูราติ เอส, อัซซาอูย ไอ และคณะ การสุกและการคงอยู่ของการตอบสนองของเซลล์ B ของหน่วยความจำต้าน SARS-CoV-2 เซลล์ 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางของมนุษย์ที่เกิดจากการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ธรรมชาติ 2020;584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q และคณะ แอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางที่มีศักยภาพเพื่อต่อต้านหลายเอพิโทปบน SARS-CoV-2 ที่เพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็ว ธรรมชาติ 2020;584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP และคณะ การทำให้แอนติบอดีของมนุษย์เป็นกลางและป้องกันได้อย่างมีประสิทธิภาพต่อ SARS-CoV-2 ธรรมชาติ 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, และคณะ พลศาสตร์เชิงโครงสร้างของ SARS-CoV-2 ไกลโคโปรตีนขัดขวางไตรเมอร์ริกในเชิงซ้อนโดยมีตัวรับ ACE2 เปิดเผยโดย cryo-EM วิทยาศาสตร์ขั้นสูง 2021;7:eabe5575

19. แม็คคัลลัม เอ็ม, เด มาร์โก เอ, เลมป์ เอฟเอ, ตอร์โตริซี่ เอ็มเอ, ปินโต ดี, วอลล์ เอซี และคณะ การทำแผนที่แอนติเจนของโดเมนที่ปลาย N เผยตำแหน่งที่มีช่องโหว่สำหรับ SARSCoV-2 เซลล์ 2021;184:2332-47.e16.

20. ซาวเออร์ เอ็มเอ็ม, ทอร์โตริซี แมสซาชูเซตส์, พาร์ค วายเจ, วอลล์ เอซี, โฮแมด แอล, แอกตัน โอเจ และคณะ พื้นฐานเชิงโครงสร้างสำหรับการวางตัวเป็นกลางของโคโรนาไวรัสในวงกว้าง Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, และคณะ แอนติบอดีของมนุษย์ที่มีศักยภาพสูงป้องกันความท้าทายของ SARS-CoV-2 ผ่านกลไกต่างๆ วิทยาศาสตร์ 2020;370:950-7.

22. ปินโต ดี, ปาร์ค วายเจ, เบลทราเมลโล เอ็ม, วอลล์ เอซี, ตอร์โตริซี แมสซาชูเซตส์, เบียนชี่ เอส, และคณะ การวางตัวเป็นกลางข้ามของ SARS-CoV-2 โดยโมโนโคลนอลแอนติบอดี SARS-CoV ของมนุษย์ ธรรมชาติ 2020;583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S และคณะ ตำแหน่งที่ส่งเสริมการติดเชื้อบนโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 ที่กำหนดเป้าหมายโดยแอนติบอดี เซลล์ 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H และคณะ Anti-spike IgG ทำให้เกิดอาการบาดเจ็บเฉียบพลันที่ปอดโดยการบิดเบือนการตอบสนองของมาโครฟาจระหว่างการติดเชื้อ SARS-CoV แบบเฉียบพลัน ข้อมูลเชิงลึกของ JCI 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, และคณะ การทำงานในหลอดทดลองและในร่างกายของแอนติบอดีต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ซึ่งช่วยเพิ่มและทำให้แอนติบอดีเป็นกลาง ห้องขัง 2021;184:4203-19.e32 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS และคณะ เอพิโทปเชิงเส้นสองอันบนสไปค์โปรตีน SARS-CoV-2 กระตุ้นแอนติบอดีที่ทำให้เป็นกลางในผู้ป่วยโควิด-19 แนทคอมมูนิตี้ 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC และอื่นๆ การขุดอีพิโทปบนสไปค์โปรตีนของ SARS-CoV-2 จากผู้ป่วยโควิด-19 ความละเอียดของเซลล์ 2020;30:702-4

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL และคณะ การทำโปรไฟล์อีพิโทปเผยให้เห็นลายเซ็นที่มีผลผูกพันของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของ SARS-CoV-2 ในการติดเชื้อตามธรรมชาติและปฏิกิริยาข้ามกับ CoV ของมนุษย์ประจำถิ่น ตัวแทนเซลล์ 2021;35: 109164

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y และคณะ การทำโปรไฟล์อีพิโทปของไวรัสของผู้ป่วยโควิด-19 เผยให้เห็นปฏิกิริยาข้ามและความสัมพันธ์ของความรุนแรง วิทยาศาสตร์ 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM และคณะ ReScan ซึ่งเป็นไปป์ไลน์การวินิจฉัยแบบมัลติเพล็กซ์ แพนซีรั่มของมนุษย์เพื่อหาแอนติเจน SARS-CoV-2- 2 ยาตัวแทนเซลล์ 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A และคณะ การทำแผนที่อีพิโทปที่มีความละเอียดสูงและการแสดงลักษณะเฉพาะของแอนติบอดี SARS-CoV-2 ในกลุ่มผู้ป่วยจำนวนมากที่มีเชื้อ COVID-19 คอมมิวนิสต์ไบโอล 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H และอื่นๆ การประเมินอย่างเป็นระบบของการตอบสนองของ IgG ต่อเปปไทด์ที่ได้มาจากโปรตีนขัดขวาง SARS-CoV-2 เพื่อติดตามผู้ป่วยโควิด-19 เซลล์ โมล อิมมูนอล 2021;18:621-31

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY และอื่นๆ ภูมิทัศน์อีพิโทปเชิงเส้นของโปรตีนสไปค์ SARS-CoV-2 ที่สร้างจากผู้ป่วยโควิด-19 จำนวน 1,051 ราย ตัวแทนเซลล์ 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D และอื่นๆ ไมโครอาร์เรย์ของโปรตีโอมของ SARS-CoV-2 สำหรับการทำแผนที่ปฏิกิริยาระหว่างแอนติบอดีของ COVID-19 ที่ความละเอียดของกรดอะมิโน ACS Cent Sci 2020;6:2238-49

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y และคณะ การทำแผนที่การทำงานของเอพิโทปเชิงเส้น B-cell ของ SARS-CoV-2 ในประชากรระยะพักฟื้นของ COVID-19 จุลินทรีย์เกิดใหม่ติดเชื้อในปี 2020;9:1988-96

36. คณะกรรมการสุขภาพแห่งชาติและการบริหารการแพทย์แผนจีนแห่งชาติ โปรโตคอลการวินิจฉัยและการรักษาสำหรับโรคปอดบวมจากเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ (เวอร์ชันทดลอง 7) ชินเมดเจ (อังกฤษ) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC และคณะ การทำโปรไฟล์ autoantibody repertoire ในซีรั่มตามยาวระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับการผ่าตัดในมะเร็งของต่อมในปอด อีไบโอเมดิซิน 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, และคณะ การตอบสนองของแอนติบอดีต่อ SARSCoV-2 ในผู้ป่วยโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ 2019 โรคติดเชื้อของคลิน 2020;71: 2027-34

39. ลูคัส ซี, หว่องพี, ไคลน์ เจ, คาสโตร TBR, ซิลวา เจ, ซันดาราม เอ็ม, และคณะ การวิเคราะห์ตามยาวเผยให้เห็นความผิดพลาดทางภูมิคุ้มกันในโรคโควิดระดับรุนแรง-19 ธรรมชาติ 2020;584: 463-9.

40. มัวร์ เจบี มิถุนายน ช. กลุ่มอาการการปล่อยไซโตไคน์ในโรคโควิดระดับรุนแรง-19 วิทยาศาสตร์ 2020;368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB และคณะ พื้นฐานเชิงโครงสร้างสำหรับการเชื่อมต่อเฮลิเคส-โพลีเมอเรสในคอมเพล็กซ์การจำลองและการถอดความ SARS-CoV-2 เซลล์ 2020;182:1560-73.e13.

42. วาจน์เบิร์ก เอ, อมานัท เอฟ, เฟอร์โป เอ, อัลท์แมน DR, เบลีย์ เอ็มเจ, มานซูร์ เอ็ม, และคณะ แอนติบอดีที่เป็นกลางต่อการติดเชื้อ SARS-CoV-2 ที่แข็งแกร่งจะคงอยู่เป็นเวลาหลายเดือน วิทยาศาสตร์ 2563; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, และคณะ แอนติบอดีของมนุษย์ที่ทำให้เป็นกลางจับกับโดเมนปลาย N ของโปรตีนสไปค์ของ SARS-CoV-2 วิทยาศาสตร์ 2020;369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนาของโรคซาร์สทำให้เกิดภูมิคุ้มกันบกพร่องในปอดเมื่อเผชิญกับความท้าทายจากไวรัสซาร์ส กรุณาหนึ่ง 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, และคณะ วัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ที่เกิดจากกลุ่มอาการทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงแบบดับเบิ้ลให้การป้องกันที่ไม่สมบูรณ์ในหนู และทำให้ปอดตอบสนองต่อการอักเสบของปอดเพิ่มขึ้นเมื่อมีการท้าทาย เจ วิโรล 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยไวรัสวัคซีนดัดแปลง วัคซีนรีคอมบิแนนท์ที่ใช้อังการาเพื่อป้องกันโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรงมีความเกี่ยวข้องกับโรคตับอักเสบที่เพิ่มขึ้นในพังพอน เจ วิโรล 2004;78:12672-6

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันก่อนหน้าด้วยโรคทางเดินหายใจเฉียบพลันรุนแรง (ซาร์ส) - โปรตีนนิวคลีโอแคปซิดที่เกี่ยวข้องกับไวรัสโคโรนา (SARS-CoV) ทำให้เกิดโรคปอดบวมรุนแรงในหนูที่ติดเชื้อ SARS-CoV เจ อิมมูนอล 2008;181:6337-48

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A และอื่นๆ ประสิทธิภาพของวัคซีนในหนูวัยชราถูกท้าทายด้วยการแพร่ระบาดของเชื้อ SARS-CoV ชนิดรีคอมบิแนนท์และสายพันธุ์ที่ขัดขวางจากสัตว์สู่คน กรุณา Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, และคณะ Epitopes ของไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ที่สร้างภูมิคุ้มกันโรคในมนุษย์กระตุ้นทั้งผลการเสริมและทำให้เป็นกลางต่อการติดเชื้อในไพรเมตที่ไม่ใช่มนุษย์ โรคติดเชื้อ ACS 2016;2: 361-76

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH และคณะ การสร้างภูมิคุ้มกันด้วยวัคซีนป้องกันไวรัสโคโรนาสายพันธุ์ใหม่ในกลุ่มอาการระบบทางเดินหายใจในตะวันออกกลางชนิดตายจะนำไปสู่ภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องในปอดเมื่อเผชิญกับความท้าทายจากไวรัสที่มีชีวิต ฮัมวัคซีนภูมิคุ้มกัน 2016;12:2351-6