Lamivudine ปรับปรุงการลดลงของความรู้ความเข้าใจในหนู SAMP8: การบูรณาการใน Vivo Pharmacological Evaluation และ Network Pharmacology

เชิงนามธรรม

การผลิต Taxol โดยเชื้อราเป็นหนึ่งในแนวทางทางเลือกที่น่าสนใจ เกี่ยวกับแหล่งที่มาจากธรรมชาติและสารกึ่งสังเคราะห์ อย่างไรก็ตาม ผลผลิตที่ลดลงและการสูญเสียผลผลิต Taxol อย่างรวดเร็วจากเชื้อราเป็นความท้าทายสำคัญที่ขัดขวางการดำเนินการทางอุตสาหกรรมต่อไป ดังนั้น การค้นหาเชื้อราที่แยกได้โดยมีความเสถียรในการผลิต Taxol ในราคาย่อมเยา นอกจากจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของมันแล้วกิจกรรมต้านมะเร็งผ่านการผันอนุภาคนาโนทองคำเป็นเป้าหมายหลักของการศึกษานี้ เห็ดราเอนโดไฟต์ที่แยกได้ 24 ชนิดได้รับการกู้คืนจากเปลือก กิ่ง และใบของต้นโจโจ้บา ในบรรดาเชื้อราเหล่านี้เชื้อรา Aspergillus favusMW485934.1 เป็นผู้ผลิต Taxol ที่มีศักยภาพมากที่สุด (88.6 µg/l) เอกลักษณ์ทางเคมีของ Taxol ที่สกัดได้ของก. ความโปรดปรานได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ TLC, HPLC, HNMR และ FTIR ผลผลิตของ Taxol ที่ผลิตโดยก. ความโปรดปรานได้รับการปรับให้เหมาะสมโดยวิธีพื้นผิวตอบสนอง (RSM) โดยใช้ Plackett–Burman (PBD) และเผชิญการออกแบบคอมโพสิตกลาง (FCCD) ผลตอบแทนของ Taxol โดยก. ความโปรดปรานเพิ่มขึ้นประมาณ 3.2 เท่าเมื่อเทียบกับวัฒนธรรมควบคุม (จาก 96.5 เป็น 302.7 ไมโครกรัม/ลิตร) ผลผลิต Taxol สูงสุดโดยเพิ่มขึ้นก. ความโปรดปรานบนอาหารเลี้ยงเชื้อมอลต์สกัดที่ผ่านการดัดแปลง (กรัม/ลิตร) (มอลต์สกัด 20.0, เปปโทน 2.0, ซูโครส 20.0, ถั่วเหลือง 2.{{10}}, ซีสเทอีน 0.5, กลูตามีน 0.5 และสารสกัดจากเนื้อวัว 1.0 ปรับเป็น pH 6.0) และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา เป็นเวลา 16 วัน จากการออกแบบ FCCD ตัวแปรสำคัญที่ส่งผลต่อการผลิต Taxol โดยก. ความโปรดปรานได้แก่ซิสเทอีน ค่า pH และเวลาฟักตัว เมื่อก. ความโปรดปราน- การฉายรังสีที่ 1.0 kGy ผลผลิต Taxol เพิ่มขึ้นประมาณ 1.25 เท่า (375.9 µg/l) ถึงเพิ่มกิจกรรมต้านมะเร็ง, Taxol บริสุทธิ์ถูกผสานเข้ากับอนุภาคนาโนทองคำ (AuNPs) ที่อาศัยโดยการฉายรังสี -rays (0.5 kGy) และคุณสมบัติทางเคมีฟิสิกส์ของคอมโพสิต Taxol-AuNPs ได้รับการประเมินโดย UV–Vis, DLS, XRD และ TEM การวิเคราะห์ ค่า IC50 ของการผันคอนจูเกตของ Taxol-Taxol และ Taxol-AuNPs ไปยังเซลล์ HEPG-2 คือ 4.06 และ 2.1 µg/ml ในขณะที่ค่า IC50 เทียบกับ MCF-7 คือ 6.07 และ 3.3 µg/ml ตามลำดับ ดังนั้นกิจกรรมต้านมะเร็งของคอมโพสิต Taxol-AuNPs เพิ่มขึ้น 2 เท่าเมื่อเทียบกับ Taxol ดั้งเดิมต่อเซลล์ HEPG-2 และ MCF-7 นอกจากนี้ ฤทธิ์ต้านจุลชีพของ Taxol ต่อแบคทีเรียที่ดื้อต่อยาหลายขนานยังเพิ่มขึ้นอย่างมากเมื่อผันคำกริยาด้วย AuNP เมื่อเทียบกับ AuNPs และ Taxol ของแท้ ทำให้มั่นใจได้ถึงความสามารถในการละลาย การกำหนดเป้าหมาย และประสิทธิภาพของ Taxol ที่สูงขึ้นเมื่อผันคำกริยา AuNP

Cistanche desertiloca constipation benefits

Taxol ทางเลือกสมุนไพรจีน Cistanche

คำสำคัญ:Aspergillus favus · โจโจ้บา · เชื้อราเอนโดไฟต์ · อนุภาคนาโนทองคำ · Taxol · -การฉายรังสี · การเพิ่มคุณค่าทางโภชนาการ

การแนะนำ

Taxol เป็นหนึ่งในผลิตภัณฑ์ในวงกว้างที่มีการค้ามากที่สุดยาต้านมะเร็ง[1]. กิจกรรมของ Taxol ขยายความจากความจำเพาะที่ไม่เหมือนใครในการจับกับเซลล์ทูบูลิน - หน่วยย่อยเฮเทอโรไดเมอร์ ส่งเสริมการเกิดพอลิเมอไรเซชันของทูบูลิน ซึ่งขัดขวางการแบ่งตัวแบบไมโทซิสของเซลล์เนื้องอก [2] Taxol แสดงกิจกรรมที่รุนแรงต่อเต้านม ปอด ศีรษะและคอ มะเร็งมดลูก และรูปแบบขั้นสูงของ Kaposi's sarcoma [3] Taxol เริ่มแรกผลิตจากเปลือกต้นยู Taxus brevifolia "วงศ์ Taxaceae" [4, 5]; อย่างไรก็ตามอัตราผลตอบแทนของ Taxol ที่ต่ำกว่านั้น<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as โรคหอบหืด,การอักเสบ, และมะเร็ง[32]. ดังนั้น วัตถุประสงค์หลักของงานนี้คือการสำรวจเชื้อราชนิดใหม่ที่แยกได้จากพืชโจโจบาที่มีความเสถียรทางเมตาบอลิซึมที่ไม่เหมือนใครสำหรับการผลิต Taxol เพื่อประเมินแนวทางต่างๆ เพื่อเพิ่มผลผลิต Taxol ของพวกมันให้สูงสุด รวมทั้งเพื่อเพิ่มฤทธิ์ต้านการเพิ่มจำนวนของสารประกอบ Taxol ที่สกัดออกมา ผ่านการผันคำกริยาด้วยอนุภาคนาโนทองคำ ผ่านการฉายรังสีแกมมา

Echinacoside in cistanche (9)

วัสดุและวิธีการ

การแยกและการเพาะเลี้ยงเชื้อราเอนโดไฟต์

ส่วนต่างๆ ของโจโจ้บา (Simmondsia chinensis) เช่น ใบ เปลือก กิ่ง และดอกตูม ถูกรวบรวมมาจากคณะเกษตรศาสตร์ มหาวิทยาลัยไคโร และใช้เป็นแหล่งของเชื้อราเอนโดไฟต์ ชิ้นส่วนของพืชถูกรวบรวมและล้างด้วยน้ำประปา ฆ่าเชื้อพื้นผิวด้วยเอทานอล 70 เปอร์เซ็นต์เป็นเวลา 1 นาที จากนั้นล้างด้วยน้ำฆ่าเชื้อ [28] ชิ้นส่วนพืชที่ผ่านการฆ่าเชื้อที่พื้นผิวถูกตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ ภายใต้สภาวะปลอดเชื้อและวางบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ Potato dextrose agar (PDA), Czapek's-Dox และอาหารเลี้ยงเชื้อมอลต์สกัด [33–36] และจานถูกบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาสำหรับ 10 วัน. ประสิทธิภาพของการฆ่าเชื้อที่พื้นผิวของชิ้นส่วนพืชได้รับการประเมินโดยการปั่นแยกน้ำล้าง จากนั้นเติมน้ำฆ่าเชื้อ 500 ul ลงในตะกอนและชุบลงในสื่อ PDA [37] เชื้อราเอ็นโดไฟต์ที่แยกได้บริสุทธิ์ถูกฉีดบน PDA slant เป็นเวลา 7 วันและเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศา

การคัดกรอง การสกัด และการหาปริมาณของ Taxol จากเชื้อราเอนโดไฟต์

เชื้อราเอนโดไฟต์ที่ฟื้นตัวซึ่งอาศัยอยู่ในโจโจบาได้รับการคัดเลือกสำหรับการผลิต Taxol โดยการเติบโตในน้ำซุปเดกซ์โทรสมันฝรั่ง (PDB) [38] หนึ่งปลั๊กของ fun gal ที่แยกได้อายุ 7 วันแต่ละตัวได้รับการฉีดวัคซีนในงาน Erlenmeyer 100 มล. / 250 มล. บ่มเป็นเวลา 15 วันที่ 30 ± 1 องศา ภายใต้สภาวะเขย่า (120 รอบต่อนาที). หลังจากการบ่ม วัฒนธรรมถูกกรอง และตัวกรองถูกแก้ไขด้วยโซเดียมไบคาร์บอเนต 0.2 เปอร์เซ็นต์เพื่อตกตะกอนกรดไขมัน แท็กซอลถูกสกัดด้วยไดคลอโรมีเทน และเฟสอินทรีย์ถูกรวบรวมและระเหยจนแห้ง และส่วนที่เหลือถูกละลายอีกครั้งในเมทานอล [17, 39] Taxol ถูกแยกและระบุโดย TLC โดยใช้แผ่นซิลิกาเจลเคลือบล่วงหน้าของเมอร์ค 1 มม. (20 × 20 ซม.) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Germany) ตรวจพบโดยแสง UV ที่ 254 นาโนเมตร [39] จุดสมมุติของ Taxol ถูกขูดออกจากแผ่นซิลิกาเจล TLC และละลายในเมทานอล หมุนวนอย่างแรงเป็นเวลา 10 นาที และหมุนเหวี่ยงที่ 1,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาที อนุภาคซิลิกาที่ตกตะกอนถูกกำจัดออก และนำส่วนเกินไปตรวจสอบปริมาณและความบริสุทธิ์ของ Taxol โดย HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) ของคอลัมน์ C18 รีเวิร์สเฟส (Eclipse Plus C18 4}.6 ×150 มม., 3.5 ไมครอน, Cat. # 959,963–902). เฟสเคลื่อนที่ที่ใช้คือเมทานอล/อะซีโตไนไทรล์/น้ำ (25:35:40, v/v/v) ที่อัตรา fow 1.0 มล./นาที เป็นเวลา 20 นาที [40] และเศษส่วน Taxol ถูกวัดที่ 227 นาโนเมตร และพวกมัน เอกลักษณ์และความเข้มข้นของสารเคมีได้รับการยืนยันจากเวลากักเก็บและพื้นที่สูงสุดในการดูดซึมเปรียบเทียบกับตัวอย่างจริง

การระบุลักษณะทางสัณฐานวิทยาและโมเลกุลของเชื้อราเอนโดไฟต์ที่กู้คืน

เชื้อราเอนโดไฟต์ที่แยกได้นั้นถูกจำแนกตามระดับสปีชีส์ของพวกมันตามลักษณะทางสัณฐานวิทยาระดับมหภาคและจุลภาคโดยการเติบโตบน PDA, Czapek's-Dox และสารสกัดจากมอลต์ตามคีย์ของข้อมูลอ้างอิง [33–36] เอกลักษณ์ของเชื้อราที่แยกได้จาก Taxol ที่มีศักยภาพมากที่สุดได้รับการยืนยันในระดับโมเลกุลเพิ่มเติมตามลำดับของสเปเซอร์ที่ถอดเสียงภายใน (ITS) [41, 42] DNA จีโนมของเชื้อรา (gDNA) ถูกสกัดโดยการบด mycelia (~0.2 g) ในไนโตรเจนเหลว จากนั้นจ่ายในบัฟเฟอร์การสกัด CTAB 1 มล. (CTAB 2 เปอร์เซ็นต์, PVP4 2 เปอร์เซ็นต์0, { {21}}.2 เปอร์เซ็นต์ 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl ใน 100 mM Tris−HCl, pH 8.0) ชุดไพรเมอร์ PCR คือ ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ และ ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTTGATATGC-3′ ปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 10 ul ของส่วนผสมหลัก 2×PCR (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul ของ gDNA, 1 ul ของไพรเมอร์แต่ละอย่าง (10 pmol/ul) และเติมจนเต็ม 20 ul ด้วยการกลั่นแบบปลอดเชื้อ น้ำ. PCR ถูกโปรแกรมไว้ที่การเสียสภาพเริ่มต้นที่ 94 องศาเป็นเวลา 2 นาที การเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 องศาเป็นเวลา 30 วินาที การหลอมที่ 55 องศาเป็นเวลา 10 วินาที การขยายที่ 72 องศาเป็นเวลา 30 วินาทีเป็นเวลา 35 รอบ และการขยาย fnal ที่ 72 องศาเป็นเวลา 2 นาที แอมพลิคอน PCR ได้รับการวิเคราะห์โดย agarose gel 1.5 เปอร์เซ็นต์ในบัฟเฟอร์ 1×TBE (Ambion Cat# AM9864) โดยใช้บันได DNA ขนาด 1 kb (Cat. # PG010-55DI) และแสดงภาพโดยระบบเอกสารเกี่ยวกับเจล แอมพลิคอนถูกทำให้บริสุทธิ์และจัดลำดับโดย Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, เวอร์ชัน 6.0 ด้วยไพรเมอร์ชุดเดียวกัน ลำดับที่ได้รับคือ BLAST ค้นหาแบบไม่ซ้ำซ้อนบนฐานข้อมูล NCBI นำเข้าสู่ซอฟต์แวร์ MEGA 6.0 และสอดคล้องกับอัลกอริทึมของกล้ามเนื้อ Clustal W [43] และต้นไม้สายวิวัฒนาการถูกสร้างขึ้นด้วยวิธีการรวมเพื่อนบ้านของ MEGA 6.0 [44]

โครงสร้างทางเคมีของ Taxol ที่สกัดออกมา

จุดสมมุติฐานของ Taxol ถูกคัดลอกมาจากแผ่นซิลิกาเจล TLC และทำให้บริสุทธิ์ และความบริสุทธิ์และความเข้มข้นถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ UV–Vis ที่ λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) เปรียบเทียบกับ Taxol ของแท้ [39]. สื่อเปล่าภายใต้เงื่อนไขเดียวกันถูกใช้เป็นค่าพื้นฐานเชิงลบสำหรับการวิเคราะห์สเปกโตรโฟโตเมตริก สเปกตรัม FT-IR ของตัวอย่าง Taxol ที่บริสุทธิ์ได้รับการวิเคราะห์โดย JASCO FT-IR 3600 spectrophotometer ตัวอย่าง Taxol บดด้วยเม็ด KBr กดเป็นแผ่นภายใต้สุญญากาศ และวัดการดูดซึมในบริเวณ 400 ถึง 4,000 ซม.−1 [3] เทียบกับของแท้ โครงสร้างทางเคมีของ Taxol ที่สกัดออกมาได้รับการยืนยันจาก HNMR สเปกโทรสโกปี (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) เมื่อเปรียบเทียบกับ Taxol แท้ ตัวอย่างได้รับการแก้ไขใน CDCl3 การเปลี่ยนแปลงทางเคมีมีหน่วยเป็น ppm (สเกล δ) และค่าคงที่ของการมีเพศสัมพันธ์จะแสดงเป็นเฮิรตซ์ (Hz)

Echinacoside in cistanche

ผลกระทบของสื่อประเภทต่างๆ ต่อการผลิต Taxol

หัวเชื้อวุ้น 2 หัว (9 มม.) จากเชื้ออายุ 7 วันของเชื้อเห็ดที่แยกได้แต่ละตัวได้รับการฉีดเชื้อสามเท่าในขวดแก้ว Erlenmeyer ขนาด 100 มล./250 มล. ของมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D และสารสกัดมอลต์ (ME ) สื่อน้ำซุป ใช้การควบคุมแบบไม่มีเชื้อจากแต่ละสื่อที่ปราศจากสปอร์ของเชื้อราเป็นตัวควบคุมเชิงลบ บ่มที่อุณหภูมิ 30 องศา เป็นเวลา 15 วันภายใต้สภาวะเดียวกัน หลังจากการบ่ม การเพาะเลี้ยงเชื้อราถูกกรอง และ Taxol ถูกสกัดและกำหนดตามที่กล่าวไว้ข้างต้น

การเพิ่มประสิทธิภาพกระบวนการทางชีวภาพของสภาวะทางโภชนาการเพื่อเพิ่มผลผลิต Taxol สูงสุด

การปรับองค์ประกอบสื่อให้เหมาะสมเพื่อเพิ่มผลผลิต Taxol สูงสุดโดย fun gal isolate ที่มีศักยภาพดำเนินการโดยวิธีการพื้นผิวตอบสนองโดยใช้การออกแบบ Placket-Burman ตามด้วยการออกแบบคอมโพสิตส่วนกลาง [17–20, 45] จากการออกแบบ RSM ตัวแปรเชิงบวกและมีนัยสำคัญที่ส่งผลต่อการผลิต Taxol โดยเชื้อราที่แยกได้ที่มีศักยภาพได้รับการประเมินโดยใช้ชุดซอฟต์แวร์ทางสถิติโดย Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA) การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการในการจำลองแบบทางชีวภาพสามครั้งและพิจารณาค่าเฉลี่ย หลังจากการบ่มที่สภาวะที่ต้องการ มวลชีวภาพของเชื้อราถูกกรอง และ Taxol ถูกสกัดและหาปริมาณโดย TLC และ HPLC ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

Plocket‑Burman Design

การออกแบบ placket-Burman ถูกนำมาใช้บ่อยครั้งเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพองค์ประกอบสื่อสำหรับการเจริญเติบโตของเชื้อราและการผลิตสารทุติยภูมิที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ โดยประเมินตัวแปรสำคัญที่ส่งผลต่อการผลิต Taxol [18, 20, 46] การเลือกปัจจัยขึ้นอยู่กับสื่อที่ใช้ในการคัดกรองเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ รวมปัจจัยสิบเอ็ดแล้ว; สารสกัดจากมอลต์ เปปโตน ซูโครส ถั่วเหลือง กลูตามีน สารสกัดจากเนื้อวัว และอุณหภูมิ ค่า pH เวลาในการบ่ม และค่าความเร็วการเขย่าและปัจจัยต่าง ๆ ในสองระดับ และเลือกช่วงระดับต่ำสุดและสูงสุด Design-Expert 7.0 ทางสถิติถูกใช้เพื่อสร้างชุดการทดลอง 12 ชุด สำหรับการทดลองแต่ละครั้ง การผลิต Taxol ถูกกำหนดในการจำลองแบบทางชีวภาพสามชุด และพิจารณาค่าเฉลี่ยของผลผลิต Taxol

การวิเคราะห์การถดถอยของข้อมูลดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ทางสถิติ คำนวณผลกระทบของแต่ละตัวแปร (Biometrika, 2020) โดยใช้สมการต่อไปนี้:

โดยที่ E คือผลของตัวแปรการทดสอบ M บวก และ M− คือความเข้มข้นของ Taxol ของการทดลองที่พารามิเตอร์อยู่ในระดับที่สูงขึ้นและต่ำลงตามลำดับ และ N คือจำนวนการทดลองที่ดำเนินการ ผลกระทบของแต่ละตัวแปรในการผลิตถูกกำหนดโดยการคำนวณค่า E ตามลำดับ

โดยที่ Tot high คือคำตอบทั้งหมดที่ระดับสูง Tot low คือคำตอบทั้งหมดที่ระดับต่ำ และ No คือจำนวนการทดลอง

การออกแบบองค์ประกอบส่วนกลางและปฏิสัมพันธ์ระหว่างปัจจัยที่ส่งผลต่อการผลิต Taxol

ปัจจัยบวกที่สำคัญที่สุดที่ส่งผลต่อการผลิต Taxol โดยเชื้อรา iso late ที่เลือกได้รับการปรับให้เหมาะสมโดยใช้การออกแบบการทดลองแบบจำลอง CCD ของพื้นผิวการตอบสนอง [47] ด้วยการใช้ CCD ความเข้มข้นของส่วนประกอบตัวกลางได้รับการปรับให้เหมาะสม และใช้อันตรกิริยาที่ศึกษาเพื่อสร้างการทดลองทั้งหมด 20 ครั้งสำหรับตัวแปรทั้งสาม ในการกำหนดระดับที่เหมาะสมของตัวแปรสำหรับการผลิต Taxol จากเชื้อราที่มีศักยภาพ เส้นโค้งพื้นผิวตอบสนองสามมิติ (3D) ถูกวางแผนเพื่อศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างปัจจัยต่างๆ และเพื่อกำหนดเงื่อนไขตัวแปรของแต่ละปัจจัยที่ส่งผลต่อการผลิต Taxol กราฟ 3 มิติดำเนินการโดยการจับค่าคงที่ของปัจจัยสามตัวให้อยู่ในระดับที่เหมาะสม และวางแผนการตอบสนองที่ได้รับของผลผลิต Taxol สำหรับระดับที่แตกต่างกันของอีกสองปัจจัย

ผลของการฉายรังสีแกมมาต่อผลผลิตของ Taxol

เอนโดไฟต์ไอโซเลตที่มีศักยภาพซึ่งผลิต Taxol สัมผัสกับ - การฉายรังสีด้วยแหล่งโคบอลต์ 60 (เซลล์แกมมา 4000-A-อินเดีย) ที่ปริมาณรังสีแกมมาต่างกัน (0.25–3.0 kGy) เมื่อเปรียบเทียบ เพื่อควบคุมวัฒนธรรมที่ไม่ฉายรังสี อัตราปริมาณรังสี 1.2 กิโลกิกะไบต์/ชม. ณ เวลาที่ทำการทดลอง อาหารเลี้ยงเชื้อที่ปรับให้เหมาะสมได้รับการฉีดวัคซีนโดยเชื้อที่ฉายรังสีภายใต้สภาวะวัฒนธรรมมาตรฐาน เปรียบเทียบกับหัวเชื้อของสปอร์ที่ไม่ฉายรังสีเป็นตัวควบคุม วัฒนธรรมถูกบ่มที่ 30 ± 2 องศาเป็นเวลา 15 วันบนเครื่องเขย่าแบบหมุน (120 รอบต่อนาที) หลังจากการบ่ม วัฒนธรรมถูกกรองและ Taxol ถูกสกัด ทำให้บริสุทธิ์ และหาปริมาณโดย TLC และ HPLC ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

KSL13

การสังเคราะห์และการศึกษาลักษณะของอนุภาคนาโนทองคำ (AuNPs); การผันคำกริยากับ Taxol

อนุภาคนาโนทองคำที่ปิดด้วยโพลีไวนิลไพร์โรลิโดน (PVP) ถูกสังเคราะห์โดยการผสม 1 mM PVP (ละลายในน้ำกลั่น) กับ 0.5 mM ทอง (III) คลอไรด์ไฮเดรตกวนด้วยแม่เหล็ก และสารละลายถูกฉายรังสีด้วยรังสีแกมมา ในปริมาณที่แตกต่างกัน (0.25–10.0 kGy) สารละลาย PVP-Au3 plus ที่ได้รับได้รับการแก้ไขด้วยโซเดียมบอโรไฮไดรด์ 1 มล. (1 มิลลิโมลาร์) เป็นตัวรีดิวซ์ Taxol (100 ไมโครกรัม/มล.) ผสมกับ PVP-AuNPS ที่อัตราส่วน 1:2 (v/v) และคอนจูเกต Taxol-PVP-AuNPs ที่ได้รับแสดงคุณลักษณะโดยการวิเคราะห์ UV–Vis

การกระจายขนาดและขนาดอนุภาคเฉลี่ยของคอนจูเกต Taxol-PVP-AuNPs วัดโดย Dynamic light scattering (DLS) (PSS-NICOMP 380-ZLS particle sizing system St. Barbara, CA, USA, at NCRRT) การวัด FTIR ดำเนินการเพื่อรับข้อมูลเกี่ยวกับกลุ่มสารเคมีของคอนจูเกต Taxol-PVP-AuNP ที่สัมพันธ์กันความเสถียรของโครงสร้าง เมื่อเทียบกับ Taxol ดั้งเดิม (สเปกตรัมอินฟาเรด JASCO FT-IR 3600นิรันดร์). ขนาดและสัณฐานวิทยาของ AuNP ที่สังเคราะห์ได้ถูกบันทึกโดยใช้ความละเอียดสูงกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน (HRTEM) และเตรียม AuNP แบบหยดเคลือบการศึกษา TEM บนกริด TEM ที่เคลือบด้วยคาร์บอน รูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ (XRD) คือที่ได้จากชุด XRD-6000 รวมถึงการวัดปริมาณออสเทนไนท์ที่เหลืออยู่ การวิเคราะห์ความเครียดซิส การคำนวณความเป็นผลึก และการวิเคราะห์วัสดุขนาดผลึก/ตาข่ายความเครียดโดยมากกว่าวางรูปแบบการเลี้ยวเบนของรังสีเอกซ์ (เครื่องมือ Shimadzu พร้อมเป้าหมาย Cu-K และแผ่นกรองนิกเกิลเครื่องมือวิทยาศาสตร์ Shimadzu (SSI), NCRRT)

ฤทธิ์ต้านมะเร็งของ Taxol

กิจกรรมของ Taxol บริสุทธิ์และ Taxol-PVP-AuNPs คอนจูเกตต่อต้านมะเร็งตับ (HPG2) และมะเร็งเต้านม (MCF7) ถูกกำหนดโดย 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-การทดสอบไดฟีนิลเตตระโซเลียมโบรไมด์ (MTT) [48] 96-เพลตหลุมถูกเพาะด้วยเซลล์ 103 เซลล์ต่อหลุม และบ่มค้างคืนที่ 37 องศา จากนั้นเติมยาที่มีความเข้มข้นต่างกัน และเพลตถูกบ่มซ้ำเป็นเวลา 48 ชั่วโมง รีเอเจนต์ MTT (25 ul) ถูกเติมและบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง และวัดสีม่วงของฟอร์มาซานคอมเพล็กซ์ที่พัฒนาขึ้นที่ λ570 นาโนเมตร ค่า IC50 ถูกแสดงโดยปริมาณของยาที่ลดการเจริญของ 50 เปอร์เซ็นต์ของจำนวนเริ่มต้นของเซลล์เนื้องอกที่ทำให้ปกติไปสู่กลุ่มควบคุมที่เป็นบวก

ฤทธิ์ต้านจุลชีพของคอนจูเกต Taxol และ Taxol‑AuNPs

ฤทธิ์ต้านจุลชีพของคอนจูเกต Taxol และ Taxol-AuNPs ได้รับการประเมินเทียบกับแบคทีเรียที่แยกได้หลายชนิด Bacillus subtilis ATCC 6633 และ Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli และ Enterobacter agglomerans นอกเหนือจาก Candida albicans เซลล์แบคทีเรียที่ทดสอบถูกแขวนลอยในน้ำเปปโตนที่ผ่านการฆ่าเชื้อเพื่อให้ได้หัวเชื้อมาตรฐานที่ ~0.5 McFarland (1–1.5)× 1{{10}}8 CFU/ ml ที่ λ6{{18 }}0 นาโนเมตร ประเมินการยับยั้งการเจริญเติบโต (มม.) ของการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์ก่อโรคโดยวิธี agar disc difusion ใช้แผ่นยาปฏิชีวนะมาตรฐานปลอดเชื้อที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 6.0 มม. เป็นตัวควบคุมเชิงบวก แผ่นยาปฏิชีวนะที่ปราศจากเชื้อ (6.0 มม.) ถูกโหลดด้วยเมทานอล 20 ul และกรดอะม็อกซีซิลลิน-คลาวูลานิก (AMC) เป็นตัวควบคุมเชิงลบและเชิงบวก ดิสก์ถูกโหลดด้วย Taxol, Taxol-PVP-AuNPs และ AuNP ที่มีความเข้มข้นเท่ากัน (1.0 ug/ml) มีการเตรียมการจำลองแบบทางชีวภาพสามแบบ จานถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และวัดโซนของการยับยั้ง มีการใช้ Amoxicillin clavulanic acid (AMC) และ nystatin เพื่อทำให้ฤทธิ์ต้านจุลชีพของ Taxol เป็นปกติ โซนการยับยั้งการเติบโตถูกกำหนดโดยเวอร์เนียร์คาลิปเปอร์ (มม.)

KSL15

การวิเคราะห์ทางสถิติ

การทดลองดำเนินการในการจำลองแบบทางชีวภาพสามชุด และแสดงผลลัพธ์ด้วยค่าเฉลี่ย±STDV นัยสำคัญคำนวณโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวด้วย

ความแตกต่างที่มีนัยสำคัญน้อยที่สุดของฟิชเชอร์หลังการทดสอบเฉพาะกิจ

การสะสมของเชื้อรา

A. favus Bd ที่แยกได้นั้นถูกฝากไว้ที่ genbank ภายใต้ภาคยานุวัติ #MW485934.1 เช่นเดียวกับที่ Assiut University Mycological Center (AUMC) ประเทศอียิปต์ โดยมีหมายเลข #AUMC13892

ผลลัพธ์

การแยกเชื้อราเอนโดไฟต์จากโจโจบา; การคัดกรองการผลิต Taxol

เชื้อราเอ็นโดไฟต์ที่แยกได้ 24 ชนิดได้รับการกู้คืนจากเปลือก กิ่ง ใบ และตาของโจโจบาที่บรรจุในอาหารเลี้ยงเชื้อ PDA, CZD และ ME เชื้อราที่แยกได้เหล่านี้ได้มาจากเปลือกไม้ (6 ไอโซเลท) กิ่ง (7 ไอโซเลท) ใบไม้ (4 ไอโซเลท) และตา (7 ไอโซเลท) ดังที่บันทึกไว้ในตารางที่ 1 เชื้อราที่แยกได้เหล่านี้ถูกจำแนกในขั้นต้นตามระดับสปีชีส์ของพวกมันตามลักษณะทางสัณฐานวิทยา ลักษณะตามแป้นสากล อยู่ใน 3 สกุล ได้แก่ Aspergillus, Penicillium และ Fusarium ในบรรดาเชื้อที่แยกได้เหล่านี้ มีรายงานความชุกของพืชสกุล Aspergillus (ร้อยละ 83.4) ในขณะที่ Fusarium และ Penicillium มีจำนวนร้อยละ 8.3 สกุล Aspergillus แสดงโดยห้าสปีชีส์ ได้แก่ A. favus (3 ไอโซเลท), Aspergillus oryzae (5 ไอโซเลท), A. niger (5 ไอโซเลท), A. fumigatus (4 ไอโซเลท) และ A. terreus (3 ไอโซเลท) ผลผลิตของ Taxol โดยเชื้อราที่แยกได้นั้นได้รับการประเมินโดยการเจริญเติบโตบน PDB การบ่มที่สภาวะมาตรฐาน การสกัด และการหาปริมาณของ Taxol โดย TLC และ HPLC (รูปที่ 1) จากผลลัพธ์ รายงานผลผลิต Taxol สูงสุดโดย A. favus Bd1 (88.65 µg/l) ตามด้วย P. polonicum Br1 (54.42 µg/l), A. niger Lv1 (43.95 µg/l), A. oryzae Bd1 (38.87 µg/l), F. oxysporum Tw1 (26.80 µg/l), A. niger Lv2 (23.01 µg/l) และ A. fumigatus Bd2 (17.62 µg/ ล). เอกลักษณ์ทางเคมีเชิงโครงสร้างของ Taxol จากผู้ผลิตเชื้อราสูงสุดได้รับการเปิดเผยจากสเปกตรัม UV–Vis เมื่อเทียบกับสเปกตรัมทางเคมีของ Taxol ของแท้ นอกจากนี้ โครงสร้างทางเคมีของ Taxol ที่สกัดจาก fun gal สี่ไอโซเลทที่ทรงพลังที่สุดยังได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์ FT-IR (รูปที่ 1) ที่น่าทึ่งคือ Taxol ที่แยกได้จากเชื้อราที่มีศักยภาพนั้นแสดงกระบวนทัศน์เชิงสเปกตรัมเดียวกันกับ Taxol ของแท้ จุดสูงสุดที่ 3393.3 cm−1 ถูกกำหนดให้กับไฮดรอกซิล (OH) ในขณะที่จุดสูงสุดที่ 2923.5 ถูกกำหนดให้กับการยืดแบบอะลิฟาติก CH ส่วนจุดสูงสุดที่ 16610 cm−1 สอดคล้องกับความถี่การยืด C=O จุดสูงสุดที่สังเกตได้ที่ 1,452.0–1,404.0 cm−1 เกิดจากความถี่การยืด NH สังเกตความถี่การยืดออกของกลุ่มคาร์บอนิล-ออกซิเจนที่ 1109 cm−1 พีคที่สังเกตได้ในช่วง 1,020–979.7 cm−1 เกิดจากการโค้งงออะโรมาติก C และ H จากการวิเคราะห์ด้วยโครมาโตกราฟีและสเปกตรัม สรุปได้ว่า Taxol ที่สกัดออกมานั้นเหมือนกับของจริง เห็นได้ชัดว่ากิจกรรมเมแทบอลิซึมของเชื้อราชนิดเดียวกันนั้นผันผวนอย่างมากกับพืชแต่ละชนิด เพื่อให้แน่ใจว่ามีปฏิสัมพันธ์ทางชีวภาพที่ไม่เหมือนใครและปล่อยสัญญาณเฉพาะจากส่วนของพืชเพื่อกระตุ้นการแสดงออกของระบบเครื่องจักรของการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ Taxol ที่น่าสนใจคือ ความผันผวนของระบบเมแทบอลิซึมไม่ได้ขึ้นอยู่กับส่วนของพืชเท่านั้น แต่ยังขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างไอโซเลตและไอโซเลตด้วย ตัวอย่างเช่น ผลผลิต Taxol ของ A. niger ที่แยกได้ซึ่งอาศัยอยู่ในใบของโจโจ้บาคือ 43.9 ไมโครกรัม/ลิตร ในขณะที่ผลผลิตของ Taxol เป็นศูนย์สำหรับ A. niger ที่แยกได้จากเปลือกพืช

ตารางที่ 1 การตรวจหา Taxol ที่ผลิต endophytic fungi ของโจโจ้บา

chinese herbs for cognitive improvement

การระบุลักษณะทางสัณฐานวิทยาและโมเลกุลของผู้ผลิต Taxol ที่มีศักยภาพ

ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเชื้อราที่มีศักยภาพที่แยกได้ซึ่งผลิต Taxol ได้รับการตรวจสอบตามคีย์อธิบายด้วยกล้องจุลทรรศน์และกล้องจุลทรรศน์ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการ และเผยให้เห็นความใกล้เคียงทางสัณฐานวิทยากับ A. favus (รูปที่ 2) เชื้อราที่แยกได้เติบโตบน PDA ที่อุณหภูมิ 30 องศา เป็นเวลา 10 วัน และลักษณะทางมาโครและกล้องจุลทรรศน์เผยให้เห็นลักษณะเฉพาะของมัน เช่น หัวรูปกรวย รูปแบบของการแตกแขนง ลักษณะเฉพาะของมลทิน ภววิทยารูปกรวย และการก่อตัวของผลไม้ตามหลักการสากล ลักษณะทางสัณฐานวิทยา [33] และพบว่าเหมือนกับ Aspergillus favus A. favus ที่ผลิตโดย Taxol ที่มีศักยภาพได้รับการระบุเพิ่มเติมตามลำดับ ITS ของพวกมัน โดยใช้ gDNA เป็นแม่แบบ แอมพลิคอน PCR (~550 bp) ของ A. favus ได้รับการแก้ไข ทำให้บริสุทธิ์ และจัดลำดับ (รูปที่ 2) ลำดับ ITS ของ A. favus เป็นการค้นหาแบบไม่ซ้ำซ้อนบนฐานข้อมูล NCBI โดยแสดงความคล้ายคลึง 99 เปอร์เซ็นต์กับ A. favus โดยมีค่า E เป็นศูนย์ และครอบคลุมการค้นหา 95 เปอร์เซ็นต์ ดังนั้น จากการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์และโมเลกุล เป้าหมายที่แยกได้ได้รับการยืนยันว่าเป็น A. favus และฝากไว้ที่ GenBank ด้วยหมายเลขภาคยานุวัติ MW485934.1 เช่นเดียวกับที่แยกได้นั้นถูกฝากไว้ที่ Assiut University Mycological Center (AUMC) ประเทศอียิปต์ด้วย หมายเลขเงินฝาก AUMC13892 ไอโซเลทปัจจุบันมีความคล้ายคลึงกันร้อยละ 99 กับ A. favus ไอโซเลท MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

รูปที่ 1 มุมมองทางสัณฐานวิทยาของต้นโจโจ้บา B การเพาะเลี้ยงเพลตของเชื้อราเอนโดไฟต์ที่มีศักยภาพซึ่งผลิต Taxol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) และ A. oryzae Bd (25) บน PDA หลังจากบ่มเพาะที่อุณหภูมิ 30 องศา 8 วัน เชื้อราที่แยกได้เติบโตบน PDB และบ่มในสภาวะมาตรฐาน และ Taxol ถูกสกัดและตรวจสอบโดย TLC (C) โครมาโตแกรม D HPLC ของ Taxol จากเชื้อราที่มีศักยภาพที่แยกได้ E Yield of Taxol ที่วัดจาก HPLC F, UV–Vis การวิเคราะห์สเปกตรัมของ Taxol ที่สกัดได้จากเชื้อราที่แยกได้ การวิเคราะห์ G FT-IR ของ Taxol ที่สกัดออกมาเปรียบเทียบกับของจริง

MK108386, KY926854, MK091395, MG554231, KY859367, JX157882, LC6020227, LC602024, KR611590, MK461562, JX912560, MT447545 และ MT447532 โดยมีศูนย์ E ค่า . และครอบคลุมข้อความค้นหา 95 เปอร์เซ็นต์ ความสัมพันธ์ทางสายวิวัฒนาการของ A. favus กับฐานข้อมูลที่แยกได้ถูกสร้างขึ้น (รูปที่ 2) ตามลำดับของ ITS กลุ่มสายวิวัฒนาการสามกลุ่มของ A. favus ได้รับการกู้คืนด้วยความคล้ายคลึงกันของลำดับที่แข็งแกร่งตามที่เปิดเผยจากค่าราก 0.001 เป้าหมายที่แยกได้นั้นเป็นของ A. favus clade I

รูปที่ 2 ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของ A. favus an endophyte of jojoba หลังจาก 3, 5 และ 8 วันของการเจริญเติบโตบน PDA ลักษณะทางสัณฐานวิทยาระดับจุลภาค หัวกรวยของ A. favus โดยกำลังขยาย 400 เท่า แอมพลิคอน C PCR ของภูมิภาค A. favus ITS ที่ 500 bp, ปรับมาตรฐานเป็นแลดเดอร์ 1 kb (Cat.#. SM0312) D การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของ ITS A. favus โดยวิธีโอกาสสูงสุด [44]

การส่งเสริมฤทธิ์ต้านมะเร็งของ Aspergillus Favus "เอนโดไฟต์ของโจโจ้บา" Taxol ผ่านการผันคำกริยาด้วยอนุภาคนาโนทองคำที่อาศัยโดยการฉายรังสี